Name: Wykrywanie heterodimeryzacji izoform białek za pomocą testu ligacji zbliżeniowej in situ (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Poznaj metodę PLA do wizualizacji heterodimeryzacji białek MST1/MST2 w komórkach utrwalonych. Ta technika umożliwia wykrywanie interakcji białkowych in situ z wysoką czułością bez konieczności ekspresji transgenowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy całemu laboratorium Chernoffa za wkład w optymalizację i walidację tego protokołu, w szczególności Marii Radu i Galinie Semenovej. Dziękujemy również Andreyowi Efimovowi z Cell Imaging Facility w Fox Chase Cancer Center. Praca ta została wsparta grantem z NIH (R01 CA148805) dla JC.

1. Przygotowanie roztworów
<ol>
	<li>Przygotować roztwór utrwalający: 4% paraformaldehydu (PFA) w 1x PBS. Na 10 ml weź 2,5 ml 16% PFA i dodaj 7,5 ml 1x PBS. 
	Zagrożeń: PFA jest rakotwórczy w niskich dawkach. Opary i kontakt ze skórą są niebezpieczne. Przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Przygotuj roztwór permeabilizacyjny: 0,1% Triton X-100 w 1x PBS. Na 100 ml roztworu dodać 100 μl Triton X-100 do 100 ml 1x PBS. Przechowywać w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Przygotuj bufor do mycia: 1x TBST. Na 1 l weź 100 ml 10x TBS, 890 ml dH2O i 10 ml Tween 20 (10%).</li>
	<li>Przygotuj roztwór blokujący zgodnie z zestawem. Alternatywnie należy użyć 1x roztworu PBS zawierającego 2% BSA.</li>
	<li>Przygotować rozcieńczalnik na przeciwciała zgodnie z zestawem. Alternatywnie należy użyć 1x roztworu PBS zawierającego 1% BSA.</li>
</ol>
2. Posiewanie komórek
UWAGA: W tym badaniu użyliśmy unieśmiertelnionych ludzkich komórek Schwanna (iHSC) i ludzkich embrionalnych komórek nerki 293 (HEK 293); jednak ta metoda może być stosowana dla wielu typów przylegających komórek.
<ol>
	<li>Kultura HEK 293 w DMEM uzupełniona 10% FBS, 0,2% glukozy, 2 mM L-glutaminy, 100 U/ml penicyliny G i 100 μg/ml streptomycyny na płytkach poddanych hodowli tkankowej w temperaturze 37 °C w 5% CO2 . Utrzymuj iHSC w 10% FBS/DMEM uzupełnionym Pen/Strep i 2 μM forskoliną. Rutynowo testuj komórki na obecność mykoplazmy. Nie przeprowadzono uwierzytelniania za pomocą linii komórkowej.</li>
	<li>Pokryć 16-dołkowe szkiełko komorowe 50 μl 10 μg/ml naturalnej lamininy mysiej lub 0,01% roztworu poli-L-lizyny i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C w 5% CO2 . Podziel komórki za pomocą 0,04% trypsyny-EDTA.</li>
	<li>Płytka iHSC i HEK-293 w 100 μl podłoża przy 80% konfluencji (15 000-25 000 komórek/dołek).</li>
	<li>Inkubować komórki przez 12 -24 godziny w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze o stężeniu 5%CO2</li>.
</ol>
3. Utrwalenie i przepuszczalność
<ol>
	<li>Usunąć pożywkę z dołków i przemyć 100 μl 1x PBS. Odessać za pomocą mikropipety, aby zminimalizować ryzyko usunięcia próbki.</li>
	<li>Utrwalić komórki, dodając 50 μl 4% PFA na studzienkę i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej, bez mieszania. Komórki są wrażliwe na odwarstwienie, dlatego należy unikać pipetowania roztworów bezpośrednio na komórki.</li>
	<li>Umyj komórki 0,05% TBST trzy razy po 5 minut każda. Odessać za pomocą mikropipety, aby zminimalizować ryzyko usunięcia próbki.</li>
	<li>Potraktuj komórki roztworem przepuszczalnym (0,1% Triton x-100 w 1x PBS) przez 10 minut bez mieszania w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyć komórki TBST trzy razy przez 5 minut każdy z mieszaniem.</li>
</ol>
4. Blokowanie
<ol>
	<li>Odczepić TBST (bardzo delikatnie za pomocą mikropipety). Wizualizuj szkiełko w mikroskopie, aby sprawdzić, czy komórki pozostają przyczepione.</li>
	<li>Dodaj jedną kroplę (50-60 μl) 1x roztworu blokującego do każdej próbki.</li>
	<li>Podgrzej wstępnie komorę wilgotnościową (puste pudełko z końcówką z wodą) do temperatury 37 °C i inkubuj w niej szkiełka przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.</li>
</ol>
5. Przeciwciała pierwotne
<ol>
	<li>Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe (1:100) w rozcieńczalniku przeciwciał (patrz tabela materiałów). Przygotować 40 μl roztworu przeciwciał na dołek.</li>
	<li>Usunąć roztwór blokujący ze szkiełek, strzepując płyn. Nie pozwól, aby komórki wyschły.</li>
	<li>Wykonać wir i dodać 40 μl roztworów przeciwciał do każdej studzienki.</li>
	<li>Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w nagrzanej komorze wilgotnościowej.</li>
</ol>
6. Sondy do ligacji zbliżeniowej
UWAGA: Sondy PLA są dostarczane jako część zestawu (patrz Tabela materiałów). Wybór sond będzie zależał od gatunku pierwotnych przeciwciał używanych do wykrywania interesujących białek.
<ol>
	<li>Rozcieńczyć dwie sondy PLA (anty-Mouse MINUS i anty-Rabbit PLUS) w stosunku 1:5 w rozcieńczalniku przeciwciał. Dla każdej próbki przygotuj 40 μl sondy PLA. Inkubować mieszaninę przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Stuknij główny roztwór przeciwciała ze szkiełek. Umyj szkiełka dwukrotnie przez 5 minut za pomocą buforu do płukania w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Delikatnie postukać buforem płuczącym w szkiełka i dodać rozcieńczalnik roztwór sondy PLA do studzienek (40 μl/studzienkę).</li>
	<li>Inkubować szkiełka w wstępnie podgrzanej komorze wilgotnościowej przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.</li>
</ol>
7. Podwiązanie
UWAGA: Odczynniki do wykrywania in situ Red, Ligase i Roztwór Ligacji są dostarczane jako część zestawu (patrz Tabela Materiałów).
<ol>
	<li>Użyj odczynników do wykrywania in situ w kolorze czerwonym.</li>
	<li>Bezpośrednio przed użyciem należy odwirować i rozcieńczyć wymagane objętości 5-krotnego podwiązania 1:5 w wodzie o wysokiej czystości. 
	UWAGA: Nie przechowywać rozcieńczonych odczynników.</li>
	<li>Odczep roztwór sondy PLA od szkiełek. Umyj szkiełka w 1x buforze do mycia dwa razy po 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Bezpośrednio przed dodaniem do próbek, odwirować i dodać ligazę do roztworu ligacji w rozcieńczeniu 1:40 i ponownie odwirować.</li>
	<li>Stuknąć bufor płuczący ze szkiełek i dodać roztwór ligacji/ligazy do każdej studzienki (40 μl/studzienkę).</li>
	<li>Inkubować szkiełka w wstępnie podgrzanej komorze wilgotnościowej przez 30 minut w temperaturze 37 °C.</li>
</ol>
8. Wzmocnienie
UWAGA: Zestaw wzmacniający jest dostarczany jako część zestawu (patrz Tabela materiałów). Odczynniki są wrażliwe na światło; Dlatego unikaj wystawiania szkiełek na działanie światła.
<ol>
	<li>Zwiruj i rozcieńcz wymagane objętości 5-krotnego wzmacniacza w stosunku 1:5 w wodzie o wysokiej czystości i wymieszaj.</li>
	<li>Stuknąć roztwór do ligacji/ligazy ze szkiełek. Umyj szkiełka w 1x buforze do mycia dwa razy po 2 minuty w temperaturze RT.</li>
	<li>Odwirować i dodać polimerazę do roztworu amplifikacyjnego w rozcieńczeniu 1:80 i ponownie przetoczyć wir.</li>
	<li>Stuknąć bufor płuczący ze szkiełek i dodać roztwór amplifikacji/polimerazy do każdej studzienki (40 μl/studzienkę). Inkubować szkiełka w podgrzanej komorze wilgotnościowej przez 100 minut w temperaturze 37 °C.</li>
</ol>
9. Przygotowanie do obrazowania
UWAGA: To są odczynniki światłoczułe. Chroń szkiełka przed światłem.
<ol>
	<li>Stuknąć roztwór polimerazy amplifikacyjnej ze szkiełek i umyć dwukrotnie przez 10 minut każdy w 1x bufor do płukania w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Całkowicie usuń komory i silikon wokół studzienek ze szkiełka. Zeskrob pozostałe kawałki silikonu brzytwą. Narysuj na szkiełku siatkę oddzielającą każdą studzienkę.</li>
	<li>Dodać ~40 μL podłoża montażowego z DAPI. Należy uważać, aby nie uwięzić pęcherzyków powietrza pod szkiełkiem nakrywkowym. Krawędzie szkiełka nakrywkowego można uszczelnić lakierem do paznokci.</li>
	<li>Odczekaj co najmniej 20 minut przed wykonaniem analizy obrazu za pomocą mikroskopu konfokalnego. 
	nuta: W tym miejscu protokół można wstrzymać.</li>
	<li>Po zobrazowaniu przechowuj szkiełka w temperaturze -20 °C w ciemności.</li>
</ol>

<ol><li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nore1B%2FMst1+complex+restrains+antigen+receptor-induced+proliferation+of+na%C3%AFve+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The Nore1B/Mst1 complex restrains antigen receptor-induced proliferation of naïve T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (51), 20321-20326 (2008).</li>
<li>Praskova, M., Xia, F., Avruch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MOBKL1A%2FMOBKL1B+phosphorylation+by+MST1+and+MST2+inhibits+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">MOBKL1A/MOBKL1B phosphorylation by MST1 and MST2 inhibits cell proliferation.</a> Current Biology. 18 (5), 311-321 (2008).</li>
<li>Dan, I., Watanabe, N. M., Kusumi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ste20+group+kinases+as+regulators+of+MAP+kinase+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Ste20 group kinases as regulators of MAP kinase cascades.</a> Trends in Cell Biology. 11 (5), 220-230 (2001).</li>
<li>Rawat, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H-ras+Inhibits+the+Hippo+Pathway+by+Promoting+Mst1%2FMst2Heterodimerization%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">H-ras Inhibits the Hippo Pathway by Promoting Mst1/Mst2Heterodimerization.</a> Current Biology. 26 (12), 1556-1563 (2016).</li>
<li>Creasy, C. L., Ambrose, D. M., Chernoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ste20-like+protein+kinase%2C+Mst1%2C+dimerizes+and+contains+an+inhibitory+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The Ste20-like protein kinase, Mst1, dimerizes and contains an inhibitory domain.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (35), 21049-21053 (1996).</li>
<li>Buntru, A., Trepte, P., Klockmeier, K., Schnoegl, S., Wanker, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+Approaches+Toward+Quantitative+Mapping+of+the+Interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Current Approaches Toward Quantitative Mapping of the Interactome.</a> Frontiers in Genetics. 74 (7), (2016).</li>
<li>Greenwood, C., Ruff, D., Kirvell, S., Johnson, G., Dhillon, H. S., Bustin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity+assays+for+sensitive+quantification+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecular+Detection+and+Quantification%22%5BJournal%5D)">Proximity assays for sensitive quantification of proteins.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).</li>
<li>Fredriksson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+detection+using+proximity-dependent+DNA+ligation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays.</a> Nature Biotechnology. 20 (5), 473-477 (2002).</li>
<li>Leuchowius, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+visualization+of+multiple+protein+complexes+in+individual+cells+in+tumor+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Parallel visualization of multiple protein complexes in individual cells in tumor tissue.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 12 (6), 1563-1571 (2013).</li>
<li>Söderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Stwierdziliśmy, że przydatne jest użycie szkiełek do szkiełek w tym eksperymencie, ponieważ bardzo wygodne jest przeprowadzenie eksperymentu na kilku (14-16) liniach komórkowych i nie ma potrzeby zmiany próbki za każdym razem podczas analizy mikroskopowej. Może dojść do kilku powikłań, takich jak zwiększone ryzyko zanieczyszczenia krzyżowego przeciwciałami. Dlatego sugerujemy mycie każdej studzienki indywidualnie zamiast używania słoika z koplinu, pomimo wydłużonego czasu trwania eksperymentu. Ponadto wyjmowanie wkładki ...

Zakłócenie sygnalizacji MST1/Hippo zostało powiązane z zaburzeniami rozwojowymi i kancerogenezą1. U ssaków kinazy MST1 i MST2 aktywują (fosforylują) MOB1 i LATS1/2, z których ten ostatni następnie fosforyluje i dezaktywuje koaktywator transkrypcji Yes-associated protein (YAP)2. W swojej aktywnej (nieufosforylowanej) postaci YAP wykazuje aktywność onkogenną, wzmacniając transkrypcję genów proliferacji komórek; i odwrotnie, gdy YAP jest inaktywowany przez szlak Hippo, proliferacja komórek jest hamowana, a apoptoza promowana3. W tkankach MST1 i MST2 występują głównie jako aktywne homodimery, ale bodźce onkogenne mogą zwiększać poziomy heterodimerów MST1/MST2, a takie heterodimery są nieaktywne4. Jednak sposób, w jaki heterodimeryzacja MST1/MST2 jest regulowana, pozostaje słabo poznany. Zarówno homo-, jak i heterodimery są mediowane poprzez interakcje między C-końcowymi regionami cewki zwijanej MST1 i MST2, znanymi jako domeny SARAH5. Korzystając z PLA in situ pokazanego w tym artykule, pokazujemy obecność heterodimerów MST1/MST2 w ludzkich komórkach Schwanna (HSC) i ludzkich embrionalnych komórkach nerkowych (HEK-293). PLA ma przewagę nad innymi metodami wykrywania interakcji białko/białko, ponieważ umożliwia wykrywanie endogennych interakcji białko-białko, które można zidentyfikować i określić ilościowo bez potrzeby ekspresji transgenu lub użycia znaczników epitopów6.
Szlaki transdukcji sygnałowej są w dużej mierze kontrolowane przez warunkową asocjację białek składowych. Na przykład stymulacja większości receptorowych kinaz tyrozynowych prowadzi do ich homo- lub heterodimeryzacji, a następnie asocjacji z dodatkowymi wewnątrzkomórkowymi białkami sygnałowymi, które same tworzą dalsze kompleksy. Celem metody PLA jest wizualizacja bliskości między białkami w komórkach, pod warunkiem, że białka są oddalone od siebie o mniej niż 30-40 nm. Bliskość białka jest zwykle wykrywana przez pierwszą inkubację komórek z odpowiednimi przeciwciałami pierwszorzędowymi wyhodowanymi u różnych gatunków (np. królika i myszy) przeciwko każdemu białku oddziałującemu, a następnie dodanie specyficznych dla gatunku przeciwciał drugorzędowych, wstępnie sprzężonych z krótkimi sondami DNA. Jeśli sondy DNA znajdują się w bliskiej odległości, specyficzny linkujący oligonukleotyd DNA może jednocześnie wiązać obie te sondy, tworząc platformę do amplifikacji za pomocą PCR in situ lub mechanizmu toczącego koła. Znaczniki fluorescencyjne dodane do reakcji amplifikacji umożliwiają wizualizację oddziałujących białek, które wyglądają jak fluorescencyjne kropki, które można łatwo określić ilościowo i zlokalizować w określonych regionach komórki7,8,9,10.

<table><tbody><tr><td>Szkiełka komorowe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>178599</td><td>16-dołkowe, szkiełko szklane</td></tr><tr><td>Sonda PLA Anti-Mouse Minus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92004</td><td>Zawiera 1x Roztwór blokujący, 1x Przeciwciało Rozcieńczalnik</td></tr><tr><td>PLA Sonda Anti-Rabbit PLUS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92002</td><td>Zawiera 1x Roztwór blokujący, 1x Przeciwciało Rozcieńczalnik</td></tr><tr><td>do płukania, Flurescence</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82049</td> Zawiera pożywkę montażową <td>buforu myjącego A i bufor do płukania B</td></tr> z <tr><td>odczynnikami do wykrywania</td><td></td> DUO82040 <td></td> DAPI Sigma-Aldrich Red <td>Sigma-Aldrich DUO92008 Zawiera 5x ligację, 1x ligazę, 5x czerwień alifikacyjną, 1x polimerazę</td></tr><tr><td>p44/42 MAPK (Erk1/2)</td><td>Komórka przeciwciała sygnalizującego</td><td>9102s</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Phospho-p44/42 MAPK (Erk1) (Tyr204)/(Erk2) (Tyr187)Komórka <td></td></tr><tr><td></td><td> Sygnalizacja</td><td>5726s</td><td>przeciwciało pERK</td></tr><tr><td>Przeciwciało MST2</td><td>Sygnalizacja</td><td>komórkowa 3952s</td><td></td></tr><tr><td>Krs-2 (RJ-5)</td> <td>Santa Cruz</td><td>sc-100449</td><td>Przeciwciało MST1</td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyd</td><td>Mikroskopia elektronowa nauki</td><td>15710</td><td>Rozcieńczyć do 4% PFA w PBS do utrwalania roztworu</td></tr><tr><td>Triton x100</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP 151-500</td><td>Aby przygotować 0,1% Triton x-100 w 1xPBS do roztworu do permeabilizacji</td></tr><tr><td>Mikroskopia konfokalna</td><td>Leica TCS SP8, 63-krotna</td><td></td><td>analiza obrazu za pomocą oprogramowania ImageJ</td></tr></tbody></table>

wykrywanie heterodimeryzacji izoform białek za pomocą testu ligacji zbliżeniowej in situ

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Regulowane interakcje białko-białko są zasadą przewodnią dla wielu zdarzeń sygnalizacyjnych, a wykrywanie takich zdarzeń jest ważnym elementem w zrozumieniu, jak takie szlaki są zorganizowane i jak funkcjonują. Istnieje wiele metod wykrywania interakcji białko-białko w komórkach, ale stosunkowo niewiele z nich można wykorzystać do wykrywania interakcji między endogennymi białkami. Jedna z takich metod, test ligacji zbliżeniowej (PLA), ma kilka zalet, które zalecają jej stosowanie. W porównaniu z innymi powszechnymi metodami analizy interakcji białko-białko, PLA ma stosunkowo wysoką czułość i swoistość, może być wykonywany przy minimalnej manipulacji komórkami, a w opisanym tutaj protokole wymaga tylko dwóch przeciwciał specyficznych dla celu pochodzących z różnych gatunków (np. od myszy i królika) i jednego wyspecjalizowanego odczynnika: zestawu przeciwciał drugorzędowych, które są kowalencyjnie połączone ze specyficznymi oligonukleotydami, które: gdy zostaną umieszczone w bliskiej odległości od siebie, stwórz amplifikowaną platformę do PCR in situ lub amplifikacji w toczonym okręgu. W tej prezentacji pokazujemy, jak zastosować technikę PLA do wizualizacji zmian w bliskości MST1 i MST2 w komórkach stałych. Technika opisana w tym manuskrypcie jest szczególnie przydatna do analizy badań nad sygnalizacją komórkową.

Wykorzystaliśmy test PLA do zbadania interakcji między MST1 a MST2 w komórkach HEK-293 i iHSC. Komórki utrwalono, poddano permeabilizacji i barwiono różnymi przeciwciałami, a następnie przeprowadzono amplifikację in situ zgodnie z protokołem PLA (Rycina 1). Aby udokumentować poziom heterodimeryzacji MST1/MST2, komórki barwiono przeciwciałami przeciwko MST1 i MST2 (Rycina 1A, 1C i 1G). Jako kontrolę pozyt...

Tutaj pokazujemy, jak używać testu ligacji zbliżeniowej (PLA) do wizualizacji heterodimeryzacji MST1/MST2 w stałych komórkach z wysoką czułością.

Wykrywanie heterodimeryzacji izoform białek za pomocą testu ligacji zbliżeniowej in situ

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Test ligacji zbliżeniowej in situ (PLA) to technologia zdolna do wykrywania interakcji między białkami, dołączonymi tkankami i komórkami. Powiązania między białkami można zidentyfikować i określić ilościowo bez potrzeby transgenicznej ekspresji lub dodatkowych technologii. Jedynym wymogiem jest dostępność specyficznych przeciwciał o wysokiej skuteczności, które można modyfikować za pomocą oligonukleotydów DNA.W tkankach MST1 i MST2 występują głównie jako aktywne homodimery, ale bodźce onkogenne mogą zwiększać poziom heterodimerów MST1 MST2 i takie heterodimery są nieaktywne. Po inkubacji ze specyficznymi przeciwciałami starterowymi przeciwko białkom będącym przedmiotem zainteresowania, do szczeliny dodaje się specjalne specyficzne przeciwciała drugorzędowe, z których każde jest połączone z unikalną, krótką, komplementarną nicią DNA, aby związać się z przeciwciałami pierwszorzędowymi. Jeśli białka, o których mowa, są heterodimeryzowane, zarówno przeciwciała pierwszorzędowe, jak i przeciwciała drugorzędowe z nimi związane będą znajdować się w bliskiej odległości.W tym stanie przyłączone nici DNA na drugim przeciwciałie mogą oddziaływać poprzez późniejsze dodanie dwóch innych oligonukleotydów DNA tworzących koło. Kilkusetkrotna replikacja koła DNA może nastąpić po reakcji amplifikacji, a sygnał fluorescencyjny jest generowany przez wyrównane uzupełniające sondy oligonukleotydowe. Dlatego każdy wykryty sygnał jest wizualizowany jako pojedyncza kropka fluorescencyjna, którą można przypisać do określonej lokalizacji subkomórkowej na podstawie obrazów mikroskopowych.Dzień przed eksperymentem pokryj 16 szkiełka z dobrze komorowymi komorami, dodając od 50 do 100 mikrolitrów mysiej lamininy lub poli-L-lizyny i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po 30 minutach usuń zimny roztwór, podziel komórki za pomocą trypsyny i płytka od 15 000 do 25 000 komórek na studzienkę na 16 szkiełku z dobrze komorami. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w nawilżonym inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla przez 24 godziny.Po 24 godzinach wyjmij pożywkę z dołków i delikatnie umyj komórki PBS. Użyj mikropipety, aby zminimalizować ryzyko pobrania próbki, a następnie odessaj PBS i utrwal komórki, dodając 50 mikrolitrów 4% PFA na studzienkę i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej bez mieszania. Nie należy pipetować roztworu bezpośrednio na komórki, ponieważ może to spowodować ich oderwanie.Po utrwaleniu przemyć komórki TBST trzy razy przez pięć minut, z lekkim mieszaniem. Następnie przepuszczaj komórki i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej bez mieszania. Po zakończeniu przepuszczalności przemyć komórki TBST trzy razy przez pięć minut na mycie z mieszaniem.Po usunięciu TBST dodać jedną kroplę roztworu blokującego do każdej studzienki i inkubować szkiełka w podgrzanej komorze wilgotnościowej przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe. Usunąć roztwór blokujący za pomocą mikropipety, ale nie dopuścić do wyschnięcia szkiełka.Wirować i dodawać 40 mikrolitrów rozcieńczonego roztworu przeciwciała do odpowiednich studzienek i inkubować próbki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w nagrzanej komorze wilgotnościowej przez godzinę. Podczas inkubacji rozcieńczyć dwie sondy PLA w rozcieńczalniku przeciwciał. Do każdej próbki przygotuj 40 mikrolitrów sondy PLA.Po godzinie inkubacji odessać roztwór przeciwciała i przemyć szkiełka dwukrotnie przez pięć minut TBST w temperaturze pokojowej. Delikatnie usuń TBST ze szkiełek i dodaj 40 mikrolitrów roztworu sondy PLA do każdej studzienki. Inkubować szkiełka w podgrzanej komorze wilgotnościowej przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Bezpośrednio przed użyciem należy odwirować i rozcieńczyć wymagane objętości podwiązania od 1 do 5 w wodzie o wysokiej czystości. Na każdą studzienkę potrzeba 40 mikrolitrów roztworu do podwiązania. Po inkubacji usunąć roztwór PLA ze szkiełek i umyć je dwukrotnie w TBST przez pięć minut w temperaturze pokojowej z mieszaniem.Podczas usuwania ligazy z zamrażarki należy użyć bloku zamrażającego i tuż przed dodaniem go do komórek, przemieszać i rozcieńczyć roztworem ligacji. Usuń TBST ze szkiełek i dodaj 40 mikrolitrów roztworu ligazy ligacyjnej do każdej studzienki. Inkubować szkiełka w podgrzanej komorze wilgotnościowej przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Po inkubacji odessać roztwór i przemyć dwukrotnie TBST przez pięć minut w temperaturze pokojowej z mieszaniem. Unikaj wystawiania studni na działanie jasnego światła, ponieważ odczynniki są wrażliwe na światło. Podczas ostatniego prania należy odwirować i rozcieńczyć wymagane objętości roztworu wzmacniającego w wodzie o wysokiej czystości bezpośrednio przed użyciem.Trzymaj polimerazę na lodzie lub w bloku chłodzącym i tuż przed dodaniem jej do komórek odwiruj i rozcieńcz roztworem amplifikacyjnym. Odessać TBST ze studzienek i dodać 40 mikrolitrów roztworu wzmacniającego do każdej studzienki. Inkubować szkiełka w ciemnej, wstępnie nagrzanej komorze wilgotnościowej przez 100 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Po inkubacji odessać roztwór polimerazy amplifikacyjnej ze szkiełek i przemyć dwa razy po dziesięć minut w TBST w temperaturze pokojowej. Całkowicie usuń komory i silikon wokół studzienek ze szkiełka. Zeskrob pozostałe koraliki silikonu brzytwą.Narysuj na szkiełku siatkę oddzielającą każdą studzienkę. Dodać około 40 mikrolitrów podłoża montażowego za pomocą DAPI, upewniając się, że żadne pęcherzyki powietrza nie dostaną się pod szkiełko nakrywkowe. Użyj lakieru do paznokci, aby przymocować szkło nakrywkowe.Analizę mikroskopową można wykonać w ciągu 20 minut po fiksacji, ale w praktyce najwygodniej jest przeprowadzić analizę obrazu następnego dnia. Do analizy próbek używamy konfiguracyjnego laserowego mikroskopu skaningowego Leica SP8. Przedstawiono tutaj przykłady testu ligacji zbliżeniowej in situ, wizualizującego bliskie sąsiedztwo białek MST 1 i MST2 w ludzkich embrionalnych komórkach nerkowych w panelach od A do D, oraz ludzkie komórki Schwanna w panelach od E do H.In wszystkie panele jądra komórkowe są barwione na niebiesko przez DAPI, a czerwone kropki wskazują dodatnie sygnały testu ligacji zbliżeniowej wynikające z bliskiej odległości między wskazanymi białkami.Panel A pokazuje bliskość MST1 i MST2, a panel B pokazuje bliskość ERK i phosphoRK, ponieważ te epitopy znajdują się na tym samym białku. Panel C reprezentuje kontrolę negatywną, ponieważ te komórki, takie jak MST1 i MST2, a panel D reprezentuje drugą kontrolę ujemną wybarwioną przeciwciałami przeciwko MST1 i ERK, które nie powinny znajdować się blisko siebie. Panele E i F pokazują bliskość MST1 z MST2 i ERK z phosphoERK w komórkach Schwanna.Panele G i H są kontrolami ujemnymi wybarwionymi wyłącznie przeciwciałami MST1 lub przeciwciałami MST1 i ERK. Konieczne jest stosowanie niereagujących krzyżowo przeciwciał pierwotnych, które powinny rozpoznawać tylko jednego członka heterodimeru. Ważne jest również, aby pamiętać o używaniu różnych końcówek, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego przeciwciał pierwotnych i sond PLA, aby uniknąć dotykania dna studzienki i unikania pipetowania bezpośrednio na próbki.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać PLA in situ do badania dimeryzacji białek w komórkach stałych.

detection-heterodimerization-protein-isoforms-using-an-situ-proximity

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W niniejszej pracy pokazujemy, jak wykorzystać test ligacji bliskości (Proximity Ligation Assay, PLA) wraz z kombinacją przeciwciał do wizualizacji sygnalizacji białka morfogenetycznego kości (Bone Morphogenetic Protein, BMP) w utrwalonych komórkach. Technika ta pozwoliła nam śledzić nuklearną akumulację endogennych kompleksów efektorowych aktywowanych przez BMP oraz ilościowo określić ich poziomy w czasie pod wpływem stymulacji BMP4.

Wykrywanie kompleksów efektorowych szlaków sygnalizacyjnych downstream BMP4 przy użyciu in situ PLA, testu ligacji w bliskości

Ten film opisuje test ligacji zbliżeniowej do badania in situ interakcji białko-białko w komórkach nicieni. Bliskie sąsiedztwo badanych białek generuje kolistą matrycę DNA za pomocą sondy PLA dołączonej do przeciwciała wtórnego. Sonda jest dalej amplifikowana za pomocą roztworu do amplifikacji, który wytwarza długie, jednoniciowe DNA, a następnie hybrydyzuje sondę detektora, umożliwiając lokalizację interakcji białko-białko w komórkach.

Test ligacji zbliżeniowej do badania interakcji białko-białko in situ

Ten protokół pokazuje, jak można użyć testu ligacji zbliżeniowej do wykrywania interakcji in situ białko-białko w połączeniu nerwowo-mięśniowym larw Drosophila. Dzięki tej technice wykazano, że duże dyski i Hu-li tai shao tworzą kompleks w regionie postsynaptycznym, związek wcześniej zidentyfikowany poprzez koimmunoprecypitację.

Wykrywanie kompleksów białkowo-białkowych in situ w połączeniu nerwowo-mięśniowym larw Drosophila za pomocą testu ligacji zbliżeniowej

Tutaj opisujemy procedurę wizualizacji i ilościowego określania z dużą czułością endogennych interakcji między retikulum endoplazmatycznym a mitochondriami w komórkach stałych. Protokół zawiera zoptymalizowany test ligacji zbliżeniowej in situ ukierunkowany na receptor 1,4,5-trifosforanu inozytolu / białko regulowane glukozą 75 / zależny od napięcia kanał anionowy / kompleks cyklofiliny D na granicy faz błony związanej z mitochondriami.

Badanie interakcji retikulum endoplazmatycznego i mitochondriów za pomocą testu ligacji zbliżeniowej in situ w komórkach utrwalonych

Interakcje białko-białko mogą zachodzić zarówno w jądrze, jak i w cytoplazmie komórki. Aby zbadać te interakcje, stosuje się tradycyjną koimmunoprecypitację i nowoczesny test ligacji zbliżeniowej. W tym badaniu porównujemy te dwie metody wizualizacji rozkładu oddziaływań NF90-RBM3 w jądrze i cytoplazmie.

Wizualizacja interakcji białko-białko we frakcjach jądrowych i cytoplazmatycznych za pomocą koimmunoprecypitacji i testu ligacji zbliżeniowej in situ

Tutaj pokazano, jak test ligacji zbliżeniowej in situ (PLA) może być wykorzystany do wykrywania i wizualizacji bezpośrednich interakcji białko-białko między ATM i p53 w hodowlach komórek zawiesinowych narażonych na stres genotoksyczny.

Wykrywanie i wizualizacja kompleksów białkowych indukowanych uszkodzeniem DNA w hodowlach komórek zawiesinowych za pomocą testu ligacji zbliżeniowej

Tutaj prezentujemy protokół monitorowania montażu i demontażu toksyny wąglika za pomocą interferometrii biowarstwowej (BLI). Po montażu/demontażu na powierzchni biosensora, duże kompleksy białkowe są uwalniane z powierzchni w celu wizualizacji i identyfikacji składników kompleksów za pomocą odpowiednio mikroskopii elektronowej i spektrometrii mas.

Analiza dynamicznych kompleksów białkowych składanych i uwalnianych z biosensora interferometrii biowarstwowej przy użyciu spektrometrii mas i mikroskopii elektronowej

Ten protokół opisuje bezkalibracyjne podejście do ilościowego określania homo-oligomeryzacji białek in vitro na podstawie spektroskopii fluktuacji fluorescencji przy użyciu komercyjnej mikroskopii skaningowej światła. Wyświetlane są prawidłowe ustawienia akwizycji i metody analizy.

Kwantyfikacja homooligomeryzacji białek in vitro bez kalibracji przy użyciu komercyjnego oprzyrządowania i bezpłatnego oprogramowania do analizy jasności typu open source

Pokrewne białka domeny J współpracują z opiekunem Hsp70, aby pomóc w niezliczonych procesach biologicznych, począwszy od fałdowania białek, a skończywszy na degradacji. W tym miejscu opisujemy test ligacji zbliżeniowej in situ, który umożliwia monitorowanie tych przejściowo utworzonych mechanizmów opiekuńczych w komórkach bakteryjnych, drożdżowych i ludzkich.

Monitorowanie in situ przejściowo utworzonych molekularnych zespołów opiekuńczych w bakteriach, drożdżach i komórkach ludzkich

Ten protokół demonstruje użycie testu ligacji zbliżeniowej do badania interakcji białko-białko in situ w linii zarodkowej C. elegans.

Wykrywanie in situ składania kompleksów rybonukleoproteinowych w linii zarodkowej C. elegans przy użyciu testu ligacji zbliżeniowej

Testy wychwytywania pętli D (DLC) i przedłużania pętli D (DLE) wykorzystują zasadę ligacji zbliżeniowej wraz z ilościowym PCR do ilościowego określenia powstawania pętli D, wydłużania pętli D i tworzenia produktu w miejscu indukowalnego dwuniciowego pęknięcia u Saccharomyces cerevisiae.

Wykrywanie produktów pośrednich rekombinacji homologicznej poprzez ligację zbliżeniową i ilościową reakcję PCR u Saccharomyces cerevisiae

Poznaj metodę PLA do wizualizacji heterodimeryzacji białek MST1/MST2 w komórkach utrwalonych. Ta technika umożliwia wykrywanie interakcji białkowych in situ z wysoką czułością bez konieczności ekspresji transgenowej.

Wykrywanie heterodimeryzacji izoform białek za pomocą testu ligacji zbliżeniowej in situ

Przeglądaj więcej filmów