Name: Charakterystyka glikoprotein z fałdem immunoglobulinowym za pomocą krystalografii rentgenowskiej i technik biofizycznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Poznaj metody charakteryzacji glikoprotein z fałdem immunoglobulinowym przy użyciu krystalografii rentgenowskiej i technik biofizycznych. Dowiedz się, jak analizować interakcje białek z ligandami w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Eksperymenty dyfrakcji rentgenowskiej opisane w tym artykule zostały przeprowadzone przy użyciu linii badawczych 08-ID i 08-BM w Kanadyjskim Źródle Światła, które jest wspierane przez Kanadyjską Fundację Innowacji, Nauk Przyrodniczych i Inżynierii Kanadyjskiej Rady Badawczej, Uniwersytet Saskatchewan, Rząd Saskatchewan, Kanadyjską Narodową Radę ds. Badań Naukowych oraz Kanadyjskie Instytuty Badań nad Zdrowiem. Chcielibyśmy podziękować Szpitalowi dla Chorych Dzieci za dostęp do instrumentów ITC i BLI. J.E.O. był wspierany przez Banting Postdoctoral Fellowship BPF-144483 z Canadian Institutes of Health Research. T.S. jest laureatem Canada Graduate Scholarship Master's Award oraz stypendium Vanier Canada Graduate Scholarship od Canadian Institutes of Health Research. Prace te były wspierane przez grant operacyjny PJT-148811 (J.-P.J.) z Kanadyjskiego Instytutu Badań nad Zdrowiem. Badania te zostały częściowo dzięki finansowaniu z programu Canada Research Chairs (J.-P.J.).

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Glikoproteiny zakotwiczone w błonie mają kluczowe znaczenie dla funkcjonowania komórek i są atrakcyjnymi celami terapeutycznymi. W tym miejscu przedstawiamy protokół strukturalnej i biofizycznej charakterystyki ECD glikoprotein błonowych, zarówno samodzielnie, jak i w kompleksie z ligandami drobnocząsteczkowymi i fragmentami Fab. Z powodzeniem wykorzystaliśmy ten protokół do określenia struktury krystalicznej trzech N-końcowych domen Ig zewnątrzkomórkowej części ludzkiego CD2228, krytycznego koreceptora na komórkach B zaangażowanych w utrzymanie odporności humoralnej w ryzach79. Scharakteryzowaliśmy również miejsce wiązania CD22 z jego naturalnym ligandem α2-6 sjallaktozą oraz określiliśmy tryb rozpoznawania przeciwciała terapeutycznego wobec ludzkiego CD22. Wyniki te dostarczają informacji na temat zależności między strukturą a funkcją kluczowego członka rodziny Siglecs, który ma ograniczoną ekspresję na komórkach B, a także molekularnego planu działania w kierunku opracowania nowych leków małocząsteczkowych i opartych na przeciwciałach ukierunkowanych na CD22. Chociaż protokół ten został z powodzeniem zastosowany w przypadku receptora komórek B zawierającego Ig, proponujemy, że nasze podejście można zastosować do strukturalnej i biofizycznej charakterystyki dowolnej glikoproteiny błonowej z wyraźną organizacją domeny. W takich przypadkach projekt konstruktu i kombinatoryczne mutacje glikanów sprzężonych z N (do Gln lub Ala) mogą być oceniane w celu znalezienia konstruktu odpowiedniego do wzrostu kryształów i dyfrakcji o wysokiej rozdzielczości.
Uzyskanie jednorodnej i czystej próbki glikoproteiny ma kluczowe znaczenie dla wzrostu kryształów i dyfrakcji rentgenowskiej, a także dla dalszej charakterystyki biofizycznej. Glikany sprzężone z N obecne na glikoproteinach są z natury niejednorodne i mogą powodować konformacyjną i chemiczną niejednorodność w glikoproteinie, co może hamować tworzenie się kryształów. Aby zmniejszyć tę mikroheterogeniczność, strategie wprowadzające mutacje punktowe w celu usunięcia reszt Asn, które zgodnie z przewidywaniami zawierają glikany sprzężone z N, lub wykorzystujące zmutowane linie komórkowe (takie jak HEK293S), a następnie leczenie endoglikozydazami (takimi jak EndoH) mogą znacznie poprawić sukces krystalizacji 15,21,22. W tym protokole omawiamy oczyszczanie rozpuszczalnych glikoprotein i Fabs, które są wydzielane do supernatantu komórki. Wydzielanie glikoproteiny zapewnia stosunkowo prostą drogę do czystości, bez konieczności lizy komórek lub dodawania ostrych chemikaliów lub detergentów. Supernatant komórkowy, uzyskany po zebraniu komórek, jest następnie przepuszczany bezpośrednio przez kolumnę, która ma powinowactwo do białka będącego przedmiotem zainteresowania (np. Ni-NTA dla glikoprotein znakowanych Hisem lub powinowactwo LC do fragmentów Fab). Jednakże, w zależności od kolumny, w której jest stosowany, i warunków panujących w supernatance komórki (np. pH), zdolność wiązania białka będącego przedmiotem zainteresowania z kolumną może być zaburzona. W takim przypadku może być konieczna koncentracja i wymiana buforowa supernatantu komórkowego w celu poprawy wiązania z kolumną. Ponadto zdecydowanie zaleca się stosowanie etapów kontroli jakości podczas oczyszczania, aby pomóc w ocenie czystości białka. Przeprowadzenie SDS-PAGE żelu lub Western blot wszystkich próbek (przed, w trakcie i po etapach oczyszczania) może dostarczyć informacji na temat tego, czy proponowany schemat oczyszczania jest odpowiedni dla białka będącego przedmiotem zainteresowania. Jeśli na SDS-PAGE widoczne są pasma zanieczyszczające lub jeśli podczas oczyszczania uzyskuje się kilka gatunków (np. kilka pików przy wykluczeniu wielkości), należy rozważyć dodatkowe etapy oczyszczania, np. chromatografię jonowymienną, w celu uzyskania czystości i zwiększenia szans na dalszą krystalizację80.
W przypadku krystalizacji makromolekularnej często kluczowe jest uzyskanie wysokiej wydajności białka będącego przedmiotem zainteresowania, aby umożliwić badanie przesiewowe dużej liczby potencjalnych warunków krystalizacji przy wysokich stężeniach białka w celu znalezienia odpowiednich trafień kryształów. Ogólnie rzecz biorąc, omawiane tutaj linie komórkowe HEK293 (HEK293F i HEK293S) są solidnymi systemami ekspresji i można je łatwo skalować w celu uzyskania większej próbki w razie potrzeby. Możliwe jest jednak, że białko będące przedmiotem zainteresowania może nie wykazywać wystarczającej ekspresji w tych liniach komórkowych. W takich przypadkach stwierdzono, że inne linie komórkowe, takie jak komórki Expi29381,82, wykazują wyższy poziom ekspresji białka i powinny być brane pod uwagę jako alternatywa.
Jeśli dobrze uporządkowane, dyfrakcyjne kryształy nie zostaną uzyskane po przetestowaniu kilku konstruktów białka będącego przedmiotem zainteresowania pomimo wysokiej czystości, może być konieczne rozszerzenie technik krystalizacji w celu pobudzenia tworzenia kryształów. Wykazano, że fragmenty Fab przeciwciał i nanociał mogą być doskonałymi wzmacniaczami krystalizacji i sprzyjać dobrze uporządkowanemu upakowaniu kryształów 83,84,85. Fragmenty te mogą być wyrażane i oczyszczane do jednorodności oraz stosowane w kompleksie z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania w celu promowania krystalizacji. Co ważne, fragmenty Fab wytworzone w sposób opisany w sekcji 10 mogą mieć tendencję do tworzenia niefunkcjonalnych dimerów LC86. Te dimery są zanieczyszczeniami i powinny być usuwane podczas oczyszczania. Z naszego doświadczenia wynika, że dimery LC często mają różną objętość retencji przy wykluczeniu wielkości lub eluują jako wyraźny pik w chromatografii jonowymiennej, a zatem mogą być usunięte z oczyszczania Fab - jednak nie zawsze tak jest. Jeśli te techniki są niewystarczające do usunięcia dimerów LC z oczyszczania Fab, można zastosować dodatkowe metody oczyszczania, takie jak oczyszczanie powinowactwa do białka G, w celu poprawy czystości.
Alternatywą dla kokompleksowania z fragmentami Fab, dobrze udokumentowane techniki, takie jak losowe mikroziarno matrycy, mogą zwiększyć szanse na uzyskanie dobrze uporządkowanych kryształów 63,70. Metoda ta polega na dodaniu niewielkich ilości pokruszonych, nieoptymalnych kryształów do warunków krystalizacji, zapewniając zarodek kryształu w celu pobudzenia wzrostu kryształów. Można to zrobić za pomocą kryształów białka będącego przedmiotem zainteresowania lub kryształów o podobnej architekturze domeny i strukturze trzeciorzędowej. Co więcej, losowe mikrowysiewanie matrycy można przeprowadzić w próbach krystalizacji białka samodzielnie lub w kompleksie z fragmentem Fab lub małą cząsteczką będącą przedmiotem zainteresowania. Ostatnie postępy w mikroskopii krioelektronowej sprawiają, że technika ta jest również atrakcyjną alternatywą dla krystalografii rentgenowskiej w celu uzyskania informacji strukturalnych o wysokiej rozdzielczości dla cząsteczek o odpowiednich cechach 87,88,89,90,91.
Gdy fazowanie zestawów danych dyfrakcji rentgenowskiej nie powiedzie się przez MR, może być konieczne wygrzewanie HA w celu rozwiązania problemu fazowego przez anomalną dyspersję lub izomorficzną substytucję. Badanie sekwencji aminokwasów białka może dostarczyć wskazówek na temat strategii derywatyzacji HA, w tym optymalnego pH do wiązania. W szczególności niesparowane cysteiny w białku mogą specyficznie wiązać związki HA zawierające rtęć. Moczenie natywnych kryształów związkami HA jest procesem iteracyjnym mającym na celu określenie tożsamości optymalnego związku HA, jego stężenia i wymaganego czasu inkubacji. Jeśli początkowe próby namaczania nie dadzą dobrze dyfrakcyjnych kryształów zawierających kwas hialuronowy odpowiedni do fazowania, może być konieczne wprowadzenie podstawień aminokwasów w celu zwiększenia prawdopodobieństwa wiązania HA i poprawy sygnału anomalnego. Przykłady obejmują mutacje zawierające wolną resztę cysteiny w celu skutecznego wiązania Hg, Au, Pt lub Pb. Ekspresja białek do anomalnego fazowania w pożywce uzupełnionej selenometioniną w E. coli jest szeroko stosowana do fazowania anomalnego, jednak równoważny system, który niezawodnie zawiera selenometioninę, nie jest łatwo dostępny dla komórek ssaków w zawiesinie92,93, i jest obszarem przyszłego rozwoju.
Po uzyskaniu niezligandowanej struktury interesującej nas glikoproteiny można przeprowadzić moczenie kryształów ligandami drobnocząsteczkowymi w celu uzyskania struktury kompleksu receptor-ligand immunologiczny. Dane te stanowią plan racjonalnego projektowania bardziej specyficznych ligandów o wysokim powinowactwie, które mogą być stosowane jako terapie małocząsteczkowe, a także zapewniają wgląd w biologiczną funkcję glikoproteiny w wysokiej rozdzielczości. Podczas próby namoczenia kryształów glikoproteiny za pomocą interesujących nas ligandów małocząsteczkowych, inspekcja struktury niezligandowanych kryształów może wskazać, czy możliwe jest nasiąkanie. Jeśli wokół miejsca wiązania liganda lub wokół regionów, które mają ulegać zmianom konformacyjnym po związaniu liganda, zostaną znalezione bliskie kontakty z upakowaniem kryształów, moczenie będzie prawdopodobnie problematyczne. W takim przypadku należy przeprowadzić inne metody, takie jak kokrystalizacja kompleksu białko-ligand.

Białka powierzchniowe odgrywają kluczową rolę w funkcjonowaniu komórek. Poprzez swoje domeny zewnątrzkomórkowe, te białka błonowe mogą modulować interakcje komórka-komórka, adhezję, transport i sygnalizację1,2. Zewnątrzkomórkowa lokalizacja tych białek sprawia, że są one atrakcyjnym celem dla rozwoju terapii w leczeniu szerokiego zakresu chorób, w tym nowotworów i chorób autoimmunologicznych3,4,5,6,7. Jednym z najczęstszych fałdów ektodomen białek błonowych człowieka jest fałd podobny do immunoglobuliny (Ig), który składa się z siedmiu lub więcej nici β ułożonych w dwa β-arkusze8,9. Zazwyczaj glikoproteiny zawierające Ig są strukturami wielodomenowymi z domenami Ig ułożonymi sekwencyjnie na zewnątrzkomórkowej części białka błonowego10. Wykazano, że potranslacyjne modyfikacje tych białek na powierzchni komórki, w szczególności glikozylacja sprzężona z N i O, odgrywają istotną rolę w ich regulacji, fałdowaniu, wydzielaniu i funkcjonowaniu11. Aby lepiej zrozumieć ich funkcję i lepiej zaprojektować terapie, które mogą być na nie ukierunkowane, potrzebne są techniki, które pozwolą na ich szczegółową charakterystykę molekularną. W tym miejscu przedstawiamy kombinację technik, które pozwalają na biofizyczną (interferometria biowarstwowa (BLI) i izotermiczna kalorymetria miareczkowa (ITC)) i strukturalną (krystalografia rentgenowska) charakterystykę domeny zewnątrzkomórkowej glikoprotein błonowych zawierających Ig, samodzielnie i w kompleksie z ich biologicznie istotnymi ligandami i cząsteczkami terapeutycznymi (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).
N związana z glikozylacją jest jedną z najczęstszych modyfikacji potranslacyjnych białek ssaków i występuje podczas dojrzewania białek w retikulum endoplazmatycznym i Golgi12,13. Linie komórkowe, takie jak 293 komórki ludzkiej embrionalnej nerki (HEK), zostały opracowane do rekombinowanej ekspresji dużych ilości glikozylowanych białek ssaków14,15. Ta linia komórkowa została opracowana w formie zawiesiny, co pozwala na łatwe zwiększenie produkcji białka do większych ilości w porównaniu z przylegającymi liniami komórkowymi. Tutaj wykorzystujemy dwie linie komórkowe HEK293: HEK293F i HEK293 Gnt I-/- (HEK293S), które różnią się brakiem N-acetyloglukozaminylotransferazy I (Gnt I) w tej ostatniej. Z kolei produkcja złożonych glikanów (jak widać na HEK293F) nie jest możliwa, a zamiast tego glikany o wysokiej zawartości mannozy (głównie Man5GlcNAc2) znajdują się w miejscach glikanów sprzężonych z N18,19,20. Równoległe wykorzystanie tych dwóch linii komórkowych pozwala na badanie wpływu wielkości i złożoności glikanów na funkcje biologiczne i celowanie terapeutyczne. Rzeczywiście, glikoproteiny wytwarzane w HEK293F komórkach będą miały większe, bardziej złożone glikany w porównaniu z tą samą glikoproteiną wytwarzaną w HEK293S komórkach. Glikoproteiny wytwarzane w komórkach HEK293S są bardziej podatne na krystalizację ze względu na zmniejszoną niejednorodność chemiczną i konformacyjną ich glikanów połączonych z N. Aby jeszcze bardziej poprawić krystalizowalność, glikoproteiny wytwarzane w HEK293S (ale nie HEK293F) komórkach mogą być traktowane enzymem endoglikozydazą H (Endo H), co powoduje rozszczepienie glikanów o wysokiej zawartości mannozy w taki sposób, że tylko jedno ugrupowanie N-acetyloglukozaminy (GlcNAc) pozostaje w każdym miejscu glikozylacji sprzężonej z N21,22. Inne metody mogą być również stosowane w celu ograniczenia przetwarzania N-glikanów w komórkach, takie jak dodawanie inhibitorów glikozylotransferazy podczas ekspresji glikoproteiny, w tym kifunensine23. Alternatywne podejścia obejmują ekspresję natywnych glikoprotein (w komórkach HEK293F), a następnie enzymatyczną deglikozylację przy użyciu peptydu N-glikozydazy F (PNGaseF). Wykazano jednak, że deglikozylacja za pomocą PNGaseF jest mniej skuteczna w warunkach natywnych i zwiększa agregację niektórych białek; W przypadkach, gdy białko pozostaje rozpuszczalne po poddaniu działaniu substancji, uzyskuje ładunki ujemne na swojej powierzchni w wyniku deamidacji reszty asparaginy do kwasu asparaginowego24, co może być szkodliwe dla jego krystalizacji. Przewidywane miejsca N-glikozylacji mogą być również zmutowane, najczęściej do reszt alaniny lub glutaminy, aby zapobiec glikozylacji sprzężonej z N w tych miejscach i wytworzyć próbki glikoprotein o wysokiej jednorodności. Alternatywnie, glikoproteiny mogą być wytwarzane w innych hodowlach komórek eukariotycznych, w tym w systemach drożdżowych, owadzich i roślinnych lub innych liniach komórkowych ssaków, takich jak komórki jajnika chomika chińskiego (CHO)16,17.
Wiele wektorów ekspresji ssaków, w tym pHLsec, pozwala na wydzielanie rekombinowanych ektodomen glikoproteinowych do podłoża komórkowego25. Wydzielanie glikoprotein z komórek HEK293 pozwala na szybkie i łatwe oczyszczanie bez konieczności lizy komórek. Dodanie znaczników oczyszczających (np. znacznika His, znacznika Strep, znacznika flagowego, znacznika Myc, znacznika HA) do końca N lub C docelowej glikoproteiny umożliwia oczyszczanie za pomocą jednoetapowej chromatografii powinowactwa. Następnie chromatografia wykluczania wielkości może być wykorzystana do uzyskania próbki monodyspersyjnej do charakterystyki biofizycznej i strukturalnej.
Wysoce czysta i jednorodna próbka glikoproteiny w odpowiednich warunkach może skutkować dobrze dyfrakcyjnymi kryształami. Po uzyskaniu pełnego zestawu danych dyfrakcji rentgenowskiej z takich kryształów należy określić początkowe fazy w celu obliczenia gęstości elektronowej glikoproteiny. Dzięki stale rosnącej liczbie struktur w Banku Danych o Białkach (PDB), zdecydowanie najczęściej stosowaną metodą fazowania stała się zastąpienie molekularne (MR), które wykorzystuje pokrewną strukturę białka do uzyskania początkowych faz26. Jednakże, gdy MR nie rozwiązuje problemu fazy, jak to czasami miało miejsce w przypadku glikoprotein z wieloma domenami Ig27,28,29, wymagane są alternatywne metody. W tym artykule szczegółowo opisujemy metodę namaczania kryształów ciężkimi atomami (HA) w celu fazowania, która była wymagana do rozwiązania struktury ektodomeny CD22 < klasy sup = "xref">28. Identyfikacja właściwego kwasu hialuronowego do fazowania jest procesem iteracyjnym, który zależy od reaktywności kwasu hialuronowego, dostępnych atomów w glikoproteinie w danej sieci krystalicznej oraz roztworu krystalizacyjnego30,31. Alternatywnie, naturalne atomy siarki w resztach cysteiny i metioniny mogą być użyte do fazowania, jeśli są obecne w wystarczająco wysokim stosunku do innych atomów w glikoproteinie i jeśli dane dyfrakcji rentgenowskiej mogą być zbierane z wystarczająco wysoką redundancją32,33.
Biologiczna funkcja glikoprotein błonowych jest często pośredniczona przez interakcje białko-białko lub białko-ligand, np. z węglowodanami. Gdy ligand jest wystarczająco mały, aby dyfundować z roztworu do miejsca wiązania glikoproteiny w sieci krystalicznej, eksperymenty z moczeniem mogą zakończyć się sukcesem w celu uzyskania struktury kokrystalicznej glikoproteina-ligand, aby lepiej zrozumieć rozpoznawanie ligandów.
Przedstawione tutaj protokoły są również istotne dla zrozumienia interakcji glikoprotein powierzchniowych z syntetycznymi ligandami terapeutycznymi34,35 i terapie przeciwciałami36,37. W połączeniu z informacjami strukturalnymi, kinetyka wiązania i termodynamika mogą być skuteczne w zrozumieniu i poprawie ich mechanizmów działania. Jedną z technik, która pozwala na analizę kinetyczną przeciwciał terapeutycznych wiążących się z glikoproteiną, jest BLI38,39. BLI wykorzystuje bioczujniki z unieruchomionym ligandem do pomiaru kinetyki asocjacji i dysocjacji z partnerem wiążącym, ostatecznie określając stałą dysocjacji równowagi (KD). BLI jest atrakcyjnym podejściem, ponieważ wymagane są niewielkie ilości glikoprotein (<100 μg), czas eksperymentu jest szybki (~10-15 minut na przebieg) i można go zautomatyzować. ITC jest również przydatny do badania powinowactwa między glikoproteinami a partnerami wiążącymi40,41,42,43. Chociaż ITC jest bardziej czasochłonne i wymaga użycia odczynników, można uzyskać cenne informacje dotyczące termodynamiki oddziaływania (ΔG, ΔH, ΔS i stechiometria). ITC jest również bardzo przydatny do badania słabych oddziaływań, które często są związane z przejściowym wiązaniem glikoprotein powierzchniowych z ligandami. Co więcej, techniki te mogą być stosowane w połączeniu do oceny wiązania różnych konstruktów i oceny wpływu różnych glikoform połączonych z N otrzymanych z ekspresji glikoproteiny w różnych liniach komórkowych. Wykonywanie BLI i ITC z glikoproteinami wytwarzanymi w HEK293F, HEK293S i leczonych Endo H może zapewnić dogłębny wgląd w rolę glikanów w aktywności biologicznej i zaangażowaniu terapeutycznym.
Udało nam się scharakteryzować te protokoły do scharakteryzowania domeny zewnątrzkomórkowej (ECD) ludzkiej klasy CD22<sup="xref">28, glikoproteiny należącej do rodziny lektyn ig-podobnych wiążących kwas sjalowy (Siglecs), która jest niezbędna do utrzymania homeostazy komórek B44. Przeprowadziliśmy dogłębny projekt konstrukcji, aby ułatwić krystalizację i podzieliliśmy zestaw danych rentgenowskich na etapy poprzez nasąkanie HA Hg. Nasączyliśmy również kryształy CD22 jego ligandowym kwasem sjalowym (α2-6 sjallaktoza), aby uzyskać strukturę kompleksu receptor-ligand immunologiczny, a tym samym dostarczyliśmy plany dla projektu mimetyki glikanów kierowanego strukturą45,46. Ponadto wygenerowaliśmy wiązanie antygenu fragmentacyjnego (Fab) przeciwciała terapeutycznego anty-CD22 epratuzumabu - kandydata terapeutycznego obecnie w III fazie badań klinicznych dla chłoniaka nieziarniczego47- w celu określenia jego powinowactwa wiązania przez BLI i ITC do różnie glikozylowanych konstruktów ECD CD22. Badania te ujawniły kluczową rolę glikozylacji sprzężonej z N w zaangażowaniu epratuzumabu, z potencjalnymi implikacjami dla rozpoznawania CD22 na dysfunkcyjnych komórkach B.

<table><tbody><tr><td>0,22 &m; m Filtr Steritop</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGPS02RE</td><td></td></tr><tr><td>10 dołków 4-15% gradient SDS-PAGE żel</td><td>Bio-Rad</td><td>4561084</td><td></td></tr><tr><td>10x glikobufor 3</td><td>New England Biolabs</td><td>P0702S</td><td>W zestawie odczynnik Endo H</td></tr><tr><td>10x Bufor kinetyczny</td><td>PALL Fort&eacute; Bio</td><td>18-1092</td><td></td></tr><tr><td>10x Bufor Tris/Glycine/SDS</td><td>Bio-Rad</td><td>1610732</td><td></td></tr><tr><td>1 ml okrągłodenny blok 96-dołkowy</td><td>ThermoFisher</td><td>260251</td><td></td></tr><tr><td>22 mm Hampton</td><td>research</td><td>HR3-231</td><td></td></tr><tr><td>4x Laemmli Bufor do próbek</td><td>Bio-Rad</td><td>1610747</td><td></td></tr><tr><td>96-3 well INTELLIPLATE&nbsp; rezerwator o małej objętości</td><td>Art Robbins Instrumenty</td><td>102-0001-03</td><td></td></tr><tr><td>AgeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0552S</td><td></td></tr><tr><td>&Auml; KTA Pure</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&Auml; Początek KTA&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroprobówka odśrodkowa Amicon Ultra 15 10KDa MWCO</td><td>Millipore</td><td>UFC901008</td><td></td></tr><tr><td>Urządzenie do filtracji odśrodkowej Amicon Ultra 4 10KDa MWCO</td><td>Millipore</td><td>UFC801008</td><td></td></tr><tr><td>Auto-iTC200</td> Mikroprobówki <td>Malvern</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axygen MaxyClear Snaplock 1,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>MCT150C</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka do komory liczenia komórek Countess</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>CryoLoop 18 x 0,05-0,1 mm</td><td>Hampton research</td><td>HR4-945</td><td></td></tr><tr><td>CryoLoop 18 x 0,1-0,2 mm</td><td>Hampton research</td><td>HR4-947</td><td></td></tr><tr><td>CryoLoop 18 x 0,2-0,3 mm</td><td>Hampton research</td><td>HR4-970</td><td></td></tr><tr><td>Cyfrowa sucha kąpiel</td><td>Bio-Rad</td><td>1660562EDU</td><td></td></tr><tr><td>E. coli DH5&alpha;</td><td>Invitrogen</td><td>18258012</td><td></td></tr><tr><td>Endo H</td><td>New England Biolabs</td><td>P0702S</td><td></td></tr><tr><td>Kolba Erlenmeyera (podstawa z przegrodą), poliwęglan, sterylna, 500 mL, DuoCAP</td><td>TriForest Labware</td><td>FBC05000S</td><td></td></tr><tr><td>Kolba Erlenmeyera 125 ml (podstawa z przegrodą), poliwęglanowa, sterylna, 125 ml z wentylowaną nakrętką</td><td>VWR</td><td>89095-258</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Jednorazowa sterylna pipeta serologiczna, niepirogenna, 10 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>607180</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Jednorazowa sterylna pipeta serologiczna, niepirogenna, 25 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>760180</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Jednorazowa sterylna pipeta serologiczna, niepirogenna, 5 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>606180</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Jednorazowa sterylna pipeta serologiczna, niepirogenna, 50 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>768180</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji DNA FectoPRO, Polyplus</td><td>VWR</td><td>10118-842</td><td></td></tr><tr><td>Ogniwa Freestyle 293F</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R79007</td><td></td></tr><tr><td>Freestyle Expression medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12338001</td><td></td></tr><tr><td>Heavy Atom Screens Au</td><td>Hampton research</td><td>HR2-444</td><td></td></tr><tr><td>Ekrany ciężkich atomów Hg</td><td>Badania Hampton</td><td>HR2-446</td><td></td></tr><tr><td>Ekrany ciężkich atomów M1</td><td>Hampton research</td><td>HR2-448</td><td></td></tr><tr><td>Ekrany ciężkich atomów M2</td><td>Hampton research</td><td>HR2-450</td><td></td></tr><tr><td>Ekrany ciężkich atomów Pt</td><td>Hampton research</td><td>HR2-442</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293S</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRL-3022</td><td></td></tr><tr><td>HisTrap Affinity Column</td><td>GE Healthcare</td><td>17525501</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap KappaSelect Kolumny powinowactwa</td><td>GE Healthcare</td><td>17545811</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap LambdaSelect Kolumny powinowactwa</td><td>GE Healthcare</td><td>17548211</td><td></td></tr><tr><td>KpnI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0142S</td><td></td></tr><tr><td>MCSG-1 Kryształowy ekran 1,7 ml Blok</td><td>Anatrace</td><td>MCSG-1</td><td></td></tr><tr><td>MCSG-2 Blok 1,7 ml</td><td>Anatrace</td><td>MCSG-2 MCSG-3</td><td></td></tr><tr><td>Kryształowy</td> <td>ekran 1,7 mlAnatrace</td><td>MCSG-3</td><td></td></tr><tr><td>MCSG-4 Kryształowy ekran 1,7 ml blok</td><td>Anatrace</td><td>MCSG-4</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek rtęci</td><td>Sigma</td><td>1044170100</td><td></td></tr><tr><td>Microplate, 96 dołków, polipropylen, płaskie dno,&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655209</td><td></td></tr><tr><td>Minstrel DT UV</td><td>Formulatrix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multitron Pro shaker</td><td>Infors HT</td><td>MP25-TA-CO2HB</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000/2000c Spektrofotometr</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>Nanosep 3K Omega urządzenie odśrodkowe</td><td>PALL Nauki przyrodnicze</td><td>OD003C33</td><td></td></tr><tr><td>Biosensory Ni-NTA</td><td>PALL Fort&eacute; Bio</td><td>18-5102</td><td></td></tr><tr><td>Octet RED96</td><td>PALL ForteBio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oryx 4 robot krystalizacyjny</td><td>Douglas Instrument</td><td>ORY-4/1</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek platyny</td><td>Sigma</td><td>520632-1g</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Standard</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0374</td><td></td></tr><tr><td>PureLink HiPure Plasmid Maxiprep Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K210006</td><td></td></tr><tr><td>Quick Coomassie Stain</td><td>Protein Ark</td><td>GEN-QC-STAIN-1L</td><td></td></tr><tr><td>Steriflip Sterylny 50 ml jednorazowy system filtracji próżniowej 0,22 i mikro; m Millipore Express</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 Wzrost 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>28990944</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17517201</td><td></td></tr><tr><td>Klaster bromku tantalu</td><td>Jena bioscience</td><td>PK-103</td><td></td></tr><tr><td>Top96</td><td>Odczynniki Rigaku</td><td>1009846</td><td></td></tr><tr><td>Tryphan Blue</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>VDX 24-studzienkowy z uszczelniaczem</td><td>Hampton research</td><td>HR3-172</td><td></td></tr><tr><td>&alpha; 2-6 sjallaktozy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8556-1mg</td><td></td></tr></tbody></table>

charakterystyka glikoprotein z fałdem immunoglobulinowym za pomocą krystalografii rentgenowskiej i technik biofizycznych

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Glikoproteiny na powierzchni komórek odgrywają kluczową rolę w funkcjonowaniu komórek, w tym w sygnalizacji, adhezji i transporcie. Na leukocytach kilka z tych glikoprotein posiada fałdy immunoglobuliny (Ig) i ma kluczowe znaczenie dla rozpoznawania i regulacji immunologicznej. W tym miejscu prezentujemy platformę do projektowania, ekspresji i biofizycznej charakterystyki domeny zewnątrzkomórkowej receptora ludzkich komórek B CD22. Proponujemy, aby podejścia te miały szerokie zastosowanie w charakterystyce ektodomen glikoprotein ssaków zawierających domeny Ig. Dwie zawiesinowe linie komórkowe ludzkiej nerki embrionalnej (HEK), HEK293F i HEK293S, są wykorzystywane do ekspresji glikoprotein zawierających odpowiednio glikany złożone i glikany o wysokiej zawartości mannozy. Te rekombinowane glikoproteiny z różnymi glikoformami pozwalają na badanie wpływu wielkości i składu glikanów na wiązanie ligandów. Omawiamy protokoły badania kinetyki i termodynamiki wiązania glikoprotein z biologicznie istotnymi ligandami i kandydatami na przeciwciała terapeutyczne. Rekombinowane glikoproteiny wytwarzane w komórkach HEK293S są podatne na krystalizację ze względu na jednorodność glikanów, zmniejszoną elastyczność i podatność na leczenie endoglikozydazą H. Przedstawiamy metody nasączania kryształów glikoproteiny ciężkimi atomami i małymi cząsteczkami odpowiednio do oznaczania faz i analizy wiązania ligandów. Omówione tutaj protokoły eksperymentalne są obiecujące dla charakterystyki glikoprotein ssaków, aby dać wgląd w ich funkcję i zbadać mechanizm działania środków terapeutycznych.

Kilka konstruktów ECD CD22 zostało pomyślnie sklonowanych do wektora ekspresyjnego pHLsec i nadmiernie wyekspresowanych w ssaczych liniach komórkowych HEK293F oraz HEK293S (Rycina&#160;2 oraz 3A). Wszystkie konstrukty oczyszczono pod kątem jednorodności wielkości za pomocą chromatografii wykluczania cząsteczek, co pozwoliło uzyskać wysoce czystą próbkę do badań krystalizacyjnych (Rysunek&#160;3B oraz 3C). Konstruktem CD22, który doprowadził do uzyskania kryształów dobrze dyfrakcyjnych, była truncacja d1-d3 (reszty 20-330), z&#160;pięć&#160;z sześciu przewidywanych miejsc glikozylacji typu N, w których dokonano mutacji Asn na Ala (N67A, N112A, N135A, N164A i N231A), otrzymanych w komórkach HEK293S, w taki sposób, aby zachowano jedynie miejsce glikozylacji na pozycji N101 (konstrukt ten nazwano CD2220-330, 5A). Kryształy uzyskano w kilku warunkach ekranowania rzadkiej macierzy MCSG-1, jednak najlepsze kryształy otrzymano w warunkach zawierających 30% (w/v) glikolu polietylenowego 4000, 0,2 M chlorku litu i 0,1 M Tris, pH 8,5. Te natywne kryształy dyfrakowały do 2,1 &#197; rozdzielczość; wykorzystanie znanych struktur domen Ig pokrewnych białek Siglec nie przyniosło żadnych rozwiązań w poszukiwaniach MR.
Aby uzyskać informacje o fazach, namaczaliśmy natywne kryształy w panelu związków HA, który obejmował Hg, Pt, Os, Ta i Br w stężeniach od 1-20 mM związku HA przez czas inkubacji od 5 min do 1 d (Rysunek 4). Monitorowaliśmy kryształy pod kątem zmian morfologii i stwierdzono, że namaczanie kryształów w związku HA o stężeniu 20 mM prowadziło do szybkiego pękania i rozpuszczania się kryształu. Zamrozono łącznie 63 kryształy, które zachowały swój kształt po określonych czasach inkubacji i były namaczane w klastrze bromku tantalu, chlorku platyny, octanie rtęci oraz chlorku rtęci. Kryształy namaczane 7 mM chlorku rtęci przez 30 min wykazały sygnał anomalny podczas skanowania fluorescencyjnego na linii wiązki 08-BM w Canadian Light Source (CLS) (Saskatoon, Kanada), co umożliwiło wielodługościową dyspersję anomalną (MAD) podczas zbierania danych rentgenowskich z pojedynczego kryształu. Zbiory danych te pozwoliły nam rozwiązać podstrukturę rtęci dla CD2220-330, 5A, co ujawniło pojedynczy atom rtęci związany z wolną cysteiną w pozycji C308 i ostatecznie umożliwiło zbudowanie struktury CD2220-330, 5A w mapie gęstości elektronowej z rozwiązaną fazą przy użyciu programu AutoBuild78.
Po rozwiązaniu struktury nieprzypiętej do liganda, postanowiliśmy rozwiązać strukturę CD22 związanego z jego ligandem, α2-6 siallylaktozą. W celu charakterystyki termodynamiki wiązania tej interakcji, najpierw obliczyliśmy powinowactwo CD22 do α2-6 siallylaktozy za pomocą ITC. Zaobserwowaliśmy powinowactwo na poziomie ~280 µM i wykorzystaliśmy tę informację do ustalenia początkowego stężenia liganda (~ 100 x KD) do namaczania naszych natywnych kryształów CD2220-330,5A . Kryształy CD2220-330, 5A namaczano w 25 mM siallylaktozie przez 5 min, 2 h, 14 h, 40 h i 5 d, monitorując zmiany w morfologii kryształów. Łącznie zamrożono ~75 kryształów z różnych punktów czasowych i wysłano je do linii wiązki 08-ID synchrotronu CLS (Saskatoon, Kanada) w celu zdalnego gromadzenia danych. Zebrano łącznie sześć zestawów danych rentgenowskich z kryształów wykazujących dobre dyfrakcje. Strukturę z każdego zestawu danych rozwiązano metodą MR&#160;, wykorzystując strukturę nieprzypiętą do liganda CD2220-330, 5A jako początkowy model poszukiwania. Następnie sprawdzono powstałą gęstość elektronową dla wszystkich zestawów danych pod kątem dodatniej gęstości na mapie Fo-Fc, która odpowiadałaby związaną α2-6 siallylaktozie w obrębie miejsca wiązania CD22. Co niezwykłe, wszystkie zebrane zestawy danych, nawet te z kryształów namaczanych przez zaledwie 5 min czasu inkubacji, zawierały dodatnią gęstość odpowiadającą ligandowi w miejscu wiązania. Ogólne struktury CD22 nieprzypiętego i związanego z ligandem były bardzo podobne, z minimalnymi zmianami konformacyjnymi, co może wyjaśniać sukces eksperymentów z namaczaniem w α2-6 siallylaktozie.
Następnie scharakteryzowano powierzchnię antygenową CD22 rozpoznawaną przez przeciwciało terapeutyczne epratuzumab w eksperymentach BLI i ITC (Rysunek 5). Profile kinetyczne i termodynamiczne wiązania Fab epratuzumabu z konstruktami CD22 o różnych glikoformach wykazały wzrost powinowactwa do CD22 wraz ze zmniejszeniem rozmiaru glikanów N-łańcuchowych, z maksymalną 14-krotną poprawą powinowactwa dla mniejszych glikanów (327 nM vs 24 nM w BLI; 188 nM vs 58 nM w ITC). Glikan N-łańcuchowy CD22 ograniczający dostęp przeciwciała do jego epitopu został zidentyfikowany metodą BLI przy użyciu pojedynczych mutantów punktowych CD22 oraz poprzez rozwiązanie struktury kokryształu Fab epratuzumabu z CD22 d1-d328.
<img alt="Rycina 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig1.jpg" /> 
Rycina 1. Przegląd charakterystyki glikoprotein, od projektu konstruktu po charakterystykę biofizyczną i strukturalną. (1) Analiza sekwencji pierwotnej reprezentatywnej glikoproteiny. Na szaro: domena zewnątrzkomórkowa (ECD); na zielono: segment transbłonowy (TM); na niebiesko: domena cytozolowa glikoproteiny. Oznakowano przewidywane glikany typu N. (2) Klonowanie konstruktów ECD. (3) Ekspresja konstruktów ECD w komórkach ssaków. (4) Oczyszczanie glikoprotein. Białka wyekspresjonowane w komórkach HEK293F będą zawierać glikany złożone, natomiast białka wyekspresjonowane w komórkach HEK293S będą posiadać glikany wysokomannozowe. Traktowanie enzymatyczne glikoprotein otrzymanych z komórek HEK293S za pomocą Endo H prowadzi do powstania glikoprotein z jedynie resztą GlcNAc w miejscach glikozylacji typu N. (5a) Glikoproteiny są testowane pod kątem wiązania z przeciwciałami za pomocą interferometrii warstwy biologicznej (BLI) i izotermicznej kalorymetrii miareczkowania (ITC). Za pomocą ITC można również zmierzyć powinowactwo do małych ligandów. (5b) Próby krystalizacji glikoprotein z jednorodnymi glikanami typu N, takich jak białka wyekspresjonowane w HEK293S i deglikozylowane za pomocą Endo H. (6) W niektórych przypadkach konieczna jest mutacja miejsc glikozylacji typu N w celu uzyskania kryształów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig1large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rysunek 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig2.jpg" /> 
Rysunek 2. Projekt konstruktów DNA ektodomeny CD22 do ekspresji w komórkach ssaków.&#160;A) Przedstawienie plazmidu pHLsec wykorzystanego do przejściowej transfekcji konstruktów CD22 ECD. Miejsca AgeI i KpnI wykorzystane do klonowania zaznaczono czerwonymi ramkami. B) CD22 ECD zawiera siedem domen Ig (d1-d7) oraz 12 przewidywanych miejsc glikozylacji typu N (na niebiesko). Zaprojektowano cztery konstrukty na podstawie CD22 ECD. C) Gel agarozowy 1% przedstawiający amplikony PCR konstruktów CD22 ECD do klonowania w wektorze ekspresyjnym dla ssaków pHLsec. Pierwsza ścieżka zawiera marker DNA 1 kb. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig3.jpg" /> 
Rysunek 3. Ekspresja i oczyszczanie glikoprotein.&#160;A) Wpływ gęstości komórek na wydajność ekspresji. Ekspresja glikoprotein w małoscaleowej kulturze 25 mL zawiesiny komórek HEK293F transfekowanych przy trzech różnych gęstościach początkowych komórek (0,5 x 106 cells mL-1, 1,0 x 106 cells mL-1 oraz 1,5 x 106 cells mL-1). Ilościowe oznaczenie wykonano metodą densytometrii z SDS-PAGE na lewym panelu oraz ilościową BLI na prawym panelu. Wartości są reprezentatywne dla jednej preparacji glikoprotein. B) Chromatogram pierwszego etapu oczyszczania konstruktu CD2220-330, 5A z 600 mL supernatantu przy użyciu kolumny powinowactwa Ni-NTA. Glikoproteinę elukowano przy użyciu gradientu imidazolu (szara linia), gdzie 100% odpowiada buforowi elucyjnemu zawierającemu 500 mM imidazolu. Połączone frakcje zaznaczono pionowymi liniami. C) Chromatogram wykluczania sizerowego dla konstruktu CD2220-330,5A z wykorzystaniem wysokowydajnej kolumny do filtracji żelowej. Połączone frakcje z piku elucji zaznaczono pionowymi liniami. Wstawka: żel SDS-PAGE barwiony Coomassie, wykazujący czystość glikoproteiny. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig4.jpg" /> 
Rysunek 4. Namaczanie kryształów w ciężkich atomach. A) Stanowisko próbkowania do namaczania kryształów natywnych w związkach HA. Wszystkie niezbędne narzędzia są opisane. B) Kroki postępowania przy namaczaniu kryształów konstrukcji CD2220-330, 5A w związkach HA. Krok 1, otwórz studzienkę zawierającą kryształy i przenieś kryształy za pomocą pętliczki do kropli 0,2 µL na szkiełku nakrytym, zawierającej roztwór HA rozcieńczony w warunkach krystalizacji w taki sposób, aby końcowe stężenie HA wynosiło od 1-10 mM. Krok 2, zabezpiecz kroplę w płytce do krystalizacji i inkubuj kryształy ze związkiem HA przez różne okresy czasu. Krok 3, zamocuj namoczony kryształ w pętliczce i przeprowadź ponowne namaczanie (back-soaking) przez 30 s w trzech kolejnych kroplach 0,2 µl zawierających roztwór cieczy macierzystej uzupełnionej o 20% (v/v) glicerolu, naniesionych na szkiełko nakryte. Krok 4, zamroź błyskawicznie kryształ zamontowany w pętliczce ciekłym azotem i umieść go w uchwycie (puck) do transportu na linię wiązki synchrotronu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rycina 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig5.jpg" /> 
Rycina 5. Pomiary metodą interferometrii warstw biologicznych (BLI) i izotermicznej kalorymetrii miareczkowej (ITC). A) Reprezentatywny eksperyment BLI. Górny panel: przykład ustawienia płytki dla eksperymentu kinetycznego, gdzie oznaczone są następujące elementy: bufor kinetyczny 1x (B), ładowanie glikoproteiny z tagiem His6x (L), reprezentatywne stężenia Fab (500, 250, 125,&#160; 62,5&#160;nM), bufor regeneracyjny PBS + 500 mM (R) oraz neutralizujący bufor kinetyczny 1x (B). Każda studzienka zawiera 200 µL roztworu. Numer kroku dla eksperymentu kinetycznego jest wskazany na górze płytki. Środkowy panel: Reprezentatywne surowe dane eksperymentu BLI przeprowadzonego przy użyciu biosensorów Ni-NTA i płytki opisanej w górnym panelu. Numery kroków odpowiadają linii bazowej (1), ładowaniu glikoproteiny His6x (2), linii bazowej (3), asocjacji w szeregu rozcieńczeń Fab (4) oraz dysocjacji (5). Kroki regeneracji nie są przedstawione (Kroki 6-7). Dolny panel: Reprezentatywne przeanalizowane dane pokazujące surową asocjację i dysocjację (niebieska linia) wraz z odpowiadającym dopasowaniem 1:1 (czerwona linia). B)&#160;Górny panel: Reprezentatywne ustawienie płytki dla pojedynczego pomiaru ITC na zautomatyzowanym urządzeniu ITC z siedmioma eksperymentami w bloku 96-dołkowym o okrągłym dnie. Każdy eksperyment składa się z trzech studzienek. Pierwsza studzienka (czerwona) odpowiada próbce do komory pomiarowej (400 µL), druga studzienka (zielona) odpowiada próbce do strzykawki (120 µL). Trzecia studzienka pozostaje pusta; zmieszane próbki zostaną do niej zwrócone po zakończeniu eksperymentu. Eksperymenty 1, 2 i 7 są kontrolami bufor-do-bufora. Eksperymenty 3-5 reprezentują pomiary w trzech powtórzeniach z glikoproteiną (P) w komorze i Fab lub ligandem (L) w strzykawce. Eksperyment 6 stanowi kontrolę ciepła rozcieńczenia ligandu i powinien zostać odjęty od eksperymentów 3-5 podczas analizy danych. Dolny panel: Reprezentatywne surowe (góra) i przetworzone (dół) dane ITC pokazujące wiązanie Fab (epratuzumab) do CD22 ECD produkowanego w komórkach HEK293F. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Prezentujemy podejścia do biofizycznej i strukturalnej charakterystyki glikoprotein z fałdowaniem immunoglobulin za pomocą interferometrii biowarstwowej, izotermicznej kalorymetrii miareczkowej i krystalografii rentgenowskiej.

Charakterystyka glikoprotein z fałdem immunoglobulinowym za pomocą krystalografii rentgenowskiej i technik biofizycznych

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie glikoproteiny. Zapewnienie wglądu w funkcję białka, rolę glikanów sprzężonych z N oraz mechanizm i działanie antybiotyków ukierunkowanych na glikoproteinę. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją zastosować do dowolnej interesującej Cię glikoproteiny.Ułatwienie strukturalnej i biofizycznej charakterystyki szerokiego zakresu celów glikoproteinowych. Procedurę tę zademonstruje Hong Cui, koordynator projektu badawczego w naszym laboratorium. Aby rozpocząć, przygotuj i transfekuj komórki zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Zbierz komórki przez odwirowanie w temperaturze 6, 371 g i czterech stopniach Celsjusza przez 20 minut. Zachowaj supernatant, a następnie użyj filtra 0,22 mikrona, aby go przefiltrować. Załadować przefiltrowany supernatant w ilości czterech mililitrów na minutę do kolumny Ni-NTA w systemie chromatografii laboratoryjnej.Następnie przemyć kolumnę trzema do czterech objętości buforu do przemywania wodą. Rozcieńczyć oczyszczoną glikoproteinę z kolumny za pomocą gradientu buforu elucji, zbierając frakcje. Wyciągnąć frakcje zawierające wymykający się pik do odśrodkowego urządzenia filtracyjnego o nominalnej masie cząsteczkowej 10 kilodaltonów.Następnie zagęścić przez odwirowanie w temperaturze 4 000 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez 15 minut lub do momentu, gdy próbka osiągnie objętość 500 mikrolitrów. Wstrzyknąć skoncentrowaną glikoproteinę do pętli próbki o pojemności 500 mikrolitrów. Załaduj glikoproteinę do wstępnie zbalansowanej, wysokowydajnej kolumny wykluczającej rozmiar w systemie FPLC w temperaturze czterech stopni Celsjusza, zbierając frakcje.Następnie uruchom żel SDS-PAGE, aby zidentyfikować, które frakcje, które wymknęły się glikoproteinie, i wyciągnąć te, które zawierają. Za pomocą odśrodkowego urządzenia filtracyjnego o nominalnym limicie masy cząsteczkowej 10 kilodaltonów, zagęścić czysty deglikozylowany ECD w temperaturze 4 000 razy G i czterech stopniach Celsjusza, aż do uzyskania pożądanego stężenia. Po określeniu stężenia białka odwirować próbkę w temperaturze 12 000 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut, aby usunąć kurz i inne zanieczyszczenia.Następnie dodaj 80 mikrolitrów roztworu krystalizacyjnego z komercyjnego sita krystalizacyjnego do każdej studzienki w zbiorniku na 96-dołkowej płytce krystalizacyjnej. Użyj robota do krystalizacji, aby dozować krople białka do dołków płytki krystalizacyjnej. Używając całkowitej objętości kropli 200 nanolitrów w stosunku jeden do jednego oczyszczonego białka do roztworu krystalizacyjnego.Następnie uszczelnij płytkę taśmą. Przenieś zapieczętowaną płytkę do imagera płytowego w celu kontroli za pomocą światła widzialnego i ultrafioletowego. Zidentyfikuj warunki, które dają początkowe głowy kryształów glikoproteiny i zoptymalizuj te kryształy zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Krioprotekcję kryształów należy zanurzyć w roztworze ługu macierzystego uzupełnionego 20% glicerolem. Następnie zamontuj kryształy w CryoLoops. Używając ciekłego azotu, błyskawicznie zamroź zamontowane kryształy przed zebraniem danych.Po wytworzeniu dobrze dyfrakcyjnych kryształów na 24-dołkowej płytce krystalizacyjnej, należy przygotować roztwór podstawowy 50-milimolowego liganda i 20-milimolowego Trisa o pH 9,0 ze 150-milimolowym chlorkiem sodu. Dodać różne stężenia tego roztworu liganda do wcześniej przygotowanej kropli zawierającej kryształy ECD. Zapieczętuj kroplę na czas inkubacji wynoszący od pięciu minut do pięciu dni.Za pomocą mikroskopu świetlnego wizualnie śledź kryształy, aby zidentyfikować wszelkie możliwe zmiany w morfologii. Po inkubacji zamontuj kryształy za pomocą CryoLoops i zabezpiecz je krioprotekcją w roztworze ługu macierzystego uzupełnionym 20% glicerolem. Aby rozpocząć interferometrię biowarstwową, przygotuj 50 milimetrów bufora 1X Kinetics z bufora 10X Kinetics zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Dodaj 200 mikrolitrów tego buforu do płytki do wstępnego zwilżania. Przenieś sześć biosensorów Ni-NTA na płytkę i pozwól im uwodnić się w buforze przez 10 minut. Następnie rozcieńczyć ECD oznaczony Hisem w jednym mililitrze buforu 1X Kinetics w końcowym stężeniu 25 nanogramów na mikrolitr.I przygotować seryjne rozcieńczenia oczyszczonego FAB. Teraz umieść odczynniki w 96-dołkowej mikropłytce, jak pokazano tutaj. Gdzie B oznacza 1X Bufor Kinetyczny, L oznacza obciążenie glikoproteiną znakowaną His, wpisy liczbowe reprezentują rozcieńczone stężenia FAB, a R oznacza bufor regeneracyjny.Przenieś uwodnione biosensory do studzienek zawierających 1X Bufor Kinetyczny na 60 sekund, aby je unieruchomić. Następnie załaduj glikoproteinę w stężeniu 25 nanogramów na mikrolitr przez 240 sekund przy 1 000 obr./min. Umieść biosensory z powrotem w studzienkach zawierających 1X Kinetics Buffer na 60 sekund dla drugiej linii bazowej.Przenieś czujniki do studzienek zawierających seryjne rozcieńczenia FAB na 180 sekund. Po tej fazie asocjacji przenieś biosensory z powrotem do bufora 1X Kinetics Buffer na 180-sekundowy etap dysocjacji. Następnie otwórz oprogramowanie do analizy.Na karcie pierwszej zaimportuj, a następnie wybierz dane. Na karcie drugiej, krok pierwszy wyboru danych, wybierz wybór czujnika. Podświetl źródła referencyjne, a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy, aby ustawić źródło odniesienia.W kroku drugim, odejmowanie, wybierz studnie referencyjne. Następnie w kroku trzecim wyrównaj oś Y, wybierz linię bazową i ustaw zakres czasu od 0,1 sekundy do 59,8 sekundy. W kroku czwartym wybierz korekcję międzyetapową i wyrównaj do dysocjacji.Następnie w kroku piątym przetworzyć filtrowanie Savitzky-Golay i kliknąć przycisk Przetwarzaj dane. Brama do zakładki trzeciej. W kroku drugim analizuj za pomocą modelu jeden do jednego, wybierz asocjację i dysocjację, wybierz globalne dopasowanie i pogrupuj według koloru.Kliknij krzywe prawym przyciskiem myszy, kliknij ustaw kolor i ustaw wszystkie krzywe na żądane kolory. Następnie wybierz dopasuj krzywe. Jeśli dane są dobrze dopasowane, wyeksportuj wynik, klikając przycisk Zapisz raport.Powtórz eksperyment dla wszystkich pożądanych warunków. W tym badaniu kilka konstruktów domeny zewnątrzkomórkowej CD22 zostało z powodzeniem sklonowanych do wektora ekspresyjnego pHL-sec. Konstrukty te ulegają następnie nadekspresji w liniach komórkowych HEK293-F i HEK293-S ssaków.Podczas gdy kultury zawierające około miliona i półtora miliona komórek na mililitr wyrażały bardzo podobne poziomy glikoprotein. Kultury składające się tylko z pół miliona komórek na mililitr wyrażały zauważalnie mniej. Następnie zbiera się kultury, a glikoproteinę ECD izoluje się za pomocą chromatografii powinowactwa i wykluczania wielkości w celu oczyszczenia wszystkich konstruktów do jednorodności wielkości.Uzyskanie próbki o wysokiej czystości do krystalizacji i badań biofizycznych. Zgodnie z tymi procedurami można przeprowadzić inne metody, takie jak mikroskopia elektronowa pojedynczych cząstek, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące trójwymiarowej struktury domeny zewnątrzkomórkowej lub kompleksów białkowych o pełnej długości. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyrażać, oczyszczać oraz strukturalnie i biofizycznie charakteryzować glikoproteiny, ich ligandy i przeciwciała celujące.

characterization-glycoproteins-with-immunoglobulin-fold-x-ray

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Struktura trójwymiarowa cząsteczki pozwala na unikalne zrozumienie sposobu jej funkcjonowania. Główną metodą wyznaczania struktury w rozdzielczości bliskiej atomowej jest krystalografia rentgenowska. W niniejszym materiale prezentujemy aktualne metody otrzymywania kryształów trójwymiarowych dowolnej makrocząsteczki, które nadają się do wyznaczenia struktury za pomocą krystalografii rentgenowskiej.

Krystalizacja białek do krystalografii rentgenowskiej

Ponad połowa białek to małe białka (masa cząsteczkowa &lt;200 kDa), które stanowią wyzwanie zarówno dla obrazowania mikroskopem elektronowym, jak i dla trójwymiarowych rekonstrukcji. Zoptymalizowane barwienie negatywowe to solidny i wysokoprzepustowy protokół umożliwiający uzyskanie obrazów o wysokim kontraście i stosunkowo wysokiej rozdzielczości (~1 nm) małych asymetrycznych białek lub kompleksów w różnych warunkach fizjologicznych.

Zoptymalizowane barwienie ujemne: wysokoprzepustowy protokół do badania małej i asymetrycznej struktury białka za pomocą mikroskopii elektronowej

β-beczkowate białka błony zewnętrznej (OMP) pełnią wiele funkcji w zewnętrznych błonach bakterii Gram-ujemnych, mitochondriów i chloroplastów. W tym miejscu mamy nadzieję złagodzić znane wąskie gardło w badaniach strukturalnych poprzez przedstawienie protokołów produkcji β-beczkowych OMP w ilościach wystarczających do określenia struktury za pomocą krystalografii rentgenowskiej lub spektroskopii NMR.

Od konstruktów do kryształów – w kierunku określania struktury β-baryłkowych białek błony zewnętrznej

Opisujemy strukturę obejmującą prostą analizę biochemiczną i obliczeniową, aby kierować charakterystyką i krystalizacją dużych domen o zwiniętych zwojach. Struktura ta może być dostosowana do białek globularnych lub rozszerzona w celu uwzględnienia różnych technik wysokoprzepustowych.

Połączenie mokrych i suchych technik laboratoryjnych w celu kierowania krystalizacją dużych zwiniętych cewek białkowych

Tutaj opisujemy metody, które powszechnie stosujemy w laboratorium, aby określić, jak natura interakcji między receptorem limfocytów T a antygenami nowotworowymi, prezentowana przez ludzkie antygeny leukocytów, reguluje funkcjonalność komórek T; metody te obejmują produkcję białek, krystalografię rentgenowską, biofizykę i eksperymenty z funkcjonalnymi komórkami T.

Wykorzystanie krystalografii rentgenowskiej, biofizyki i testów funkcjonalnych do określenia mechanizmów rządzących rozpoznawaniem antygenów nowotworowych przez receptory komórek T

Przedstawiono uproszczony protokół do przeprowadzenia obszernej charakterystyki biochemicznej i strukturalnej białka wiążącego substrat węglowodanowy ze Streptococcus pneumoniae.

Charakterystyka biochemiczna i strukturalna białka wiążącego substrat transportu węglowodanów SP0092

Tutaj prezentujemy, jak można wykorzystać rozpraszanie promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem (SAXS) do uzyskania informacji o obwiedniach o niskiej rozdzielczości reprezentujących struktury makromolekularne. W połączeniu z technikami strukturalnymi o wysokiej rozdzielczości, takimi jak krystalografia rentgenowska i magnetyczny rezonans jądrowy, SAXS może dostarczyć szczegółowych informacji na temat wielodomenowych białek i kompleksów makromolekularnych w roztworze.

Badania strukturalne makrocząsteczek w roztworze z wykorzystaniem rozpraszania promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem

Ten artykuł szczegółowo opisuje protokół wytwarzania mikroprzepływowych chipów opracowanych do krystalizacji białek na chipie metodą dializy i eksperymentów dyfrakcji rentgenowskiej in situ. Proces mikroprodukcji umożliwia zintegrowanie półprzepuszczalnej membrany do dializy z regenerowanej celulozy z dowolnym odcięciem masy cząsteczkowej między dwiema warstwami chipa.

Krystalizacja białek na chipie za pomocą mikrodializy do badań dyfrakcji rentgenowskiej in situ

Ten protokół oparty na NMR bada słabe interakcje białko-glikan przy użyciu cyjanowiryny-N i D-mannozy. Łącząc metody wykrywania ligandów i białek, mapuje miejsca wiązania, wykrywa efekty allosteryczne i identyfikuje kompleksy spotkań. Podejście to obejmuje przygotowanie próbek i analizę danych, oferując strukturalne i dynamiczne spostrzeżenia cenne dla mechanizmów diagnostyki i rozpoznawania specyficznych dla glikanów.

Badanie interakcji białko-glikan: postępy w magnetycznym rezonansie jądrowym

Opisujemy procedury przygotowania i dostarczania mikrokryształów białek błonowych w lipidowej fazie sześciennej do krystalografii szeregowej w laserach rentgenowskich na swobodnych elektronach i źródłach synchrotronowych. Protokoły te mogą być również stosowane do wprowadzania i dostarczania rozpuszczalnych mikrokryształów białek, co prowadzi do znacznego zmniejszenia zużycia próbki w porównaniu z wstrzykiwaniem cieczy.

Otrzymywanie i dostarczanie mikrokryształów białkowych w lipidowej fazie sześciennej do seryjnej krystalografii femtosekundowej

Poznaj metody charakteryzacji glikoprotein z fałdem immunoglobulinowym przy użyciu krystalografii rentgenowskiej i technik biofizycznych. Dowiedz się, jak analizować interakcje białek z ligandami w czasie rzeczywistym.

Charakterystyka glikoprotein z fałdem immunoglobulinowym za pomocą krystalografii rentgenowskiej i technik biofizycznych

Przeglądaj więcej filmów