Wizualizacja mikrobioty w jelitach kleszczy poprzez hybrydyzację in situ w całości

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące entomologii kleszczy, takie jak ocena obecności żywych bakterii w kleszczu w przestrzeni i czasie. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że nie wymaga ona sekcji kleszczy ani drogiego sprzętu, a także umożliwia przestrzenną i czasową wizualizację transkryptów genów. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej technice, będą miały trudności, ponieważ obejmuje ona wiele kroków i odczynników.

Jednak ta technika nie jest pracochłonna. Chociaż może to zająć około trzech dni, czas pracy to tylko kilka godzin każdego dnia. W ramach przygotowań karm zebrane kleszcze przez 48 do 72 godzin przed pobraniem jelit.

Aby wypreparować jelito od kleszcza, dodaj 20 do 30 mikrolitrów roztworu MEMFA do czystego szkiełka podstawowego. Następnie umieść kleszcza w MEMMA i ustaw ostrość na głowie kleszcza. Teraz, używając pary sterylnych żyletek ze stali wysokowęglowej, odetnij obszar głowy w miejscu tarczy, pozostawiając ciało kleszcza w takcie.

Następnie delikatnie dociśnij ciało, aby wypchnąć uchyłki jelitowe i gruczoły ślinowe z naskórka ciała. Następnie, nie uszkadzając jelit, ostrożnie oddziel je od gruczołów ślinowych i ostrożnie zgarnij nacięcia na żyletkę. Zbierz wszystkie pobrane wnętrzności w 1,5-mililitrowej probówce w 500 mikrometrach MEMFA.

Następnie inkubuj probówkę w temperaturze pokojowej, delikatnie kołysząc przez godzinę. Następnego dnia odwodnić tkankę zgodnie ze wskazaniami w protokole tekstowym i przechowywać ją w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Aby przygotować kosz siatkowy, najpierw użyj rozgrzanego ostrza z pojedynczą krawędzią na skalpelu, aby odciąć dno dwumililitrowej lub pięciomililitrowej probówki wirówkowej typu snap-top.

Ostrze może wymagać kilkukrotnego podgrzania przed zakończeniem cięcia. Następnie wytnij kwadrat siatki nylonowej o grubości 110 mikronów, która jest nieco większa niż nowe otwory. Następnie przymocuj siatkę do otworu, lekko wciskając rurkę w siatkę na płycie grzejnej ustawionej na średnie/niskie ciepło, aż do uzyskania dobrego ciepła.

Po ostygnięciu odetnij nadmiar siatki i upewnij się, że nie ma szczelin. Wykonaj 24 takie kosze, aby pasowały do 24-dołkowej płytki. Następnie wytnij otwory w pokrywie płytki 24-dołkowej, tak aby krawędź kosza na próbkę chwyciła otwór i nie wpadła.

Po zakończeniu zmontowane kosze na próbki powinny znajdować się aż do studzienek. Teraz użyj tego dopasowanego uchwytu na kosz, aby stosunkowo łatwo przenosić kosze z jednego talerza na drugi przez cały czas hybrydyzacji in situ. Użyj dwóch takich płytek, aby podczas inkubacji próbki w jednej, druga mogła przygotować się do następnego prania.

W tej sekcji omówiono niektóre etapy hybrydyzacji in situ. Pełny opis można znaleźć w protokole tekstowym. Aby rozpocząć, przenieś każdą utrwaloną próbkę tkanki do oznakowanego kosza na próbki.

Uporządkuj płytkę według warunków eksperymentalnych i zabarwij co najmniej pięć wnętrzności na warunek. Najpierw delikatnie ponownie uwodnić próbki. Unikaj wprowadzania pęcherzyków powietrza poprzez stopniowe zwiększanie stosunku PBS-T do etanolu przy każdym praniu.

W pierwszym dniu, po dwugodzinnym etapie przed hybrydyzacją, zamiast wyrzucać bufor hybrydyzacyjny, przechowuj go do wykorzystania w przyszłości podczas testu. Później, podczas traktowania próbek roztworem hybrydyzacyjnym sondy, przykryj płytkę szczelnie folią aluminiową, aby zapobiec parowaniu roztworu. Drugiego dnia załaduj zarezerwowany bufor hybrydyzacyjny do płytki 24-dołkowej i podgrzej płytkę do 60 stopni Celsjusza.

Później tego samego dnia, aby usunąć wszelkie ślady sondy i buforu hybrydyzacyjnego, przemyj próbki dwukrotnie 2x SSC przez trzy minuty na mycie. Następnie przemyć próbki trzykrotnie 2x SSC przez 20 minut na pranie w temperaturze 60 stopni Celsjusza. Następnie przygotować przeciwciało pierwszorzędowe w buforze blokującym.

Załaduj 500 mikrolitrów tej mieszaniny do każdej studzienki. Po etapie blokowania inkubować w temperaturze pokojowej przez około cztery godziny lub w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Trzeciego dnia przeprowadź reakcję barwną w podłożu chromogenicznym.

Przykryj płytkę próbki folią aluminiową. A podczas reakcji okresowo sprawdzaj, czy nie ma nadmiernego zabarwienia za pomocą mikroskopu preparacyjnego. Czwartego dnia ważne jest, aby inkubować i wybielać na kasetonie świetlnym, ponieważ pozwala to na usunięcie wszelkich pigmentacji w próbkach lub zabarwienia z roztworu Bouina i wzmacnia sygnał sondy w celu uzyskania wyraźnej wizualizacji.

Następnie, po umyciu SSC, ostrożnie przenieś próbki jelit, odwracając kosz do nowej płytki 24-dołkowej. Będąc w studzienkach, dokładnie spłucz kosze przy użyciu 70% etanolu. Następnie należy przystąpić do obrazowania próbek.

Bardzo ważne jest, aby oszacować jakość sond RNA przed ich użyciem. Sondy można sprawdzić na żelu formaldehydowym. Jeśli pojawiają się jako jasne, dyskretne paski, są dobrej jakości.

Podczas barwienia pewne różnice w rozmieszczeniu są normalne wśród replik biologicznych, a także wśród siedmiu par uchyłków poszczególnych jelit. Dlatego najlepiej jest zabarwić co najmniej pięć wnętrzności na stan, aby zorientować się w przeciętnym wzorze barwienia. Ogólny sukces najlepiej ocenić, porównując barwienie próbek zmysłowych i antysensownych dla każdego stanu.

Oba muszą być rozwijane przez ten sam czas. Próbki sensoryczne powinny mieć minimalny lub żaden fioletowy kolor, podczas gdy próbki antysensowne powinny wykazywać mocne zabarwienie z minimalnym tłem. Krytycznie, tkanki muszą być całkowicie zanurzone w plamie, aby zapewnić równomierną ekspozycję.

Ważne jest, aby uniknąć nadmiernego rozwoju reakcji barwiącej. Może to spowodować dużą ilość barwienia tła, a próbki wyczuwalne mogą zacząć wyglądać jak próbki antysensowne. Innym czynnikiem wpływającym na wyniki jest to, ile kleszczy jest wcześniej karmione.

Kleszcze, które nie są karmione lub karmione tylko przez 24 godziny, są trudne do pracy. Ich jelita łatwiej ulegają uszkodzeniom i nie plamią się dobrze. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch i pół do trzech dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby przed rozpoczęciem eksperymentu przygotować wszystkie materiały wymienione w tabeli odczynników i materiałów. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.