Name: Metody badania regeneracji w stentorze (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Poznaj metody hodowli i regeneracji komórek Stentor coeruleus na poziomie pojedynczej komórki. Ten protokół umożliwia badanie mechanizmów odbudowy struktur komórkowych przy użyciu mikroskopii świetlnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant NIH R01 GM113602 (WFM) i NSF 1144247 (AL). Dziękujemy Markowi Slabodnickowi i Natalie Kirkland za opracowanie wstępnych wersji niektórych z tych protokołów oraz za pouczające dyskusje. Dziękujemy Karinie Perlazie i Greysonowi Lewisowi za krytyczną lekturę rękopisu.

<ol><li>Kirschner, M., Gerhart, J., Mitchison, T. <a target="_blank" href="http://www.cell.com/cell/abstract/S0092-8674(00)81685-2">Molecular "vitalism".</a> Cell. 100 (1), 79-88 (2000).</li>
<li>Shulman, J. M., St Johnston, D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10611685">Pattern formation in single cells.</a> Trends in Cell Biology. 9 (12), M60-M64 (1999).</li>
<li>Wloga, D., Frankel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+molecules+to+morphology%3A+cellular+organization+of+Tetrahymena+thermophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">From molecules to morphology: cellular organization of Tetrahymena thermophila.</a> Methods in Cell Biology. 109, 83-140 (2012).</li>
<li>Frankel, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFrankel%2C+J+%22Pattern+Formation%3A+Ciliate+Studies+and+Models%22">Pattern Formation: Ciliate Studies and Models</a>. , Oxford University Press. Oxford. (1989).</li>
<li>Tartar, V. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jez.1401310105/full">Grafting experiments concerning primordium formation in Stentor coeruleus.</a> Journal of Experimental Zoology Part A. 131 (1), 75-121 (1956).</li>
<li>Lillie, F. R. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jmor.1050120105/abstract">On the smallest parts of Stentor capable of regeneration; a contribution on the limits of divisibility of living matter.</a> Journal of Morphology. 12 (1), 239-249 (1896).</li>
<li>Morgan, T. H. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/1535709">Regeneration of proportionate structures in Stentor.</a> The Biological Bulletin. 2 (6), 311-328 (1901).</li>
<li>Slabodnick, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+macronuclear+genome+of+Stentor+coeruleus+reveals+tiny+introns+in+a+giant+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The macronuclear genome of Stentor coeruleus reveals tiny introns in a giant cell.</a> Current Biology. 27 (4), 569-575 (2017).</li>
<li>Tang, S. K. Y., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-repairing+cells%3A+How+single+cells+heal+membrane+ruptures+and+restore+lost+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Self-repairing cells: How single cells heal membrane ruptures and restore lost structures.</a> Science. 356 (6342), 1022-1025 (2017).</li>
<li>Slabodnick, M., Prevo, B., Gross, P., Sheung, J., Marshall, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+cytoplasmic+flow+during+single-cell+wound+healing+in+Stentor+coeruleus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Visualizing cytoplasmic flow during single-cell wound healing in Stentor coeruleus.</a> Journal of Visualized Experiments. 82 (82), 50848(2013).</li>
<li>Tartar, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTartar%2C+V+%22Biology+of+Stentor%22">Biology of Stentor</a>. , Pergammon Press. Oxford. (1961).</li>
<li>Slabodnick, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinase+regulator+mob1+acts+as+a+patterning+protein+for+stentor+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biology%22%5BJournal%5D)">The kinase regulator mob1 acts as a patterning protein for stentor morphogenesis.</a> PLOS Biology. 12 (5), e1001861(2014).</li>
<li>Harris, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarris%2C+E+%22The+Chlamydomonas+sourcebook%3A+Introduction+to+Chlamydomonas+and+its+laboratory+use%22">The Chlamydomonas sourcebook: Introduction to Chlamydomonas and its laboratory use</a>. 1, Academic Press. Cambridge. (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Hodowla Stentora wiąże się z wieloma wyzwaniami. Po pierwsze, aby przeprowadzić eksperymenty, które wymagają dużej liczby komórek, należy utrzymać dużą liczbę kultur Stentora , ponieważ kultury stają się niezdrowe, gdy stężenie Stentora przekracza 20 komórek / ml. Po drugie, organizmy, które mogą zanieczyścić kultury Stentora , często dzielą się szybciej niż Stentor i przytłaczają kulturę (częstym zanieczyszczeniem są wrotki). Dlatego konieczne jest okresowe sprawdzanie kultury pod mikroskopem i usuwanie zanieczyszczeń. Czasami konieczne jest rozpoczęcie nowej hodowli z niewielkiej liczby komórek uratowanych ręcznie z zanieczyszczonej hodowli. Wydłuża to czas potrzebny do utrzymania zdrowych kultur Stentora . Po trzecie, rozszerzenie pojedynczej komórki do hodowli o objętości 400 ml wymaga co najmniej jednego miesiąca, ponieważ cykl komórkowy Stentor trwa 3 - 5 dni. Po czwarte, w przeciwieństwie do innych orzęsków modelowych, Stentor rzadko przechodzi w postać torbieli i nie można ich zamrozić.
Ważnym aspektem hodowli Stentora jest dobór odpowiedniego organizmu pokarmowego. Wcześniej opisano różne metody hodowli Stentora . Jeden z nich sugeruje użycie odtłuszczonego mleka do hodowli bakterii, które następnie karmią Stentora. Taka technika jest skuteczna w hodowli Stentora; Jednak zastosowanie technik genomicznych wymaga czystych próbek, aby uniknąć nieporozumień wynikających z odczytów genomowych z nieokreślonych organizmów pokarmowych. Korzystając z obecnego protokołu, Stentor może być hodowany masowo, a ponieważ ich pokarm, Chlamydomonas, został zsekwencjonowany, obecność zanieczyszczenia genomowego przez organizm pokarmowy może być wykryta i kontrolowana. Z niewiadomych przyczyn Tatar musiał uzupełnić swoje zapasy, wracając do miejsca, w którym wcześniej zastał Stentora . Dzięki obecnemu protokołowi jesteśmy w stanie zatrzymać Stentor od lat.
Eksperymenty z regeneracją z użyciem Stentora są na ogół proste, ale należy pamiętać o kilku kluczowych szczegółach. Jeśli chodzi o sekcję 2, przecięcie komórek Stentora na pół można opanować w ciągu kilku minut. Opanowanie bardziej zaawansowanych procedur mikrochirurgicznych preparatu Stentor może wymagać tygodnia praktyki. Podczas wykonywania zabiegu sacharozy lub mocznika (sekcja 3), jeśli na początku obrazowania większość komórek nadal ma prążki membranellar, należy wydłużyć czas inkubacji o 10 - 30 s, aby można było przeprowadzić następne leczenie sacharozą. Nie należy wydłużać czasu leczenia sacharozą powyżej 3 minut inkubacji, ponieważ spowoduje to śmierć komórki.
Obrazowanie regeneracji stentora wymaga metod obrazowania dużych komórek przez długi czas. Metoda obrazowania opisana w rozdziale 4 może być stosowana wyłącznie przy użyciu mikroskopu pionowego. Jeśli zamiast tego dostępny jest mikroskop odwrócony, komórki można umieścić na szkiełku podstawowym lub nakrywkowym w małych komorach. Jedną z metod jest stworzenie komory z wazeliny i przykrycie innym szkiełkiem nakrywkowym, aby zapobiec parowaniu. Alternatywnie, komorę na pojedynczą komórkę można wykonać poprzez wykonanie otworu z dziurkaczem o pożądanej wielkości w kwadracie 1 x 1 cm2 z silikonowej przekładki (Tabela Materiałów), umieszczenie przekładki na szkiełku nakrywkowym, umieszczenie komórek w komorze i przykrycie komory kolejnym szkiełkiem nakrywkowym. Podczas obrazowania, jeśli Stentor nie jest w odpowiedniej orientacji, aby zaobserwować charakterystyczne cechy każdego etapu regeneracji, mocno postukaj w płytkę, aby komórka się skurczyła. Obserwuj, jak ogniwo się rozciąga, aby określić etap regeneracji (pełne wyprostowanie trwa około 45 s). Jeśli komórka nadal znajduje się w złej orientacji, powtórz stukanie. Obrazy pokazane na rys. 1 i ryc. 6 zostały wykonane za pomocą mikroskopu stereoskopowego z zoomem; jednak wszystkie szczegółowe eksperymenty można przeprowadzić przy użyciu mikroskopu stereoskopowego 5X.
Kolejnym wyzwaniem, oprócz hodowli i obrazowania Stentora , jest śledzenie regeneracji, a konkretnie czasu potrzebnego do zidentyfikowania etapów. Jeśli komórka regenerująca jest idealnie zorientowana, a obszar zawiązka jamy ustnej jest wyraźnie widoczny, identyfikacja etapu zajmuje kilka sekund. Czasami jednak komórka Stentor znajduje się w orientacji uniemożliwiającej wyraźne przypisanie etapu regeneracji, co zajmuje więcej czasu na identyfikację. Znaczna ilość czasu potrzebna do etapowania poszczególnych regenerujących się komórek może opóźnić kwantyfikację wszystkich regenerujących się komórek, zmniejszając w ten sposób czasową precyzję etapowania i wymagając od obserwatora oczekiwania i ponownego zobrazowania komórki po tym, jak przejdzie do nowej orientacji. W związku z tym eksperyment ten jest zarówno czasochłonny, jak i pracochłonny. Z tych powodów wysoce pożądane byłoby opracowanie zautomatyzowanych metod wykrywania komórek Stentora i przypisywania etapów regeneracji w danych z mikroskopii wideo. Pozwoliłoby to również na bardziej powtarzalne eksperymenty, zwiększenie wielkości próby i usunięcie ludzkich uprzedzeń.
Pojawienie się wysoce czułych metod genomicznych i proteomicznych zaczęło otwierać badania nad pojedynczymi komórkami. W przypadku takich analiz jednokomórkowych gigantyczny rozmiar komórki Stentora sprawia, że jest ona pożądanym obiektem testowym dla eksperymentów potwierdzających słuszność koncepcji. Aby takie eksperymenty były możliwe, hodowla Stentora ma fundamentalne znaczenie, a zatem opisane tutaj metody powinny odegrać rolę w dalszym rozwoju bardziej zaawansowanych technik jednokomórkowych.

Komórki nie są zwykłymi workami enzymów, ale raczej bardzo złożonymi maszynami, których komponenty są starannie skalowane do odpowiednich rozmiarów i rozmieszczone w dobrze zdefiniowanych pozycjach. Morfogeneza poszczególnych komórek stanowi kluczowy proces w biologii komórkowej i rozwojowej, ale jej mechanizm molekularny jest nieznany1,2. Podczas gdy niektóre hodowane komórki przypominają plamy, organizmy jednokomórkowe mogą mieć niezwykle skomplikowaną architekturę, czego przykładem są złożone wzorce korowe widoczne w orzęskach3,4.
Być może najbardziej ekstremalnym przykładem wysoce zbudowanej komórki jest Stentor coeruleus, gigantyczny heterotrychiczny orzęsek daleko spokrewniony z Tetrahymena i Paramecium. Stentor ma 1 mm długości i jest pokryty ponad 100 podłużnymi paskami niebieskiego pigmentu na przemian z rzędami rzęsek zorganizowanych równoległymi stosami wstążek mikrotubul, które biegną przez całą komórkę. Komórka ma kształt trąbki (<klasa silna = "xfig" >Ryc. 1), z pasmem błoniastym i aparatem ustnym (OA) na jej przednim końcu oraz uchwytem, który przyczepia komórkę do podłoża na jej tylnym końcu. Oprócz wyraźnej polaryzacji przednio-tylnej, komórka wykazuje również charakterystyczny wzór chiralny, tak że odstępy między rzędami rzęsek stopniowo zwiększają się w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara. Powoduje to nieciągłość, w której najwęższy rząd spotyka się z najszerszym rzędem, a ten obszar powierzchni komórki, znany jako locus kontrastu prążkowanego, może indukować tworzenie drugiego zestawu przednich struktur końcowych po przeszczepieniu na inną komórkę5, co czyni go formalnie równoważnym Organizatorowi Spemanna. Tak więc wszystkie kluczowe procesy biologii rozwoju mają swoje odpowiedniki w Stentorze: aksjonacja, tworzenie wzorców i indukcja. W zarodku procesy te są napędzane przez różnice w losie między różnymi komórkami, ale w Stentorze muszą być napędzane przez różnice losu między różnymi regionami w jednej komórce. To, co definiuje różnice między regionami w Stentorze, pozostaje tajemnicą.
Jeśli jakakolwiek część Stentora zostanie odcięta, brakująca część komórki może się zregenerować, aby w ciągu kilku godzin uzyskać normalną komórkę. Jeśli komórka zostanie przecięta na pół lub nawet na znacznie mniejsze kawałki, każdy fragment reorganizuje się w normalnie wyglądającą, ale mniejszą komórkę i przywraca właściwą proporcję między częściami komórki6,7. Nawet maleńkie fragmenty, 1/64 wielkości oryginalnej komórki, są w stanie zregenerować się do małej, ale normalnie proporcjonalnej komórki, a następnie urosnąć do pełnego rozmiaru6. Projekt Stentor stanowi zatem wyjątkową okazję do zbadania mechanizmów skalowania wielkości organelli i regulacji wzrostu komórek za pomocą metod chirurgicznych, które są zwykle stosowane na poziomie tkanek lub całych organizmów.
Jedną z właściwości Stentora, która pozwala mu na regenerację po wielu operacjach chirurgicznych, jest to, że zawiera on pojedyncze guzkowate makrojądro (<silna klasa="xfig">Rysunek 1) z około 50 000 kopii całego genomu8. Dopóki fragment komórki zawiera co najmniej jeden węzeł makrojądrowy, ma zdolność do pełnej regeneracji. Inną właściwością leżącą u podstaw zdolności regeneracji Stentora jest jego niesamowita zdolność gojenia się ran. Chociaż wiele typów komórek jest zdolnych do leczenia swoich ran9, Stentor jest w stanie wyzdrowieć z niezwykłego zakresu zaburzeń fizycznych. Przykład odzyskania Stentora po drastycznych zaburzeniach, wraz z metodami wizualizacji przepływu cytoplazmatycznego w Stentor10 został wcześniej opisany. Metody te pozwalają na badanie, w jaki sposób zranienie i późniejsza regeneracja wpływają na stan fizyczny cytoplazmy.
Ogromne rozmiary Stentora, niezwykła zdolność do regeneracji oraz fakt, że manifestuje on wiele zjawisk rozwojowych obserwowanych w wielokomórkowych embrionach (takich jak organizatorzy, aksjonacja i wzory) przyciągnęły wielu biologów rozwojowych na przełomie XIX i XX wieku, w tym Thomasa Hunta Morgana7. W latach 50-tych i 60-tych metody mikrochirurgiczne wykazały zaskakujący wachlarz procesów regeneracyjnych i morfogenetycznych w tym jednokomórkowym organizmie11. Jednak Stentor został opracowany jako model systemu biologii molekularnej dopiero niedawno. W ciągu ostatnich kilku lat genom Stentora został zsekwencjonowany i złożony w 8, a następnie opracowano metodę zakłócania ekspresji genów za pomocą RNAi poprzez karmienie12.
Jednym z powodów, dla których Stentor dopiero niedawno stał się organizmem modelowym dla nowoczesnej biologii molekularnej, była trudność w hodowli dużych kultur ze względu na jego długi cykl komórkowy (3 do 5 dni). Jednak nowoczesne metody genomiczne i proteomiczne wymagają mniej materiału niż kiedyś, a objętość pojedynczej komórki Stentora jest wystarczająca dla tych metod, nawet bez uciekania się do ultraczułych metod, które zostały opracowane do analizy pojedynczych komórek, które są znacznie mniejsze niż Stentor. Sekcja 1 protokołu szczegółowo opisuje procedurę tworzenia dużej hodowli z pojedynczej komórki Stentora. To samo podejście można zastosować do stworzenia dużej kultury z fragmentu komórki uzyskanego przez przecięcie komórki. Sekcja 1 zawiera również wytyczne dotyczące utrzymywania zdrowych kultur Stentor przez długi czas. Sekcja 2 protokołu zawiera metodologię indukowania regeneracji komórek poprzez ręczne cięcie komórek szklaną igłą. Sekcja 3 protokołu poświęcona jest dwóm metodom indukowania regeneracji określonych struktur komórkowych (pasmo błoniaste i aparat doustny): traktowanie komórek sacharozą lub mocznikiem prowadzi do złuszczania tych struktur, a następnie do ich regeneracji. Sekcja 4 protokołu szczegółowo opisuje metodę obrazowania poszczególnych regenerujących się komórek w długich okresach czasu. Rozdział 4 kończy się opisem etapów regeneracji oraz wskazówkami dotyczącymi analizy dynamiki regeneracji.

<table><tbody><tr><td>Stentor coeruleus żywa kultura</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>131598</td><td></td></tr><tr><td>Chlamydomonas reinhardtii na agarze</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>152040</td><td></td></tr><tr><td>Pasteryzowana woda źródlana, butelka</td><td>1 litr Carolina Biological Supply</td><td>132458</td><td></td></tr><tr><td>Metyloceluloza, 1500 cP</td><td>Millipore Sigma</td><td>M0387</td><td></td></tr><tr><td>Szklana płytka punktowa Pyrex</td><td>Fisher Scientific</td><td>13748B</td><td></td></tr><tr><td>Szklany słoik z szerokim otworem i zakrętką, 60 ml</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>715740</td><td></td></tr><tr><td>Szklany pojemnik na 2 filiżanki ze szklaną pokrywką</td><td>Pyrex</td><td>1095600</td><td></td></tr><tr><td>Materiał arkusza silikonowego CultureWell</td><td>Grace Bio Labs</td><td>664475</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly Clark</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Rurka do mikrowirówek Posi-Click 1,7 ml</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td></td></tr><tr><td>Szkło osłonowe</td><td>Fisher finest</td><td>12-548-B</td><td></td></tr><tr><td>TAP Pożywka wzrostowa, zoptymalizowana pod kątem hodowli Chlamydomonas</td><td>ThermoFisher</td><td>A1379801</td><td></td></tr><tr><td>Silikonowa przekładka, arkusz silikonowy CultureWell, grubość 0,25 mm / 13 cm x 18 cm</td><td>Grace Bio Labs</td><td>664475</td><td></td></tr><tr><td>Wazelina, wazelina, białe</td><td>widmo</td><td>P1037</td><td></td></tr><tr><td>Rurki kapilarne ze szkła borokrzemianowego. OD: 1,2 mm, ID: 0,9 mm, długość: 10 cm.</td><td>Sutter Instrument</td><td>B120-90-10</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz igieł P-87</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stemi 2000 mikroskop stereoskopowy</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiozoom V16, stereoskopowy mikroskop zmiennoogniskowy</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

metody badania regeneracji w stentorze

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Komórki muszą być w stanie zregenerować swoje części, aby odzyskać siły po zewnętrznych zakłóceniach. Jednokomórkowy rzęsek Stentor coeruleus jest doskonałym organizmem modelowym do badania gojenia się ran i późniejszej regeneracji komórek. Genom Stentora stał się dostępny niedawno, wraz z nowoczesnymi metodami biologii molekularnej, takimi jak RNAi. Narzędzia te umożliwiają badanie regeneracji pojedynczych komórek na poziomie molekularnym. Pierwsza sekcja protokołu obejmuje tworzenie kultur komórek Stentor z pojedynczych komórek lub fragmentów komórek, wraz z ogólnymi wytycznymi dotyczącymi utrzymywania kultur Stentora. Hodowla Stentora w dużych ilościach pozwala na wykorzystanie cennych narzędzi, takich jak biochemia, sekwencjonowanie i spektrometria mas. Kolejne sekcje protokołu obejmują różne podejścia do wywoływania regeneracji u Stentora. Ręczne cięcie komórek szklaną igłą pozwala na badanie regeneracji dużych części komórek, podczas gdy traktowanie komórek sacharozą lub mocznikiem pozwala na badanie regeneracji określonych struktur znajdujących się na przednim końcu komórki. Podano metodę obrazowania poszczególnych regenerujących się komórek wraz z rubryką do oceny stopnia zaawansowania i analizy dynamiki regeneracji. Cały proces regeneracji podzielony jest na trzy etapy. Wizualizując dynamikę progresji populacji komórek przez kolejne etapy, wykazano niejednorodność czasu regeneracji.

Stentor kultury zostały w sposób wiarygodny ustanowione i utrzymane z pojedynczych komórek lub fragmentów komórek zgodnie z Sekcją 1 protokołu. Reprezentatywny przykład dużej, zdrowej kultury pokazano w Video 1.
Przebieg czasowy regeneracji zmierzono u Stentor, stosując metodę indukcji regeneracji za pomocą sacharozy opisaną w kroku 3.1, w połączeniu z metodą obrazowania i analizy omówioną w sekcji 4 (Rycina 7). Wykres ten wskazuje, że czas potrzebny populacji komórek na osiągnięcie dowolnego konkretnego etapu rozciąga się w przedziale jednej godziny. Ten rodzaj analizy pozwala na badanie heterogeniczności czasowej procesu regeneracji w populacji regenerujących się komórek.
Poniżej przedstawiono podsumowanie czasu regeneracji zaobserwowanego do tej pory po kilkudziesięciu zabiegach z użyciem sacharozy (Rycina 4 i Rycina 6). Etap 1 następuje, gdy komórki Stentor przypominają krople łez i nie posiadają pasma membranellarnego (etap ten rozpoczyna się bezpośrednio po wypłukaniu sacharozy). Etap ten trwa od 3 do 6 h. Etap 2 to moment, w którym pojawia się i rozwija pasmo membranellarne (3–6 h po zabiegu z sacharozą). Etap ten trwa od 3 do 4 h. Etap 3 polega na pojawieniu się primordium oralnego na tylnym końcu pasma membranellarnego (6–8 h po zabiegu z sacharozą), a następnie przesunięciu obu struktur w stronę przedniego końca komórki. Etap ten trwa od 1 do 2 h. Moment, w którym zarówno pasmo membranellarne, jak i aparat oralny dotarły do przedniego końca komórki, oznaczał zakończenie regeneracji. Komórka przybrała charakterystyczny dla Stentor kształt przypominający trąbkę. Komórki uległy całkowitej regeneracji 8–9 h po zabiegu z sacharozą.
<img alt="Schemat Paramecium z etykietami: pas błonowy, aparat gębowy, wakuola, makronukleus, dysk przylepny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Zdjęcie Stentor. Pas błonowy oraz aparat gębowy widoczne są na przednim końcu komórki. Dysk przylepny znajduje się na tylnym końcu komórki. Makronukleus Stentor jest guzkowaty. Dobrze odżywiony Stentor posiada zielone wakuole pokarmowe zawierające głównie Chlamydomonas. Pasek skali wynosi 0.5 mm. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Ustawienie mikroskopu stereoskopowego z szkiełkiem przedmiotowym, organizm Stentor w kropli do analizy mikroskopowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Ustawienie do cięcia Stentor. Cięcie komórki wykonuje się poprzez ręczne manipulowanie szklaną igłą podczas obserwacji komórki przy użyciu dostępnego komercyjnie mikroskopu stereoskopowego. Ręcznik papierowy służy do zapewnienia białego tła w celu lepszej widoczności komórek. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obrazy mikroskopowe; etapy podziału komórkowego w polach widzenia mikroskopu; obserwacja eksperymentalna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Klatki z filmu 3 ilustrujące sposób przecinania Stentor za pomocą szklanej igły. (A) Stentor bezpośrednio przed dotknięciem go igłą. (B) Stentor delikatnie ściśnięty między igłą a szkiełkiem przedmiotowym. (C) Skurczony Stentor reagujący na nacisk igły. (D) Stentor w trakcie przecinania poprzez delikatny nacisk boku igły na komórkę. (E) Stentor przecięty na dwie części, lecz jeszcze nie rozdzielony. (F) Dwa fragmenty Stentor. Pasek skali wynosi 0.25 mm. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat procesu regeneracji Stentor; szok sacharozą/mocznikiem; etapowe przemywanie komórek; obrazowanie mikroskopowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig4v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Schematyczna wizualizacja sekcji 3 i 4 protokołu. Jest to zilustrowany protokół przeprowadzania zabiegu sacharozą lub mocznikiem oraz obserwacji regeneracji komórek. Czas wskazany w dolnym panelu mierzony jest od rozpoczęcia etapu Wash 1. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig4v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Układ mikroskopu stereoskopowego z 9-dołkową płytką do analizy kropel pod szkiełkiem nakrywnym." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Układ do obrazowania i/lub bezpośredniej obserwacji regeneracji za pomocą mikroskopu pionowego. W każdej 4 µL kropli zwisającej ze szkiełka nakrywnego znajduje się jedna komórka ulegająca regeneracji. Woda w dołkach szklanej płytki ogranicza parowanie kropel. Układ ten umożliwia równoległe śledzenie regeneracji wielu komórek. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza mikroskopowa komórek roślinnych, seria obrazów pokazująca zmienność struktury komórek, badanie mikroskopowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6. Zdjęcia Stentor w każdym stadium regeneracji pasma membranellarnego i aparatu gębowego. (A) Stadium 1 charakteryzuje się kształtem komórki przypominającym łzę oraz brakiem pasma membranellarnego. (B) Stadium 2 charakteryzuje się pojawieniem się pasma membranellarnego, struktury rzęskowej, która uderza w sposób ciągły. Pasma membranellarne są zaznaczone białymi przerywanymi liniami na panelach B - D. (C i D) Stadium 3 charakteryzuje się pojawieniem się primordium gębowego (zaznaczonego strzałką). Primordium gębowe wygląda jak invaginacja na tylnym końcu pasma membranellarnego. Primordium gębowe przesuwa się następnie ku przedniej części komórki, aby przekształcić się w aparat gębowy. (E) Regeneracja kończy się, gdy komórka przyjmuje charakterystyczny dla Stentor kształt trąbki, a aparat gębowy (zaznaczony strzałką) rozszerza się na przednim końcu komórki. Pasek skali wynosi 0.25 mm. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Etapy cyklu komórkowego w funkcji czasu od szoku sacharozowego; wykres słupkowy; analiza rozkładu etapów komórkowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rysunek 7. Skumulowany wykres pudełkowy pokazujący, jak zmieniają się w czasie proporcje komórek we wszystkich etapach regeneracji po traktowaniu sacharozą. Wykres obrazuje heterogeniczność czasową etapów regeneracji w populacji regenerujących się komórek. "Reg. end" oznacza zakończenie regeneracji. Liczba komórek: 28. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig7large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Zawiesina komórek drożdży w zlewce; kultura mikrobowa; proces fermentacji; zestaw do eksperymentu biologicznego." src="/files/ftp_upload/57759/57759video1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Film 1"> 
Film 1. Przykład zdrowej kultury Stentor. Zazwyczaj, gdy kultura jest tak zagęszczona, zaleca się jej rozdzielenie. <a href="/files/ftp_upload/57759/Video1.mp4" target="_blank">Kliknij tutaj, aby obejrzeć ten film. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.)</a>
<img alt="Kropla z zawieszonymi cząstkami; obraz mikroskopowy przedstawiający napięcie powierzchniowe i zanieczyszczenia." src="/files/ftp_upload/57759/57759video2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Film 2"> 
Film 2. Spowalnianie Stentor za pomocą metylocelulozy. <a href="/files/ftp_upload/57759/Video2.mov" target="_blank">Kliknij tutaj, aby obejrzeć ten film. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).</a>
<img alt="Eksperyment mikrofluidyczny z kroplą na cienkim drucie; schemat do badań nad dynamiką płynów." src="/files/ftp_upload/57759/57759video3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Film 3"> 
Film 3. Cięcie Stentor. Poszczególne komórki można ręcznie podzielić na kilka części pod stereo-mikroskopem sekcyjnym, przebijając komórkę szklaną igłą. <a href="/files/ftp_upload/57759/Video3.mov" target="_blank">Kliknij tutaj, aby obejrzeć ten film. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Problem z kulturą</td>
			<td >Możliwe rozwiązanie</td>
			<td >Możliwa profilaktyka</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Kultura jest zdominowana przez wrotki lub inne duże organizmy.</td>
			<td >Przenieść jak najwięcej Stentor do nowej szalki hodowlanej. Następnie trzykrotnie wyprać komórki.</td>
			<td >Dokładnie wyprać Stentor po otrzymaniu, nawet jeśli zostały zakupione od komercyjnego dostawcy.</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Kultura jest zdominowana przez grzyby lub inne małe organizmy.</td>
			<td >Zidentyfikować obszar, w którym znajduje się najmniej Stentor. W tym obszarze usunąć jak najwięcej medium, starając się nie usunąć wielu Stentor, i dolać nowe PSW. Wymieszać delikatnie, ale dokładnie, aby rozproszyć organizmy inwazyjne. Pominąć następne karmienie, a Stentor zjadą zanieczyszczenia.</td>
			<td >Regularnie obserwować kulturę i usuwać małe zanieczyszczenia poprzez wymianę medium na świeże PSW.</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Stentor nakładają się na siebie.</td>
			<td >Rozdzielić kulturę tak, aby stężenie wynosiło mniej niż 20 cells/mL.</td>
			<td >Częściej rozdzielać kultury.</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Komórki Stentor koją się.</td>
			<td >Karmić co 4 dni zamiast co 5 dni.</td>
			<td></td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Kultura zawiera dużo ciemnego materiału odpadowego.</td>
			<td >Usunąć jak najwięcej ciemnego materiału (odchodów Stentor), nie usuwając komórek. Jeśli Stentor są przytwierdzone do ciemnego materiału, pipetować w górę i w dół, aby uwolnić komórki Stentor z ich odchodów, a następnie usunąć medium wraz z odpadami, nie usuwając komórek. Alternatywnie usunąć te Stentor i odpowiednio zmniejszyć ilość podawanego pokarmu.</td>
			<td >Podawać Stentor o 1 mL mniej pokarmu na każde 100 mL kultury.</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Niewłaściwy wygląd Stentor (uwakuolowane/opuchnięte lub zaokrąglone).</td>
			<td >Usunąć jak najwięcej medium, starając się nie usunąć wielu komórek Stentor, i dodać nowe PSW.</td>
			<td >Regularnie wymieniać medium.</td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 1. Przewodnik rozwiązywania problemów przy hodowli Stentor.

Gigantyczny orzęsek, Stentor coeruleus, jest doskonałym systemem do badania regeneracji i gojenia się ran. Przedstawiono procedury zakładania hodowli komórek Stentor z pojedynczych komórek lub fragmentów komórek, indukowania regeneracji poprzez cięcie komórek, chemicznej indukcji regeneracji pasma błoniastego i aparatu jamy ustnej, obrazowania i analizy regeneracji komórek.

Metody badania regeneracji w stentorze

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model ...

Ogólnym celem tego protokołu jest wyhodowanie Stentorów do wykorzystania ich jako organizmu modelowego do badania regeneracji na poziomie pojedynczej komórki. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii komórki, takie jak to, w jaki sposób komórki budują struktury z dyskretnych części. Główną zaletą Stentora jest to, że są to pojedyncze komórki, które mogą się regenerować i są wystarczająco duże, aby przeprowadzić na nich operację.Ogólnie rzecz biorąc, wyzwaniem w tym protokole jest to, że ludzie są przyzwyczajeni do pracy z komórkami jako kulturami, a nie jako osobami. Zacznij od wyszukania płytki Petriego zawierającej próbkę Stentora pod mikroskopem stereoskopowym przy użyciu ukośnego światła przy 5-krotnym powiększeniu. Zauważ, że komórki Stentora wykazują kształt podobny do trąbki, gdy są przymocowane do podłoża.Nieprzyłączone, pływające komórki stentorowe mają mniej wydłużony wygląd. Za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra przenieś pojedyncze komórki Stentor do studzienki szklanej płytki punktowej zawierającej co najmniej 100 mikrolitrów dostępnej w handlu pasteryzowanej wody źródlanej. Następnie usuń około 90% wody ze studni bez usuwania komórek Stentora i dodaj 500 mikrolitrów świeżej pasteryzowanej wody źródlanej do studzienki trzy razy, aby umyć komórki.Aby nakarmić komórki, najpierw przenieś jednomililitrową porcję z kultury Chlamydomonas do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej do wirowania przy 2 095 g przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Ponownie zawiesić granulki w jednym mililitrze pasteryzowanej wody źródlanej do drugiego odwirowania, a następnie ponownie zawiesić w 500 mikrolitrach pasteryzowanej wody źródlanej. Jeśli potrzebna jest klonalna hodowla Stentora, przenieś 500 mikrolitrów kondycjonowanej pożywki na kulturę do indywidualnych dołków szklanej płytki punktowej i przenieś jedną komórkę Stentora do każdej studzienki pożywki.Podawaj każdej kulturze Stentor pięć mikrolitrów przygotowanych Chlamydomonas co 48 godzin i trzymaj kultury w zacienionym miejscu. Policz liczbę nowych komórek Stentora przed każdym karmieniem i odpowiednio dostosuj objętość dostarczonych Chlamydomonów. Co 96 godzin delikatnie odpipetować pożywkę hodowlaną kilka razy, aby odłączyć Stentor od menisku każdej studzienki i użyć pipety o pojemności jednego mililitra, aby ostrożnie zassać pożywkę z dołków bez usuwania jakichkolwiek komórek.Następnie dodaj 500 mikrolitrów świeżej kondycjonowanej pożywki do każdej studzienki. Gdy liczba komórek w co najmniej jednej studzience przekroczy 20, dodaj 20 mililitrów pasteryzowanej wody źródlanej do autoklawowanego sterylizowanego szklanego słoika z szerokimi ustami i ostrożnie odłącz komórki Stentora od dna każdej studzienki, jak pokazano. Zbierz wszystkie komórki Stentor za pomocą jednomililitrowej pipety i delikatnie przenieś komórki do szklanego słoika.Dodawaj świeżą pasteryzowaną wodę źródlaną do słoika co 48 godzin, aby utrzymać gęstość Stentora na poziomie około 20 komórek na mililitr i nakarm komórki Stentora 200 do 1 000 mikrolitrów przygotowanych Chlamydomonas. Gdy objętość kultury osiągnie około 90% pojemności słoika, przenieś całą zawartość słoika do szklanego pojemnika na dwie filiżanki, podając kulturom Stentor o dużej objętości dwa mililitry przygotowanych Chlamydomonas na 100 mililitrów kultury i dodając pasteryzowaną wodę źródlaną do kultury co cztery do pięciu dni, aby utrzymać gęstość Stentora na poziomie około 20 komórek na mililitr. Raz w tygodniu sprawdzaj kultury pod mikroskopem preparacyjnym 5X pod kątem wrotków, grzybów i innych wzrostów za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra, aby usunąć wszelkie zanieczyszczające mikroorganizmy wraz z nieprawidłowo ukształtowanymi i bezbarwnymi komórkami Stentora.Podziel kulturę, gdy szklany pojemnik jest wypełniony w około 90%, dodając do kultury 25 mililitrów pasteryzowanej wody źródlanej i używając 50-mililitrowej pipety, aby odłączyć Stentor od szkła, jak pokazano. Następnie przenieś około 50% kultury do nowego szklanego pojemnika na dwie filiżanki. Aby wywołać regenerację przez fragmentację komórek, najpierw użyj ściągacza do igieł, aby wykonać kilka igieł z rurek kapilarnych.Następnie zbierz jeden zdrowy Stentor o określonym kształcie trąbki, żywym niebiesko-zielonym kolorze i bez dużych wakuoli w kropli o pojemności dwóch mikrolitrów. Umieść kroplę na szkiełku i zwolnij ruch Stentora za pomocą dwóch mikrolitrów 4% metylocelulozy. Umieść kroplę pod mikroskopem preparacyjnym i trzymaj szklaną igłę jak najbardziej równolegle do powierzchni cięcia, aby zapobiec złamaniu igły.Delikatnie dociśnij skurczony Stentor bokiem igły, aby oddzielić przedni koniec komórki od tylnego końca komórki. Upewnij się, że oba fragmenty mają co najmniej jeden węzeł makrojądrowy i przenieś fragmenty do pojedynczych studzienek szklanej płytki punktowej. Aby wywołać regenerację pasma błoniastego i aparatu ustnego, przenieś od 30 do 60 komórek Stentora w jednym mililitrze pożywki hodowlanej do probówki mikrowirówkowej i użyj pipety o pojemności 200 mikrolitrów, aby zebrać wszystkie komórki z probówki w jednym pobraniu objętości 125 mikrolitrów.Dozuj komórki do probówki zawierającej 500 mikrolitrów świeżo przygotowanej 25% sacharozy i uruchom stoper. Po obracaniu komórek w probówce w stojaku przez jedną minutę, zbierz wszystkie komórki w jednym pobraniu o pojemności 200 mikrolitrów i przytrzymaj komórki w końcówce pipety, aż stoper wyświetli dwie minuty leczenia sacharozą. Następnie wyrzuć Stentor do probówki mikrowirówki zawierającej jeden mililitr pasteryzowanej wody źródlanej do trzech myć wirowaniem.Aby zobrazować regenerację, dodaj 100 mikrolitrów pasteryzowanej wody źródlanej do jednej studzienki szklanej płytki punktowej i użyj końcówki pipety o pojemności 20 mikrolitrów, aby zebrać jedną komórkę Stentor w czterech mikrolitrach pożywki hodowlanej. Umieść kroplę w środku szkiełka nakrywkowego o wymiarach 22 na 22 milimetry kwadratowe i umieść cztery kolejne kropelki wokół poprzedniej kropli. Odwróć szkiełko nakrywkowe i delikatnie umieść je nad studzienką z pasteryzowaną wodą źródlaną.Następnie zobrazuj regenerujące się komórki pod mikroskopem świetlnym z odpowiednią rozdzielczością czasową. Podczas pierwszego etapu regeneracji, który następuje bezpośrednio po wypłukaniu sacharozy, komórki stentora wyglądają jak łzy bez żadnego pasma błoniastego. Po trzech do sześciu godzinach pojawia się pasmo błoniaste.Ten etap, etap drugi, trwa kolejne trzy do czterech godzin. Etap trzeci występuje, gdy zawiązek jamy ustnej pojawia się na tylnym końcu pasma błoniastego i obie struktury zaczynają poruszać się w kierunku przedniego końca komórki. Ten etap trwa od jednej do dwóch godzin.Kiedy zarówno pasmo błoniaste, jak i aparat ustny dotrą do przedniego końca komórki, regeneracja jest zakończona, a komórka przyjmie charakterystyczny kształt przypominający trąbkę Stentora. Wykreśl procent komórek na każdym etapie regeneracji w każdym punkcie czasowym na skumulowanym wykresie pudełkowym. Pomiar czasu regeneracji po przecięciu komórek i poddaniu działaniu sacharozy ujawnia godzinny rozrzut w czasie potrzebnym populacji komórek do osiągnięcia określonego etapu, co świadczy o niejednorodności czasowej procesu regeneracji w danej populacji regenerujących się komórek.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak hodować Stentor i inicjować ich regenerację oraz określać ją ilościowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o cierpliwości. Stentor potrzebuje od trzech do pięciu dni, aby podzielić się w kulturze, a identyfikacja etapów regeneracji Stentora wymaga praktyki.Technika ta utoruje drogę naukowcom zajmującym się biologią komórki do zbadania regeneracji w Stentorze.

methods-for-the-study-of-regeneration-in-stentor

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Atrakcyjnym modelem do badania różnicowania się komórek macierzystych w żywym organizmie jest płaskonic z rzędu Planarioidea. Regenerację bada się za pomocą prostych eksperymentów z amputacją, które można łatwo przeprowadzić w podstawowym laboratorium i które poddaje się manipulacjom farmakologicznym oraz genetycznym (in vivo RNAi), zgodnie ze szczegółowymi protokołami zawartymi w niniejszym artykule.

Badania farmakologiczne i funkcjonalne badania genetyczne w celu manipulacji regeneracją planarii Dugesia japonica

Opisano skuteczną metodę przeszczepiania tkanek o określonym i powtarzalnym rozmiarze pomiędzy planariami. Uwzględniono również opis tego, w jaki sposób technikę unieruchamiania stosowaną podczas transplantacji można zaadaptować, przy użyciu osłon ołowianych, do częściowego napromieniowania żywych zwierząt.

Unieruchomienie planarii, częściowe napromieniowanie i transplantacja tkanek

Opisano model implantacji stentu w tętnicy szyjnej myszy. W porównaniu z innymi podobnymi metodami, procedura ta jest bardzo szybka, prosta i dostępna, oferując możliwość zbadania w wygodny sposób reakcji ściany naczyniowej na różne stenty uwalniające leki oraz molekularnych mechanizmów restenozy.

Mysi model implantacji stentu w tętnicy szyjnej do badania restenozy

Gigantyczny orzęsek Stentor coeruleus to klasyczny system do badania regeneracji i gojenia się ran w pojedynczych komórkach. Poprzez obrazowanie komórek Stentora jednocześnie przy małym i dużym powiększeniu, można mierzyć przepływy cytoplazmatyczne przed, w trakcie i po zranieniu.

Wizualizacja przepływu cytoplazmatycznego podczas gojenia się ran jednokomórkowych w stentorze sinawym

Ponieważ wiele modeli chorób neurologicznych i nieneurologicznych u danio pręgowanego jest badanych na dorosłych rybach, a nie na zarodkach/larwach, opracowaliśmy ilościowy test regeneracyjny linii bocznej, który może być zastosowany do modeli chorób u dorosłych ryb danio pręgowanego. Test polegał na rozdzielczości na poziomie 1) neuromastu i 2) poszczególnych komórek rzęsatych.

Test do regeneracji linii bocznej u dorosłych danio pręgowanych

Tutaj prezentujemy protokół, który opiera się na wycinkach rdzenia kręgowego hodowanych na układach wieloelektrodowych w celu zbadania funkcjonalnej regeneracji połączeń propriordzeniowych in vitro.

Badanie regeneracji funkcjonalnej w organotypowych kokulturach rdzenia kręgowego hodowanych na matrycach wieloelektrodowych

W tym badaniu pokazano protokół wideo krok po kroku resekcji wierzchołkowej. Resekcja wierzchołkowa jest ostatnio wyróżnionym podejściem chirurgicznym w badaniach nad regeneracją serca u ssaków. Badanie to może promować zastosowanie resekcji wierzchołkowej jako standardowej metodologii w badaniach nad mechanizmem leżącym u podstaw regeneracji serca.

Mysi model resekcji wierzchołkowej do badania wczesnej regeneracji serca ssaków

Tutaj pokazujemy, jak indukować i monitorować regenerację u ukwiału gwiazdkowego Nematostella vectensis, modelowego antozoana parzydełkowego.  Pokazujemy, jak amputować i kategoryzować regenerację za pomocą morfologicznego systemu oceny stopnia zaawansowania, a także używamy tego systemu, aby ujawnić wymóg autofagii w regeneracji struktur polipowych.

Indukowanie całkowitej regeneracji polipów z pęcherza brzusznego ukwiału gwiazdkowego Nematostella vectensis

Przedstawiamy protokół charakteryzacji ruchliwości i zachowania populacji komórek o rozmiarach stu mikronów do milimetrów za pomocą mikroskopii jasnego pola i śledzenia komórek. Ten test ujawnia, że Stentor coeruleus przechodzi przez cztery behawioralnie odrębne fazy podczas regeneracji utraconego aparatu ustnego.

Analiza wzorców ruchliwości stentora w trakcie i po regeneracji aparatu jamy ustnej z wykorzystaniem śledzenia komórek

Tutaj przedstawiamy proces korzystania z systemu TetON w celu osiągnięcia specyficznej tkankowo ekspresji genów w dorosłej regenerującej się płetwie ogonowej danio pręgowanego.

Wykorzystanie systemu TetON do badania mechanizmów molekularnych regeneracji danio pręgowanego

Poznaj metody hodowli i regeneracji komórek Stentor coeruleus na poziomie pojedynczej komórki. Ten protokół umożliwia badanie mechanizmów odbudowy struktur komórkowych przy użyciu mikroskopii świetlnej.

Metody badania regeneracji w stentorze

Przeglądaj więcej filmów