Name: Ustanowienie klonalnej hodowli jednokomórkowych glonów sprzężonych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Poznaj metodę izolacji i hodowli jednokomórkowych glonów sprzężonych z próbek wodnych z jezior i pól ryżowych. Technika ta umożliwia uzyskanie czystych szczepów do badań mikrobiologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Hisayoshi Nozaki (Uniwersytet Tokijski), Takashi Nakada (Uniwersytet Keio), Yuka Marukawa Hashimoto (Japoński Uniwersytet Kobiet) i Hiroyuki Sekimoto (Japoński Uniwersytet Kobiet). Dziękujemy recenzentom za uwagi. Badanie to zostało wsparte grantem na badania naukowe (nr 26440223 i 15H04413) z Japońskiego Towarzystwa Promocji Nauki w Japonii oraz z grantu Fundacji Rozwoju Nowych Technologii dla Yuki Tsuchikane.

1. Pobieranie próbki wody zawierającej glony
UWAGA: Jednokomórkowe koniugaty rosną w stojących obszarach słodkowodnych, takich jak jeziora, bagna i pola ryżowe. Z jednego z tych środowisk pobiera się próbkę wody zawierającej glony w celu wytworzenia szczepu kulturowego. Przed rozpoczęciem procesu potrzebne są: siatka planktonowa, jednorazowa pipeta oraz butelka lub probówka o pojemności 50 ml do pobierania próbek wody.
<ol>
	<li>Użyj siatki planktonowej w środowisku jeziora, aby zebrać glony z wody. Użyj odpowiedniej siatki, w zależności od celu. 
	UWAGA: Górna część siatki jest przepuszczalna dla wody. Glony złapane przez sieć są skoncentrowane w dolnym pojemniku sieci planktonowej. Gruba siatka przepuszcza małe glony. Drobna siatka łatwo się zapycha.</li>
	<li>Przenieś wodę (około 50 ml) do probówki o pojemności 50 ml lub plastikowej butelki o pojemności 100 ml. Przynieś skoncentrowaną próbkę wody do laboratorium.</li>
	<li>Jednokomórkowe koniugatity rosną również na bagnach lub polach ryżowych. W tych płytkich wodach próbkę wody zawierającą glony można pobrać bezpośrednio za pomocą zakraplacza. Następnie przenieś wodę (30 - 50 ml) do probówki o pojemności 50 ml lub plastikowej butelki o pojemności 50 ml. 
	UWAGA: Próbki wody są starannie pobierane nad powierzchnią gleby, tak aby próbka nie zawierała żadnej gleby.</li>
</ol>
2. Potwierdzenie obecności glonów
UWAGA: Wymagane są następujące elementy: lupa lub przenośny mikroskop oraz czasza 60 mm do obserwacji.
<ol>
	<li>Aby potwierdzić obecność glonów w próbce, gdy znajduje się ona w jednorazowej pipecie, użyj lupy do bezpośredniej obserwacji próbki. 
	UWAGA: Większe komórki o długości około 400 - 1 000 μm (np. Closterium ehrenbergii) można łatwo zaobserwować za pomocą tej metody.</li>
	<li>Aby potwierdzić glony pod przenośnym mikroskopem, wlej próbkę wody do plastikowego naczynia laboratoryjnego.
	<ol>
		<li>Umieścić próbkę (około 3 ml) na wewnętrznej części górnej połowy (pokrywy) płytki Petriego o średnicy 60 mm, a następnie umieścić dolną połowę, tak aby jej dolna część była skierowana w stronę wewnętrznej części pokrywki, na górze. 
		UWAGA: Ta metoda zapobiega przemieszczaniu się próbki i ułatwia obserwację.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie szklanej pipety kapilarnej z pipety Pasteura do izolacji
UWAGA: Przed rozpoczęciem procesu potrzebne są następujące elementy: wysterylizowane pipety Pasteura, stojak na pipety Pasteura, rękawiczki, gumowa żarówka, lampa spirytusowa, metanol do lampy spirytusowej, zapalniczka, kleszcze, kosz na śmieci na szkło oraz clean room lub okap z przepływem laminarnym (jeśli to konieczne).
<ol>
	<li>Zapal palnik alkoholowy.
	<ol>
		<li>Aby wyprodukować cienką szklaną pipetę kapilarną do izolacji, upewnij się, że płomień nie migocze. Naostrz płomień i rozpuść pipetę Pasteura na jej końcówce.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podgrzej sterylną szklaną pipetę Pasteura na płomieniu, podpartą ręcznie z boku gumowej bańki, a po stronie końcówki za pomocą kleszczy.</li>
	<li>Zdejmij pipetę Pasteura z ognia i rozciągnij ją.
	<ol>
		<li>Gdy szklanka się topi, szybko wyjmij pipetę Pasteura z płomienia, a następnie pociągnij. 
		UWAGA: W tym eksperymencie pipeta Pasteura została przedłużona o 15 - 20 cm. Upewnij się, że pipeta nie pali się podczas ciągnięcia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odłamać końcówkę szklanej pipety kapilarnej na odpowiednią długość. Ponieważ część łukowa jest najlepsza, idealnie nadaje się do końcówki. 
	UWAGA: W tym badaniu przygotowano szklaną pipetę kapilarną z końcówką o długości 5 - 10 cm.
	<ol>
		<li>Pamiętaj, aby wyrzucić kapilarnę po jej stopieniu i upewnić się, że płomień został zgaszony.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pęcherzyki uwalniane ze szklanej pipety kapilarnej wskazują rozmiar otworu końcówki. Wybierz odpowiedni rozmiar komórki, która ma zostać odizolowana. Około 1 mm pęcherzyków jest odpowiednie do izolacji gatunków Closterium, o szerokości komórek 10 - 20 μm.</li>
</ol>
4. Izolacja pojedynczej komórki za pomocą szklanej pipety kapilarnej
UWAGA: Przed rozpoczęciem potrzebne są następujące elementy: mikroskop z odwróconym światłem, okulary zegarkowe, plastikowe naczynie i sterylne probówki z gwintem zawierające pożywkę CA (Tabela 1) lub kondycjonowaną pożywkę CA7.
<ol>
	<li>Przygotuj kilka szkieł zegarkowych (o średnicy 22 mm i głębokości 1 mm), z których każde zawiera 1 ml sterylnego podłoża CA.</li>
	<li>Wyizolować komórkę docelową od próbki wody pobranej na polu.
	<ol>
		<li>Wlej próbkę wody (około 30 - 40 ml) zawierającą komórki docelowe do plastikowego naczynia.</li>
		<li>Obserwując próbkę w plastikowym naczyniu pod mikroskopem z odwróconym światłem, pobierz pojedyncze komórki za pomocą szklanej pipety kapilarnej.</li>
		<li>Umieść szklaną pipetę kapilarną w pobliżu komórki, aby ułatwić aspirację komórki przez działanie kapilarne.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieś komórki do szkła zegarka zawierającego 1 ml sterylnego podłoża CA (<klasa silna = "xfig">Rysunek 1a).</li>
	<li>Ponownie pobrać komórki za pomocą nowej szklanej pipety kapilarnej ze sterylnego podłoża CA i przenieść je do drugiego szkła zegarkowego zawierającego sterylne podłoże CA (<klasa silna = "xfig">Rysunek 1b). 
	UWAGA: Proces ten jest powtarzany, dopóki pojedyncza komórka nie zostanie wyizolowana w płytce punktowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 1c).</li>
	<li>Pobrać pojedynczą komórkę za pomocą nowej szklanej pipety kapilarnej, a na koniec przenieść ją do probówki zawierającej 14 ml pożywki CA lub kondycjonowanej pożywki CA (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1d). Próbkę inkubować w temperaturze 23 °C w 16-godzinnym cyklu światło: 8 godzin ciemności przez 2 tygodnie. 
	UWAGA: Nieznane czynniki proliferacji komórek, które są wydzielane z rosnących komórek do otaczającego środowiska, są zawarte w kondycjonowanej pożywce, aby ułatwić podział komórek4. Jeśli zostanie utworzona hodowla klonalna, przygotuj kondycjonowaną pożywkę CA z pożywki hodowlanej4. Kultura zmieni kolor na zielony, jeśli się powiedzie.</li>
</ol>

<ol><li>Wickett, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylotranscriptomic+analysis+of+the+origin+and+early+diversification+of+land+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Phylotranscriptomic analysis of the origin and early diversification of land plants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, E4859-E4868 (2014).</li>
<li>Delwiche, C. F., Cooper, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolutionary+origin+of+a+terrestrial+flora%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The evolutionary origin of a terrestrial flora.</a> Current Biology. 25, R899-R910 (2015).</li>
<li>Daste, P., Neuville, D., Victor-Baptiste, B. <a target="_blank" href="https://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/00071618300650011">A simple procedure for obtaining clonal isolation of diatoms.</a> British Journal of Psychology. 18, 1-3 (1983).</li>
<li>Pringsheim, E. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPringsheim%2C+EG+%22Pure+Cultures+of+Algae%3A+Their+Preparation+and+Maintenance%22">Pure Cultures of Algae: Their Preparation and Maintenance</a>. , Cambridge University Press. London, UK. 119(1946).</li>
<li>Sieracki, M., Poulton, N., Crosbie, N. Automated isolation techniques for microalgae. <a target="_blank" href="https://www.elsevier.com/books/algal-culturing-techniques/andersen/978-0-12-088426-1">Algal Culturing Techniques: Automated isolation techniques for microalgae</a>. Andersen, R. A. , Elsevier Academic Press. 101-116 (2005).</li>
<li>Andersen, R. A., Kawachi, M. Traditional microalgae isolation techniques. <a target="_blank" href="https://www.elsevier.com/books/algal-culturing-techniques/andersen/978-0-12-088426-1">Algal Culturing Techniques: Traditional micro algae isolation techniques</a>. Andersen, R. A. , Elsevier Academic Press. 83-100 (2005).</li>
<li>Abe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+nuclear+transformation+of+the+Closterium+peracerosum-strigosum-littorale+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Cell+physiology%22%5BJournal%5D)">Stable nuclear transformation of the Closterium peracerosum-strigosum-littorale complex.</a> Plant and Cell physiology. 52, 1676-1685 (2011).</li>
<li>Tsuchikane, Y., Tsuchiya, M., Kokubun, Y., Abe, J., Sekimoto, H. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/j.1440-1835.2010.00602.x">Conjugation processes of Penium margaritaceum (Zygnemophyceae, Charophyta).</a> Phycological Research. 59, 74-82 (2011).</li>
<li>Kanda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-based+knockouts+reveal+that+CpRLP1+is+a+negative+regulator+of+the+sex+pheromone+PR-IP+in+the+Closterium+peracerosum-strigosum-littorale+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-based knockouts reveal that CpRLP1 is a negative regulator of the sex pheromone PR-IP in the Closterium peracerosum-strigosum-littorale complex.</a> Scientific Reports. 7, 17873(2017).</li>
<li>Ichimura, T. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF02493393">Mating types and reproductive isolation in Closterium-ehrenbergii Meneghini.</a> Botanical Magazine-Tokyo. 94, 325-334 (1981).</li>
<li>Sekimoto, H., Satoh, S., Fujii, T. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF02411384">Biochemical and physiological properties of a protein inducing protoplast release during conjugation in the Closterium peracerosum-strigosum-littorale complex.</a> Planta. 182, 348-354 (1990).</li>
<li>Ichimura, T., Watanabe, M. <a target="_blank" href="http://agris.fao.org/agris-search/search.do?recordID=US201302724192">The Closterium calosporum complex from the Ryukyu Islands-Variation and taxonomical problems.</a> Memoirs of the National Science Museum. 7, (1974).</li>
<li>Provasoli, L., Pintner, I. J. Artificial media for fresh-water algae: problems and suggestions . <a target="_blank" href="https://archive.org/details/ecologyofalgaesy00tryo">The Ecology of Algae, a symposium held at the Pymatuning Laboratory of Field Biology on June 18 and 19, 1959</a>. , Pymatuning Laboratory of Field Biology, University of Pittsburgh, . Pittsburgh. 84-96 (1960).</li>
<li>Provasoli, L. Media & prospects for the cultivation of marine algae. <a target="_blank" href="https://ci.nii.ac.jp/naid/10008776057/">Proceedings of U. S.-Japan Conference in Hakone, Japan</a>. Tryon, C. A. Jr, Hartmann, R. T. , Japanese Society of Plant Physiologists. 63-75 (1968).</li>
<li>Guillard, R. R. L. Purification methods for microalgae. <a target="_blank" href="https://www.elsevier.com/books/algal-culturing-techniques/andersen/978-0-12-088426-1">Algal Culturing Techniques: Purification methods for microalgae</a>. Andersen, R. A. , Elsevier Academic Press. 117-132 (2005).</li>
</ol>

Stosując niniejszą metodę, ustalono 9 szczepów klonalnych Closterium sp. z 15 komórek wyizolowanych z próbki wody (Inba1), co stanowi 60% wskaźnik sukcesu. Identyfikacja gatunków będzie w przyszłości prowadzona na podstawie obserwacji morfologicznej, a także analiz DNA, takich jak molekularna analiza filogenetyczna8.
W niniejszej metodzie świeżość próbki wody ma znaczenie dla wskaźnika sukcesu. Lepiej jest odizolować komórki od próbek wody tak szybko, jak to możliwe po pobraniu w terenie. Chociaż komórki z gatunku Closterium (np. C. ehrenbergii, kompleks C. peracerosum-strigosum-littorale ) mogą być utrzymywane w próbce wody przez około 7 dni, przechowując ją w temperaturze 4–8 °C, izolacja komórek jest pożądana w dniu pobrania lub następnego dnia. Ważne jest również, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia inne niż komórki docelowe, dlatego zwiększenie liczby powtórzeń mycia (tj. > 3x) może zapobiec zanieczyszczeniu kultur przez mikroorganizmy znajdujące się w glebie i komórkach.
Ograniczeniem tej techniki jest to, że pożywki hodowlane stosowane w tym protokole (CA lub kondycjonowane pożywki CA) nie zawsze są odpowiednie dla wszystkich koniugowanych glonów. W niektórych przypadkach może być konieczne rozważenie użycia innego medium, a także innych warunków oświetleniowych i temperaturowych. Ponadto, ponieważ trudno jest udowodnić, czy kultura wyrosła z jednej komórki, konieczne jest dokładne pobranie tylko 1 komórki podczas przenoszenia komórek do probówki. Dlatego przenoszenie powinno odbywać się za każdym razem za pomocą nowej szklanej pipety kapilarnej.
Ustanowienie hodowli klonalnej za pomocą tej metody mycia pipet jest klasyczną/standardową metodą i jest najbardziej niezawodną metodą do wykorzystania do izolacji pożądanych komórek do badania. Klonalne kultury koniugujących glonów używane w wielu badaniach 8,9,10,11 zostały ustalone przy użyciu niniejszej metody. Trudno jest analizować koniugujące glony bez hodowli klonalnej. Co więcej, w ostatnich latach sekwencje całego genomu de novo stały się łatwe do uzyskania (np. dzięki zastosowaniu sekwenatora nanoporowego MinION), a tworzenie kultur klonalnych jeszcze bardziej ułatwi sekwencjonowanie de novo. Innymi słowy, metoda ta jest pierwszym krokiem w przyszłych badaniach nad tymi algami, aby lepiej zrozumieć ich bioróżnorodność.
Aby ustalić stabilny szczep hodowlany, konieczne jest dokładne wykonanie pewnych krytycznych kroków w ramach protokołu. Najważniejszym krokiem jest przygotowanie szklanej pipety kapilarnej o optymalnym otworze, który umożliwia przejście tylko jednej komórki. Otwór szklanej pipety kapilarnej musi być nieco większy niż długość osi mniejszej komórki będącej przedmiotem zainteresowania. Optymalna szklana pipeta kapilarna może zassać pojedynczą komórkę za pomocą działania kapilarnego. Jeśli jednak średnica otworu jest zbyt duża, kapilara będzie również przyciągać nieożywione materiały zanieczyszczające, a nawet inne organizmy, oprócz komórki docelowej.
Aby uzyskać szklaną pipetę kapilarną o optymalnym otworze, należy zwrócić uwagę na następujące punkty. Po pierwsze, słup płomienia musi być wąski podczas podgrzewania szklanej pipety kapilarnej. Następnie, wyciągając pipetę Pasteura, należy ją zdjąć z płomienia; w przeciwnym razie otwór pipety Pasteura zapadnie się.
Wyposażenie i pojemniki przedstawione w tym protokole są podstawowe i mogą być modyfikowane. Na przykład, używając płytek wielodołkowych zamiast szkieł zegarkowych z jednym dołkiem, mycie komórek może być bardziej wydajne. Ponadto pojemniki można zastąpić innymi podobnymi. Przenosząc pojedynczą komórkę do pożywki hodowlanej na ostatnim etapie, można ustalić hodowlę klonalną.
Przygotowanie wysterylizowanego pojemnika i praca w kapturze spowoduje powstanie aksenów (nieskażonych) szczepów. Aby zapobiec zanieczyszczeniu, konieczne jest powtórzenie etapu mycia ze świeżymi porcjami więcej niż 3 razy. Czasami bakterie są również sterylizowane przez dodanie antybiotyków15.
Metoda ta koncentrowała się na izolacji desmid (Zygnematales), ale zmieniając rozmiar szklanego otworu pipety kapilarnej, można ją zastosować do izolacji planktonu o różnej wielkości.

Koniugujące glony (rzędu Zygnematales), znane również jako koniugaty, zajmują kluczową pozycję filogenetyczną jako najbliżsi żyjący krewni bezpośrednich przodków roślin lądowych1,2. Ugruntowane hodowle klonalne glonów doprowadziły w ostatnich latach do wielu różnych badań taksonomicznych, fizjologicznych i genetycznych. Techniki izolacji mikroorganizmów z naturalnego pola mają długą tradycję3,4. W ostatnich latach opracowano również techniki automatycznej izolacji z wykorzystaniem cytometrii przepływowej5. Najpowszechniejszą metodą stosowaną do uzyskania pojedynczej komórki w celu założenia hodowli klonalnej jest izolacja pojedynczej komórki za pomocą szklanej pipety kapilarnej6. Ta tradycyjna metoda wymaga umiejętności i precyzyjnego protokołu eksperymentalnego.
W tym artykule pokazujemy pobieranie próbek glonów z próbek terenowych oraz tworzenie kultur klonalnych jednokomórkowych koniugujących glonów, takich jak gatunki Closterium, za pomocą szklanej pipety kapilarnej. Próbkę wody zawierającą komórki wegetatywne pobiera się z terenu polowego (np. jeziora, stawu lub pola ryżowego). Komórki izoluje się od próbki wody za pomocą szklanej pipety kapilarnej, a następnie przemywa. Komórki hoduje się w probówce zawierającej pożywkę uzupełnioną azotem (pożywka CA) w temperaturze 24 °C w 16-godzinnym trybie jasnym: 8-godzinnym ciemnym. Ta metoda nadaje się również do izolowania innych mikroalg w celu wytworzenia kultur klonalnych.

<table><tbody><tr><td>Sampling</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plankton net</td><td>RIGO, Japonia</td><td>N-NO380T</td><td>Rozmiar oczek: 32 &mikro; m</td></tr><tr><td>Mikroskop przenośny (np. Nature Scope FABRE)</td><td>Nikon, Japonia</td><td>STYCZEŃ: 4960759 206725</td><td>Powiększenie: 20 razy;</td></tr><tr><td>Lupa (np. Lupa Steinheil Peak 1985</td>) <td>Tohkai Sangyo Co. Ltd., Japonia</td><td>1985-20</td><td>Powiększenie: 20 razy;</td></tr><tr><td>Spuit</td><td>EIKEN CHEMICAL CO. LTD. Japonia</td><td>Sterylna rurka nr 4</td><td></td></tr><tr><td>50 ml (probówki wirówkowe 50 ml z zakrętkami)</td> <td>Labcon, USA</td><td>3181-345-008</td><td></td></tr><tr><td>Butelka (100 ml butelka z poliwęglanu)</td><td>AS ONE Corporation, Japonia</td><td>1-7403-01</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie 60 mm</td><td>Asahi glass Co. Ltd., Japonia</td><td>1010-060</td><td>&nbsp; Do obserwacji glonów.&nbsp; 60 mm/naczynie nieobrobione</td></tr><tr><td><mocne>Przygotowanie pipety do mikropipet</mocne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pasteura (bawełniane zatyczki 9") Pipety Pasteura)</td><td>Fisher Scientific, USA</td><td>13-678-8B</td><td>7 & razy; 225 mm</td></tr><tr><td>Gumowa bańka (SPOID SILICONE, 1 cc)</td><td>AS ONE Corporation, Japonia</td><td>5-5669-01</td><td>10 i razy; 40 mm</td></tr><tr><td>Kleszcze ze stali nierdzewnej</td><td>AS ONE Corporation, Japonia</td><td>PT-09</td><td>110 mm</td></tr><tr><td>Izolacja jednokomórkowa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szkło zegarkowe (tablica do reakcji krwi)</td><td>Sekiya Rika Co., Ltd, Japonia</td><td>F14-155-030</td><td>do płukania komórek podczas izolacji. Średnica 22 mm i głębokość 1 mm</td></tr><tr><td>Probówki gwintowane&nbsp;</td><td>Fujimotorika, Co., Ltd, Japonia</td><td>XX142</td><td>18 & Oslash; &times; 170 mm</td></tr><tr><td>Mikroskop światła odwróconego</td><td>Olympus, Tokio, Japonia</td><td>CKX41N</td><td>do izolacji glonów.</td></tr><tr><td>Naczynie plastikowe</td><td>Asahi glass Co. Ltd., Japonia</td><td>SH90-15E&nbsp;</td><td>&nbsp; 90 i razy; Grubość 15 mm</td></tr></tbody></table>

ustanowienie klonalnej hodowli jednokomórkowych glonów sprzężonych

Establishment of a Clonal Culture of Unicellular Conjugating Algae

Niezbędne jest stworzenie klonalnych kultur mikroalg do wykorzystania w badaniach różnych tematów, takich jak fizjologia, genetyka, taksonomia i mikrobiologia. Dlatego niezwykle ważne jest opracowanie technik tworzenia kultur klonalnych. W tym artykule pokazujemy tworzenie kultur klonalnych sprzężonych glonów. Próbki wody pobierane są z pola. Następnie komórki izoluje się za pomocą szklanej pipety kapilarnej, umieszcza w pożywce i hoduje w warunkach odpowiednich do wytworzenia kultury klonalnej.

Próbkę wody (Inba1) o objętości 50 mL pobrano z jednego punktu poboru w jeziorze Inba-numa (pH 8.1, 24.7 °C; 35°44′30.2″N 140°12′08.2″E) w Sakura-shi, Chiba, Japonia, dnia 25 czerwca 2016 roku. Próbkę wody przechowywano w temperaturze 4 - 8 °C. Następnego dnia po pobraniu z próbki wody zawierającej komórki wegetatywne wyizolowano okaz Closterium sp. Z próbki wyizolowano piętnaście komórek wegetatywnych o identycznej morfologii (Inba1-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -12, -13, -14 oraz -15), a następnie przemyto je metodą płukania pipetą. Piętnaście wyizolowanych pojedynczych komórek hodowano w oddzielnych probówkach zawierających 15 mL kondycjonowanego pożywki CA. Po 2 tygodniach inkubacji proliferację komórek zaobserwowano w 9 probówkach [Inba1-1, -3, -4, -5 (Rycyna 2a), -6, -9, -10, -12 (Rycyna 2b) oraz -13; Tabela 2]. Z izolatów próbki Inba1 utworzono dziewięć kultur klonalnych (Rycina 3).
<img alt="Schemat hodowli komórkowej w zawiesinie; przedstawia proces przenoszenia z szalki Petriego na szkiełko." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57761/57761fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat izolacji pojedynczej komórki. (a) Przeniesienie pojedynczej docelowej komórki alg z oryginalnej próbki wody do sterylnego medium w pierwszym szkiełku zegarkowym. (b, c) Ponowne przeniesienie komórki do kolejnego szkiełka zegarkowego w celu przemycia. Procedurę tę należy powtarzać do momentu, aż w medium nie będzie innych komórek ani zanieczyszczeń niż komórka docelowa; na schemacie pokazano trzy szkiełka zegarkowe jako przykład. (d) Na koniec przeniesienie przemytej komórki do probówki z odpowiednim medium wzrostowym. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57761/57761fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Klasyfikacja zielonych glonów, obraz mikroskopowy. Badanie porównawcze morfologii gatunków. Badania biologiczne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57761/57761fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Fotografie komórek wegetatywnych Closterium sp. (a) Inba1-5 oraz (b) Inba1-12. Pasek skali = 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57761/57761fig2v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obserwacja wzrostu roślin w szalkach Petriego; schemat eksperymentalny; układ badań biologicznych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57761/57761fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Utworzenie hodowli klonalnej z próbki Inba1. Probówki hodowane przez 2 tygodnie zostały sfotografowane od dołu. Gwiazdką zaznaczono proliferację komórek. Pasek skali = 2 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57761/57761fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Nazwa pożywki</td>
			<td>Bibliografia</td>
			<td colspan="2">Komentarze</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="13">CA </td>
			<td rowspan="13">Ichimura i Watanabe12</td>
			<td>Ca(NO3)23)24h2O</td>
			<td>2 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KNO3</td>
			<td>10 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4NIE3</td>
			<td>5 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>β-Na2glicerofosforan·5H2O</td>
			<td>3 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO₄4·7H2O </td>
			<td>2 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Witamina B12</td>
			<td>0.01 μg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotyna</td>
			<td>0.01 μg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorowodorek tiaminy</td>
			<td>1 μg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>metale PIV</td>
			<td>0,1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fe (jako EDTA; stosunek molowy 1:1) </td>
			<td>0,1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>40 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Dopełnić wodą do objętości 100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Dostosować pH do 7,2 za pomocą NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="7">Metale grupy IV P</td>
			<td rowspan="7">Provasoli i Pintner13</td>
			<td>Na2EDTA·2H₂O2O</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl3·6h2O</td>
			<td>19,6 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl22· 4h2O</td>
			<td>3,6 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnCl₂2*</td>
			<td>1,04 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>$\text{CoCl}_2$26h2O</td>
			<td>0,4 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2MoO4·2H2O</td>
			<td>0,25 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Dopełnić wodą do objętości 100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Fe (jako EDTA; stosunek molowy 1:1)</td>
			<td rowspan="3">Provasoli14</td>
			<td>Fe(NH₄)₂(SO₄)₂4)2(SO4)26 h2O, </td>
			<td>70,2 mg </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2EDTA·2H2O, </td>
			<td>66 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Dopełnić wodą do objętości 100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warunkowana pożywka CA</td>
			<td>Abe i wsp.7</td>
			<td colspan="2">Inkubować komórki w świeżej pożywce CA przez 14–20 dni. Zebrać hodowlaną pożywkę poprzez filtrację przy użyciu jakościowego papieru filtracyjnego, a następnie wysterylizować przefiltrowaną pożywkę w autoklawie (121 °C przez 15 min).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">W NIES 1,04 mg ZnCl22 zastępuje się 2,2 mg ZnSO44·7H2O.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Składy pożywek użytych w niniejszym badaniu.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Próbka wody</td>
			<td >Nazwa komórki</td>
			<td >Stan po hodowli</td>
			<td >Nazwa szczepu</td>
		</tr>
		<tr >
			<td rowspan="15">Inba1</td>
			<td>-1</td>
			<td>Komórki namnożyły się</td>
			<td>Inba1-1</td>
		</tr>
		<tr >
			<td>-2</td>
			<td>Bez zmian</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>-3</td>
			<td>Komórki namnożyły się</td>
			<td>inba1-3</td>
		</tr>
		<tr >
			<td>-4</td>
			<td>Komórki namnożyły się</td>
			<td>inba1-4</td>
		</tr>
		<tr >
			<td>-5</td>
			<td>Komórki namnożyły się</td>
			<td>inba1-5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td>-6</td>
			<td>Komórki namnożyły się</td>
			<td>inba1-6</td>
		</tr>
		<tr >
			<td>-7</td>
			<td>Bez zmian</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>-8</td>
			<td>Bez zmian</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>-9</td>
			<td>Komórki namnożyły się</td>
			<td>inba1-9</td>
		</tr>
		<tr >
			<td>-10</td>
			<td>Komórki namnożyły się</td>
			<td>inba1-10</td>
		</tr>
		<tr >
			<td>-11</td>
			<td>Bez zmian</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>-12</td>
			<td>Komórki namnożyły się</td>
			<td>inba1-12</td>
		</tr>
		<tr >
			<td>-13</td>
			<td>Komórki namnożyły się</td>
			<td>inba1-13</td>
		</tr>
		<tr >
			<td>-14</td>
			<td>Bez zmian</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>-15</td>
			<td>Bez zmian</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Podsumowanie próby izolacji.

W tym artykule pokazujemy tworzenie kultur klonalnych jednokomórkowych koniugujących gatunków glonów zebranych z naturalnego stanowiska polowego.

Ustanowienie klonalnej hodowli jednokomórkowych glonów sprzężonych

It is essential to establish clonal cultures of microalgae for use in studies of various topics, such as physiology, genetics, taxonomy, and microbiology. ...

Przedstawimy naszą metodę tworzenia ciągu glonów, zwłaszcza koniugfitów jednokomórkowych. W celu ustanowienia szczepu konieczne jest pobranie próbki wody, która zawiera glony, podczas prac terenowych. Próbka wody zawiera ciała obce inne niż glony.Z tej próbki izolowana jest tylko jedna komórka. THIL jest przenoszony do czystego podłoża i wielokrotnie oczyszczany. Izolacja odbywa się w tym procesie.Sterylizacja jest możliwa, jeśli zostanie przeprowadzona w ostrożny sposób. Na koniec wyizolowaną komórkę przenosi się do probówki, a poprzez hodowlę ustala się szczep. Tutaj skupiamy się na jednokomórkowych koniugatomitach, w których identyfikowane są odmiany form.Jednokomórkowe koniugatofity rosną w stojących, słodkowodnych obszarach, takich jak jeziora, bagna i pola ryżowe. Z tych środowisk pobiera się próbkę glonów zawierających wodę w celu wytworzenia szczepu kulturowego. Przedstawimy metodę pobierania próbki wody ze środowiska jeziora.Do ochrony środowiska jeziora używana jest siatka planktonowa. Górna część siatki jest przepuszczalna dla wody. Glony złapane przez siatkę zostaną skoncentrowane w dolnym pojemniku.Siatka krzyżowa umożliwia przechodzenie małych glonów. Drobna siatka łatwo się zapycha. W zależności od celu należy użyć odpowiedniej siatki.Przynieś skoncentrowaną próbkę wody do laboratorium. Jednokomórkowe koniugatity rosną również na bagnach lub polach ryżowych. W płytkiej wodzie próbka jest pobierana bezpośrednio za pomocą zakraplacza.Próbki wody pobiera się starannie z powierzchni gleby, aby nie zatrzymywać gleby. Sprawdź, czy próbka wody zawiera glony. Glony, około 400 mikrometrów i więcej, są bezpośrednio obserwowane przez pętlę.Jeśli chodzi o małe glony, stosuje się przenośny mikroskop. Próbka wody jest umieszczana na pokrywie szalki Petriego i przykrywana korpusem. Ta metoda zapobiega przemieszczaniu się próbki i ułatwia obserwację.Na tej próbce wody przeprowadza się izolację glonów. Przedstawimy metodę wykonania pipety, służącej do izolacji glonów jednokomórkowych z próbki wody. Jak zrobić pipetę do izolacji.Zapal palnik alkoholowy. Podgrzej sterylną pipetę Pasteura na ogniu. Zdejmij pipetę z ognia i rozciągnij ją.Przyciąć końcówkę pipety na odpowiednią długość. Pamiętaj, aby wyrzucić kapilatę topnienia. Pamiętaj, aby sprawdzić, czy płomień jest zgaszony.Aby wyprodukować cienką pipetę do izolacji, należy upewnić się, że płomień nie migocze. Naostrz płomień i rozpuść pipetę na końcówce. Podczas rozciągania należy upewnić się, że pipeta nie jest podłączona do płomienia.Oto część kłaniania się jest najlepsza. Idealnie nadaje się na końcówkę. Bąbelki z pipety wskazują rozmiar końcówki.Wybierz odpowiedni rozmiar komórki, która ma zostać odizolowana. Pokazano dla szerokości komórki od 10 do 20 mikrometrów. Przygotowuje się odpowiednią liczbę szkieł zegarkowych potrzebnych do kołysania.Umieść pożywkę na szkiełku zegarka. Wyizolować komórkę docelową od próbki wody pobranej w terenie. Bardzo cienka szklana rurka pobiera wodę w wyniku reakcji kapilarnej.Umieść szklaną rurkę obok komórki, aby ją podnieść. Odizoluj ogniwo od podłoża na szkiełku zegarka i przenieś je do nowego szkiełka zegarka. Użyj nowej pipety, aby przenieść kuwetę z pierwszego szkiełka zegarka do drugiego.I kolejna pipeta do trzeciej. Na koniec wyizolowaną komórkę przenosi się do probówki. Poprzez hodowlę tej probówki sprzyja się namnażaniu komórek i tworzy się szczep.Kultura może zmienić kolor na zielony w ciągu dwóch tygodni, jeśli się powiedzie. W tym badaniu wyizolowaliśmy 15 komórek z próbki wody pobranej z jeziora w Biwa w Japonii. Dwa tygodnie później zaobserwowano zielony osad w dziewięciu probówkach oznaczonych czerwoną ramką, co wskazuje, że trwa oczyszczanie komórek z glonów.Osad obserwowano tylko dla izolowanych komórek, co pokazuje, że izolacja komórek zakończyła się sukcesem. Jest to nasza metoda na stworzenie unikalnego szczepu kultur glonów. Możliwe jest ustalenie szczepu hodowli aksenicznej, jeśli przeprowadzi się izolację w akceptowanych warunkach, takich jak żywność.

establishment-of-a-clonal-culture-of-unicellular-conjugating-algae

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Kopulacja i separacja tetrad są niezbędne do analizy genetycznej Chlamydomonas reinhardtii. W niniejszym materiale prezentujemy standardowe metody gametogenezy, kopulacji, kiełkowania zygot oraz sekcji tetrad. Niniejszy protokół składa się z serii łatwych do wykonania kroków, które ułatwią zastosowanie metod genetycznych naukowcom mniej zaznajomionym z Chlamydomonas.

Kojenie i separacja tetrad Chlamydomonas reinhardtii do analizy genetycznej

Pąkla Balanus (Amphibalanus) improvisus jest modelem do badania osmoregulacji i przeciwporostowości. Jednak naturalne tarło sezonowe daje nieprzewidywalną podaż larw karpiowatych. W tym miejscu opisano protokół całorocznej hodowli B. improvisus, w tym produkcji larw. Zilustrowano zastosowanie hodowlanych pąkli w badaniach ekspresji genów.

Barnacle Balanus improvisus jako model morski - hodowla i ekspresja genów

Tutaj prezentujemy protokół budowy fotobioreaktorów z bąbelkowymi kolumnami na skalę laboratoryjną i wykorzystania ich do hodowli mikroalg. Dostarcza również metody określania tempa wzrostu kultury i neutralnej zawartości lipidów.

Hodowla zielonych mikroalg w fotobioreaktorach z kolumnami bąbelkowymi i test na obecność obojętnych lipidów

Analiza wielu biomolekuł w całym systemie jest kluczowa dla uzyskania funkcjonalnego i mechanistycznego wglądu w procesy biologiczne. W niniejszym opisano obszerny protokół wysokoprzepustowej ekstrakcji lipidów, metabolitów, białek i skrobi z pojedynczej próbki pobranej z zsynchronizowanej kultury Chlamydomonas.

Multiomiczna metoda ekstrakcji do dogłębnej analizy zsynchronizowanych kultur zielonej algi Chlamydomonas reinhardtii

Doliolidy, w tym gatunek Dolioletta gegenbauri, to mały, galaretowaty zooplankton morski o znaczeniu ekologicznym, występujący na produktywnych systemach szelfu subkontynentalnego na całym świecie. Trudność w hodowli tych delikatnych organizmów ogranicza ich badania. W tym badaniu opisujemy podejścia do uprawy w celu zbierania, hodowli i utrzymania doliolid Dolioletta gegenbauri.

Uprawa osłonicy morskiej pelagicznej Dolioletta gegenbauri (Uljanin 1884) do badań eksperymentalnych

Oikopleura dioica to organizm modelowy osłonic w różnych dziedzinach biologii. Opisujemy metody pobierania próbek, identyfikację gatunków, konfigurację hodowli i protokoły hodowli zwierząt i paszy dla glonów. Zwracamy uwagę na kluczowe czynniki, które przyczyniły się do wzmocnienia systemu kultury oraz omawiamy możliwe problemy i rozwiązania.

Usprawnione pobieranie próbek i hodowla pelagicznych larw kosmopolitycznych (Oikopleura dioica)

Opisano protokół wykorzystania dwutlenku węgla z gazów spalinowych elektrowni na gaz ziemny do hodowli mikroalg w otwartych stawach torowych. Wtryskiwanie spalin jest kontrolowane za pomocą czujnika pH, a wzrost mikroalg jest monitorowany za pomocą pomiarów gęstości optycznej w czasie rzeczywistym.

Sprzężenie wychwytywania dwutlenku węgla z elektrowni z półautomatycznymi otwartymi stawami torowymi do uprawy mikroalg

Ratowanie polipów to proces wywołany ostrym stresem, w którym polipy koralowców trawią tkankę łączącą je z ich kolonią i odłączają się od niej, aby żyć jako jednostki. Niniejszy protokół opisuje, w jaki sposób indukować mikrorozmnażanie koralowców poprzez ratowanie za pomocą hipersoli fizjologicznej lub bezwapniowej wody morskiej.

Indukowanie ratowania polipów w koloniach koralowców w celu uzyskania zindywidualizowanych mikropropagatów do laboratoryjnego użytku eksperymentalnego

Niniejsze badanie podkreśla zalety stosowania metody opracowanej przez Jeffreya i Humphreya do ekstrakcji i ilościowego oznaczania rozpuszczalnych w tłuszczach pigmentów z mikroalg. Metoda ta służy jako cenne narzędzie do oceny wpływu czynników wzrostu na produkcję chlorofilu i zawartość komórkową w tych organizmach.

Ocena wpływu czynników wzrostu na produkcję chlorofilów a i b z mikroalg

W tym filmie zaprezentowano New culture – metodę, dzięki której zarodki kurcząt są hodowane poza jajem przez maksymalnie 24 hr. Metoda ta umożliwia badanie wczesnego rozwoju (od pręgi pierwotnej do 14 som.), co odpowiada okresowi E7-9 u myszy. Zastosowania tej techniki obejmują elektroporację, hybrydyzację in situ oraz immunohistochemię.

Metoda hodowli wczesnych zarodków kurczaka ex vivo (nowa hodowla)

Poznaj metodę izolacji i hodowli jednokomórkowych glonów sprzężonych z próbek wodnych z jezior i pól ryżowych. Technika ta umożliwia uzyskanie czystych szczepów do badań mikrobiologicznych.

Ustanowienie klonalnej hodowli jednokomórkowych glonów sprzężonych

Przeglądaj więcej filmów