Name: Cykl barwnika FM w synapsie: porównanie wysokiej depolaryzacji potasu, stymulacji elektrycznej i rodopsyny kanałowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Poznaj cykl pęcherzyków synaptycznych w larwalnym złączu nerwowo-mięśniowym Drosophila przy użyciu fluorescencyjnych barwników FM. Ta metoda pozwala optycznie śledzić endocytozę i egzocytozę żywych preparatów przy trzech rodzajach stymulacji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy członkom Broadie Lab za wkład w ten artykuł. Praca ta była wspierana przez NIH R01s MH096832 i MH084989 do KB oraz stypendium przeddoktoranckie NIH F31 MH111144 do DLK.

1. Rozwarstwienie kleju larwalnego
<ol>
	<li>Dokładnie wymieszaj 10 części bazy z elastomeru silikonowego z 1 częścią utwardzacza z elastomeru silikonowego z zestawu elastomerów (tabela materiałów).</li>
	<li>Szkiełka nakrywkowe ze szkła o wymiarach 22 x 22 mm pokryć elastomerem i utwardzić na gorącej płycie w temperaturze 75 °C przez kilka godzin (do momentu, gdy przestaną być lepkie w dotyku).</li>
	<li>Umieść pojedyncze szkiełko nakrywkowe pokryte elastomerem w wykonanej na zamówienie komorze preparacyjnej ze szkła pleksi (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1, na dole) w celu przygotowania do sekcji larw.</li>
	<li>Przygotuj pipety kleju z kapilary ze szkła borokrzemianowego za pomocą standardowego ściągacza do mikroelektrod, aby uzyskać pożądany rozmiar stożka i końcówki.</li>
	<li>Delikatnie oderwij końcówkę mikropipety, a do drugiego końca przymocuj 2 stopy elastycznej rurki z tworzywa sztucznego (średnica wewnętrzna 1/32", średnica wewnętrzna; średnica zewnętrzna 3/32", średnica zewnętrzna; ścianka 1/32"; Tabela materiałów) z końcówką do ust (końcówka pipety P2).</li>
	<li>Napełnij mały pojemnik (0,6 ml nakrętki probówki Eppendorfa) niewielką objętością (~20 μl) kleju (Tabela materiałów) w ramach przygotowań do rozwarstwienia larw.</li>
	<li>Napełnij komorę solą fizjologiczną (w mM): 128 NaCl, 2 KCl, 4 MgCl2, 1 CaCl2, 70 sacharozą i 5 kwasem 2-[4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-ylo]etanosulfonowym (HEPES) o pH 7,2.</li>
	<li>Dodać przeciwciało przeciwko peroksydazie chrzanu (HRP) sprzężone z Alexa Fluor 647 (anty-HRP:647; rozcieńczyć 1:10 z 1 mg / ml bulionu) w celu oznaczenia zakończenia presynaptycznego NMJ podczas sekcji21,22.</li>
	<li>Za pomocą cienkiego pędzla (rozmiar 2) usuń wędrujący trzeci instar z fiolki z jedzeniem i umieść go na pokrytym elastomerem szkle nakrywkowym.</li>
	<li>Napełnij szklaną końcówkę mikropipety niewielką ilością kleju, korzystając z podciśnienia powietrza wytwarzanego przez usta z nasadką (krok 1.5).</li>
	<li>Ułóż larwę grzbietową do góry za pomocą kleszczy i przyklej głowę do szkiełka nakrywkowego pokrytego elastomerem za pomocą małej kropli kleju, używając dodatniego ciśnienia powietrza ustami.</li>
	<li>Powtórz tę procedurę z tylnym końcem larwy, upewniając się, że zwierzę jest napięte między dwoma nasadkami kleju.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek (ostrza 3 mm; Tabela materiałów), wykonaj cięcie poziome (~1 mm) z tyłu i cięcie pionowe wzdłuż grzbietowej linii środkowej.</li>
	<li>Za pomocą cienkich kleszczy (#5, Tabela materiałów) delikatnie usuń tchawicę grzbietową, jelita, ciało tłuszczowe i inne narządy wewnętrzne pokrywające mięśnie.</li>
	<li>Powtórz procedurę klejenia dla czterech klap ścian korpusu, upewniając się, że delikatnie rozciągasz ścianę korpusu zarówno w poziomie, jak i w pionie.</li>
	<li>Podnieś brzuszny rdzeń nerwowy (VNC) za pomocą kleszczy, ostrożnie przetnij nerwy ruchowe nożyczkami, a następnie całkowicie usuń VNC.</li>
	<li>Zastąp sól fizjologiczną do rozwarstwiania solą fizjologiczną wolną od Ca2+ (taką samą jak powyższa sól fizjologiczna bez CaCl2), aby zatrzymać cykl SV.</li>
</ol>
2. Opcja 1: Wysokie [K+] FM Obciążenie barwnikiem
<ol>
	<li>Z roztworu podstawowego FM1-43 (4 mM) dodać 1 μl do 1 ml 90 mM roztworu KCl (o wysokiej zawartości [K+] w roztworze soli fizjologicznej), aby uzyskać końcowe stężenie 4 μM.</li>
	<li>Za pomocą pipety zastąp sól fizjologiczną wolną od Ca2+ w komorze obrazowania roztworem barwnika o wysokiej [K+] FM, aby stymulować wychwyt barwnika endocytozy SV.</li>
	<li>Natychmiast uruchom cyfrowy timer na z góry określony czas trwania wysokiego [K+] okresu stymulacji depolaryzacyjnej (np. 5 min; <silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
	<li>Aby potwierdzić zdrowy preparat larwalny, należy zwrócić uwagę na silne skurcze mięśni przez cały czas trwania wysokiego okresu depolaryzacji [K+].</li>
	<li>Po upływie okresu odliczania szybko usuń roztwór barwnika o wysokiej zawartości [K+] FM i zastąp go solą fizjologiczną wolną od Ca2+, aby zatrzymać cykle SV.</li>
	<li>Umyj w krótkich odstępach czasu solą fizjologiczną wolną od Ca2+ (5x przez 1 min), aby upewnić się, że roztwór barwnika o wysokiej zawartości [K+] FM został całkowicie usunięty.</li>
	<li>Preparat larwalny należy przechowywać w świeżej soli fizjologicznej wolnej od Ca2+ w celu natychmiastowego obrazowania za pomocą mikroskopu konfokalnego.</li>
</ol>
3. Obrazowanie: Mikroskopia konfokalna
<ol>
	<li>Użyj pionowego mikroskopu konfokalnego z obiektywem 40-krotnym zanurzeniem w wodzie, aby zobrazować fluorescencję barwnika NMJ (można użyć innych mikroskopów).</li>
	<li>Zobrazuj mięsień 4 NMJ segmentów brzucha 2-4 (można zobrazować inne NMJ) i zbierz obrazy za pomocą odpowiedniego oprogramowania (Tabela materiałów).</li>
	<li>Użyj lasera HeNe 633 nm do wzbudzenia HRP: 647 (z filtrem długoprzepustowym > 635 nm) i lasera Argon 488 nm do wzbudzenia FM1-43 (z filtrem pasmowo-przepustowym 530-600 nm).</li>
	<li>Operacyjnie określ optymalne wzmocnienie i przesunięcie dla obu kanałów. 
	UWAGA: Te ustawienia pozostaną niezmienne przez resztę eksperymentu.</li>
	<li>Weź konfokalny stos Z przez cały wybrany NMJ od góry do dołu zakończenia synaptycznego oznaczonego przez HRP.</li>
	<li>Zwróć uwagę na zobrazowany NMJ (segment, bok i mięsień), aby zapewnić nadmiar do dokładnie tego samego NMJ po rozładowaniu barwnika FM.</li>
</ol>
4. Wysoka [K+] Stymulacja: Rozładunek barwnika FM
<ol>
	<li>Zastąp sól fizjologiczną wolną od Ca2+ solą fizjologiczną o wysokiej zawartości [K+] (bez barwnika FM1-43), aby napędzać depolaryzację, egzocytozę SV i uwalnianie barwnika.</li>
	<li>Natychmiast uruchom cyfrowy zegar na określony czas trwania okresu wysokiej stymulacji [K+] (np. 2 min; <silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
	<li>Po upływie okresu odliczania natychmiast usuń sól fizjologiczną o wysokiej zawartości [K+] i zastąp ją solą fizjologiczną wolną od Ca2+, aby zatrzymać cykle SV.</li>
	<li>Umyj w krótkich odstępach czasu solą fizjologiczną bez Ca2+ (5x przez 1 min), aby upewnić się, że sól fizjologiczna o wysokiej zawartości [K+] została całkowicie usunięta.</li>
	<li>Preparat larwalny należy przechowywać w świeżej soli fizjologicznej wolnej od Ca2+ w celu natychmiastowego obrazowania za pomocą mikroskopu konfokalnego.</li>
	<li>Upewnij się, że obrazujesz fluorescencję barwnika FM1-43 w tym samym NMJ, jak wspomniano powyżej, przy użyciu tych samych ustawień konfokalnych.</li>
</ol>
5. Opcja 2: Stymulacja elektryczna FM Ładowanie barwnika
<ol>
	<li>Przygotuj pipetę ssącą za pomocą ściągacza do mikroelektrod (tabela materiałów), aby uzyskać wymagany rozmiar stożka i końcówki.</li>
	<li>Wypoleruj na gorąco końcówkę mikroelektrody za pomocą mikrokuźni, aż pojedynczy nerw ruchowy będzie mógł zostać zaessany przy ciasnym dopasowaniu.</li>
	<li>Wsuń pipetę ssącą na uchwyt elektrody na mikromanipulatorze i przymocuj do długiej elastycznej plastikowej rurki i strzykawki.</li>
	<li>Ustaw parametry stymulatora (np. 15 V, częstotliwość 20 Hz, czas trwania 20 ms i czas 5 min (<silna klasa="xfig">Rysunek 2) lub 1 minutę (<silna klasa="xfig">Rysunek 3)).</li>
	<li>Zastąp sól fizjologiczną wolną odCa2+ w preparacie larwalnym solą fizjologiczną powyżej FM1-43 (4 μM; 1 mM CaCl2) na stanowisku do elektrofizjologii.</li>
	<li>Umieścić preparat na stoliku mikroskopowym i podnosić stolik, aż larwa i pipeta ssąca będą w ostrości (obiektyw 40-krotnie zanurzony w wodzie).</li>
	<li>Zassać pętlę przeciętego nerwu ruchowego unerwiającego wybrany półsegment za pomocą podciśnienia powietrza wytwarzanego przez strzykawkę do elektrody ssącej.</li>
	<li>Przetestuj działanie elektrody ssącej za pomocą krótkiej serii stymulacji, jednocześnie monitorując wzrokowo skurcz mięśni w wybranym półsegmencie.</li>
	<li>Stymuluj nerw ruchowy za pomocą wybranych parametrów (krok 5.4) w celu stymulowania endocytozy SV i wychwytu barwnika FM1-43 (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2).</li>
	<li>Umyj w krótkich odstępach czasu solą fizjologiczną wolną od Ca2+ (5x przez 1 min), aby upewnić się, że roztwór barwnika FM1-43 został całkowicie usunięty.</li>
	<li>Preparat larwalny należy przechowywać w świeżej soli fizjologicznej wolnej od Ca2+ w celu natychmiastowego obrazowania przy użyciu protokołu obrazowania konfokalnego od góry.</li>
	<li>Zwróć uwagę na zobrazowany NMJ (segment, bok i mięsień), aby zapewnić dostęp do dokładnie tego samego NMJ po rozładowaniu barwnika FM.</li>
</ol>
6. Stymulacja elektryczna: Rozładunek barwnika FM
<ol>
	<li>Zastąp sól fizjologiczną wolną od Ca2+ zwykłą solą fizjologiczną (bez barwnika FM1-43) i umieść preparat z powrotem na etapie urządzenia do elektrofizjologii.</li>
	<li>Ustaw parametry stymulatora rozładunku (np. 15 V, częstotliwość 20 Hz, czas trwania 20 ms i czas 2 min (<silna klasa="xfig">Rysunek 2) lub 20 s (<silna klasa="xfig">Rysunek 3)).</li>
	<li>Zassaj ten sam nerw ruchowy do tej samej elektrody, co powyżej, a następnie stymuluj do aktywacji egzocytozy SV i uwalniania barwnika FM1-43.</li>
	<li>Umyj w krótkich odstępach czasu solą fizjologiczną bez Ca2+ (5x przez 1 min), aby upewnić się, że zewnętrzny barwnik został całkowicie usunięty.</li>
	<li>Preparat larwalny należy przechowywać w świeżej soli fizjologicznej wolnej od Ca2+ w celu natychmiastowego obrazowania za pomocą mikroskopu konfokalnego.</li>
	<li>Upewnij się, że obrazujesz fluorescencję barwnika FM1-43 w tym samym NMJ, jak wspomniano powyżej, przy użyciu tych samych ustawień konfokalnych.</li>
</ol>
7. Opcja 3: Stymulacja rodopsyny kanałowej FM Ładowanie barwnika
<ol>
	<li>Hodować larwy wykazujące ekspresję ChR2 na żywności zawierającej kofaktor ChR2 all-trans retinal (rozpuszczony w etanolu; końcowe stężenie 100 μM).</li>
	<li>Preparat larwalny umieścić w komorze z pleksi na stoliku mikroskopu preparacyjnego wyposażonym w port kamery.</li>
	<li>Podłącz niebieską diodę LED (470 nm; Tabela materiałów) do programowalnego stymulatora za pomocą koncentrycznego i umieść diodę LED w porcie kamery.</li>
	<li>Skoncentruj niebieską wiązkę światła LED na funkcji wypreparowanej larwy za pomocą funkcji zoomu mikroskopu.</li>
	<li>Zastąp sól fizjologiczną wolną od Ca2+ w preparacie larwalnym solą fizjologiczną powyżej FM1-43 (4 μM; 1 mM CaCl2) na etapie optogenetycznym.</li>
	<li>Ustaw parametry diody LED za pomocą stymulatora (np. częstotliwość 15 V, 20 Hz, czas trwania 20 ms i czas 5 min (<silna klasa="xfig">Rysunek 2)).</li>
	<li>Rozpocznij stymulację światłem i śledź za pomocą timera przez z góry określony czas trwania okresu stymulacji optogenetycznej (np. 5 min; <silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
	<li>Gdy timer się zatrzyma, szybko usuń roztwór barwnika FM i zastąp go solą fizjologiczną wolną od Ca2+, aby zatrzymać cykl SV.</li>
	<li>Umyj w krótkich odstępach czasu solą fizjologiczną bez Ca2+ (5x przez 1 min), aby upewnić się, że roztwór barwnika FM został całkowicie usunięty.</li>
	<li>Preparat larwalny należy przechowywać w świeżej soli fizjologicznej wolnej od Ca2+ w celu natychmiastowego obrazowania za pomocą mikroskopu konfokalnego przy użyciu protokołu obrazowania od góry.</li>
	<li>Zwróć uwagę na zobrazowany NMJ (segment, bok i mięsień), aby zapewnić dostęp do dokładnie tego samego NMJ po rozładowaniu barwnika FM.</li>
</ol>
8. Stymulacja rodopsyny kanałowej: Rozładunek barwnika FM
<ol>
	<li>Zastąp sól fizjologiczną wolną od Ca2+ zwykłą solą fizjologiczną (bez barwnika FM1-43) na etapie mikroskopu preparacyjnego z diodą LED portu kamery skupioną na larwie.</li>
	<li>Ustaw parametry stymulatora do rozładowywania (np. 15 V, częstotliwość 20 Hz, czas trwania 20 ms i czas 2 min (<silna klasa="xfig">Rysunek 2)).</li>
	<li>Rozpocznij stymulację światłem i śledź za pomocą timera przez z góry określony czas trwania okresu stymulacji optogenetycznej (np. 2 min; <silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
	<li>Po upływie okresu odliczania szybko usuń roztwór barwnika FM i zastąp go solą fizjologiczną wolną od Ca2+, aby zatrzymać cykl SV.</li>
	<li>Umyj w krótkich odstępach czasu solą fizjologiczną bez Ca2+ (5x przez 1 min), aby upewnić się, że zewnętrzny barwnik został całkowicie usunięty.</li>
	<li>Preparat larwalny należy przechowywać w świeżej soli fizjologicznej wolnej od Ca2+ w celu natychmiastowego obrazowania za pomocą mikroskopu konfokalnego.</li>
	<li>Upewnij się, że obrazujesz fluorescencję barwnika FM1-43 w tym samym NMJ, jak wspomniano powyżej, przy użyciu tych samych ustawień konfokalnych.</li>
</ol>
9. Kwantyfikacja fluorescencji
<ol>
	<li>Załaduj obraz do Image J (NIH open source) i utwórz projekcję o maksymalnej intensywności, klikając Obraz | Stosy | Projekt Z.</li>
	<li>Korzystając z kanału anty-HRP:647, przejdź do punktu menu Obraz | Dostosuj | Przesuń próg i przesuń górny pasek narzędzi, aż podświetlony zostanie tylko NMJ.</li>
	<li>Za pomocą narzędzia różdżki kliknij NMJ. Jeśli NMJ jest nieciągły, przytrzymaj przycisk Shift i wybierz wszystkie części.</li>
	<li>Zmień obraz na kanał barwnika FM1-43 i przejdź do Analizuj | Zmierzyć, aby uzyskać pomiar fluorescencji.</li>
	<li>Powtórz kroki 9.1-9.4 dla "niezaładowanego" obrazu z tego samego NMJ (zidentyfikowany segment, bok i mięsień).</li>
	<li>Aby uzyskać procent barwnika, który został usunięty, weź stosunek intensywności fluorescencji niezaładowanej/załadowanej. 
	UWAGA: Ta procedura może być zmodyfikowana w celu analizy fluorescencji na podstawie bulonu na bouton przy użyciu narzędzi do selekcji "owalnej" lub "odręcznej". Fluorescencję tła można odjąć, pobierając próbki fluorescencji mięśni. Można również dodać agentów, aby zmniejszyć to tło.</li>
</ol>

<ol><li>Menon, K. P., Carrillo, R. A., Zinn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+plasticity+of+the+Drosophila+larval+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Development and plasticity of the Drosophila larval neuromuscular junction.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 647-670 (2013).</li>
<li>Rizzoli, S. O., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicle+pools%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicle pools.</a> Nat Rev Neurosci. 6 (1), 57-69 (2005).</li>
<li>Long, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+calcium+channel+localization+and+calcium-dependent+synaptic+vesicle+exocytosis+regulated+by+the+Fuseless+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Presynaptic calcium channel localization and calcium-dependent synaptic vesicle exocytosis regulated by the Fuseless protein.</a> J Neurosci. 28 (14), 3668-3682 (2008).</li>
<li>Kopke, D. L., Lima, S. C., Alexandre, C., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notum+coordinates+synapse+development+via+extracellular+regulation+of+Wingless+trans-synaptic+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Notum coordinates synapse development via extracellular regulation of Wingless trans-synaptic signaling.</a> Development. 144 (19), 3499-3510 (2017).</li>
<li>Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+fluorescent+staining+and+destaining+of+living+vertebrate+motor+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals.</a> J Neurosci. 12 (2), 363-375 (1992).</li>
<li>Richards, D. A., Bai, J., Chapman, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+modes+of+exocytosis+at+hippocampal+synapses+revealed+by+rate+of+FM1-43+efflux+from+individual+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Two modes of exocytosis at hippocampal synapses revealed by rate of FM1-43 efflux from individual vesicles.</a> J Cell Biol. 168 (6), 929-939 (2005).</li>
<li>Verstreken, P., Ohyama, T., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FM+1-43+labeling+of+synaptic+vesicle+pools+at+the+drosophila+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">FM 1-43 labeling of synaptic vesicle pools at the drosophila neuromuscular junction.</a> Methods Mol Biol. 440, 349-369 (2008).</li>
<li>Dickman, D. K., Horne, J. A., Meinertzhagen, I. A., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Slowed+Classical+Pathway+Rather+Than+Kiss-and-Run+Mediates+Endocytosis+at+Synapses+Lacking+Synaptojanin+and+Endophilin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Slowed Classical Pathway Rather Than Kiss-and-Run Mediates Endocytosis at Synapses Lacking Synaptojanin and Endophilin.</a> Cell. 123 (3), 521-533 (2005).</li>
<li>Verstreken, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endophilin+Mutations+Block+Clathrin-Mediated+Endocytosis+but+Not+Neurotransmitter+Release%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Endophilin Mutations Block Clathrin-Mediated Endocytosis but Not Neurotransmitter Release.</a> Cell. 109 (1), 101-112 (2002).</li>
<li>Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J. -Y., Goodman, K. M., Harata, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+synaptic+vesicle+recycling+using+FM+dyes+during+evoked%2C+spontaneous%2C+and+miniature+synaptic+activities%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Examination of synaptic vesicle recycling using FM dyes during evoked, spontaneous, and miniature synaptic activities.</a> J Vis Exp. (85), (2014).</li>
<li>Sandell, J. H., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoconversion+of+some+fluorescent+markers+to+a+diaminobenzidine+product%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Photoconversion of some fluorescent markers to a diaminobenzidine product.</a> J Histochem Cytochem. 36 (5), 555-559 (1988).</li>
<li>Opazo, F., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+Synaptic+Vesicle+Pools+using+Photoconversion+of+Styryl+Dyes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes.</a> J Vis Exp. (36), e1790(2010).</li>
<li>Sabeva, N. S., Bykhovskaia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FM1-43+Photoconversion+and+Electron+Microscopy+Analysis+at+the+Drosophila+Neuromuscular+Junction%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">FM1-43 Photoconversion and Electron Microscopy Analysis at the Drosophila Neuromuscular Junction.</a> Bio-protocol. 7 (17), (2017).</li>
<li>Sabeva, N., Cho, R. W., Vasin, A., Gonzalez, A., Littleton, J. T., Bykhovskaia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complexin+Mutants+Reveal+Partial+Segregation+between+Recycling+Pathways+That+Drive+Evoked+and+Spontaneous+Neurotransmission%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Complexin Mutants Reveal Partial Segregation between Recycling Pathways That Drive Evoked and Spontaneous Neurotransmission.</a> J Neurosci. 37 (2), 383-396 (2017).</li>
<li>Ryan, T. A., Reuter, H., Wendland, B., Schweizer, F. E., Tsien, R. W., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinetics+of+synaptic+vesicle+recycling+measured+at+single+presynaptic+boutons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The kinetics of synaptic vesicle recycling measured at single presynaptic boutons.</a> Neuron. 11 (4), 713-724 (1993).</li>
<li>Ramaswami, M., Krishnan, K. S., Kelly, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermediates+in+synaptic+vesicle+recycling+revealed+by+optical+imaging+of+Drosophila+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Intermediates in synaptic vesicle recycling revealed by optical imaging of Drosophila neuromuscular junctions.</a> Neuron. 13 (2), 363-375 (1994).</li>
<li>Trotta, N., Rodesch, C. K., Fergestad, T., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+bases+of+activity-dependent+paralysis+in+Drosophila+stress-sensitive+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Cellular bases of activity-dependent paralysis in Drosophila stress-sensitive mutants.</a> J Neurobiol. 60 (3), 328-347 (2004).</li>
<li>Long, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nonsense-mediated+decay+pathway+maintains+synapse+architecture+and+synaptic+vesicle+cycle+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The nonsense-mediated decay pathway maintains synapse architecture and synaptic vesicle cycle efficacy.</a> J Cell Sci. 123 (Pt 19), 3303-3315 (2010).</li>
<li>Parkinson, W., Dear, M. L., Rushton, E., Broadie, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24227656">N-glycosylation requirements in neuromuscular synaptogenesis.</a> Development. 140 (24), 4970-4981 (2013).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://dev.biologists.org/content/118/2/401.abstract">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), (1993).</li>
<li>Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+horseradish+peroxidase+as+specific+neuronal+markers+in+Drosophila+and+in+grasshopper+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Antibodies to horseradish peroxidase as specific neuronal markers in Drosophila and in grasshopper embryos.</a> Proc Natl Acad Sci. 79 (8), (1982).</li>
<li>Paschinger, K., Rendić, D., Wilson, I. B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+the+anti-HRP+epitope+in+Drosophila+and+Caenorhabditis%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconj+J%22%5BJournal%5D)">Revealing the anti-HRP epitope in Drosophila and Caenorhabditis.</a> Glycoconj J. 26 (3), 385-395 (2009).</li>
<li>Ramachandran, P., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fm1-43+labeling+of+Drosophila+larval+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Fm1-43 labeling of Drosophila larval neuromuscular junctions.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010 (8), (2010).</li>
<li>Yawo, H., Kandori, H., Koizumi, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYawo%2C+H+%22Optogenetics%3A+light-sensing+proteins+and+their+applications%22">Optogenetics: light-sensing proteins and their applications</a>. , (2015).</li>
<li>Pulver, S. R., Pashkovski, S. L., Hornstein, N. J., Garrity, P. A., Griffith, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+dynamics+of+neuronal+activation+by+Channelrhodopsin-2+and+TRPA1+determine+behavioral+output+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Temporal dynamics of neuronal activation by Channelrhodopsin-2 and TRPA1 determine behavioral output in Drosophila larvae.</a> J Neurophysiol. 101 (6), 3075-3088 (2009).</li>
<li>Hornstein, N. J., Pulver, S. R., Griffith, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin2+Mediated+Stimulation+of+Synaptic+Potentials+at+Drosophila+Neuromuscular+Junctions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions.</a> J Vis Exp. (25), e1133(2009).</li>
<li>Britt, J. P., McDevitt, R. A., Bonci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+channelrhodopsin+for+activation+of+CNS+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Use of channelrhodopsin for activation of CNS neurons.</a> Curr Protoc Neurosci. , Chapter 2, Unit 2.16 (2012).</li>
<li>Lin, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+user%27s+guide+to+channelrhodopsin+variants%3A+features%2C+limitations+and+future+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Physiol%22%5BJournal%5D)">A user's guide to channelrhodopsin variants: features, limitations and future developments.</a> Exp Physiol. 96 (1), 19-25 (2011).</li>
<li>Vijayakrishnan, N., Woodruff, E. A., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rolling+blackout+is+required+for+bulk+endocytosis+in+non-neuronal+cells+and+neuronal+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Rolling blackout is required for bulk endocytosis in non-neuronal cells and neuronal synapses.</a> J Cell Sci. 122, 114-125 (2009).</li>
<li>Honjo, K., Hwang, R. Y., Tracey, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+manipulation+of+neural+circuits+and+behavior+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Optogenetic manipulation of neural circuits and behavior in Drosophila larvae.</a> Nat Protoc. 7 (8), 1470-1478 (2012).</li>
<li>Dear, M. L., Shilts, J., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+drives+FMRP-+and+HSPG-dependent+matrix+metalloproteinase+function+required+for+rapid+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity drives FMRP- and HSPG-dependent matrix metalloproteinase function required for rapid synaptogenesis.</a> Sci Signal. 10 (504), (2017).</li>
<li>Baldwin, M. L., Rostas, J. A. P., Sim, A. T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+modes+of+exocytosis+from+synaptosomes+are+differentially+regulated+by+protein+phosphatase+types+2A+and+2B%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Two modes of exocytosis from synaptosomes are differentially regulated by protein phosphatase types 2A and 2B.</a> J Neurochem. 85 (5), 1190-1199 (2003).</li>
<li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-2%2C+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940-13945 (2003).</li>
<li>Pfeiffer, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+for+neuroanatomy+and+neurogenetics+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9715-9720 (2008).</li>
<li>Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+Activation+of+Channelrhodopsin-2+in+Excitable+Cells+of+Caenorhabditis+elegans+Triggers+Rapid+Behavioral+Responses%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Light Activation of Channelrhodopsin-2 in Excitable Cells of Caenorhabditis elegans Triggers Rapid Behavioral Responses.</a> Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).</li>
<li>Lin, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+user%27s+guide+to+channelrhodopsin+variants%3A+features%2C+limitations+and+future+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Physiol%22%5BJournal%5D)">A user's guide to channelrhodopsin variants: features, limitations and future developments.</a> Exp Physiol. 96 (1), 19-25 (2011).</li>
<li>Sullivan, K. M., Scott, K., Zuker, C. S., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ryanodine+receptor+is+essential+for+larval+development+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The ryanodine receptor is essential for larval development in Drosophila melanogaster.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (11), 5942-5947 (2000).</li>
<li>Narahashi, T., Moore, J. W., Scott, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrodotoxin+Blockage+of+Sodium+Conductance+Increase+in+Lobster+Giant+Axons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Tetrodotoxin Blockage of Sodium Conductance Increase in Lobster Giant Axons.</a> J Gen Physiol. 47 (5), 965-974 (1964).</li>
<li>Narahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemicals+as+tools+in+the+study+of+excitable+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Chemicals as tools in the study of excitable membranes.</a> Physiol Rev. 54 (4), 813-889 (1974).</li>
<li>Kuromi, H., Yoshihara, M., Kidokoro, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inhibitory+role+of+calcineurin+in+endocytosis+of+synaptic+vesicles+at+nerve+terminals+of+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">An inhibitory role of calcineurin in endocytosis of synaptic vesicles at nerve terminals of Drosophila larvae.</a> Neurosci Res. 27 (2), 101-113 (1997).</li>
<li>Seamon, K. B., Daly, J. W. <a target="_blank" href="http://www.cell.com/trends/pharmacological-sciences/abstract/0165-6147(83)90326-7">Forskolin, cyclic AMP and cellular physiology.</a> Trends Pharmacol Sci. 4, 120-123 (1983).</li>
<li>Zhang, D., Kuromi, H., Kidokoro, Y. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-4-431-66973-9_32">Synaptic Transmission at the Drosophila Neuromuscular Junction: Effects of Metabotropic Glutamate Receptor Activation.</a> Slow Synaptic Responses Modul. , 260-265 (2000).</li>
<li>Kuromi, H., Kidokoro, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+optically+determined+size+of+exo%2Fendo+cycling+vesicle+pool+correlates+with+the+quantal+content+at+the+neuromuscular+junction+of+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The optically determined size of exo/endo cycling vesicle pool correlates with the quantal content at the neuromuscular junction of Drosophila larvae.</a> J Neurosci. 19 (5), 1557-1565 (1999).</li>
<li>Kuromi, H., Kidokoro, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+Replenishment+of+Two+Vesicle+Pools+Depends+on+the+Source+of+Ca2%2B+at+the+Drosophila+Synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Selective Replenishment of Two Vesicle Pools Depends on the Source of Ca2+ at the Drosophila Synapse.</a> Neuron. 35 (2), 333-343 (2002).</li>
<li>Kay, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Synaptic+Activity+in+Intact+Brain+and+Slices+with+FM1-43+in+C.+elegans%2C+Lamprey%2C+and+Rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging Synaptic Activity in Intact Brain and Slices with FM1-43 in C. elegans, Lamprey, and Rat.</a> Neuron. 24 (4), 809-817 (1999).</li>
<li>Pyle, J. L., Kavalali, E. T., Choi, S., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+Synaptic+Activity+in+Hippocampal+Slices+with+FM1-43+Enabled+by+Fluorescence+Quenching%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Visualization of Synaptic Activity in Hippocampal Slices with FM1-43 Enabled by Fluorescence Quenching.</a> Neuron. 24 (4), 803-808 (1999).</li>
<li>Denker, A., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicle+pools%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Synaptic+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicle pools: an update.</a> Front Synaptic Neurosci. 2, 135(2010).</li>
<li>Denker, A., Kröhnert, K., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+synaptic+vesicle+pool+localization+in+the+Drosophila+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Revisiting synaptic vesicle pool localization in the Drosophila neuromuscular junction.</a> J Physiol. 587 (12), 2919-2926 (2009).</li>
<li>Wucherpfennig, T., Wilsch-Bräuninger, M., Gonz ález-Gait án, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Drosophila+Rab5+during+endosomal+trafficking+at+the+synapse+and+evoked+neurotransmitter+release%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of Drosophila Rab5 during endosomal trafficking at the synapse and evoked neurotransmitter release.</a> J Cell Biol. 161 (3), 609-624 (2003).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Stymulacja depolaryzująca o wysokiej zawartości soli fizjologicznej o wysokiej [K+] jest zdecydowanie najłatwiejszą z trzech opcji dla zależnych od aktywności cykli barwnika FM, ale prawdopodobnienajmniej fizjologiczną. Ta prosta metoda depolaryzuje każdą dostępną komórkę w całym zwierzęciu, a więc nie pozwala na ukierunkowane badania. Możliwe jest miejscowe zastosowanie soli fizjologicznej o wysokiej zawartości [K+] za pomocą mikropipety, ale to nadal spowoduje depolaryzację...

Pięknie scharakteryzowany model synapsy glutaminergicznego Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ) został wykorzystany do badania powstawania i funkcjonowania synaps z szerokim spektrum genetycznych perturbacji1. Zakończenie neuronu ruchowego składa się z wielu gałęzi aksonów, z których każda ma wiele powiększonych guzów synaptycznych. Te pojemne żylaki (do 5 μm średnicy) zawierają całą maszynerię neurotransmisji, w tym jednolite glutaminergiczne pęcherzyki synaptyczne (SV; o średnicy ~40 nm) w rezerwie cytozolowej i łatwo uwalnianych basenach2. Pęcherzyki te dokują w strefach aktywnych miejsca fuzji błony plazmatycznej presynaptyki (AZ), gdzie egzocytoza pośredniczy w uwalnianiu neuroprzekaźnika glutaminianu w celu komunikacji transsynaptycznej. Następnie SV są pobierane z błony komórkowej poprzez recykling typu kiss-and-run lub endocytozę za pośrednictwem klatryny (CME) dla powtarzających się cykli egzo/endocytozy. Drosophila NMJ jest łatwo dostępna i dobrze nadaje się zarówno do izolowania, jak i charakteryzowania mutantów cyklu SV. Korzystając z zaawansowanych badań genetycznych, nowe mutacje doprowadziły do identyfikacji nowych genów krytycznych dla cyklu SV3. Co więcej, odwrócone podejścia genetyczne, rozpoczynające się od już znanych genów, doprowadziły do wyjaśnienia nowych mechanizmów cyklu SV poprzez dokładny opis zmutowanych fenotypów cyklicznych4. Drosophila NMJ jest prawie idealny jako eksperymentalny preparat synaptyczny do preparowania endocytozy SV i mechanizmów egzocytozy za pomocą metod optycznego śledzenia cyklu pęcherzyków podczas neuroprzekaźnictwa.
Gama markerów fluorescencyjnych pozwala na wizualne śledzenie pęcherzyków podczas dynamiki cyklu, ale najbardziej wszechstronne są analogi barwnika FM, które po raz pierwszy zostały zsyntetyzowane przez Mao, F., et al. 5. Strukturalnie, barwniki FM zawierają hydrofilową głowę i lipofilowy ogon połączone aromatycznym pierścieniem, z centralnym obszarem nadającym właściwości spektralne. Te barwniki styrylowe rozdzielają się odwracalnie w membranach, nie "przeskakują" między listkami membranowymi, a więc nigdy nie są wolne w cytozolu i są znacznie bardziej fluorescencyjne w membranach niż woda5. Odwracalna insercja do dwuwarstwy lipidowej powoduje 40-krotny wzrost fluorescencji6. W synapsach neuronalnych klasyczne eksperymenty znakowania barwnika FM polegają na kąpieli preparatu synaptycznego z barwnikiem podczas stymulacji depolaryzacyjnej w celu załadowania barwnika przez endocytozę SV. Zewnętrzny barwnik jest następnie wypłukiwany, a cykl SV jest zatrzymywany w roztworze dzwonka bez wapnia w celu zobrazowania załadowanych synaps7. Druga runda stymulacji w kąpieli bezbarwnikowej wyzwala uwalnianie FM poprzez egzocytozę, proces, który można śledzić, mierząc spadek intensywności fluorescencji. Populacje SV od pojedynczego pęcherzyka do puli zawierającej setki pęcherzyków mogą być monitorowane ilościowo6,7. Barwniki FM zostały użyte do analizy zależnej od aktywności mobilizacji funkcjonalnie odrębnych pul SV oraz do porównania kiss-and-run vs. CME cycling8,9. Metoda została zmodyfikowana tak, aby oddzielnie oznaczać wywołane, spontaniczne i miniaturowe aktywności cyklu synaptycznego (z bardzo czułym sprzętem do wykrywania bardzo małych zmian fluorescencji i zmniejszania fotowybielania)10. Testy można rozszerzyć na poziom ultrastrukturalny poprzez fotokonwersję fluorescencyjnego sygnału FM na etykietę o dużej gęstości elektronów do transmisyjnej mikroskopii elektronowej11,12,13,14.
Historycznie, kąpiel preparatów synaptycznych w wysokim stężeniu potasu (dalej określanym jako "wysokie [K+]") była metodą wyboru do stymulacji depolaryzacyjnej w celu wywołania cyklu SV; począwszy od cholinergicznego NMJ5, do hodowanych neuronów hipokampa mózgu gryzoni15, do glutaminergicznego modelu NMJ Drosophila16,17. To podejście o wysokim [K+] jest proste, nie wymaga specjalistycznego sprzętu i dlatego jest dostępne dla większości laboratoriów, ale ma ograniczenia zarówno w zakresie aplikacji, jak i interpretacji danych. O wiele bardziej fizjologicznie odpowiednią metodą jest użycie elektrody ssącej do stymulacji elektrycznej nerwu4,5,12. Takie podejście napędza propagację potencjału czynnościowego w celu bezpośredniej stymulacji presynaptycznego zakończenia nerwowego, a wyniki można bezpośrednio porównać z elektrofizjologicznymi testami funkcji neuroprzekaźnictwa13,14,15, ale wymaga specjalistycznego sprzętu i jest technicznie znacznie trudniejsze. Wraz z pojawieniem się optogenetyki, zastosowanie stymulacji neuronalnej rodopsyny kanałowej ma dodatkowe zalety, w tym ścisłą czasoprzestrzenną kontrolę ekspresji kanału za pomocą binarnego systemu Gal4/UAS20. Takie podejście jest technicznie znacznie łatwiejsze niż stymulacja elektrodą ssącą i nie wymaga niczego więcej niż bardzo taniego źródła światła LED. Tutaj wykorzystujemy obrazowanie FM1-43 (dibromidek N-(3-trietyloamonu propylo)-4-(4-(dibutyloamino)styryl) pirydyny), aby zarówno porównać, jak i skontrastować te trzy różne metody stymulacji w Drosophila NMJ: prosty wysoki [K+], trudne podejścia elektryczne i nowe podejścia do rodopsyny kanałowej.

<table><tbody><tr><td>SylGard 184 Zestaw elastomerów silikonowych</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9644388</td><td>Do zakładania szkła nakrywkowego do sekcji</td></tr><tr><td>Szkło osłonowe mikroskopu 22x22-1</td><td>Fisherbrand</td><td>12-542-B</td><td>Do zakładania SylGard do sekcji</td></tr><tr><td>Aluminiowa górna płyta grzejna Typ 2200</td><td>Thermolyne</td><td>HPA2235M</td><td>Do utwardzania</td></tr><tr><td>komory preparacyjnej ze szkła SylGard Plexi</td><td>N/A</td> N<td>/A</td><td>Ręcznie robione</td></tr><tr><td>Kapilary ze szkła borokrzemianowego</td><td>WPI</td><td>1B100F-4</td><td>Do wykonywania mikropipet ssących i klejowych</td></tr><tr><td>Laserowy ściągacz do mikropipet</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-2000</td><td>Do wykonywania mikropipet ssących i klejowych</td></tr><tr><td>Tygon E-3603 Laboratory Tubing</td><td>Component Supply Co.</td><td>TET-031A</td><td>Do pipety do ust i ssania</td></tr><tr><td>Końcówka do pipety P2</td><td>USA Scientific</td><td>1111-3700</td><td>Do pipety doustnej</td></tr><tr><td>0,6 ml Nasadka do probówki Eppendorf</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-120</td><td>Służy do wkładania kleju do preparacji</td></tr><tr><td>Vetbond 3M</td><td>WPI</td><td>vetbond</td><td>Klej używany do rozwarstwiania</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Fisher Scientific</td><td>P-217</td><td>Forsaline</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Millipore Sigma</td><td>S5886</td><td>Do soli Chlorek</td></tr><tr><td>magnezu</td><td>Fisher Scientific</td><td>M35-500</td><td>Do soli fizjologicznej</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia dwuwodny</td><td>Millipore Sigma</td><td>C7902</td><td>Do soli</td></tr><tr><td>fizjologicznej Sacharoza</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-3</td><td>Do soli</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Millipore Sigma</td><td>H3375</td><td>Do soli fizjologicznej</td></tr><tr><td>HRP: Alexa Fluor 647</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>123-605-021</td><td>Do oznaczania błon neuronalnych</td></tr><tr><td>Pędzel</td><td>Winsor & Newton</td><td>94376864793</td><td>Do manipulowania larwami</td></tr><tr><td>Pęseta Dumont Dumostar #5</td><td>WPI</td><td>500233</td><td>Używana podczas preparacji</td></tr><tr><td>7 cm Mikronożyczki McPhersona-Vannasa (ostrza 3 mm)</td><td>WPI</td><td>14177</td><td>Używana podczas sekcji&nbsp;</td></tr><tr><td>FM1-43</td><td>Fisher Scientific</td><td>T35356</td><td>Fluorescencyjny barwnik styrylowy</td></tr><tr><td>Cyfrowy zegar</td><td>VWR</td><td>62344-641</td><td>Do pomiaru czasu załadunku/rozładunku barwnika FM&nbsp;</td></tr><tr><td>LSM 510 META laserowo-skaningowy mikroskop konfokalny</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Do obrazowania markerów fluorescencyjnych</td></tr><tr><td>Zen 2009 SP2 wersja 6.0</td><td>Oprogramowanie Zeiss</td><td></td><td>do obrazowania na konfokalnym</td></tr><tr><td>laserze HeNe 633nm</td><td>Lasos</td><td></td><td>Aby wzbudzić HRP: 647 podczas obrazowania</td></tr><tr><td>Argon 488nm laser</td><td>Lasos</td><td></td><td>Aby wzbudzić barwnik FM podczas obrazowania</td></tr><tr><td>Micro-Forge</td><td>WPI</td><td>MF200</td><td>Do wypalania mikropipet szklanych z polerowaniem</td></tr><tr><td>20 ml Końcówka strzykawkowa</td><td>BD</td><td>301625</td><td>Do zasysania aksonu w celu stymulacji elektrycznej.</td></tr><tr><td>Mikromanipulator (podstawa magnetyczna)</td><td>Narishige</td><td>MMN-9</td><td>Do sterowania elektrodą ssącą do stymulacji elektrycznej</td></tr><tr><td>Stymulator</td><td></td><td>Trawa S48</td><td>Do sterowania diodą LED i stymulacją elektryczną</td></tr><tr><td>Mikroskop Zeiss Axioskop</td><td>Używany podczas stymulacji</td><td></td><td>elektrycznej.</td></tr><tr><td>40-krotny obiektyw Achroplan do zanurzenia w wodzie</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Używany podczas stymulacji elektrycznej i obrazowania konfokalnego</td></tr><tr><td>All-trans Retinal</td><td>Millipore Sigma</td><td>R2500</td><td>Niezbędny kofaktor dla mikroskopu ChR2</td></tr><tr><td>Zeiss Stemi z portem kamery</td><td>Zeiss</td><td>2000-C</td><td>Używany podczas stymulacji rodopsyny kanałowej</td></tr><tr><td>LED 470nm</td><td>ThorLabs</td><td>M470L2</td><td>Używany do aktywacji ChR</td></tr><tr><td>Sterownik LED T-Cube</td><td>ThorLabs</td><td>LEDD1B</td><td>Do sterowania zasilaczem</td></tr><tr><td>LED LED</td><td>Cincon Electronics Co.</td><td>TR15RA150</td><td>Do zasilania miernika</td></tr><tr><td>mocy optycznej i energii</td> LED <td>ThorLabs</td><td>PM100D</td><td>Do pomiaru intensywności diod LED</td></tr></tbody></table>

cykl barwnika fm w synapsie: porównanie wysokiej depolaryzacji potasu, stymulacji elektrycznej i rodopsyny kanałowej

FM Dye Cycling at the Synapse: Comparing High Potassium Depolarization, Electrical and Channelrhodopsin Stimulation

Barwniki FM są używane do badania cyklu pęcherzyków synaptycznych (SV). Te amfipatyczne sondy mają hydrofilową głowę i hydrofobowy ogon, dzięki czemu są rozpuszczalne w wodzie ze zdolnością do odwracalnego wchodzenia i wychodzenia z dwuwarstw lipidowych błony. Te barwniki styrylowe są stosunkowo niefluorescencyjne w środowisku wodnym, ale wprowadzenie do zewnętrznego płatka błony plazmatycznej powoduje >40-krotny wzrost fluorescencji. W synapsach neuronalnych barwniki FM są internalizowane podczas endocytozy SV, transportowane zarówno w pulach SV, jak i między nimi, i uwalniane wraz z egzocytozą SV, zapewniając potężne narzędzie do wizualizacji presynaptycznych etapów neuroprzekaźnictwa. Podstawowym modelem genetycznym rozwoju i funkcji synaps glutaminergicznego jest połączenie nerwowo-mięśniowe Drosophila (NMJ), w którym obrazowanie barwnikiem FM jest szeroko stosowane do ilościowego określenia dynamiki SV w szerokim zakresie zmutowanych stanów. Terminal synaptyczny NMJ jest łatwo dostępny, z piękną gamą dużych boutonów synaptycznych idealnych do zastosowań obrazowych. Tutaj porównujemy i kontrastujemy trzy sposoby stymulowania Drosophila NMJ do napędzania zależnego od aktywności wchłaniania/uwalniania barwnika FM1-43: 1) zastosowanie kąpieli o wysokiej zawartości [K+] w celu depolaryzacji tkanek nerwowo-mięśniowych, 2) stymulacja nerwu ruchowego elektrody ssącej w celu depolaryzacji presynaptycznego zakończenia nerwowego oraz 3) ukierunkowana transgeniczna ekspresja wariantów rodopsyny kanałowej w celu stymulowanej światłem, przestrzennej kontroli depolaryzacji. Każda z tych metod ma zalety i wady w badaniu wpływu mutacji genetycznych na cykl SV w Drosophila NMJ. Omówimy te zalety i wady, aby pomóc w wyborze podejścia stymulacyjnego, wraz z metodologiami specyficznymi dla każdej strategii. Oprócz obrazowania fluorescencyjnego, barwniki FM mogą być fotokonwertowane na sygnały o dużej gęstości elektronów wizualizowane za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) w celu zbadania mechanizmów cyklu SV na poziomie ultrastrukturalnym. Zapewniamy porównania obrazowania w mikroskopii konfokalnej i elektronowej z różnych metod stymulacji Drosophila NMJ, aby pomóc w wyborze przyszłych paradygmatów eksperymentalnych.

Rycina 1 przedstawia schemat procedury obrazowania barwnikiem FM zależnego od aktywności. Eksperyment zawsze rozpoczyna się od tej samej dyssekcji larwy z użyciem kleju, niezależnie od zastosowanej później metody stymulacji. Rycina 1a to schemat zdyssekowanej larwy, pokazujący brzuszny sznur nerwowy (VNC), nerwy promieniście odchodzące oraz powtarzający się hemisegmentalny wzór mięśniowy. VNC zostaje usunięty, a preparat zanurzon...

Cykl pęcherzyków synaptycznych (SV) jest podstawowym mechanizmem komunikacji międzykomórkowej w synapsach neuronalnych. Wychwyt i uwalnianie barwnika FM są podstawowymi sposobami ilościowego oznaczania endo- i egzocytozy SV. Tutaj porównujemy wszystkie metody stymulacji w celu napędzania cyklu FM1-43 w synapsie modelu połączenia nerwowo-mięśniowego Drosophila (NMJ).

Cykl barwnika FM w synapsie: porównanie wysokiej depolaryzacji potasu, stymulacji elektrycznej i rodopsyny kanałowej

FM dyes are used to study the synaptic vesicle (SV) cycle. These amphipathic probes have a hydrophilic head and hydrophobic tail, making them ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest obserwacja cyklu endocytozy i egzocytozy pęcherzyków synaptycznych na żywym przygotowaniu połączenia nerwowo-mięśniowego larw Drosophila przy użyciu fluorescencyjnych barwników FM. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neuronauki, takie jak to, które geny są kluczowe dla funkcjonowania cyklu pęcherzyków synaptycznych? Główną zaletą tej techniki jest to, że można optycznie śledzić cykl pęcherzyków w preparacie na żywo za pomocą trzech różnych rodzajów bodźców, depolaryzacji o wysokiej zawartości potasu, stymulacji elektrycznej lub za pomocą optogenetyki.Do tej procedury należy dodać przeciwciało anty-HRP, sprzężone z lexoflor 647 do rozwarstwiającego się roztworu soli fizjologicznej. Następnie dodaj szkiełko nakrywkowe pokryte elastomerem do komory rozwarstwiającej, a następnie dodaj roztwór preparacyjny z przeciwciałem HRP do znakowania zakończenia presynaptycznego NMJ podczas sekcji. Za pomocą cienkiego pędzla przenieś wędrującą trzecią gwiazdkę z fiolki z jedzeniem na pokryte elastomerem szkło nakrywkowe.Następnie napełnij szklaną końcówkę mikropipety niewielką ilością kleju, wykorzystując podciśnienie powietrza wytwarzane przez usta. Następnie ułóż larwy grzbietem do góry za pomocą kleszczy i przyklej głowę do szkiełka nakrywkowego pokrytego elastomerem za pomocą małej kropli kleju za pomocą dodatniego ciśnienia powietrza ustami. Powtórz tę procedurę z tylnym końcem larw, upewniając się, że zwierzę jest napięte między dwoma nasadkami kleju.Za pomocą nożyczek wykonaj jednomilimetrowe poziome cięcie z tyłu i pionowe wzdłuż grzbietowej linii środkowej. Następnie delikatnie usuń tchawicę grzbietową, jelita, ciało tłuszczowe i inne narządy wewnętrzne, pokrywające mięśnie. Powtórz procedurę klejenia dla czterech klap ścian korpusu, upewniając się, że delikatnie rozciągasz korpus zarówno w poziomie, jak i w pionie.Następnie podnieś VNC i ostrożnie przetnij nerwy ruchowe nożyczkami i całkowicie usuń VNC. Zastąp sól fizjologiczną z preparacji solą fizjologiczną bez wapnia, aby zatrzymać cykl SV. Do stymulacji elektrycznej przygotuj pipetę ssącą za pomocą ściągacza do mikroelektrod, aby uzyskać wymagany rozmiar stożka i końcówki.Następnie wypoleruj końcówkę mikroelektrody za pomocą mikro kuźni, aby uzyskać ścisłe dopasowanie podczas zasysania pojedynczego nerwu ruchowego. Wsuń pipetę ssącą na uchwyt elektrody na mikromanipulatorze, który jest przymocowany do długiej, elastycznej rurki z tworzywa sztucznego i strzykawki. Następnie umieść preparat z barwnikiem FM na stoliku mikroskopu i podnieś stolik, aż larwy i pipeta ssąca będą w ostrości.Następnie zassać pętlę przeciętego nerwu ruchowego, unerwiając wybrany segment hemi za pomocą podciśnienia powietrza, generowanego przez strzykawkę do elektrody ssącej. Następnie stymuluj nerw ruchowy za pomocą wybranych parametrów do napędzania endocytozy SV i wychwytu barwnika FM 143. Najważniejszym krokiem na tym etapie procedury jest zassanie pojedynczego aksonu silnika do elektrody ssącej z ciasnym dopasowaniem.Może to wymagać kilku prób i błędów. Po znalezieniu odpowiedniej elektrody ssącej należy użyć tej samej elektrody do wszystkich porównywanych warunków, aby zapewnić stałe napięcie stymulacyjne. Aby rozładować barwnik FM, zassaj ten sam nerw ruchowy do tej samej elektrody, a następnie stymuluj nerw ruchowy do aktywacji egzocytozy SV i uwalniania barwnika FM 143.W celu stymulacji rodopsyny kanałowej podłącz niebieską diodę LED do programowalnego stymulatora za pomocą koncentrycznego i umieść diodę LED w porcie kamery. Skoncentruj niebieską wiązkę światła LED na preparacie z barwnikiem FM za pomocą funkcji zoomu mikroskopu. Najważniejszym krokiem w tym momencie procedury jest upewnienie się, że ustawienia diod LED są utrzymywane na stałym poziomie i że oświetlasz tę samą część każdego zwierzęcia we wszystkich porównywanych warunkach, aby zapewnić stałe napięcie stymulacji.Rozpocznij stymulację światłem i śledź za pomocą timera przez określony czas trwania okresu stymulacji optogenetycznej. Gdy timer się zatrzyma, szybko usuń roztwór barwnika FM i zastąp go solą fizjologiczną bez wapnia, aby zatrzymać cykl SV. Po rozładowaniu barwnika FM rozpocznij stymulację światłem i śledź za pomocą timera przez określony czas trwania okresu stymulacji optogenetycznej.Po upływie okresu odliczania szybko usuń roztwór barwnika FM i umieść go w soli fizjologicznej bez wapnia, aby zatrzymać cykl SV. Aby określić ilościowo obraz fluorescencyjny, załaduj go do obrazu J i utwórz projekcję o maksymalnej intensywności, klikając Obraz, Stosy, Zproject, a następnie używając kanału anty-HRP 647, przejdź do Obraz, Dostosuj, Próg i przesuwaj górny pasek narzędzi, aż podświetlony zostanie tylko NMJ. Za pomocą narzędzia różdżki kliknij NMJ.Jeśli NMJ jest nieciągły, przytrzymaj przycisk Shift i wybierz wszystkie części. Następnie zmień obraz na kanał barwnika FM 143 i przejdź do Analizuj, Mierz, aby uzyskać pomiar fluorescencji. Powtórz te kroki dla niezaładowanego obrazu z tego samego NMJ.Fluorescencyjny FM 143 może być fotokonwertowany do utlenionego gęstego osadu elektronowego DAB w celu wizualizacji za pomocą TEM. Poniżej znajduje się schemat ideowy metody konwersji zdjęć w celu oznaczenia drosophila NMJ po zależnym od aktywności obciążeniu barwnikiem FM 143. Jest to reprezentatywny obraz TEM synaptycznego boutona typu dzikiego w spoczynku, który pokazuje gęstą populację SV o jednakowej wielkości.Obrazy te pokazują bulony synaptyczne, które były stymulowane depolaryzacją soli fizjologicznej o wysokiej zawartości potasu przez pięć minut bez fotokonwersji lub z fotokonwersją FM 143. Można tu zaobserwować masowe struktury homo końcowe. Zdjęcia te pokazują bulony synaptyczne, które były stymulowane elektrycznie elektrodą ssącą nerwy o częstotliwości 20 Hz przez pięć minut bez fotokonwersji lub z fotokonwersją FM 143.Należy zauważyć, że pęcherzyki obciążone barwnikiem wydają się znacznie ciemniejsze niż sąsiednie pęcherzyki nieobciążone. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić sekcję kleju larwalnego, a także ładowanie i rozładowywanie barwnika FM przy użyciu wysokiej depolaryzacji potasu, stymulacji elektrycznej i optogenetycznej stymulacji rodopsyny kanałowej. Odkąd barwniki FM zostały po raz pierwszy zsyntetyzowane przez Fei-Mao, te wszechstronne barwniki były używane do badania zależnej od aktywności mobilizacji różnych pul pęcherzyków w celu zbadania różnicy między endocytozą za pośrednictwem klatryny, a także do badania wywołanych, spontanicznych i miniaturowych aktywności synaptycznych.W tym eksperymencie należy wziąć pod uwagę wiele czynników. Aby wymienić tylko kilka, zewnętrzne stężenie wapnia, rodzaj stosowanej metody stymulacji, a także czas ładowania i rozładowywania barwnika FM podczas etapów pobierania i uwalniania. Weź te czynniki pod uwagę podczas planowania własnego eksperymentu.Powodzenia!

fm-dye-cycling-at-synapse-comparing-high-potassium-depolarization

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W niniejszej procedurze wykorzystano aktywowany niebieskim światłem kanał glonowy oraz narzędzia do specyficznej dla komórek ekspresji genetycznej w celu wywołania potencjałów synaptycznych za pomocą impulsów świetlnych w złączu nerwowo-mięśniowym (NMJ) u larw Drosophila. Technika ta stanowi niedrogą i łatwą w użyciu alternatywę dla stymulacji elektrodami ssącymi w badaniach nad fizjologią synaptyczną w laboratoriach badawczych i dydaktycznych.

Stymulacja potencjałów synaptycznych w złączach nerwowo-mięśniowych Drosophila za pośrednictwem kanalorodopsyny 2

Barwniki FM okazały się nieocenioną pomocą w zrozumieniu dynamiki synaptycznej. Barwniki FM są zazwyczaj śledzone pod mikroskopem fluorescencyjnym w różnych warunkach stymulacji. Jednakże fotokonwersja barwników FM w połączeniu z mikroskopią elektronową umożliwia wizualizację odrębnych pul pęcherzyków synaptycznych, a także innych komponentów ultrastruktury, w pączkach synaptycznych.

Badanie pul pul pęcherzyków synaptycznych z wykorzystaniem fotokonwersji barwników styrylowych

Fotoliza związków klatkowanych pozwala na gwałtowny i zlokalizowany wzrost stężenia różnych związków aktywnych fizjologicznie. W niniejszej pracy przedstawiamy sposób uzyskiwania rejestracji metodą patch-clamp w połączeniu z fotolizą klatkowanego cAMP lub klatkowanego Ca w celu badania transdukcji węchowej w dysocjowanych neuronach sensorycznych węchu myszy.

Fotoliza błyskowa związków klatkowych w rzęskach neuronów sensorycznych węchu

W tym filmie włókna nerwowe larw Drosophila są zanurzone w barwniku FM, który wiąże się z lipidami błony komórkowej. Mikroelektroda ssąca i impulsy elektryczne stymulują proces endocytozy, wprowadzając barwnik FM do nowo powstałych pęcherzyków endocytarnych. Ta metoda, która wizualizuje presynaptyczne etapy neuroprzekaźnictwa, jest przydatna do badania funkcji synaptycznych i uwalniania neuroprzekaźników.

Ładowanie i rozładowywanie barwnika FM za pośrednictwem mikroelektrod w komórkach nerwowych larw Drosophila

Ten film demonstruje protokół badania recyklingu pęcherzyków synaptycznych w połączeniach nerwowo-mięśniowych u larw Drosophila wykazujących ekspresję rodopsyny kanałowej za pomocą barwnika fluorescencyjnego. Niebieskie światło aktywuje rodopsyny kanałowe, powodując napływ wapnia i egzocytozę pęcherzyków synaptycznych. Barwnik integruje się z błonami neuronalnymi i jest internalizowany podczas endocytozy, co powoduje zwiększoną fluorescencję. Dalsza stymulacja światłem niebieskim indukuje...

Analiza recyklingu pęcherzyków synaptycznych i wychwytu barwnika fluorescencyjnego przez larwy Drosophila

Opisujemy użycie styrylowych barwników FM do obrazowania recyklingu pęcherzyków synaptycznych w funkcjonalnych zakończeniach nerwowych. Protokół ten może być stosowany nie tylko do wywołanych, ale także spontanicznych i miniaturowych aktywności synaptycznych. Protokół rozszerza różnorodność zdarzeń synaptycznych, które można skutecznie ocenić.<br...

Badanie recyklingu pęcherzyków synaptycznych za pomocą barwników FM podczas wywołanych, spontanicznych i miniaturowych aktywności synaptycznych

Ten artykuł przedstawia metodę testowania połączeń monosynaptycznych między neuronami za pomocą tetrodotoksyny i kanału sodowego opornego na tetrodotoksynę, NaChBac.

Badanie połączeń monosynaptycznych u Drosophila przy użyciu kanałów sodowych opornych na tetrodotoksynę

Przedstawiamy protokół oceny elektromechanicznych efektów aktywacji GtACR1 w kardiomiocytach królików. Dostarczamy szczegółowych informacji na temat izolacji komórek, hodowli i transdukcji adenowirusa oraz na temat eksperymentów funkcjonalnych z użyciem technik patch-clamp i włókna węglowego.

Elektromechaniczna ocena optogenetycznie modulowanej aktywności kardiomiocytów

Opisano dwie powiązane metody wizualizacji zdarzeń subkomórkowych wymaganych do transmisji synaptycznej. Protokoły te umożliwiają monitorowanie w czasie rzeczywistym dynamiki napływu presynaptycznego wapnia i fuzji błony pęcherzyków synaptycznych przy użyciu obrazowania żywych komórek neuronów hodowanych in vitro.

Fluorescencyjny pomiar funkcji synaptycznych w czasie rzeczywistym w modelach stwardnienia zanikowego bocznego

Funkcjonalna fluorometria ukierunkowana na miejsce to metoda badania ruchów domen białek w czasie rzeczywistym. Modyfikacja tej techniki pod kątem jej zastosowania w komórkach natywnych umożliwia teraz wykrywanie i śledzenie ruchów pojedynczego czujnika napięcia z bramkowanych napięciem kanałów Ca2+ w mysich izolowanych włóknach mięśni szkieletowych.

Funkcjonalna fluorometria ukierunkowana na miejsce w komórkach natywnych w celu zbadania pobudliwości mięśni szkieletowych

Poznaj cykl pęcherzyków synaptycznych w larwalnym złączu nerwowo-mięśniowym Drosophila przy użyciu fluorescencyjnych barwników FM. Ta metoda pozwala optycznie śledzić endocytozę i egzocytozę żywych preparatów przy trzech rodzajach stymulacji.

Cykl barwnika FM w synapsie: porównanie wysokiej depolaryzacji potasu, stymulacji elektrycznej i rodopsyny kanałowej

Przeglądaj więcej filmów