Name: Pomiar poziomu wysiłku fizycznego u Drosophila melanogaster za pomocą Rotacyjnego Systemu Kwantyfikacji Wysiłkowej (REQS) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 53 s
Description: Poznaj metodę pomiaru aktywności Drosophila melanogaster podczas ćwiczeń rotacyjnych za pomocą systemu REQS. Protokół umożliwia badanie wpływu wieku i genetyki na odpowiedź wysiłkową w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca została wsparta przez Nagrodę Numer P30DK056336 od National Institute Of Diabetes And Digestive And Kidney Diseases poprzez pilotażowy grant z Centrum Badań nad Żywieniem i Otyłością na Uniwersytecie Alabama w Birmingham dla NCR.

REQS składa się z jednostki Monitora Aktywności Drosophila (informacje o źródłach proszę znaleźć w Tabeli Materiałów) zamontowanej na obrotowym ramieniu, które jest kontrolowane przez jednostkę motoryczną (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Monitor aktywności określa, jak często w danym przedziale czasu układ wiązek laserowych rozcinających środek probówki testowej jest przerywany. Szczegółowe rysunki i szczegółową charakterystykę można znaleźć w naszej poprzedniej publikacji9. Podczas gdy nasz system korzysta z jednostki LAM25H, REQS można zmodyfikować, aby dostosować się również do innych jednostek monitorujących aktywność Drosophila.
1. Testowanie konfiguracji REQS
<ol>
	<li>Test obciążeniowy wlatuje do szklanych probówek z próbkami poprzez znieczulenie zwierząt za pomocą CO2 lub innej wybranej metody obchodzenia się, przeniesienie ich do pustych probówek i zamknięcie probówek.</li>
	<li>Włóż zaślepione szklane probówki na próbki do szczelin monitora aktywności. Zabezpiecz rurki za pomocą gumowych pierścieni uszczelniających o przekroju okrągłym (o rozmiarze 17-18) i/lub gumowych opasek po obu stronach urządzenia, aby zapewnić, że rurki nie poruszają się podczas obracania:
	<ol>
		<li>Nałóż jeden O-ring na probówkę z próbką i umieść O-ring blisko środka probówki. Włóż probówkę z próbką do szczeliny monitora aktywności od przodu i wyśrodkuj ją.</li>
		<li>W razie potrzeby przesuń O-ring i upewnij się, że po wyśrodkowaniu rurki z próbką O-ring jest wsunięty jak najbliżej jednostki monitorującej aktywność. Zamocuj probówkę z próbką na miejscu, wsuwając drugi O-ring na szklaną rurkę od tyłu, ponownie przesuwając O-ring jak najbliżej jednostki monitorującej aktywność.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zainicjuj obracanie REQS, przestawiając przełącznik zasilania z przodu urządzenia. Dostosuj prędkość obrotową za pomocą pokrętła z przodu urządzenia do żądanej prędkości (4 obr./min (obroty na minutę) w tym example). 
	UWAGA: Prędkość obrotowa w tym przykładzie została wybrana tak, aby pasowała do wcześniej opublikowanego badania7. Ponieważ różne prędkości obrotowe będą skutkować różnymi poziomami aktywności zwierząt, podczas rozpoczynania nowego badania może być konieczna optymalizacja prędkości obrotowej dla konkretnego układu doświadczalnego (genotyp, długość wysiłku itp. 
	UWAGA: Ważne jest, aby upewnić się, że rurki są prawidłowo ustawione, tak aby nie ciągnęły się wzdłuż dolnej części jednostki REQS podczas obracania.</li>
	<li>Przetestuj połączenie z systemem gromadzenia danych dostarczonym z modułem Drosophila Activity Monitor, otwierając oprogramowanie DAMSystem308 i upewniając się, że kontrolka połączenia pozostaje zielona przez kilka obrotów. Oprogramowanie rozpocznie zapisywanie danych w pliku tekstowym "monitorX" (X to numer jednostki, jeśli używanych jest wiele monitorów) natychmiast po zainicjowaniu. Częstotliwość nagrywania można dostosować w zakładce "Preferencje"; Zazwyczaj nagrywamy w odstępach 5-minutowych.</li>
	<li>Sprawdź plik tekstowy wygenerowany przez oprogramowanie DAMSystem308, aby upewnić się, że połączenie danych działa poprawnie. Problemy z połączeniem skutkują wycięciami, punktami czasowymi, w których rejestrowana jest aktywność 0 dla wszystkich pozycji w REQS (zob. wyniki reprezentatywne i tabela 2). Jeśli wystąpią przerwy, wyreguluj połączenia danych prowadzące do obracającego się gniazda telefonicznego, ponieważ podczas obracania połączenie to może się poluzować lub skręcić. Uważamy, że stabilizacja połączenia za pomocą taśmy pomaga zapobiec temu problemowi.</li>
</ol>
2. Przygotowanie zwierząt
UWAGA: Wszystkie zwierzęta były hodowane i testowane w standardowych warunkach w inkubatorze (25 °C, 60-70% wilgotności, 12 godzin cykl jasny/ciemny) na melasie/mące kukurydzianej10.
<ol>
	<li>Na dwa tygodnie przed planowanym eksperymentem należy ustawić fiolki o kontrolowanym zagęszczeniu zwierząt, z których będą zbierane eksperymentalne muchy; zazwyczaj ustawiamy fiolki z 7 samcami i 10 samicami. Przy zdrowym bulionie, z jednej fiolki, można zebrać około 15 dziewiczych samców i 15 samic w ciągu 4 dni. Dostosuj liczbę ustawionych fiolek w oparciu o liczbę zwierząt potrzebnych do testu; Typowy test w naszym laboratorium obejmuje 10 zestawów po 10 dziewiczych samców i samic na genotyp (100 samców i 100 samic). 
	UWAGA: Muchy inne niż pierwotne mogą być używane w zależności od konkretnego pytania eksperymentalnego. W przypadku prowadzenia długoterminowych eksperymentów na zwierzętach innych niż pierwotne, pełzające larwy mogą zakłócać dokładne monitorowanie aktywności.</li>
	<li>Usunąć muchy rodzicielskie tydzień po ustawieniu fiolek.</li>
	<li>Począwszy od 10 dnia po umieszczeniu fiolek, należy zbierać dziewicze muchy z fiolek i przechowywać je oddzielnie według płci.</li>
	<li>Zbierz wystarczającą ilość zwierząt do eksperymentu i postarzaj je w razie potrzeby, w tym przykładzie 3 dni. 
	UWAGA: Zazwyczaj znieczulamy zwierzęta za pomocą CO2 do pracy. Wiadomo, że CO2 wpływa na poziom aktywności zwierząt przez dłuższy czas po zastosowaniu środka (na przykład patrz Bartholomew et al. 201511). Jeśli efekt CO2 zakłóca planowane dalsze testy lub analizy, należy zastosować inną metodę znieczulenia, taką jak znieczulenie lodem.</li>
</ol>
3. Zbieranie danych za pomocą REQS
<ol>
	<li>Znieczulić zwierzęta, które mają być wykorzystane do badania ilościowego wysiłku fizycznego, za pomocą CO2 lub innej metody znieczulenia. W razie potrzeby podziel je na grupy i załaduj grupy zwierząt do pustych szklanych probówek monitora aktywności; W tym przykładzie 10 zwierząt w tym samym wieku jest ładowanych do szklanej probówki, z 10 powtórzeniami dla każdego typu zwierzęcia (płci/genotypu). Upewnij się, że zwróciłeś uwagę, jaki typ zwierzęcia jest załadowany do każdej tuby. 
	UWAGA: W przypadku dłuższych eksperymentów do probówek z próbkami można dodać jedzenie. W takim przypadku ważne jest, aby żywność była bezpieczna i nie wysunęła się podczas obracania.</li>
	<li>Załaduj szklane probówki do jednostki REQS i zabezpiecz je gumowymi pierścieniami uszczelniającymi o przekroju okrągłym. W przypadku pracy z więcej niż jedną płcią/genotypem, zastosowanie randomizowanego projektu blokowego lub randomizacji pozycji zwierząt w REQS wyeliminuje wszelkie potencjalne efekty pozycji. Randomizację można osiągnąć, przypisując każdej fiolce liczbę losową, na przykład z internetowego generatora liczb losowych (np. https://www.randomizer.org/ ) lub w arkuszu kalkulacyjnym, a następnie porządkując fiolki na podstawie liczby losowej.</li>
	<li>Umieść REQS w inkubatorze, aby zapewnić stałą temperaturę, wilgotność i warunki oświetleniowe. Upewnij się, że zarówno danych, jak i zasilające są prawidłowo podłączone.</li>
	<li>Pozwól zwierzętom dojść do siebie po znieczuleniu i zaaklimatyzować się w nowym środowisku przez 1 godzinę.</li>
	<li>Rozpocznij eksperyment od zainicjowania rotacji REQS z żądaną prędkością. 
	UWAGA: Inną opcją jest najpierw zebranie danych o podstawowej aktywności zwierząt przed rozpoczęciem rotacji, a następnie zarejestrowanie poziomów aktywności w odpowiedzi na stymulację rotacyjną.</li>
	<li>Rozpocznij zbieranie danych, otwierając oprogramowanie DAMsystem308 (samo otwarcie oprogramowania inicjuje zbieranie danych). Dane są zapisywane do pliku tekstowego w ustalonym odstępie czasu (w tym przypadku 5 min); w razie potrzeby zmień ustawienia interwału w zakładce "Preferencje" (patrz krok 1.4).</li>
	<li>Aby upewnić się, że dane zostały pomyślnie przesłane do komputera, po upływie jednego lub dwóch odstępów czasu otwórz plik tekstowy wygenerowany przez oprogramowanie DAMsystem308 i potwierdź, że dane są zapisywane do pliku. Zamknij i ponownie otwórz ten plik, aby wyświetlić dane z dodatkowych punktów czasowych. Zbieraj dane przez żądany okres czasu; W tym przykładzie 2 H. 
	UWAGA: Nie otwieraj inkubatora w okresie testu, ponieważ zwierzęta są bardzo wrażliwe na wszelkie zakłócenia i prawdopodobnie zareagują zwiększoną aktywnością.</li>
	<li>Po zakończeniu testu ćwiczenia zakończ zbieranie danych, zamykając oprogramowanie DAMsystem308, a następnie wyłącz REQS. Wyjmij zwierzęta ze szklanych probówek i wyczyść probówki. Zwierzęta mogą być przenoszone z powrotem do fiolek z karmą, jeśli konieczne jest powtórzenie pomiarów w różnym wieku. 
	UWAGA: Jeśli podczas ćwiczeń dojdzie do zgonu, należy to odnotować, ponieważ obecność martwych much może mieć wpływ na liczbę aktywności. Z naszego doświadczenia z liniami muchowymi DGRP212,13, ćwiczenia przy 4 obr./min przez 2 godziny nie spowodowały żadnych zgonów, ale słabsze szczepy mogą reagować inaczej.</li>
</ol>
4. Analiza danych
<ol>
	<li>Otwórz plik .txt oznaczony jako "Monitor1" utworzony przez oprogramowanie DAMSystem308.</li>
	<li>Sprawdź plik danych pod kątem problemów, które mogły wystąpić podczas pozyskiwania danych (pominięte punkty czasowe itp.; Tabela 1). W razie potrzeby ocenzuruj plik, usuwając punkty danych na początku i na końcu nagrania.</li>
	<li>Korzystając z wybranego przez siebie oprogramowania statystycznego (np. R), analizuj zebrane dane. Generuj statystyki opisowe i przeprowadzaj analizę wariancji (ANOVA) w celu zbadania efektów, takich jak płeć i genotyp, jeśli dane mają rozkład normalny. Jeśli dane nie mają rozkładu normalnego, należy użyć metod nieparametrycznych, takich jak testy Kruskala-Wallisa, aby porównać grupy. Wymagane szczegółowe analizy będą zależały od konkretnego zagadnienia naukowego i projektu doświadczalnego.</li>
</ol>

<ol><li>Rieder, L. E., Larschan, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wisdom+from+the+fly%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Wisdom from the fly.</a> Trends Genet. 30 (11), 479-481 (2014).</li>
<li>Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+tools+and+assays+for+the+study+of+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Drosophila tools and assays for the study of human diseases.</a> Dis Model Mech. 9 (3), 235-244 (2016).</li>
<li>Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+on+the+fly%3A+A+primer+on+the+Drosophila+Model+System%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetics on the fly: A primer on the Drosophila Model System.</a> Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).</li>
<li>Piazza, N., Gosangi, B., Devilla, S., Arking, R., Wessells, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise-training+in+young+Drosophila+melanogaster+reduces+age-related+decline+in+mobility+and+cardiac+performance%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Exercise-training in young Drosophila melanogaster reduces age-related decline in mobility and cardiac performance.</a> PLoS One. 4 (6), e5886(2009).</li>
<li>Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+iterative+negative+geotaxis+%28RING%29%3A+a+new+method+for+assessing+age-related+locomotor+decline+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila.</a> Exp Gerontol. 40 (5), 386-395 (2005).</li>
<li>Tinkerhess, M. J., Ginzberg, S., Piazza, N., Wessells, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endurance+training+protocol+and+longitudinal+performance+assays+for+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Endurance training protocol and longitudinal performance assays for Drosophila melanogaster.</a> J Vis Exp. (61), (2012).</li>
<li>Mendez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TreadWheel%3A+A+novel+apparatus+to+measure+genetic+variation+in+response+to+gently+induced+exercise+for+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The TreadWheel: A novel apparatus to measure genetic variation in response to gently induced exercise for Drosophila.</a> PLoS One. 11 (10), e0164706(2016).</li>
<li>Katzenberger, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+model+of+closed+head+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A Drosophila model of closed head traumatic brain injury.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (44), E4152-E4159 (2013).</li>
<li>Watanabe, L. P., Riddle, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+Rotating+Exercise+Quantification+System+%28REQS%29%2C+a+novel+Drosophila+exercise+quantification+apparatus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization of the Rotating Exercise Quantification System (REQS), a novel Drosophila exercise quantification apparatus.</a> PLoS One. 12 (10), e0185090(2017).</li>
<li>Reed, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotype-by-diet+interactions+drive+metabolic+phenotype+variation+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genotype-by-diet interactions drive metabolic phenotype variation in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 185 (3), 1009-1019 (2010).</li>
<li>Bartholomew, N. R., Burdett, J. M., VandenBrooks, J. M., Quinlan, M. C., Call, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+climbing+and+flight+behaviour+in+Drosophila+melanogaster+following+carbon+dioxide+anaesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Impaired climbing and flight behaviour in Drosophila melanogaster following carbon dioxide anaesthesia.</a> Sci Rep. 5, 15298(2015).</li>
<li>Huang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+variation+in+genome+architecture+among+205+Drosophila+melanogaster+Genetic+Reference+Panel+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Natural variation in genome architecture among 205 Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel lines.</a> Genome Res. 24 (7), 1193-1208 (2014).</li>
<li>Mackay, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+melanogaster+Genetic+Reference+Panel%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel.</a> Nature. 482 (7384), 173-178 (2012).</li>
<li>Berlandi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swing+Boat%3A+Inducing+and+recording+locomotor+activity+in+a+Drosophila+melanogaster+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Behav+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Swing Boat: Inducing and recording locomotor activity in a Drosophila melanogaster model of Alzheimer's disease.</a> Front Behav Neurosci. 11, 159(2017).</li>
<li>Faville, R., Kottler, B., Goodhill, G. J., Shaw, P. J., van Swinderen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+deeply+does+your+mutant+sleep%3F+Probing+arousal+to+better+understand+sleep+defects+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">How deeply does your mutant sleep? Probing arousal to better understand sleep defects in Drosophila.</a> Sci Rep. 5, 8454(2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Jak pokazują reprezentatywne wyniki, REQS jest w stanie dokładnie zmierzyć aktywność ćwiczącą Drosophila. REQS jest elastyczny i pozwala naukowcom na zajęcie się różnymi pytaniami badawczymi związanymi z biologią ćwiczeń lub interwencjami ruchowymi. W protokole należy zwrócić uwagę na dwa kluczowe kroki. Po pierwsze, konieczne jest przetestowanie konfiguracji REQS, aby upewnić się, że transmisja danych z REQS do DAMSystem308 działa poprawnie. Jeśli nie zostanie prawidłowo skonfigurowany, kabel do transmisji danych może s...

Ostatnio naukowcy zaczęli używać muszki owocowej Drosophila melanogaster do badania biologii ćwiczeń. D. melanogaster jest modelem genetycznym od ponad 100 lat1,2. Jednak badania nad Drosophila przyczyniły się nie tylko do genetyki, ale także do wielu innych dyscyplin, w tym neurobiologii, biologii behawioralnej i fizjologii3. W 2009 roku opisano Power Tower, pierwszą maszynę do ćwiczeń dla Drosophila4. Wieża Energetyczna wykorzystuje negatywną reakcję zwierząt na geotaksję. W przypadku zakłóceń Drosophila ma tendencję do przemieszczania się na szczyt swojego wybiegu. Ta odpowiedź jest dobrze ugruntowana i stanowi podstawę popularnego testu "RING" (Rapid Iterative Negative Geotaxis5), który służy do oceny zdolności wspinaczkowej i/lub sprawności fizycznej u Drosophila. Power Tower wykorzystuje mechaniczne ramię połączone z jednostką silnikową do wielokrotnego podnoszenia grupy zwierząt w ich zagrodach o kilka cali i upuszczania ich z powrotem na ziemię, aby wywołać negatywną reakcję geotaksji (Tinkerhess et al. 20126 dostarczają film ilustrujący użycie Power Tower). Długotrwałe leczenie na Power Tower zwiększa zatem ilość aktywności fizycznej (bieganie lub latanie) wykonywanej przez zwierzęta w porównaniu z nieleczonymi zwierzętami kontrolnymi i z czasem prowadzi do poprawy wydajności w teście RING dla sprawności fizycznej4. W związku z tym praca ta wykazała możliwość wykorzystania Drosophila jako modelu dla biologii wysiłku fizycznego.
Aby poszerzyć repertuar narzędzi dostępnych do badań nad ćwiczeniami Drosophila, w 2016 roku, Mendez i współpracownicy opisali drugą maszynę do ćwiczeń Drosophila, Treadwheel7. Podobnie jak Power Tower, Treadwheel wykorzystuje negatywną reakcję geotaksji Drosophila. Jednak ta reakcja jest wywoływana przez ciągłe obracanie wybiegów dla zwierząt, a nie przez podnoszenie i upuszczanie ich, jak w Wieży Energetycznej. Ta metoda indukcji jest łagodniejsza i pozwala na bardziej zorientowany na wytrzymałość reżim ćwiczeń, który pozwala uniknąć wszelkich urazów fizycznych, które mogą wystąpić podczas ćwiczeń w Power Tower (patrz Katzenberger, R. J. et al. 20138 dla wpływu powtarzających się urazów fizycznych na zdrowie Drosophila). Podobnie jak w Power Tower4, zabieg fizyczny u zwierząt na Treadwheel prowadzi do różnych reakcji fizjologicznych, w tym zmian w sprawności fizycznej, poziomie trójglicerydów i masie ciała7. W związku z tym dwie uzupełniające się metody są dostępne dla biologów Drosophila badających ćwiczenia.
Jednym z ograniczeń zarówno Power Tower, jak i Treadwheel jest niemożność zmierzenia ilości aktywności wywołanej przez zabieg ćwiczeń. Analiza nagrań wideo wykonanych z Treadwheel wykazała, że istnieją znaczące różnice między różnymi szczepami Drosophila w tym, jak reagują na leczenie ćwiczeniami7. W szczególności badane szczepy różniły się pod względem ilości dodatkowej aktywności wykonywanej przez zwierzęta po stymulacji7. Ta obserwacja skłoniła nas do opracowania trzeciego systemu ćwiczeń, Rotary Exercise Quantification System (REQS), który pozwala nam mierzyć poziom aktywności zwierząt podczas ćwiczeń wywołanych rotacją9. REQS wykorzystuje dostępną na rynku jednostkę monitorującą aktywność, która jest zainstalowana na obracającym się ramieniu, aby stymulować ćwiczenia poprzez rotację, tak jak w kole derogacyjnym. Wstępne prace z REQS potwierdzają, że genetycznie różne szczepy Drosophila - i płcie - mogą mieć znacząco różne reakcje na stymulację rotacyjną, a zatem ilość indukowanego wysiłku fizycznego nie jest identyczna między różnymi genotypami9. W ten sposób REQS umożliwia teraz biologom Drosophila mierzenie ilości wysiłku fizycznego wywołanego leczeniem, otwierając wiele nowych ścieżek badawczych w dziedzinie ćwiczeń.
Tutaj szczegółowo opisujemy, jak używać REQS do ilościowego oznaczania ćwiczeń rotacyjnych. REQS indukuje ćwiczenia rotacyjne i jednocześnie mierzy poziom aktywności leczonych zwierząt. REQS jest w stanie dostosować się do różnych programów ćwiczeń, począwszy od prostego 2-godzinnego reżimu ciągłych ćwiczeń, który został tutaj pokazany, po bardziej złożone metody treningu interwałowego, jak opisali Mendez i współpracownicy7, a stymulację można regulować za pomocą prędkości obrotowej (od około 1 do 13 obrotów na minutę). W zależności od jednostki monitorującej aktywność wykorzystanej do opracowania REQS, metodę tę można dostosować do analizy pojedynczych much lub dużych populacji zwierząt. Ze względu na tę wszechstronność, REQS zapewnia badaczom Drosophila szereg możliwości badania, na przykład, różnych reżimów ćwiczeń, interwencji dietetycznych lub wpływu gęstości zaludnienia.

<table><tbody><tr><td>Monitor aktywności Drosophila&nbsp;</td><td>Trikinetics</td><td>LAM25H</td><td>Składnik REQS</td></tr><tr><td>Przewód telefoniczny Detangler</td><td>Uvital</td><td>uv20170719</td><td>Składnik REQS</td></tr><tr><td>Zamknięcia fiolek (flugs)</td><td>Genesee Scientific</td><td>49-102</td><td>Materiały do hodowli Drosophila</td></tr><tr><td>Fiolki&nbsp;</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-120</td><td>Zaopatrzenie kultur Drosophila</td></tr><tr><td>Siatka do hodowli Drosophila</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>173090</td><td>Zapasy kultur Drosophila</td></tr><tr><td>Mąka kukurydziana</td><td>Pepsico</td><td>43375</td><td>Drosophila media</td></tr><tr><td>Melasa</td><td>Golden Barrel</td><td>BLA-GAL</td><td>Drosophila media</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Apex Bioresearch</td><td>66-103</td><td>Drosophila media</td></tr><tr><td>Nieaktywne suche drożdże</td><td>Genesee Scientific</td><td>62-106</td><td>Drosophila media</td></tr><tr><td>Tegosept</td><td>Apex Bioresearch</td><td>20-258</td><td>Drosophila media</td></tr><tr><td>Kwas propionowy</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-271</td><td>Drosophila media</td></tr></tbody></table>

pomiar poziomu wysiłku fizycznego u drosophila melanogaster za pomocą rotacyjnego systemu kwantyfikacji wysiłkowej (reqs)

Measuring Exercise Levels in Drosophila melanogaster Using the Rotating Exercise Quantification System (REQS)

Drosophila melanogaster to nowy organizm modelowy do badań w biologii ćwiczeń. Do tej pory opisano dwa główne systemy ćwiczeń, Power Tower i Treadwheel. Brakowało jednak metody pomiaru ilości dodatkowej aktywności zwierząt wywołanej przez leczenie wysiłkowe. System kwantyfikacji ćwiczeń rotacyjnych (REQS) zaspokaja tę potrzebę, zapewniając miarę aktywności zwierząt dla zwierząt doświadczających ćwiczeń rotacyjnych. Protokół ten szczegółowo opisuje, w jaki sposób korzystać z REQS do oceny aktywności zwierząt podczas ćwiczeń rotacyjnych i ilustruje rodzaj danych, które można wygenerować. W tym miejscu pokazujemy, w jaki sposób REQS jest używany do pomiaru specyficznych dla płci i szczepu różnic w aktywności wywołanej wysiłkiem fizycznym. REQS może być również wykorzystany do oceny wpływu różnych innych parametrów eksperymentalnych, takich jak wiek, dieta lub wielkość populacji, na aktywność wywołaną wysiłkiem fizycznym. Ponadto może być używany do porównywania skuteczności różnych protokołów treningu fizycznego. Co ważne, daje to możliwość standaryzacji zabiegów ruchowych między szczepami, co pozwala badaczowi osiągnąć równą ilość aktywności między grupami, jeśli zajdzie taka potrzeba. W związku z tym REQS jest godnym uwagi nowym zasobem dla biologów pracujących z systemem modelowym Drosophila i uzupełnia istniejące systemy ćwiczeń.

Wynikiem pojedynczego pomiaru z użyciem REQS jest tabela danych generowana przez oprogramowanie DAMSystem308, która domyślnie zostanie zapisana jako „Monitor1.txt” (przykład znajduje się w Pliku uzupełniającym 1). Fragment takiej tabeli przedstawiono w Tabeli 1. Każda kolumna zawiera dane z pojedynczej probówki pomiarowej, natomiast wiersze zawierają aktywność zmierzoną w każdym odstępie czasu od początku eksperymentu (góra) do jego końca (dół). Należy mo...

System Oceny Ilościowej Ćwiczeń Rotacyjnych (REQS) może indukować ćwiczenia u Drosophila melanogaster poprzez rotację, jednocześnie mierząc ilość aktywności wykonywanej przez zwierzęta. W tym miejscu przedstawiamy protokół punkt po punkcie, w którym szczegółowo opisano, w jaki sposób mierzyć poziom aktywności zwierząt doświadczających zabiegów ćwiczeń rotacyjnych za pomocą REQS.

Pomiar poziomu wysiłku fizycznego u Drosophila melanogaster za pomocą Rotacyjnego Systemu Kwantyfikacji Wysiłkowej (REQS)

Drosophila melanogaster is a new model organism for studies in exercise biology. To date, two main exercise systems, the Power Tower and the Treadwheel ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii wysiłku fizycznego, takie jak to, jak różni się reakcja na wysiłek fizyczny u zwierząt w różnym wieku i jakie szlaki genetyczne kontrolują reakcję na wysiłek. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona naukowcom po raz pierwszy zmierzyć aktywność muszek wykonujących ćwiczenia wywołane rotacją w czasie rzeczywistym. Procedurę zademonstruje Louis Patrick Watanabe, doktorant z mojego laboratorium.Przed planowanym eksperymentem należy ustawić krzyżówki samców i samic much, aby można było zebrać każde kontrolowane potomstwo do eksperymentu. Na początek załaduj osiem szklanych probówek z próbkami 10 znieczulonych much testowych na fiolkę. Standardowa grupa eksperymentalna składa się z 10 fiolek po 10 much każdej płci.Aby załadować fiolki do REQS, należy włożyć fiolkę do szczeliny monitora aktywności od przodu. Następnie nałożyć drugą nakrętkę na fiolkę i wyśrodkować fiolkę, przesuwając O-ring w razie potrzeby. Umieść REQS w inkubatorze zapewniającym kontrolowane warunki środowiskowe.Przed kontynuowaniem pozwól zwierzętom dojść do siebie po znieczuleniu przez godzinę w tym inkubatorze. W przypadku testów dłuższych niż osiem godzin można używać fiolek zawierających żywność, która jest bardzo bezpiecznie przymocowana do jednego końca probówki. Po okresie aklimatyzacji włącz urządzenie, aby rozpocząć obroty.Dostosuj prędkość do żądanej prędkości, na przykład cztery obroty/min. Żadna rurka nie powinna stykać się z dolną powierzchnią, jeśli są prawidłowo ustawione. W przypadku typowego testu wystarczy uruchomić oprogramowanie i rejestrować aktywność przez żądany czas, na przykład przez dwie godziny w przypadku używania fiolek bez jedzenia.Po zainicjowaniu oprogramowanie automatycznie zapisuje dane w pliku tekstowym. W oprogramowaniu zielona lampka połączenia wskazuje, że oprogramowanie zbiera dane. Częstotliwość nagrywania można dostosować w zakładce Preferencje.Zazwyczaj stosuje się interwały pięciominutowe. Podczas badania nie należy otwierać inkubatora, ponieważ zwierzęta są bardzo wrażliwe na wszelkie zakłócenia i prawdopodobnie zareagują zwiększoną aktywnością. Pod koniec testu zakończ zbieranie danych, zamykając oprogramowanie, a następnie wyłącz REQS i sprawdź probówki.Zwróć uwagę na wszelkie zgony, które miały miejsce podczas reżimu ćwiczeń. Ogólnie rzecz biorąc, cztery obroty na minutę przez dwie godziny nie są śmiertelne dla zdrowych szczepów. Na koniec rozładuj fiolki, znieczulając muchy dwutlenkiem węgla.Plik danych może być analizowany za pomocą dowolnego pakietu statystycznego. Jeśli istnieją punkty czasowe, w których wynik aktywności wynosi zero dla wszystkich pozycji, oznacza to, że w tych punktach czasowych nastąpiła przerwa w połączeniu. Jeśli wystąpią przerwy, ustabilizuj połączenia prowadzące do obracającego się gniazda telefonicznego za pomocą taśmy.Cztery genetycznie odrębne linie Drosophila zostały przetestowane za pomocą REQS przy użyciu opisanego protokołu. Każda grupa składała się ze 100 much podzielonych na 10 fiolek. Średnią aktywność obliczono w pięciominutowych przedziałach w ciągu dwugodzinnego testu, przeprowadzonego przy czterech prędkościach obrotowych.Średnia aktywność wysiłkowa między wszystkimi czterema genotypami była istotnie różna, jednak nie stwierdzono istotnej różnicy między dziewiczymi samcami i dziewiczymi samicami much, dlatego ich dane przedstawiono razem w tej analizie. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się genetyką ćwiczeń do zbadania różnych reakcji na wysiłek fizyczny u Drosophila melanogaster i zbadania wpływu ćwiczeń na zachowanie i fizjologię zwierząt. Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak analiza składu ciała, testy wysiłkowe i testy sprawnościowe, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące wpływu zabiegów ruchowych na zwierzęta.

measuring-exercise-levels-drosophila-melanogaster-using-rotating

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Opisujemy pierwszy protokół treningu wytrzymałościowego dla ważnego gatunku modelowego genetycznie, Drosophila melanogaster, oraz przedstawiamy kilka testów pozwalających monitorować poprawę mobilności po treningu.

Protokół treningu wytrzymałościowego i podłużne testy wydolnościowe dla Drosophila melanogaster

Ten film opisuje prostą metodę ilościowego oznaczania lokomocji muchy i pokazuje przeprowadzony test wspinaczki. Test wspinaczki muchowej jest ogólnym testem funkcji motorycznych, który opiera się na negatywnej odpowiedzi geotaksji.

Test wspinaczki muchowej: metoda testowania ogólnej lokomocji u Drosophila melanogaster

Ten film opisuje, jak śledzić swobodnie chodzące muchy, aby ocenić ich ogólną zdolność poruszania się. Prezentowany protokół demonstruje konfigurację testu i analizę danych za pomocą oprogramowania do śledzenia wideo.

Śledzenie swobodnie chodzących much: metoda oceny lokomocji u Drosophila

Ten film opisuje system monitorowania aktywności Drosophila (DAM) używany do śledzenia aktywności lokomotorycznej. Naukowcy wykorzystują dane dotyczące aktywności zebrane z DAM do badania rytmów okołodobowych u muszek owocowych. Prezentowany klip protokołu pokazuje, jak ładować muchy do urządzenia i rejestrować dane dotyczące aktywności do eksperymentów okołodobowych.

Drosophila Monitor aktywności (DAM): metoda pomiaru aktywności lokomotorycznej u much

Drosophila melanogaster są przydatne w badaniu manipulacji genetycznych lub środowiskowych, które wpływają na zachowania takie jak spontaniczna aktywność lokomotoryczna. Tutaj opisujemy protokół, który wykorzystuje monitory z wiązkami podczerwieni i oprogramowanie do analizy danych do ilościowego określania spontanicznej aktywności lokomotorycznej.

Oznaczanie spontanicznej aktywności lokomotorycznej u Drosophila melanogaster

Zaburzenia metaboliczne należą do najczęstszych chorób u ludzi. Genetycznie podatny organizm modelowy D. melanogaster może być wykorzystany do identyfikacji nowych genów regulujących metabolizm. W artykule opisano stosunkowo prostą metodę, która pozwala na badanie tempa przemiany materii u much poprzez pomiar ich produkcji CO2 .

Pomiar tempa przemiany materii u Drosophila za pomocą respirometrii

Ten raport opisuje metodę pomiaru aktywności larw Drosophila za pomocą TriKinetics Drosophila Activity Monitor. Urządzenie wykorzystuje wiązki podczerwieni do wykrywania ruchów do 16 pojedynczych zwierząt. Dane mogą być analizowane w celu przedstawienia parametrów ruchu, w tym szybkości i pozycji zwierząt w komorach testowych.

Pomiar aktywności larw w monitorze aktywności Drosophila

TreadWheel wykorzystuje ruch obrotowy, aby delikatnie wywołać ćwiczenia u dorosłych Drosophila melanogaster, wykorzystując wrodzoną, negatywną geotaksję much. Pozwala na analizę interakcji między ćwiczeniami a czynnikami, takimi jak genotyp, płeć i dieta, oraz ich wpływu na testy fizjologiczne i molekularne w celu oceny zdrowia metabolicznego.

TreadWheel: Protokół treningu interwałowego dla delikatnie indukowanych ćwiczeń u Drosophila melanogaster

Obecny protokół ocenia aktywność lokomotoryczną Drosophila poprzez śledzenie i analizowanie ruchu much na ręcznie wykonanej arenie za pomocą oprogramowania typu open source Fiji, kompatybilnego z wtyczkami do segmentacji pikseli każdej klatki na podstawie nagrania wideo w wysokiej rozdzielczości w celu obliczenia parametrów prędkości, odległości itp.

Prosta technika oznaczania aktywności lokomotorycznej u Drosophila

Celem tego protokołu jest zapewnienie ćwiczeń lotniczych muszce owocowej Drosophila. Reprezentatywne wyniki pokazują, że trening lotniczy skutkuje zwiększoną pojemnością tlenową i odpornością na dietę wysokotłuszczową.

FLEX: Protokół szkolenia z ćwiczeń lotniczych dla muszki owocowej Drosophila

Ten protokół zapewnia ramy do oceny zmian zachowania wywołanych stresem u Drosophila melanogaster. Łączenie uzupełniających się testów umożliwia ilościową ocenę aktywności, eksploracji i podejmowania decyzji dla poszczególnych much. Podejście to jest elastyczne i może być dostosowane do szerokiej gamy badań dotyczących biologii stresu, metabolizmu i funkcji neurobehawioralnych.

Multimodalowe fenotypowanie behawioralne stanów przypominających depresję indukowanych stresem u Drosophila melanogaster

Poznaj metodę pomiaru aktywności Drosophila melanogaster podczas ćwiczeń rotacyjnych za pomocą systemu REQS. Protokół umożliwia badanie wpływu wieku i genetyki na odpowiedź wysiłkową w czasie rzeczywistym.

Pomiar poziomu wysiłku fizycznego u Drosophila melanogaster za pomocą Rotacyjnego Systemu Kwantyfikacji Wysiłkowej (REQS)

Przeglądaj więcej filmów