Wykrywanie heterodimeryzacji izoform białek za pomocą testu ligacji zbliżeniowej in situ

Test ligacji zbliżeniowej in situ (PLA) to technologia zdolna do wykrywania interakcji między białkami, dołączonymi tkankami i komórkami. Powiązania między białkami można zidentyfikować i określić ilościowo bez potrzeby transgenicznej ekspresji lub dodatkowych technologii. Jedynym wymogiem jest dostępność specyficznych przeciwciał o wysokiej skuteczności, które można modyfikować za pomocą oligonukleotydów DNA.

W tkankach MST1 i MST2 występują głównie jako aktywne homodimery, ale bodźce onkogenne mogą zwiększać poziom heterodimerów MST1 MST2 i takie heterodimery są nieaktywne. Po inkubacji ze specyficznymi przeciwciałami starterowymi przeciwko białkom będącym przedmiotem zainteresowania, do szczeliny dodaje się specjalne specyficzne przeciwciała drugorzędowe, z których każde jest połączone z unikalną, krótką, komplementarną nicią DNA, aby związać się z przeciwciałami pierwszorzędowymi. Jeśli białka, o których mowa, są heterodimeryzowane, zarówno przeciwciała pierwszorzędowe, jak i przeciwciała drugorzędowe z nimi związane będą znajdować się w bliskiej odległości.

W tym stanie przyłączone nici DNA na drugim przeciwciałie mogą oddziaływać poprzez późniejsze dodanie dwóch innych oligonukleotydów DNA tworzących koło. Kilkusetkrotna replikacja koła DNA może nastąpić po reakcji amplifikacji, a sygnał fluorescencyjny jest generowany przez wyrównane uzupełniające sondy oligonukleotydowe. Dlatego każdy wykryty sygnał jest wizualizowany jako pojedyncza kropka fluorescencyjna, którą można przypisać do określonej lokalizacji subkomórkowej na podstawie obrazów mikroskopowych.

Dzień przed eksperymentem pokryj 16 szkiełka z dobrze komorowymi komorami, dodając od 50 do 100 mikrolitrów mysiej lamininy lub poli-L-lizyny i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po 30 minutach usuń zimny roztwór, podziel komórki za pomocą trypsyny i płytka od 15 000 do 25 000 komórek na studzienkę na 16 szkiełku z dobrze komorami. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w nawilżonym inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla przez 24 godziny.

Po 24 godzinach wyjmij pożywkę z dołków i delikatnie umyj komórki PBS. Użyj mikropipety, aby zminimalizować ryzyko pobrania próbki, a następnie odessaj PBS i utrwal komórki, dodając 50 mikrolitrów 4% PFA na studzienkę i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej bez mieszania. Nie należy pipetować roztworu bezpośrednio na komórki, ponieważ może to spowodować ich oderwanie.

Po utrwaleniu przemyć komórki TBST trzy razy przez pięć minut, z lekkim mieszaniem. Następnie przepuszczaj komórki i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej bez mieszania. Po zakończeniu przepuszczalności przemyć komórki TBST trzy razy przez pięć minut na mycie z mieszaniem.

Po usunięciu TBST dodać jedną kroplę roztworu blokującego do każdej studzienki i inkubować szkiełka w podgrzanej komorze wilgotnościowej przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe. Usunąć roztwór blokujący za pomocą mikropipety, ale nie dopuścić do wyschnięcia szkiełka.

Wirować i dodawać 40 mikrolitrów rozcieńczonego roztworu przeciwciała do odpowiednich studzienek i inkubować próbki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w nagrzanej komorze wilgotnościowej przez godzinę. Podczas inkubacji rozcieńczyć dwie sondy PLA w rozcieńczalniku przeciwciał. Do każdej próbki przygotuj 40 mikrolitrów sondy PLA.

Po godzinie inkubacji odessać roztwór przeciwciała i przemyć szkiełka dwukrotnie przez pięć minut TBST w temperaturze pokojowej. Delikatnie usuń TBST ze szkiełek i dodaj 40 mikrolitrów roztworu sondy PLA do każdej studzienki. Inkubować szkiełka w podgrzanej komorze wilgotnościowej przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Bezpośrednio przed użyciem należy odwirować i rozcieńczyć wymagane objętości podwiązania od 1 do 5 w wodzie o wysokiej czystości. Na każdą studzienkę potrzeba 40 mikrolitrów roztworu do podwiązania. Po inkubacji usunąć roztwór PLA ze szkiełek i umyć je dwukrotnie w TBST przez pięć minut w temperaturze pokojowej z mieszaniem.

Podczas usuwania ligazy z zamrażarki należy użyć bloku zamrażającego i tuż przed dodaniem go do komórek, przemieszać i rozcieńczyć roztworem ligacji. Usuń TBST ze szkiełek i dodaj 40 mikrolitrów roztworu ligazy ligacyjnej do każdej studzienki. Inkubować szkiełka w podgrzanej komorze wilgotnościowej przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po inkubacji odessać roztwór i przemyć dwukrotnie TBST przez pięć minut w temperaturze pokojowej z mieszaniem. Unikaj wystawiania studni na działanie jasnego światła, ponieważ odczynniki są wrażliwe na światło. Podczas ostatniego prania należy odwirować i rozcieńczyć wymagane objętości roztworu wzmacniającego w wodzie o wysokiej czystości bezpośrednio przed użyciem.

Trzymaj polimerazę na lodzie lub w bloku chłodzącym i tuż przed dodaniem jej do komórek odwiruj i rozcieńcz roztworem amplifikacyjnym. Odessać TBST ze studzienek i dodać 40 mikrolitrów roztworu wzmacniającego do każdej studzienki. Inkubować szkiełka w ciemnej, wstępnie nagrzanej komorze wilgotnościowej przez 100 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po inkubacji odessać roztwór polimerazy amplifikacyjnej ze szkiełek i przemyć dwa razy po dziesięć minut w TBST w temperaturze pokojowej. Całkowicie usuń komory i silikon wokół studzienek ze szkiełka. Zeskrob pozostałe koraliki silikonu brzytwą.

Narysuj na szkiełku siatkę oddzielającą każdą studzienkę. Dodać około 40 mikrolitrów podłoża montażowego za pomocą DAPI, upewniając się, że żadne pęcherzyki powietrza nie dostaną się pod szkiełko nakrywkowe. Użyj lakieru do paznokci, aby przymocować szkło nakrywkowe.

Analizę mikroskopową można wykonać w ciągu 20 minut po fiksacji, ale w praktyce najwygodniej jest przeprowadzić analizę obrazu następnego dnia. Do analizy próbek używamy konfiguracyjnego laserowego mikroskopu skaningowego Leica SP8. Przedstawiono tutaj przykłady testu ligacji zbliżeniowej in situ, wizualizującego bliskie sąsiedztwo białek MST 1 i MST2 w ludzkich embrionalnych komórkach nerkowych w panelach od A do D, oraz ludzkie komórki Schwanna w panelach od E do H.In wszystkie panele jądra komórkowe są barwione na niebiesko przez DAPI, a czerwone kropki wskazują dodatnie sygnały testu ligacji zbliżeniowej wynikające z bliskiej odległości między wskazanymi białkami.

Panel A pokazuje bliskość MST1 i MST2, a panel B pokazuje bliskość ERK i phosphoRK, ponieważ te epitopy znajdują się na tym samym białku. Panel C reprezentuje kontrolę negatywną, ponieważ te komórki, takie jak MST1 i MST2, a panel D reprezentuje drugą kontrolę ujemną wybarwioną przeciwciałami przeciwko MST1 i ERK, które nie powinny znajdować się blisko siebie. Panele E i F pokazują bliskość MST1 z MST2 i ERK z phosphoERK w komórkach Schwanna.

Panele G i H są kontrolami ujemnymi wybarwionymi wyłącznie przeciwciałami MST1 lub przeciwciałami MST1 i ERK. Konieczne jest stosowanie niereagujących krzyżowo przeciwciał pierwotnych, które powinny rozpoznawać tylko jednego członka heterodimeru. Ważne jest również, aby pamiętać o używaniu różnych końcówek, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego przeciwciał pierwotnych i sond PLA, aby uniknąć dotykania dna studzienki i unikania pipetowania bezpośrednio na próbki.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać PLA in situ do badania dimeryzacji białek w komórkach stałych.