Charakterystyka glikoprotein z fałdem immunoglobulinowym za pomocą krystalografii rentgenowskiej i technik biofizycznych

Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie glikoproteiny. Zapewnienie wglądu w funkcję białka, rolę glikanów sprzężonych z N oraz mechanizm i działanie antybiotyków ukierunkowanych na glikoproteinę. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją zastosować do dowolnej interesującej Cię glikoproteiny.

Ułatwienie strukturalnej i biofizycznej charakterystyki szerokiego zakresu celów glikoproteinowych. Procedurę tę zademonstruje Hong Cui, koordynator projektu badawczego w naszym laboratorium. Aby rozpocząć, przygotuj i transfekuj komórki zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Zbierz komórki przez odwirowanie w temperaturze 6, 371 g i czterech stopniach Celsjusza przez 20 minut. Zachowaj supernatant, a następnie użyj filtra 0,22 mikrona, aby go przefiltrować. Załadować przefiltrowany supernatant w ilości czterech mililitrów na minutę do kolumny Ni-NTA w systemie chromatografii laboratoryjnej.

Następnie przemyć kolumnę trzema do czterech objętości buforu do przemywania wodą. Rozcieńczyć oczyszczoną glikoproteinę z kolumny za pomocą gradientu buforu elucji, zbierając frakcje. Wyciągnąć frakcje zawierające wymykający się pik do odśrodkowego urządzenia filtracyjnego o nominalnej masie cząsteczkowej 10 kilodaltonów.

Następnie zagęścić przez odwirowanie w temperaturze 4 000 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez 15 minut lub do momentu, gdy próbka osiągnie objętość 500 mikrolitrów. Wstrzyknąć skoncentrowaną glikoproteinę do pętli próbki o pojemności 500 mikrolitrów. Załaduj glikoproteinę do wstępnie zbalansowanej, wysokowydajnej kolumny wykluczającej rozmiar w systemie FPLC w temperaturze czterech stopni Celsjusza, zbierając frakcje.

Następnie uruchom żel SDS-PAGE, aby zidentyfikować, które frakcje, które wymknęły się glikoproteinie, i wyciągnąć te, które zawierają. Za pomocą odśrodkowego urządzenia filtracyjnego o nominalnym limicie masy cząsteczkowej 10 kilodaltonów, zagęścić czysty deglikozylowany ECD w temperaturze 4 000 razy G i czterech stopniach Celsjusza, aż do uzyskania pożądanego stężenia. Po określeniu stężenia białka odwirować próbkę w temperaturze 12 000 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut, aby usunąć kurz i inne zanieczyszczenia.

Następnie dodaj 80 mikrolitrów roztworu krystalizacyjnego z komercyjnego sita krystalizacyjnego do każdej studzienki w zbiorniku na 96-dołkowej płytce krystalizacyjnej. Użyj robota do krystalizacji, aby dozować krople białka do dołków płytki krystalizacyjnej. Używając całkowitej objętości kropli 200 nanolitrów w stosunku jeden do jednego oczyszczonego białka do roztworu krystalizacyjnego.

Następnie uszczelnij płytkę taśmą. Przenieś zapieczętowaną płytkę do imagera płytowego w celu kontroli za pomocą światła widzialnego i ultrafioletowego. Zidentyfikuj warunki, które dają początkowe głowy kryształów glikoproteiny i zoptymalizuj te kryształy zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Krioprotekcję kryształów należy zanurzyć w roztworze ługu macierzystego uzupełnionego 20% glicerolem. Następnie zamontuj kryształy w CryoLoops. Używając ciekłego azotu, błyskawicznie zamroź zamontowane kryształy przed zebraniem danych.

Po wytworzeniu dobrze dyfrakcyjnych kryształów na 24-dołkowej płytce krystalizacyjnej, należy przygotować roztwór podstawowy 50-milimolowego liganda i 20-milimolowego Trisa o pH 9,0 ze 150-milimolowym chlorkiem sodu. Dodać różne stężenia tego roztworu liganda do wcześniej przygotowanej kropli zawierającej kryształy ECD. Zapieczętuj kroplę na czas inkubacji wynoszący od pięciu minut do pięciu dni.

Za pomocą mikroskopu świetlnego wizualnie śledź kryształy, aby zidentyfikować wszelkie możliwe zmiany w morfologii. Po inkubacji zamontuj kryształy za pomocą CryoLoops i zabezpiecz je krioprotekcją w roztworze ługu macierzystego uzupełnionym 20% glicerolem. Aby rozpocząć interferometrię biowarstwową, przygotuj 50 milimetrów bufora 1X Kinetics z bufora 10X Kinetics zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Dodaj 200 mikrolitrów tego buforu do płytki do wstępnego zwilżania. Przenieś sześć biosensorów Ni-NTA na płytkę i pozwól im uwodnić się w buforze przez 10 minut. Następnie rozcieńczyć ECD oznaczony Hisem w jednym mililitrze buforu 1X Kinetics w końcowym stężeniu 25 nanogramów na mikrolitr.

I przygotować seryjne rozcieńczenia oczyszczonego FAB. Teraz umieść odczynniki w 96-dołkowej mikropłytce, jak pokazano tutaj. Gdzie B oznacza 1X Bufor Kinetyczny, L oznacza obciążenie glikoproteiną znakowaną His, wpisy liczbowe reprezentują rozcieńczone stężenia FAB, a R oznacza bufor regeneracyjny.

Przenieś uwodnione biosensory do studzienek zawierających 1X Bufor Kinetyczny na 60 sekund, aby je unieruchomić. Następnie załaduj glikoproteinę w stężeniu 25 nanogramów na mikrolitr przez 240 sekund przy 1 000 obr./min. Umieść biosensory z powrotem w studzienkach zawierających 1X Kinetics Buffer na 60 sekund dla drugiej linii bazowej.

Przenieś czujniki do studzienek zawierających seryjne rozcieńczenia FAB na 180 sekund. Po tej fazie asocjacji przenieś biosensory z powrotem do bufora 1X Kinetics Buffer na 180-sekundowy etap dysocjacji. Następnie otwórz oprogramowanie do analizy.

Na karcie pierwszej zaimportuj, a następnie wybierz dane. Na karcie drugiej, krok pierwszy wyboru danych, wybierz wybór czujnika. Podświetl źródła referencyjne, a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy, aby ustawić źródło odniesienia.

W kroku drugim, odejmowanie, wybierz studnie referencyjne. Następnie w kroku trzecim wyrównaj oś Y, wybierz linię bazową i ustaw zakres czasu od 0,1 sekundy do 59,8 sekundy. W kroku czwartym wybierz korekcję międzyetapową i wyrównaj do dysocjacji.

Następnie w kroku piątym przetworzyć filtrowanie Savitzky-Golay i kliknąć przycisk Przetwarzaj dane. Brama do zakładki trzeciej. W kroku drugim analizuj za pomocą modelu jeden do jednego, wybierz asocjację i dysocjację, wybierz globalne dopasowanie i pogrupuj według koloru.

Kliknij krzywe prawym przyciskiem myszy, kliknij ustaw kolor i ustaw wszystkie krzywe na żądane kolory. Następnie wybierz dopasuj krzywe. Jeśli dane są dobrze dopasowane, wyeksportuj wynik, klikając przycisk Zapisz raport.

Powtórz eksperyment dla wszystkich pożądanych warunków. W tym badaniu kilka konstruktów domeny zewnątrzkomórkowej CD22 zostało z powodzeniem sklonowanych do wektora ekspresyjnego pHL-sec. Konstrukty te ulegają następnie nadekspresji w liniach komórkowych HEK293-F i HEK293-S ssaków.

Podczas gdy kultury zawierające około miliona i półtora miliona komórek na mililitr wyrażały bardzo podobne poziomy glikoprotein. Kultury składające się tylko z pół miliona komórek na mililitr wyrażały zauważalnie mniej. Następnie zbiera się kultury, a glikoproteinę ECD izoluje się za pomocą chromatografii powinowactwa i wykluczania wielkości w celu oczyszczenia wszystkich konstruktów do jednorodności wielkości.

Uzyskanie próbki o wysokiej czystości do krystalizacji i badań biofizycznych. Zgodnie z tymi procedurami można przeprowadzić inne metody, takie jak mikroskopia elektronowa pojedynczych cząstek, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące trójwymiarowej struktury domeny zewnątrzkomórkowej lub kompleksów białkowych o pełnej długości. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyrażać, oczyszczać oraz strukturalnie i biofizycznie charakteryzować glikoproteiny, ich ligandy i przeciwciała celujące.