Cykl barwnika FM w synapsie: porównanie wysokiej depolaryzacji potasu, stymulacji elektrycznej i rodopsyny kanałowej

Ogólnym celem tego eksperymentu jest obserwacja cyklu endocytozy i egzocytozy pęcherzyków synaptycznych na żywym przygotowaniu połączenia nerwowo-mięśniowego larw Drosophila przy użyciu fluorescencyjnych barwników FM. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neuronauki, takie jak to, które geny są kluczowe dla funkcjonowania cyklu pęcherzyków synaptycznych? Główną zaletą tej techniki jest to, że można optycznie śledzić cykl pęcherzyków w preparacie na żywo za pomocą trzech różnych rodzajów bodźców, depolaryzacji o wysokiej zawartości potasu, stymulacji elektrycznej lub za pomocą optogenetyki.

Do tej procedury należy dodać przeciwciało anty-HRP, sprzężone z lexoflor 647 do rozwarstwiającego się roztworu soli fizjologicznej. Następnie dodaj szkiełko nakrywkowe pokryte elastomerem do komory rozwarstwiającej, a następnie dodaj roztwór preparacyjny z przeciwciałem HRP do znakowania zakończenia presynaptycznego NMJ podczas sekcji. Za pomocą cienkiego pędzla przenieś wędrującą trzecią gwiazdkę z fiolki z jedzeniem na pokryte elastomerem szkło nakrywkowe.

Następnie napełnij szklaną końcówkę mikropipety niewielką ilością kleju, wykorzystując podciśnienie powietrza wytwarzane przez usta. Następnie ułóż larwy grzbietem do góry za pomocą kleszczy i przyklej głowę do szkiełka nakrywkowego pokrytego elastomerem za pomocą małej kropli kleju za pomocą dodatniego ciśnienia powietrza ustami. Powtórz tę procedurę z tylnym końcem larw, upewniając się, że zwierzę jest napięte między dwoma nasadkami kleju.

Za pomocą nożyczek wykonaj jednomilimetrowe poziome cięcie z tyłu i pionowe wzdłuż grzbietowej linii środkowej. Następnie delikatnie usuń tchawicę grzbietową, jelita, ciało tłuszczowe i inne narządy wewnętrzne, pokrywające mięśnie. Powtórz procedurę klejenia dla czterech klap ścian korpusu, upewniając się, że delikatnie rozciągasz korpus zarówno w poziomie, jak i w pionie.

Następnie podnieś VNC i ostrożnie przetnij nerwy ruchowe nożyczkami i całkowicie usuń VNC. Zastąp sól fizjologiczną z preparacji solą fizjologiczną bez wapnia, aby zatrzymać cykl SV. Do stymulacji elektrycznej przygotuj pipetę ssącą za pomocą ściągacza do mikroelektrod, aby uzyskać wymagany rozmiar stożka i końcówki.

Następnie wypoleruj końcówkę mikroelektrody za pomocą mikro kuźni, aby uzyskać ścisłe dopasowanie podczas zasysania pojedynczego nerwu ruchowego. Wsuń pipetę ssącą na uchwyt elektrody na mikromanipulatorze, który jest przymocowany do długiej, elastycznej rurki z tworzywa sztucznego i strzykawki. Następnie umieść preparat z barwnikiem FM na stoliku mikroskopu i podnieś stolik, aż larwy i pipeta ssąca będą w ostrości.

Następnie zassać pętlę przeciętego nerwu ruchowego, unerwiając wybrany segment hemi za pomocą podciśnienia powietrza, generowanego przez strzykawkę do elektrody ssącej. Następnie stymuluj nerw ruchowy za pomocą wybranych parametrów do napędzania endocytozy SV i wychwytu barwnika FM 143. Najważniejszym krokiem na tym etapie procedury jest zassanie pojedynczego aksonu silnika do elektrody ssącej z ciasnym dopasowaniem.

Może to wymagać kilku prób i błędów. Po znalezieniu odpowiedniej elektrody ssącej należy użyć tej samej elektrody do wszystkich porównywanych warunków, aby zapewnić stałe napięcie stymulacyjne. Aby rozładować barwnik FM, zassaj ten sam nerw ruchowy do tej samej elektrody, a następnie stymuluj nerw ruchowy do aktywacji egzocytozy SV i uwalniania barwnika FM 143.

W celu stymulacji rodopsyny kanałowej podłącz niebieską diodę LED do programowalnego stymulatora za pomocą koncentrycznego i umieść diodę LED w porcie kamery. Skoncentruj niebieską wiązkę światła LED na preparacie z barwnikiem FM za pomocą funkcji zoomu mikroskopu. Najważniejszym krokiem w tym momencie procedury jest upewnienie się, że ustawienia diod LED są utrzymywane na stałym poziomie i że oświetlasz tę samą część każdego zwierzęcia we wszystkich porównywanych warunkach, aby zapewnić stałe napięcie stymulacji.

Rozpocznij stymulację światłem i śledź za pomocą timera przez określony czas trwania okresu stymulacji optogenetycznej. Gdy timer się zatrzyma, szybko usuń roztwór barwnika FM i zastąp go solą fizjologiczną bez wapnia, aby zatrzymać cykl SV. Po rozładowaniu barwnika FM rozpocznij stymulację światłem i śledź za pomocą timera przez określony czas trwania okresu stymulacji optogenetycznej.

Po upływie okresu odliczania szybko usuń roztwór barwnika FM i umieść go w soli fizjologicznej bez wapnia, aby zatrzymać cykl SV. Aby określić ilościowo obraz fluorescencyjny, załaduj go do obrazu J i utwórz projekcję o maksymalnej intensywności, klikając Obraz, Stosy, Zproject, a następnie używając kanału anty-HRP 647, przejdź do Obraz, Dostosuj, Próg i przesuwaj górny pasek narzędzi, aż podświetlony zostanie tylko NMJ. Za pomocą narzędzia różdżki kliknij NMJ.

Jeśli NMJ jest nieciągły, przytrzymaj przycisk Shift i wybierz wszystkie części. Następnie zmień obraz na kanał barwnika FM 143 i przejdź do Analizuj, Mierz, aby uzyskać pomiar fluorescencji. Powtórz te kroki dla niezaładowanego obrazu z tego samego NMJ.

Fluorescencyjny FM 143 może być fotokonwertowany do utlenionego gęstego osadu elektronowego DAB w celu wizualizacji za pomocą TEM. Poniżej znajduje się schemat ideowy metody konwersji zdjęć w celu oznaczenia drosophila NMJ po zależnym od aktywności obciążeniu barwnikiem FM 143. Jest to reprezentatywny obraz TEM synaptycznego boutona typu dzikiego w spoczynku, który pokazuje gęstą populację SV o jednakowej wielkości.

Obrazy te pokazują bulony synaptyczne, które były stymulowane depolaryzacją soli fizjologicznej o wysokiej zawartości potasu przez pięć minut bez fotokonwersji lub z fotokonwersją FM 143. Można tu zaobserwować masowe struktury homo końcowe. Zdjęcia te pokazują bulony synaptyczne, które były stymulowane elektrycznie elektrodą ssącą nerwy o częstotliwości 20 Hz przez pięć minut bez fotokonwersji lub z fotokonwersją FM 143.

Należy zauważyć, że pęcherzyki obciążone barwnikiem wydają się znacznie ciemniejsze niż sąsiednie pęcherzyki nieobciążone. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić sekcję kleju larwalnego, a także ładowanie i rozładowywanie barwnika FM przy użyciu wysokiej depolaryzacji potasu, stymulacji elektrycznej i optogenetycznej stymulacji rodopsyny kanałowej. Odkąd barwniki FM zostały po raz pierwszy zsyntetyzowane przez Fei-Mao, te wszechstronne barwniki były używane do badania zależnej od aktywności mobilizacji różnych pul pęcherzyków w celu zbadania różnicy między endocytozą za pośrednictwem klatryny, a także do badania wywołanych, spontanicznych i miniaturowych aktywności synaptycznych.

W tym eksperymencie należy wziąć pod uwagę wiele czynników. Aby wymienić tylko kilka, zewnętrzne stężenie wapnia, rodzaj stosowanej metody stymulacji, a także czas ładowania i rozładowywania barwnika FM podczas etapów pobierania i uwalniania. Weź te czynniki pod uwagę podczas planowania własnego eksperymentu.

Powodzenia!