Name: Metodologia dokładnego wykrywania metylacji mitochondrialnego DNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-20T13:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 11 s
Description: Poznaj metodę bisulfite sequencing i pipeline bioinformatyczny do dokładnej kwantyfikacji metylacji mitochondrialnego DNA. Technika ta umożliwia badanie zmian metylacji mtDNA w chorobach ludzkich.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Centrum Podstawowych Badań Metabolicznych Fundacji Novo Nordisk jest niezależnym ośrodkiem badawczym na Uniwersytecie Kopenhaskim, częściowo finansowanym z nieograniczonej darowizny od Fundacji Novo Nordisk.

1. Traktowanie enzymami restrykcyjnymi
<ol>
	<li>Zlinearyzuj mtDNA, traktując całkowite ludzkie DNA enzymem restrykcyjnym BamHI, który tnie w pozycji 14258 w ludzkim mitochondrialnym DNA. 
	UWAGA: W przypadku DNA mysiego należy użyć enzymu restrykcyjnego BglII w identycznych warunkach, jak opisano poniżej.</li>
	<li>Dla każdej próbki, w której ma zostać oceniona metylacja mtDNA, przygotuj jedną probówkę reakcyjną o pojemności 0,2 mL i dodaj następującą mieszaninę: 3 μg genomic DNA (ilość określona metodą fluorometrii), 15 μL Buffer 3, 3 μL BamHI oraz wodę do uzyskania objętości 150 μL.</li>
	<li>Umieść probówki w termocyklerze na 4 h w temperaturze 37 °C.</li>
</ol>
2. Konwersja pirosiarczynowa
<ol>
	<li>Przeprowadzić konwersję DNA traktowanego enzymem BamHI za pomocą pirosiarczynu sodu zgodnie z opisem zamieszczonym w innym opracowaniu29.</li>
	<li>Do każdej reakcji konwersji użyć 200-500 ng DNA traktowanego enzymem BamHI w całkowitej objętości 20 μL. Odzysk DNA wynosi 50-70%.</li>
	<li>Eluować DNA po konwersji pirosiarczynem w 10 μL buforu do elucji.</li>
	<li>Ilościowo oznaczyć jednoniciowe DNA za pomocą fluorometrii.</li>
	<li>Opcjonalnie: DNA po konwersji pirosiarczynem przechowywać w temperaturze -20 °C przed przystąpieniem do pozostałych etapów protokołu. Do długotrwałego przechowywania użyć temperatury -80 °C</li>
</ol>
3. Projektowanie starterów do sekwencjonowania z pirosiarczynem
<ol>
	<li>Zaprojektuj startery do sekwencjonowania po konwersji pirosiarczynowej, korzystając z narzędzi online Methprimer30 oraz BiSearch31,32. 
	UWAGA: Methprimer i BiSearch umożliwiają wyszukiwanie sekwencji wiązania starterów w sekwencjach genomicznych, w których cytozyny zostały przekształcone w tyminy, analogicznie do procesu po konwersji pirosiarczynowej.</li>
	<li>Aby uzyskać optymalną i nieobciążoną amplifikację, unikaj dinukleotydów CpG w starterach i zaprojektuj amplikon o rozmiarze od 100 do 300 bp.</li>
	<li>Upewnij się, że zaprojektowane startery są specyficzne dla mtDNA, korzystając z funkcji Primer Search w programie BiSearch. Wprowadź wcześniej zaprojektowane startery do DNA po konwersji pirosiarczynowej, zaznacz pole bisulfite oraz podaj genom referencyjny i parametry PCR. 
	UWAGA: Wyświetlona zostanie lista możliwych produktów PCR.</li>
	<li>Skopiuj 1–5 najlepszych sekwencji starterów i wklej je do formularza zamówienia syntezy oligonukleotydów. 
	UWAGA: Lista zwalidowanych w laboratorium sekwencji starterów do mtDNA człowieka i myszy znajduje się w Tabeli 1.</li>
	<li>Przetestuj startery, wykonując PCR z DNA po konwersji pirosiarczynowej, a następnie elektroforezę w żelu agarozowym zgodnie z opisem w kroku 4. Przetestuj i zoptymalizuj wszystkie pary starterów oddzielnie i upewnij się, że na żelu agarozowym pojawia się amplikon o prawidłowym rozmiarze. 
	UWAGA: Jeśli wymagane są startery do PCR multipleksowego, dodaj kilka starterów do jednej reakcji PCR i zwizualizuj produkty PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym lub metodą o wyższej rozdzielczości, np. elektroforezą w żelu poliakrylamidowym, aby rozróżnić produkty o podobnej wielkości.</li>
</ol>
4. PCR po konwersji pirosiarczynowej i ekstrakcja z żelu
<ol>
	<li>Aby przeprowadzić amplifikację obszarów zainteresowania, wykonaj reakcję PCR z użyciem polimerazy Taq typu hot start. W skrócie: wymieszaj 100 ng przekształconego DNA, 500 µM starterów sensu i anty-sensu, 1 µL mieszaniny dNTP (po 10 µM każdego dNTP) oraz polimerazę w ilości 7,5 U/reakcję w całkowitej objętości 50 µL. Przeprowadź PCR w następujących warunkach: 5 min w 95 °C (60 s 94 °C; 60 s 55 °C*; 60 s 72 °C) <img alt="Schemat równowagi statycznej, ΣFx=0, MA=0; siły, równowaga momentów sił; ilustracja edukacyjna z fizyki." src="/files/ftp_upload/57772/57772eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="strzałka"> 35 cykli; 10 min 72 °C. Użyj starterów osobno lub w układzie multipleksowym.</li>
	<li>Opcjonalnie: Podczas stosowania starterów w układzie multipleksowym użyj 200 ng przekształconego DNA i następujących warunków cyklicznych: 5 min 95 °C (60 s 94 °C; 90 s 55 °C*; 90 s 72 °C) <img alt="Schemat równowagi statycznej, ΣFx=0, MA=0; siły, równowaga momentów sił; ilustracja edukacyjna z fizyki." src="/files/ftp_upload/57772/57772eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="strzałka"> 35 cykli; 10 min 72 °C. 
	UWAGA: Temperatura może się różnić w zależności od temperatury topnienia starterów.</li>
	<li>Produkty PCR poddaj elektroforezie w 2% żelu agarozowym przy napięciu 100 V.</li>
	<li>Pod słabym światłem UV wytnij produkty PCR skalpelem i przenieś je do mikroprotek. Nie wystawiaj produktów PCR na nadmierne działanie światła UV, aby uniknąć uszkodzenia DNA. Unikaj czasu ekspozycji przekraczającego 30 s.</li>
	<li>Oczyść produkty PCR metodą oczyszczania z żelu, zgodnie z opisem w punkcie3.</li>
	<li>Oznacz ilość oczyszczonego DNA z kroku 4.5 za pomocą fluorometrii. Przejdź do kroku 5 lub przechowuj próbki w -20°C.</li>
</ol>
5. Przygotowanie biblioteki do sekwencjonowania bisulfitowego
<ol>
	<li>Przeprowadź przygotowanie biblioteki z produktów PCR po konwersji bisulfitowej. 
	Opcjonalnie: produkty multiplex PCR na tym etapie.</li>
	<li>Przeprowadzić naprawę końców, wykorzystując do 100 ng produktu PCR. Dodać 3 µL enzym do przygotowania końców i 6.5 µL Bufor do reakcji naprawy końców (10x) do 55.5 µL produkt PCR w probówce 0,2 ml. Umieścić probówkę w termocyklerze i inkubować przez 30 min w temperaturze 20 °C a następnie 30 min w temperaturze 65 °C.</li>
	<li>Ligować adaptery sekwencyjne, mieszając DNA po naprawie końców z 15 µL mieszanina ligazy Blunt/TA, 2.5 µL Adapter i 1 µL Wzmacniacz ligacji. W przypadku stosowania &lt;100 ng produktu PCR jako materiał wyjściowy, rozcieńczyć adaptor 10-krotnie.</li>
	<li>Umieść mieszaninę (krok 5.3) w termocyklerze i inkubuj przez 15 min w temperaturze 20 °CWstrzymaj pracę termocyklera i dodaj 3 µl Dodać enzym do probówki. Wymieszać i umieścić probówkę z powrotem w termocyklerze, a następnie inkubować przez 15 min w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Przeprowadź selekcję wielkości DNA z przyligowanymi adapterami, wykorzystując kule do odwracalnej immobilizacji w fazie stałej (SPRI), stosując różne proporcje kul do DNA w zależności od wielkości produktu PCR.</li>
	<li>Dodaj 13.5 µL H2Do tego dodaj DNA z ligowanymi adaptorami z etapu 5.4 i 55 µL resuspender kulki SPRI. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min, a następnie umieścić probówkę na statywie magnetycznym. Po całkowitym oczyszczeniu roztworu przenieść nadsącz do nowej probówki i odrzucić probówkę z kulkami. 
	UWAGA: Nadfiltr zawiera DNA z przyłączonymi adaptorami, a duże, niepożądane fragmenty są związane z odrzuconymi kuleczkami.</li>
	<li>Dodaj 25 µL dodać resuspenderowane kulki SPRI do nadsączu z kroku 5.6, wymieszać i inkubować przez 5 min w temperaturze pokojowej. Umieścić probówkę na statywie magnetycznym i odpiplikować nadsącz, gdy roztwór stanie się klarowny. 
	UWAGA: Odrzucony nadsącz zawiera niepożądane DNA, natomiast DNA z przyłączonymi adapterami jest związane z kuleczkami.</li>
	<li>Gdy probówka znajduje się na statywie magnetycznym, należy dodać 200 µL 80% etanol (świeżo przygotowany) do przemycia kulek. Inkubować przez 30 s, a następnie usunąć i odrzucić nadsącz. Powtórzyć ten krok, aby w sumie wykonać 2 przemycia.</li>
	<li>Suszyć kuleczki na powietrzu przez 5 min, pozostawiając probówkę z otwartą zakrętką na statywie magnetycznym.</li>
	<li>Wyjmij probówkę z magnesu, a następnie eluuj DNA do 23 µL bufor do elucji i wymieszać. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 min.</li>
	<li>Umieść probówkę na statywie magnetycznym, a gdy roztwór stanie się klarowny, przenieś 2 µL do płytki PCR z 96 dołkami do wstępnej amplifikacji PCR (krok 5.14).</li>
	<li>Przenieść pozostałą część w przybliżeniu 21 µL do nowej probówki o pojemności 0,2 ml do amplifikacji PCR (krok 5.17). 
	UWAGA: Należy upewnić się, aby nie przenieść żadnych kulek, ponieważ mogą one hamować reakcje enzymatyczne w kolejnych etapach.</li>
	<li>Przejdź do kroku 5.14 lub przechowuj próbki w temperaturze -20°C.</li>
	<li>Przeprowadź amplifikację przed-PCR metodą RT-qPCR w celu oszacowania liczby cykli niezbędnych do amplifikacji DNA z ligowanymi adaptorami. Do każdej reakcji w 96-dołkowej płytce PCR dodaj następujące składniki: 2 µL DNA (krok 5.11): 0.4 µL Starter indeksowy, 0.4 µL uniwersalny primer PCR, 7.2 µL H2O, 10 µL Master mix do RT-qPCR.</li>
	<li>Umieść płytkę w urządzeniu do PCR w czasie rzeczywistym i poddaj ją następującym warunkom: 30 s w temperaturze 98 °C (10 s 98 °C; 75 s 65 °C) <img alt="Schemat równowagi statycznej, ΣFx=0, MA=0; siły, równowaga momentów sił; ilustracja dydaktyczna z fizyki." src="/files/ftp_upload/57772/57772eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="strzałka"> 20 cykli; 5 min 65 °C.</li>
	<li>Oszacuj liczbę cykli amplifikacji niezbędną dla każdej próbki, odejmując od wartości Ct uzyskanej w preamplifikacyjnej reakcji RT-qPCR wartość Ct odpowiadającą końcowi fazy liniowej reakcji PCR.</li>
	<li>Przeprowadź amplifikację DNA z przyligowanymi adapterami z kroku 5.12, mieszając: 21 µL DNA, 25 µL gotowa mieszanina do PCR (master mix), 1 µL starter indeksowy, 1 µL Uniwersalna starter do PCR i 2 µL H2O. W termocyklerze poddać każdą próbkę następującym warunkom: 30 s w temperaturze 98 °C (10 s 98 °C; 75 s 65 °C) <img alt="Schemat równowagi statycznej, ΣFx=0, MA=0; siły, równowaga momentów sił; ilustracja edukacyjna z fizyki." src="/files/ftp_upload/57772/57772eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="strzałka"> [obliczona wartość Ct z kroku 5.16] cykli; 5 min 65 °C. 
	UWAGA: Należy pamiętać, aby do każdej próbki użyć tylko jednego startera indeksującego, co umożliwi multipleksowanie. Indeks jest wprowadzany podczas reakcji PCR.</li>
	<li>Oczyść namnożone DNA za pomocą kulek SPRI i eluuj do 22 µL bufor elucyjny</li>
	<li>Kontroluj jakość biblioteki za pomocą elektroforezy żelowej lub alternatywnej metody. Sprawdź, czy rozmiary pików biblioteki są prawidłowe (rozmiar produktu/produktów PCR plus adapter).</li>
	<li>Oszacuj średnią wielkość par zasad produktu/produktów biblioteki za pomocą analizy rozmycia (smear analysis): W zaawansowanych ustawieniach globalnych kliknij dwukrotnie w „Tablepodczas analizy rozmycia (smear analysis). Zdefiniuj zakres od 100 do 1000 bp i kliknij Proszę dostarczyć tekst źródłowy do tłumaczenia.Pod Tabela regionówpojawia się zdefiniowany obszar i obliczana jest średnia wielkość biblioteki (bp).</li>
	<li>Oznacz ilość bibliotek metodą fluorometrii. Przejdź do kroku 6 lub przechowuj biblioteki w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
6. Sekwencjonowanie nowej generacji
<ol>
	<li>Oblicz stężenie bibliotek w nM, korzystając ze wzoru: 
	<img alt="Wzór obliczania stężenia DNA; konwersja masy cząsteczkowej na jednostki nanomolarne; równanie." src="/files/ftp_upload/57772/57772eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie"></li>
	<li>Rozcieńcz biblioteki do tej samej koncentracji w nM, np. 2 nM (wybierz 4 nM, 2 nM, 1 nM lub 0,5 nM w zależności od stężeń bibliotek). Połącz wszystkie biblioteki, aby uzyskać pulę bibliotek o stężeniu 2 nM.</li>
	<li>Zdenaturować i rozcieńczyć biblioteki zgodnie z instrukcją obsługi sekwenconera. W skrócie: zdenaturować pulę 2 nM poprzez dodanie 0,2 N NaOH i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min. Rozcieńczyć zdenaturowaną pulę do końcowego stężenia 10 pM. Zdenaturować i rozcieńczyć dostępną komercyjnie bibliotekę kontrolną (Control library) do końcowego stężenia 12,5 pM. W nowej probówce zmieszać pulę 10 pM z 20% biblioteki kontrolnej 12,5 pM. 
	UWAGA: Konwersja pirosiarczynowa wprowadza bardzo niską złożoność. Dodatek 20% biblioteki kontrolnej zapewni lepszą jakość sekwencjonowania.</li>
	<li>Przeprowadzić sekwencjonowanie paired-end 150 bp przy użyciu urządzenia do głębokiego sekwencjonowania.</li>
</ol>
7. Analiza obliczeniowa – szacowanie poziomów metylacji
<ol>
	<li>Wygeneruj pliki .fastq (tutaj nazwane sample1_R1.fastq.gz oraz sample1_R2.fastq.gz), wygeneruj indeks Bismark dla całego analizowanego genomu (tutaj w folderze o nazwie bismarkIndex) i upewnij się, że sekwencja genomowa chrM jest dostępna w formacie fasta (tutaj w folderze o nazwie chrM).</li>
	<li>Przeprowadź wstępne przetwarzanie odczytów w celu usunięcia adapterów i błędów (bias) wprowadzonych przez primery: użyj narzędzia Trim_galore33. Usuń dwa nukleotydy z końca 5' zarówno z odczytów forward, jak i reverse. 
	trim_galore --clip_R1 2 --clip_R2 2 -o ./ --trim1 --paired sample1_R1.fastq.gz sample1_R2.fastq.gz</li>
	<li>Zmapuj wstępnie przetworzone odczyty do całego genomu przy użyciu Bismark34 
	bismark --dovetail --bam -o ./ ./bismarkIndex / -1 ./sample1_R1_val_1.fq.gz -2 ./sample1_R2_val_2.fq.gz 
	UWAGA: Jeśli używany jest inny program do mapowania, należy upewnić się, że odczyty, których nie można jednoznacznie zmapować, zostaną odrzucone.</li>
	<li>Wyodrębnij odczyty mapujące się do chromosomu M, tutaj przy użyciu Samtools35 
	samtools sort -l 0 -O BAM -o sample1_sorted.bam 
	sample1_R1_val_1_bismark_bt2_pe.bam 
	samtools index sample1_sorted.bam 
	samtools view -u sample1_sorted.bam chrM | samtools sort -n -O BAM -o sample1_chrM.bam</li>
	<li>Wyekstrahuj informacje o metylacji 
	bismark_methylation_extractor -p --CX --cytosine_report --comprehensive --genome_folder ./chrM ./sample1_chrM.bam</li>
	<li>Wykorzystaj pliki .bedGraph, .cov lub CX_report.txt do dalszej analizy. Użyj pliku sample1_chrM.CX_report.txt do wizualizacji i testów.</li>
	<li>Jeśli analizowane jest wiele regionów i na wykresach M-bias wygenerowanych podczas mapowania widoczny jest błąd wprowadzony przez primery, przeprowadź dodatkowe przycinanie (clipping) na etapie wstępnego przetwarzania. Więcej informacji znajduje się w dokumentacji Bismark.</li>
</ol>
8. Analiza obliczeniowa - Test różnic
<ol>
	<li>Upewnij się, że plik CX_report.txt zawiera 7 kolumn: chromosom (tutaj chrM), pozycję, nić, liczbę odczytów zmetylowanych, liczbę odczytów niezmetylowanych, kontekst C oraz sekwencję otaczającą dla każdej cytyzyny (C) na chromosomie M.</li>
	<li>Ponieważ raport CX_report obejmuje cały chrM, wydziel podzbiór odpowiadający regionowi (regionom), które zostały poddane amplifikacji.</li>
	<li>Do wykazania różnic między próbkami zastosuj testy nieparametryczne, takie jak dokładny test Fishera dla poszczególnych C lub test znakowy dla całego regionu. 
	UWAGA: Poziom metylacji często będzie bliski 0%, dlatego założenie o rozkładzie normalnym jest nieodpowiednie.</li>
	<li>Podobnie w przypadku wizualizacji, przedstaw kwantyle lub oblicz przedziały ufności dla proporcji dwumianowej.</li>
</ol>

<ol><li>Falkenberg, M., Larsson, N. -G., Gustafsson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+replication+and+transcription+in+mammalian+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">DNA replication and transcription in mammalian mitochondria.</a> Annu Rev Biochem. 76, 679-699 (2007).</li>
<li>Kolesar, J. E., Wang, C. Y., Taguchi, Y. V., Chou, S. -H., Kaufman, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+intact+mitochondrial+DNA+agarose+electrophoresis+reveals+the+structural+complexity+of+the+mammalian+mitochondrial+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional intact mitochondrial DNA agarose electrophoresis reveals the structural complexity of the mammalian mitochondrial genome.</a> Nucleic Acids Res. 41 (4), e58(2013).</li>
<li>Mechta, M., Ingerslev, L. R., Fabre, O., Picard, M., Barres, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+Suggesting+Absence+of+Mitochondrial+DNA+Methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Evidence Suggesting Absence of Mitochondrial DNA Methylation.</a> Front Genet. 8, 166(2017).</li>
<li>Ehrlich, M., Gama-Sosa, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amount+and+distribution+of+5-methylcytosine+in+human+DNA+from+different+types+of+tissues+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Amount and distribution of 5-methylcytosine in human DNA from different types of tissues of cells.</a> Nucleic Acids Res. 10 (8), 2709-2721 (1982).</li>
<li>Lister, R., Pelizzola, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+DNA+methylomes+at+base+resolution+show+widespread+epigenomic+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences.</a> Nature. 462 (7271), 315-322 (2009).</li>
<li>Yan, J., Zierath, J. R., Barres, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+non-CpG+methylation+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Evidence for non-CpG methylation in mammals.</a> Exp Cell Res. 317 (18), 2555-2561 (2011).</li>
<li>Patil, V., Ward, R. L., Hesson, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evidence+for+functional+non-CpG+methylation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">The evidence for functional non-CpG methylation in mammalian cells.</a> Epigenetics. 9 (6), 823-828 (2014).</li>
<li>Nass, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+methylation+of+mitochondrial+and+nuclear+DNA+in+cultured+mouse%2C+hamser+and+virus+trasnforemd+hamser+cells+in+vivo+and+in+vitro+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential methylation of mitochondrial and nuclear DNA in cultured mouse, hamser and virus trasnforemd hamser cells in vivo and in vitro methylation.</a> J Mol Biol. 80 (1), 155-175 (1973).</li>
<li>Shock, L. S., Thakkar, P. V., Peterson, E. J., Moran, R. G., Taylor, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methyltransferase+1%2C+cytosine+methylation%2C+and+cytosine+hydroxymethylation+in+mammalian+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">DNA methyltransferase 1, cytosine methylation, and cytosine hydroxymethylation in mammalian mitochondria.</a> PNAS. 108 (9), 3630-3635 (2011).</li>
<li>Bellizzi, D., D'Aquila, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Control+Region+of+Mitochondrial+DNA+Shows+an+Unusual+CpG+and+Non-CpG+Methylation+Pattern%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Res%22%5BJournal%5D)">The Control Region of Mitochondrial DNA Shows an Unusual CpG and Non-CpG Methylation Pattern.</a> DNA Res. 20 (6), 537-547 (2013).</li>
<li>Jia, Y., Li, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+Low-Protein+Diet+Affects+Epigenetic+Regulation+of+Hepatic+Mitochondrial+DNA+Transcription+in+a+Sex-Specific+Manner+in+Newborn+Piglets+Associated+with+GR+Binding+to+Its+Promoter%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Maternal Low-Protein Diet Affects Epigenetic Regulation of Hepatic Mitochondrial DNA Transcription in a Sex-Specific Manner in Newborn Piglets Associated with GR Binding to Its Promoter.</a> PLoS ONE. 8 (5), e63855(2013).</li>
<li>Jia, Y., Song, H., Gao, G., Cai, D., Yang, X., Zhao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+Betaine+Supplementation+during+Gestation+Enhances+Expression+of+mtDNA-Encoded+Genes+through+D-Loop+DNA+Hypomethylation+in+the+Skeletal+Muscle+of+Newborn+Piglets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Agric+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Maternal Betaine Supplementation during Gestation Enhances Expression of mtDNA-Encoded Genes through D-Loop DNA Hypomethylation in the Skeletal Muscle of Newborn Piglets.</a> J Agric Food Chem. 63 (46), 10152-10160 (2015).</li>
<li>Infantino, V., Castegna, A., Iacobazzi, F., Spera, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impairment+of+methyl+cycle+affects+mitochondrial+methyl+availability+and+glutathione+level+in+Down%27s+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Genet+Metab%22%5BJournal%5D)">Impairment of methyl cycle affects mitochondrial methyl availability and glutathione level in Down's syndrome.</a> Mol Genet Metab. 102 (3), 378-382 (2011).</li>
<li>Chen, H., Dzitoyeva, S., Manev, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+valproic+acid+on+mitochondrial+epigenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Effect of valproic acid on mitochondrial epigenetics.</a> Eur J Pharmacol. 690 (1-3), 51-59 (2012).</li>
<li>Dzitoyeva, S., Chen, H., Manev, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+aging+on+5-hydroxymethylcytosine+in+brain+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Effect of aging on 5-hydroxymethylcytosine in brain mitochondria.</a> Neurobiol Aging. 33 (12), 2881-2891 (2012).</li>
<li>Menga, A., Palmieri, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLC25A26+overexpression+impairs+cell+function+via+mtDNA+hypermethylation+and+rewiring+of+methyl+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">SLC25A26 overexpression impairs cell function via mtDNA hypermethylation and rewiring of methyl metabolism.</a> FEBS J. 284 (6), 967-984 (2017).</li>
<li>Frommer, M., McDonald, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genomic+sequencing+protocol+that+yields+a+positive+display+of+5-methylcytosine+residues+in+individual+DNA+strands%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands.</a> PNAS. 89 (5), 1827-1831 (1992).</li>
<li>Byun, H. -M., Panni, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+airborne+pollutants+on+mitochondrial+DNA+Methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Part+Fibre+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Effects of airborne pollutants on mitochondrial DNA Methylation.</a> Part Fibre Toxicol. 10 (1), 1(2013).</li>
<li>Janssen, B. G., Byun, H. -M., Gyselaers, W., Lefebvre, W., Baccarelli, A. A., Nawrot, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental+mitochondrial+methylation+and+exposure+to+airborne+particulate+matter+in+the+early+life+environment%3A+An+ENVIRONAGE+birth+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Placental mitochondrial methylation and exposure to airborne particulate matter in the early life environment: An ENVIRONAGE birth cohort study.</a> Epigenetics. 10 (6), 536-544 (2015).</li>
<li>Zheng, L. D., Linarelli, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+resistance+is+associated+with+epigenetic+and+genetic+regulation+of+mitochondrial+DNA+in+obese+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Insulin resistance is associated with epigenetic and genetic regulation of mitochondrial DNA in obese humans.</a> Clin Epigenetics. 7 (1), 1739(2015).</li>
<li>Byun, H. -M., Colicino, E., Trevisi, L., Fan, T., Christiani, D. C., Baccarelli, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Air+Pollution+and+Blood+Mitochondrial+DNA+Methylation+on+Markers+of+Heart+Rate+Variability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Heart+Assoc%22%5BJournal%5D)">Effects of Air Pollution and Blood Mitochondrial DNA Methylation on Markers of Heart Rate Variability.</a> J Am Heart Assoc. 5 (4), (2016).</li>
<li>Bianchessi, V., Vinci, M. C., et al. Mitochondrion. MITOCH. 27 (C), 40-47 (2016).</li>
<li>Wijst, M. G. P., van Tilburg, A. Y., Ruiters, M. H. J., Rots, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+mitochondria-targeted+DNA+methylation+identifies+GpC+methylation%2C+not+CpG+methylation%2C+as+potential+regulator+of+mitochondrial+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Experimental mitochondria-targeted DNA methylation identifies GpC methylation, not CpG methylation, as potential regulator of mitochondrial gene expression.</a> Sci Rep. 7 (1), 177(2017).</li>
<li>Wong, M., Gertz, B., Chestnut, B. A., Martin, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNMT3A+and+DNA+methylation+in+skeletal+muscle+and+CNS+of+transgenic+mouse+models+of+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Front+cellr+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNMT3A and DNA methylation in skeletal muscle and CNS of transgenic mouse models of ALS.</a> Front cellr Neurosci. 7, 279(2013).</li>
<li>Dawid, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-methylcytidylic+acid%3A+absence+from+mitochondrial+DNA+of+frogs+and+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">5-methylcytidylic acid: absence from mitochondrial DNA of frogs and HeLa cells.</a> Science. 184 (4132), 80-81 (1974).</li>
<li>Gama-Sosa, M. A. <a target="_blank" href="http://www.worldcat.org/title/levels-and-distribution-of-5-methylcytosine-in-chordate-dna/oclc/15059352">Levels and distribution of 5-methylcytosine in Chordate DNA</a>. , 1-201 (1985).</li>
<li>Hong, E. E., Okitsu, C. Y., Smith, A. D., Hsieh, C. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regionally+specific+and+genome-wide+analyses+conclusively+demonstrate+the+absence+of+CpG+methylation+in+human+mitochondrial+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regionally specific and genome-wide analyses conclusively demonstrate the absence of CpG methylation in human mitochondrial DNA.</a> Mol Cell Biol. 33 (14), 2683-2690 (2013).</li>
<li>Liu, B., Du, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CpG+methylation+patterns+ofhuman+mitochondrial+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Publishing+Group%22%5BJournal%5D)">CpG methylation patterns ofhuman mitochondrial DNA.</a> Nature Publishing Group. , 1-10 (2016).</li>
<li>Donkin, I., Versteyhe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+and+Bariatric+Surgery+Drive+Epigenetic+Variation+of+Spermatozoa+in+Humans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Obesity and Bariatric Surgery Drive Epigenetic Variation of Spermatozoa in Humans.</a> Cell Metab. 23 (2), 369-378 (2016).</li>
<li>Li, L. C., Dahiya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MethPrimer%3A+designing+primers+for+methylation+PCRs%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MethPrimer: designing primers for methylation PCRs.</a> Bioinformatics. 18 (11), 1427-1431 (2002).</li>
<li>Tusnády, G. E., Simon, I., Váradi, A., Arányi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BiSearch%3A+primer-design+and+search+tool+for+PCR+on+bisulfite-treated+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">BiSearch: primer-design and search tool for PCR on bisulfite-treated genomes.</a> Nucleic Acids Res. 33 (1), e9(2005).</li>
<li>Arányi, T., Váradi, A., Simon, I., Tusnády, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+BiSearch+web+server%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The BiSearch web server.</a> BMC bioinformatics. 7, 431(2006).</li>
<li>Krueger, F. Trim Galore!. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/">http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/</a> (2018).</li>
<li>Krueger, F., Andrews, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bismark%3A+a+flexible+aligner+and+methylation+caller+for+Bisulfite-Seq+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Bismark: a flexible aligner and methylation caller for Bisulfite-Seq applications.</a> Bioinformatics. 27 (11), 1571-1572 (2011).</li>
<li>Li, H., Handsaker, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sequence+Alignment%2FMap+format+and+SAMtools%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li>
<li>Ramos, A., Barbena, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+insertions+of+mitochondrial+origin%3A+Database+updating+and+usefulness+in+cancer+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Nuclear insertions of mitochondrial origin: Database updating and usefulness in cancer studies.</a> Mitochondrion. 11 (6), 946-953 (2011).</li>
<li>Warnecke, P. M., Stirzaker, C., Song, J., Grunau, C., Melki, J. R., Clark, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+resolution+of+artifacts+in+bisulfite+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+%28San+Diego%2C+Calif%29%22%5BJournal%5D)">Identification and resolution of artifacts in bisulfite sequencing.</a> Methods (San Diego, Calif). 27 (2), 101-107 (2002).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych, które mogliby zadeklarować.

W tym miejscu udostępniamy protokół sekwencjonowania wodorosiarczynów, który jest specjalnie zaprojektowany do badania metylacji mtDNA. Różnice w stosunku do protokołów sekwencjonowania wodorosiarczynów stosowanych do genomowego DNA polegają na wykorzystaniu wcześniejszego etapu trawienia enzymem restrykcyjnym i analizie bioinformatycznej wykluczającej fałszywie dodatnie wyniki wynikające z sekwencji NUMT.
Zapewniamy protokół zapobiegający artefaktom sekwencjonowania wodorosiarczynów podczas b...

Genom mitochondrialny to okrągła, dwuniciowa struktura o długości około 16,5 kilo podstawy (kb), składająca się z ciężkiej i lekkiej nici. Genom mitochondrialny jest obecny w wielu kopiach w każdej komórce, dziedziczony przez matkę i koduje niezbędne składniki kompleksów łańcucha oddechowego1. Podobnie jak genomy bakteryjne i w przeciwieństwie do genomu jądrowego, genom mitochondrialny jest zorganizowany w liczne struktury drugorzędowe i trzeciorzędowe, takie jak struktury zwinięte i superskręcone2, co może utrudnić dostęp podczas eksperymentów sekwencjonowania3.
W jądrze, metylacja DNA jest szeroko badanym znakiem epigenetycznym, który odgrywa rolę w wielu procesach, zwłaszcza w regulacji ekspresji genów. W genomach ssaków metylacja DNA zachodzi głównie w pozycji 5 pierścienia pirymidynowego deoksycytydyn, głównie na dinukleotydach CG (lub CpG). Metylacja cytozyny występuje w 70% wszystkich CpG w genomie komórek somatycznych i stanowi ~1% wszystkich zasad DNA4. Metylacje DNA zostały również opisane w kontekstach innych niż CpG, takich jak CpA, CpT i CpC i występują w różnych ilościach w jądrowym DNA, z wartościami do 25% wszystkich metylowanych cytozyn w embrionalnych komórkach macierzystych5,6,7.
Chociaż metylacja genomu jądrowego cytozyny jest powszechnie akceptowana, istnienie metylacji mitochondrialnego DNA (mtDNA) jest nadal kontrowersyjne. Pierwsze badanie dotyczące metylacji mtDNA przeprowadzono w hodowanych komórkach, w których metylacja mtDNA była łatwo wykrywalna, chociaż na niższych poziomach w porównaniu z jądrowym DNA8. Zarówno w komórkach ludzkich, jak i mysich metylację mtDNA wykryto również na niskich poziomach (2-5%). Korzystając z testów opierających się na wychwytywaniu 5 metylocytozyny, takich jak immunoprecypitacja metylowanego DNA (MeDIP), a następnie ilościowy PCR, metylację mtDNA wykryto również w różnych liniach myszy i ludzi oraz komórkach9,10,11,12. Używając przeciwciał przeciwko 5-metylocytozynie w teście ELISA lub spektrometrii mas, wykryto znaczne poziomy metylacji DNA z oczyszczonych frakcji mitochondrialnych13,14,15,16. Jednak większość testów w wyżej wymienionych badaniach wykorzystywała techniki, które nie zostały zaprojektowane w celu zapewnienia bezwzględnej kwantyfikacji metylacji DNA w rozdzielczości pojedynczej zasady.
Ilościowa i rezolutna analiza metylacji DNA może być osiągnięta za pomocą techniki zwanej "sekwencjonowaniem dwusiarczynowym", która wykorzystuje właściwość wodorosiarczynu sodu do przekształcania niemetylowanej cytozyny w uracyl w jednoniciowym DNA Context17. Korzystając z sekwencjonowania wodorosiarczynów, konstelacja badań wykryła obecność metylacji cytozyny na różnych poziomach. Metylacja mtDNA w regionie pętli D, regionie 12S lub 16S została łatwo wykryta w tkankach i komórkach human18,19,20,21,22,23 i mouse24 tkankach i komórkach, jednak z intrygującą zmiennością, wynoszącą 1-20% całkowitych cytozyn we wszystkich badaniach.
W porównaniu z tymi licznymi badaniami, tylko kilka badań, w tym z naszej grupy, kwestionowało obecność metylacji mtDNA3,25,26,27 lub kwestionowały biologiczne znaczenie bardzo niskich poziomów poziomów mtDNA (poniżej 2%)28. Niedawno informowaliśmy o obserwacji potencjalnego artefaktu sekwencjonowania wodorosiarczynów w całym sekwencjonowaniu wodorosiarczynów w mitochondriach3. Dostarczyliśmy dowodów na to, że drugorzędowa struktura mitochondrialnego DNA może prowadzić do wyników fałszywie dodatnich w sekwencjonowaniu wodorosiarczynów, przeszacowując w ten sposób poziomy metylacji. Przedstawiamy tutaj protokół zapobiegający artefaktowi konwersji mtDNA przez wodorosiarczyn. Protokół ten wykorzystuje proste enzymatyczne trawienie DNA w celu zakłócenia drugorzędowych struktur mtDNA i umożliwienia pełnego dostępu do wodorosiarczynu po protokole sekwencjonowania wodorosiarczynu. Ponadto zapewniamy towarzyszący proces bioinformatyczny do analizy sekwencjonowania wodorosiarczynów.

<table><tbody><tr><td>BamHI</td><td>New England BioLabs</td><td># R0136</td><td></td></tr><tr><td>EZ Zestaw do metylacji DNA i błyskawicy</td><td>Zymo Research</td><td># D5030&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Test Qubit ssDNA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td># Q10212</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do testów kubitowych</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td># Q32856</td><td></td></tr><tr><td>HotStarTaq plus zestaw polimerazy DNA</td><td>Qiagen</td><td># 203603&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji żelu QIAquick</td><td>Qiagen</td><td># 28704</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra Zestaw biblioteki DNA dla Illumina</td><td>New England BioLabs</td><td># E7370S</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Multiplex Oligoes dla Illumina</td><td>New England BioLabs</td><td># E7335S</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td># A63881</td><td></td></tr><tr><td>Chip DNA o wysokiej czułości</td><td>Agilent</td><td># 5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Test dsDNA o wysokiej czułości kubitu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td># Q33230</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw odczynników MiSeq v2 300 cykli</td><td>Illumina</td><td># MS-102-2003</td><td></td></tr><tr><td>PhiX control v3</td><td>Illumina</td><td># FC-110-3001</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu&nbsp;</td><td>Sigma</td><td># S5881</td><td></td></tr><tr><td>Termocykler C1000</td><td>Biorad</td><td># 1851148</td><td></td></tr><tr><td>CFX96 System wykrywania PCR w czasie rzeczywistym</td><td>Biorad&nbsp;</td><td>#1855195</td><td></td></tr><tr><td>Fluorometr kubitowy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td># Q33226</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalizator 2100</td><td>Agilent</td> <td># G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq instrument</td><td>Illumina</td><td># SY-410-1003</td><td></td></tr></tbody></table>

metodologia dokładnego wykrywania metylacji mitochondrialnego dna

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Kwantyfikacja metylacji DNA może być osiągnięta za pomocą sekwencjonowania wodorosiarczynowego, które wykorzystuje właściwość wodorosiarczynu sodu do przekształcania niemetylowanej cytozyny w uracyl, w kontekście jednoniciowego DNA. Sekwencjonowanie wodorosiarczynów może być ukierunkowane (przy użyciu PCR) lub przeprowadzone na całym genomie i zapewnia bezwzględną kwantyfikację metylacji cytozyny w rozdzielczości pojedynczej zasady. Biorąc pod uwagę odrębny charakter DNA jądrowego i mitochondrialnego, zwłaszcza w strukturze drugorzędowej, należy dostosować metody sekwencjonowania wodorosiarczynów do badania metylacji cytozyny w mtDNA. Drugorzędowa i trzeciorzędowa struktura mtDNA może rzeczywiście prowadzić do artefaktów sekwencjonowania wodorosiarczynów, co prowadzi do wyników fałszywie dodatnich z powodu niepełnej denaturacji, słabego dostępu wodorosiarczynu do jednoniciowego DNA. W tym miejscu opisujemy protokół wykorzystujący enzymatyczne trawienie DNA za pomocą BamHI w połączeniu z procesem analizy bioinformatycznej, aby umożliwić dokładne ilościowe określenie poziomów metylacji cytozyny w mtDNA. Ponadto podajemy wytyczne dotyczące projektowania starterów sekwencjonowania wodorosiarczynów specyficznych dla mtDNA, aby uniknąć celowania w niepożądane segmenty miTochondrial NUclear (NUMT) wprowadzone do genomu jądrowego.

Dwa kroki w tym protokole są kluczowe podczas badania metylacji mtDNA. 1) Rozplecenie struktury drugorzędowej oraz 2) zaprojektowanie starterów specyficznych dla mitochondrialnego DNA.
Poprzez trawienie ludzkiego genomowego DNA za pomocą enzymu restrykcyjnego BamHI (Rysunek 1), struktura mitochondrialnego DNA zostanie przecięta na pozycji nukleotydowej 14 258, a struktura drugorzędowa zostanie otwar...

Tutaj prezentujemy protokół umożliwiający dokładne ilościowe określenie metylacji mitochondrialnego DNA (mtDNA). W tym protokole opisujemy enzymatyczne trawienie DNA za pomocą BamHI w połączeniu z procesem analizy bioinformatycznej, który można wykorzystać do uniknięcia przeszacowania poziomów metylacji mtDNA spowodowanych drugorzędową strukturą mtDNA.

Metodologia dokładnego wykrywania metylacji mitochondrialnego DNA

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Ogólnym celem tego protokołu sekwencjonowania wodorosiarczynów i bioinformatycznego toku badań jest osiągnięcie dokładnej kwantyfikacji metylacji mitochondrialnego DNA. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie mitoepigenetyki, takie jak: czy metylacja mitochondrialnego DNA zmienia chorobę człowieka? Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala na dokładne ilościowe określenie metylacji mitochondrialnego DNA.Kluczowym krokiem podczas badania metylacji mitochondrialnego DNA jest linearyzacja mitochondrialnego DNA poprzez trawienie BamH1 przed leczeniem wodorosiarczynem sodu. Miejsce enzymu restrykcyjnego BamH1 jest wyświetlane na tej mapie ludzkiego genomu mitochondrialnego. Pokazano również pięć regionów genomu mitochondrialnego, które będą badane za pomocą sekwencjonowania wodorosiarczynów.Pętla przemieszczenia, fenyloalanina tRNA i rybosom 12S, rybosom 16S, dehydrogenaza NADH 5, gen kodujący mRNA cytochromu B. Po zaprojektowaniu starterów do sekwencjonowania wodorosiarczynów, przy użyciu narzędzi online opisanych w protokole tekstowym, specyficzność startera w stosunku do genomu mitochondrialnego jest weryfikowana za pomocą BiSearch. Sekwencje starterów są dodawane do wyszukiwania starterów funkcji BiSearch.Pole wodorosiarczynu jest zaznaczone i wybierany jest genom referencyjny. Wyniki wyszukiwania pokażą potencjalne produkty PCR generowane na łańcuchach sense i antysensownych. Aby amplifikować obszary zainteresowania z genomu mitochondrialnego przekształconego w wodorosiarczyn, należy przeprowadzić PCR przy użyciu polimerazy Taq na gorąco.W przypadku stosowania starterów oddzielnie wymieszaj 100 nanogramów przekształconego DNA, 500 mikromolowych starterów sensownych i antysensownych, jedną mikrolitrową mieszankę dNTP i polimerazę w ilości 7,5 jednostki na reakcję w łącznej objętości 50 mikrolitrów. Uruchom PCR w następujących warunkach: pięć minut w 95 stopniach Celsjusza, jedna minuta w 94 stopniach Celsjusza, jedna minuta w 55 stopniach Celsjusza, jedna minuta w 72 stopniach Celsjusza przez 35 cykli, a następnie 10 minut w 72 stopniach Celsjusza. Do multipleksowania starterów użyj 200 nanogramów przekształconego DNA w następujących warunkach cyklicznych: pięć minut w 95 stopniach Celsjusza, jedna minuta w 94 stopniach Celsjusza, 1,5 minuty w 55 stopniach Celsjusza i 1,5 minuty w 72 stopniach Celsjusza przez 35 cykli, a następnie 10 minut w 72 stopniach Celsjusza.Po zakończeniu PCR wykonaj elektroforezę żelową na produktach PCR, używając 2% agarozy o napięciu 100 woltów. Ekstrakcja produktów PCR z żelu agarozowego musi odbywać się w sposób minimalizujący ekspozycję na promieniowanie UV i ryzyko uszkodzenia DNA. Zrób zdjęcie żelu w świetle UV.Następnie, bardzo szybko, oznacz produkt PCR skalpelem i wyłącz światło UV. Następnie powoli pokrój produkt PCR bez ekspozycji na światło UV. Umieść plastry żelu w probówkach mikrowirówek i oczyść produkty PCR za pomocą oczyszczania żelem, jak opisano w protokole tekstowym.Określić ilościowo oczyszczone DNA za pomocą fluorometrii. Przechowuj próbki w temperaturze 20 stopni Celsjusza, jeśli tego nie zrobisz, natychmiast przystępując do przygotowania biblioteki sekwencjonowania wodorosiarczynowego. Rozpocznij przygotowanie biblioteki produktów PCR z konwersją wodorosiarczynową, wykonując naprawę końcową przy użyciu do 100 nanogramów produktu PCR.Do każdej probówki o pojemności 0,2 mililitra dodaj 55,5 mikrolitra produktu PCR, trzy mikrolitry enzymu przygotowania końcowego i 6,5 mikrolitra 10-krotnego buforu reakcyjnego naprawy końca. Inkubuj probówki w termocyklerze w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez 30 minut, a następnie w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie podwiązaj adaptery sekwencjonowania, mieszając naprawione DNA z 15 mikrolitrami mieszanki ligazy Blunt / TA, 2,5 mikrolitrami adaptera i jednym mikrolitrem wzmacniacza ligacji.Umieść mieszankę w termocyklerze i inkubuj w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez 15 minut. Zatrzymaj termocykler i dodaj 3 mikrolitry enzymu USER do każdej probówki. Wymieszaj i umieść probówki z powrotem w termocyklerze i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut.Rozmiar: wybierz DNA podwiązane adaptorowo za pomocą odwracalnego unieruchomienia w fazie stałej lub SPRI. Dodać do DNA podwiązanego adaptorowo 13,5 mikrolitra wody i 55 mikrolitrów ponownie zawieszonych kulek SPRI. Inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut.Umieść rurki na stojaku magnetycznym. Gdy roztwór jest klarowny, przenieś supernatant zawierający DNA ligowane adaptorowo do nowej probówki i wyrzuć probówkę zawierającą kulki. Dodać 25 mikrolitrów zawieszonych kulek SPRI do supernatantu; Mieszać i inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut.Umieść probówki na stojaku magnetycznym, a gdy roztwór będzie klarowny, wyrzuć supernatant. DNA podwiązane adaptorowo jest teraz związane z koralikami. Gdy probówki znajdują się na stojaku magnetycznym, dodaj 200 mikrolitrów świeżo przygotowanego 80% etanolu do każdej probówki i inkubuj przez 30 sekund, aby umyć kulki.Usunąć i wyrzucić sklarowany osad. Powtórz ten etap mycia etanolem, w sumie dwa prania. Usuń etanol z drugiego prania i wysusz kulki na powietrzu, pozostawiając rurki na stojaku magnetycznym z otwartą pokrywą na pięć minut.Po pięciu minutach wyjmij probówki ze stojaka magnetycznego, dodaj 23 mikrolitry buforu elucyjnego DNA do kulek i wymieszaj. Inkubować w temperaturze pokojowej przez dwie minuty. Umieść probówki na stojaku magnetycznym, aż roztwór będzie klarowny.Następnie przenieś dwa mikrolitry roztworu na 96-dołkową płytkę PCR w celu amplifikacji przed PCR. Ostrożnie unikając kulek, przenieś resztę roztworu do nowej probówki o pojemności 0,2 mililitra w celu amplifikacji PCR. Wykonaj amplifikację pre-PCR za pomocą RT-qPCR, aby oszacować liczbę cykli potrzebnych do amplifikacji DNA ligowanego adaptorowo.Wykonaj mieszankę wzorcową następujących składników dla każdej zastosowanej reakcji. 0,4 mikrolitra startera indeksującego, 0,4 mikrolitra uniwersalnego startera PCR, 7,2 mikrolitra wody i 10 mikrolitrów mieszanki głównej RT-qPCR. Następnie wymieszaj mieszankę główną i dodaj 18 mikrolitrów mieszanki głównej do dwóch mikrolitrów DNA w 96-dołkowej płytce PCR.Umieść płytkę w maszynie do PCR w czasie rzeczywistym i wykonaj amplifikację w następujących warunkach: 30 sekund w 98 stopniach Celsjusza, 10 sekund w 98 stopniach Celsjusza i 75 sekund w 65 stopniach Celsjusza przez 20 cykli, a następnie pięć minut w 65 stopniach Celsjusza. Po oszacowaniu liczby cykli amplifikacji potrzebnych dla każdej próbki, zgodnie z opisem w protokole tekstowym, należy amplifikować DNA podwiązane adaptorem. Dla każdej próbki wymieszaj 21 mikrolitrów DNA, 25 mikrolitrów głównej mieszanki PCR, jeden mikrolitr startera indeksowego, jeden mikrolitr uniwersalnego startera PCR i dwa mikrolitry wody.W termocyklerze poddaj każdą próbkę następującym warunkom: 30 sekund w temperaturze 98 stopni Celsjusza, 10 sekund w temperaturze 98 stopni Celsjusza i 75 sekund w temperaturze 65 stopni Celsjusza dla obliczonej liczby cykli, a następnie pięć minut w temperaturze 65 stopni Celsjusza. Oczyść amplifikowane DNA za pomocą kulek SPRI, jak pokazano wcześniej, i eluuj w 22 mikrolitrach buforu elucyjnego. Kontroluj jakość biblioteki za pomocą bioanalizatora.Poszukaj prawidłowych rozmiarów szczytów biblioteki. Oszacuj średnią wielkość pary zasad produktów bibliotecznych za pomocą analizy rozmazów. W obszarze Zaawansowane ustawienia globalne, w obszarze Analiza rozmazu, kliknij dwukrotnie pozycję Tabela.Znajdź region od 100 do 1000 pary zasad i kliknij przycisk OK. W obszarze Tabela regionów pojawi się zdefiniowany region i zostanie obliczony średni rozmiar biblioteki. Określ ilościowo bibliotekę za pomocą fluorometrii. Przechowuj bibliotekę w temperaturze 20 stopni Celsjusza, aż będzie gotowa do sekwencjonowania i analiz obliczeniowych nowej generacji.Poprzez sekwencjonowanie wodorosiarczynów badano metylację mitochondrialnego DNA w niestrawionym i strawionym całkowitym DNA z ludzkich komórek mięśni szkieletowych w pięciu różnych regionach genomu mitochondrialnego. Pełny kwadrat reprezentuje miejsca dinukleotydu cytozyny guaniny. Otwarty kwadrat reprezentuje miejsca dinukleotydu guaniny niezwiązane z cytozyną.W przypadku niestrawionego mitochondrialnego DNA poziomy metylacji wahały się od 0 do 15,1% we wszystkich badanych regionach. Jednak, gdy DNA zostało strawione przed konwersją wodorosiarczynu, wskaźnik unkowersji spadł do maksymalnie 1% we wszystkich regionach. Ilustruje to znaczenie trawienia BamH1 przed konwersją wodorosiarczynu, aby uniknąć przeszacowania poziomów metylacji mitochondrialnego DNA.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić sekwencjonowanie mitochondrialnego wodorosiarczynu, a postępując zgodnie z naszym procesem bioinformatycznym, możesz osiągnąć dokładną kwantyfikację metylacji mitochondrialnego DNA.

methodology-for-accurate-detection-of-mitochondrial-dna-methylation

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Ten film przedstawia protokół immunoprecypitacji zmetylowanego DNA (MeDIP). MeDIP jest dwudniową procedurą, która pozwala na selektywne wyodrębnienie zmetylowanych fragmentów DNA z próbki genomowego DNA przy użyciu przeciwciał specyficznych dla 5-metylocytozyny (anti-5 mC).

Immunoprecypitacja zmetylowanego DNA

Złotym standardem analizy metylacji DNA jest sekwencjonowanie genomowe DNA poddanego konwersji pirosiarczynowej. Metoda ta wykorzystuje zwiększoną wrażliwość cytozyny w porównaniu z 5-metylocytozyną (5-MeC) na deaminację pirosiarczynową w warunkach kwasowych. Niezmetylowane cytozyny można odróżnić od cytozyn zmetylowanych po amplifikacji PCR docelowego DNA genomowego.

Metylacja DNA: modyfikacja i analiza pirosiarczynowa

Przedstawiono usprawniony schemat badania metylacji DNA oraz zmian w ekspresji genów pod wpływem stresu we wczesnym okresie życia. Począwszy od separacji matczynej noworodków myszy i izolacji poszczególnych tkanek mózgowych, prezentujemy protokół jednoczesnej izolacji DNA i RNA z wycinków tkanki mózgowej w celu przeprowadzenia następującej po niej sekwencjonowania z konwersją bisulfitową oraz analizy RT-PCR.

Zoptymalizowana analiza metylacji DNA i ekspresji genów z małych, anatomicznie zdefiniowanych obszarów mózgu

Ten film opisuje technikę dot-blot do określania poziomu metylacji DNA w ludzkich chondrocytach in vitro poprzez plamienie próbek DNA na nylonowej membranie i późniejszą wizualizację za pomocą przeciwciał monoklonalnych. Pomaga to określić fenotyp chondrocytów na różnych etapach hodowli.

5-metylocytozyna Dot Blot w celu określenia stopnia metylacji DNA

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing to metoda przygotowania bibliotek sekwencjonowania do analizy metylacji DNA opartej na trawieniu enzymem restrykcyjnym połączonym z konwersją wodorosiarczynu cytozyny. Protokół ten wymaga 50 ng materiału wyjściowego i daje dane o rozdzielczości par zasad w regionach genomowych bogatych w GC.

Ulepszone sekwencjonowanie wodorosiarczynów o zmniejszonej reprezentacji do oceny metylacji DNA w rozdzielczości par zasad

Sekwencjonowanie amplikonów bisulfitowych (BSAS) to metoda ilościowego określania metylacji cytozyny w docelowych regionach genomu. Metoda ta wykorzystuje konwersję wodorosiarczynów w połączeniu z amplifikacją PCR regionów docelowych przed sekwencjonowaniem nowej generacji w celu uzyskania bezwzględnej oceny ilościowej metylacji DNA na poziomie specyficznym dla zasady.

Ukierunkowana analiza metylacji DNA za pomocą sekwencjonowania nowej generacji

Metylotransferazy DNA są potencjalnymi celami leków przeciwnowotworowych. W tym miejscu przedstawiono protokół oceny małych cząsteczek pod kątem hamowania metylotransferazy DNA. Test ten wykorzystuje endonukleazę do sprzężenia metylacji DNA z generowaniem fluorescencji i pozwala na monitorowanie aktywności enzymu w czasie rzeczywistym.

Ciągły test metylacji DNA sprzężony z endonukleazą oparty na fluorescencji w celu wykrycia inhibitorów metylotransferazy DNA

Tutaj prezentujemy protokół pomiaru bezwzględnej liczby kopii mitochondrialnego (mt)DNA i poziomów heteroplazmii delecji mtDNA w pojedynczych komórkach.

Pomiar liczby kopii i heteroplazmii mitochondrialnego DNA pojedynczej komórki za pomocą cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej

Testy pirosekwencjonowania umożliwiają solidne i szybkie genotypowanie polimorfizmów pojedynczego nukleotydu mitochondrialnego DNA w heteroplazmatycznych komórkach lub tkankach.

Genotypowanie polimorfizmów pojedynczych nukleotydów w genomie mitochondrialnym metodą pirosekwencjonowania

Opisano procedurę badania dynamiki metabolizmu mitochondrialnego DNA (mtDNA) w komórkach przy użyciu formatu wielodołkowej płytki i automatycznego obrazowania immunofluorescencyjnego w celu wykrycia i ilościowego określenia syntezy i dystrybucji mtDNA. Można to dalej wykorzystać do zbadania wpływu różnych inhibitorów, stresów komórkowych i wyciszania genów na metabolizm mtDNA.

Wysokoprzepustowa, obrazowa kwantyfikacja syntezy i dystrybucji mitochondrialnego DNA

Poznaj metodę bisulfite sequencing i pipeline bioinformatyczny do dokładnej kwantyfikacji metylacji mitochondrialnego DNA. Technika ta umożliwia badanie zmian metylacji mtDNA w chorobach ludzkich.

Metodologia dokładnego wykrywania metylacji mitochondrialnego DNA

Przeglądaj więcej filmów