Kwantyfikacja mRNA i ekspresji białek powierzchniowych w pojedynczych komórkach w limfocytach T CD4 ⁺ zakażonych małpim wirusem niedoboru odporności wyizolowanych od makaków rezusów

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie interakcji gospodarz-patogen, takie jak unikalne cechy produktywnie zakażonych komórek, jakie kofaktory gospodarza umożliwiają wirusom nawiązanie produktywnej infekcji oraz jak celować w te komórki w interwencjach terapeutycznych. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona pomiary ilościowe zarówno białka, jak i mRNA w pojedynczych komórkach, a większość odczynników jest dostępna na rynku. Procedurę sortowania komórek zademonstruje Matthew Creegan, starszy technik z rdzenia cytometrii przepływowej w laboratorium doktora Michaela Ellera.

Na początek, na wyznaczonej stacji roboczej biologii molekularnej przed PCR, przygotuj mieszankę testów, łącząc 96 testów ekspresji genów w probówce wolnej od RNazy, DNazy, upewniając się, że każdy test został dodany do końcowego stężenia 180 nanomolowych starterów do przodu i do tyłu. Dodać bufor zawiesiny DNA, aby uzyskać odpowiednie rozcieńczenie mieszaniny testowej. Dla każdej przewidywanej matrycy chipów o wymiarach 96 na 96 należy odpipetować sześć mikrolitrów każdego testu do wyznaczonego dołka na 96-dołkowej płytce PCR, a następnie uszczelnić płytkę klejem.

Aby rozpocząć barwienie powierzchni żywych komórek, w komorze bezpieczeństwa biologicznego do hodowli tkankowej, najpierw przygotuj próbki kompensacyjne i główną mieszankę koktajlu przeciwciał fluorescencyjnych, jak opisano w protokole tekstowym. Rozmrozić kriokonserwowane komórki w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie minuty. Następnie dodaj od 5 do dwóch mililitrów zawiesiny komórek do 15-mililitrowej probówki zawierającej 12 mililitrów PBS.

Wirować przy 500 G przez trzy minuty w temperaturze 25 stopni Celsjusza, następnie odessać PBS i ponownie zawiesić osad w trzech mililitrach świeżego PBS. Przenieś tę mieszaninę do pięciomililitrowej rurki z polistyrenu. Ponownie odwirować w temperaturze 500 G przez trzy minuty w temperaturze 25 stopni Celsjusza.

Odessać supernatant, pozostawiając około 10 mikrolitrów resztkowego PBS. Następnie ponownie wymieszaj do 20 milionów umytych komórek w 80 mikrolitrach koktajlu przeciwciał. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 25 stopni Celsjusza, chroniąc przed światłem.

Następnie dodaj trzy mililitry PBS. Wirować przy 500 G przez trzy minuty i odsysać supernatant. Dokładnie zawieś komórki w 300 do 500 mikrolitrach PBS.

Przefiltruj ten roztwór, pipetując go przez nylonową nasadkę z sitkiem o grubości 35 mikrometrów. Następnie trzymaj komórki na lodzie i chroń przed światłem aż do sortowania. Po powrocie do stacji roboczej pre-PCR najpierw przygotuj mieszaninę reakcyjną RT preAMP w pojedynczej sterylnej probówce wolnej od RNazy, DNazy, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Za pomocą pipety wielokanałowej dozować 10 mikrolitrów tej mieszaniny reakcyjnej do żądanej liczby 96-dołkowych płytek zbiorczych do sortowania PCR. Uszczelnij płytkę folią samoprzylepną, a następnie umieść płytkę na wstępnie schłodzonym 96-dołkowym bloku aluminiowym. Następnie ustal schemat bramkowania sortowania komórek i przygotuj sortownik komórek z cytometrią przepływową, jak opisano w protokole tekstowym.

Wprowadź odpowiednie ustawienia instrumentu, aby określić liczbę i podzbiór komórek, które mają zostać posortowane do każdej studzienki. Usuń plombę samoprzylepną, a następnie FACS sortuje komórki do przygotowanych 96-dołkowych płytek do pobierania PCR. Ponownie uszczelnij płytkę świeżą folią samoprzylepną.

Natychmiast zwirować ponownie zamkniętą płytkę, a następnie odwirować w temperaturze 2000 G przez jedną minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Poddaj płytkę cyklowi termicznemu w maszynie do PCR z nagrzaną pokrywką w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez 15 minut, a następnie w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez dwie minuty. Na koniec poddaj cyklowi termicznemu przez 18 cykli w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 15 sekund i 60 stopni Celsjusza przez cztery minuty, a następnie w stacji roboczej po PCR przenieś pięć mikrolitrów cDNA do 20 mikrolitrów buforu zawiesiny DNA na nowej 96-dołkowej płytce PCR.

Na początek przygotuj płytkę testową qPCR, pipetując cztery mikrolitry odczynnika ładującego test do każdej studzienki. Następnie przenieś cztery mikrolitry każdego testu z płytki testowej 2X na płytkę qPCR. Utrzymuj płytkę testową qPCR w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Dozować płyny z przewodu sterującego ze strzykawek zalewających do dwóch zaworów wlotowych chipa. Usuń plastikową osłonę spod płyty. Umieść chip na kontrolerze IFC z karbem w pozycji A1, a następnie wybierz i uruchom główny skrypt.

Dla każdego chipa mikroprzepływowego wymieszaj 50 mikrolitrów odczynnika do ładowania próbki z 500 mikrolitrami głównej mieszanki PCR, aby przygotować mieszaninę reakcyjną w czasie rzeczywistym. Odpipetować 4,4 mikrolitra tej reakcji wymieszać z każdym dołkiem nowej 96-dołkowej płytki do PCR, teraz oznaczonej jako płytka do próbki. Następnie odpipetuj 3,6 mikrolitra wcześniej rozcieńczonego cDNA do każdego dołka płytki próbki.

Następnie przenieś pięć mikrolitrów z płytki testowej do odpowiedniego dołka po karbowanej stronie chipa. Przenieś pięć mikrolitrów z płytki próbki do odpowiedniego dołka po drugiej stronie chipa. Włóż załadowany chip do kontrolera IFC i uruchom skrypt load mix.

Następnie przenieś chip na platformę BioMark i skonfiguruj instrument zgodnie z opisem w protokole tekstowym, a następnie zapisz plik uruchomienia chipa w wyznaczonym folderze. Po zakończeniu przebiegu chipa otwórz oprogramowanie do analizy PCR w czasie rzeczywistym, a następnie wybierz plik, otwórz, aby otworzyć chiprun. Plik BML.

W lewym górnym rogu okna oprogramowania znajdź eksplorator układów i podsumowanie przebiegu układu. W podsumowaniu przebiegu chipa kliknij konfigurację detektora. W obszarze Zadanie kliknij przycisk Nowy i wybierz typ kontenera, płytę SBS i format kontenera SBS 96.

Kliknij przycisk z wielokropkiem obok mapowania, a następnie wybierz M96-Assay-SBS96.dsp. Kliknij widoki analizy. W zakładce qPCR w obszarze zadania wybierz korekcję linii bazowej dla pochodnej liniowej oraz metodę progową CT dla detektorów użytkownika.

Na karcie Progi CT zaznacz pole inicjuj z auto, a następnie kliknij przycisk analizy. W prawym górnym kwadrancie widoków analizy kliknij drugą zakładkę, tabelę wyników. Z menu rozwijanego wybierz widok mapy cieplnej, a pojawi się mapa ciepła z danymi.

Pod mapą cieplną kliknij próg i wykres logarytmu. Dostosuj progi CT ręcznie dla każdego detektora, klikając testy, reprezentowane przez kolumny na mapie cieplnej, i przeciągając próg w razie potrzeby, aby przeciąć krzywe wzmocnienia w fazie wykładniczej. Po zakończeniu kliknij przycisk analizuj.

Następnie wyeksportuj dane qPCR jako plik csv. Przenieś dane qPCR z komputera BioMark na pulpit. Zaimportuj dane do arkusza kalkulacyjnego lub oprogramowania do analizy statystycznej i zmapuj wyniki według pozycji próbki i testu na chipie.

Utwórz nową kolumnę i użyj formuły warunkowej, aby uporządkować komórki w grupy na podstawie ekspresji genów wirusa. W obszarze analizy wybierz dopasowanie Y przez X i wykreśl ekspresję genów w zależności od grupy. Następnie użyj FlowJo w wersji dziewiątej, aby otworzyć pliki FCS z sortowania FACS odpowiadającego płytce 96-dołkowej.

Po wyróżnieniu nazwy pliku wybierz platformę, bramę o numerze zdarzenia i utwórz indeksowane bramki sortowania. Poszczególne komórki będą wyświetlane według wierszy. Zaznacz wszystkie 96 komórek, a następnie wybierz obszar roboczy, eksport, wybierz wszystkie skompensowane piętra.

W obszarze dane wybierz pozycję Plik FCS, kliknij przycisk Eksportuj i wybierz wyznaczony folder. Przeciągnij nowe pliki FCS dla poszczególnych komórek do nowego obszaru roboczego FlowJo. Zaznacz wszystkie komórki i kliknij dodaj statystyki, reprezentowane przez przycisk sigma, średnią i wszystkie parametry fluorescencji.

Otwórz edytor tabel, a następnie zaznacz wszystkie piętra pierwszej komórki i przeciągnij je do okna edytora tabel. W tym oknie kliknij utwórz i wyświetl tabelę. Następnie skopiuj i wprowadź dane do oprogramowania statystycznego przez kopiowanie i wklejanie lub kliknięcie przycisku Zapisz i uruchom aplikację.

Połącz dane FACS z jednej komórki z danymi qPCR w JMP według numeru płytki i pozycji studzienki. Na koniec wykonaj analizy graficzne i statystyczne na połączonych danych. W tym badaniu kwantyfikacja białek powierzchniowych pojedynczej komórki za pomocą wieloparametrowej cytometrii przepływowej jest zintegrowana z ilościową ekspresją mRNA pojedynczej komórki za pomocą wysoce multipleksowanego RTqPCR.

Pokazano tutaj ilościową ekspresję genów wirusa w pojedynczej komórce z komórek T CD4-dodatnich makaków rezusów posortowanych przez FACS. N Tat / rev dodatni komórek ujemnych wyraża mniej kopii RNA tat / rev niż N komórek dodatnich w kolorze ciemnozielonym, co jest zgodne z wczesnym etapem infekcji przed stabilizacją i eksportem jądrowym częściowo splicowanego wirusowego RNA. Duża obfitość niesplicowanego Gag-RNA w nat / rev dodatnim N komórek dodatnich jest zgodna z późnym stadium produktywnej infekcji, podczas której obfite genomowe RNA ulega ekspresji i jest pakowane w pączkujące wiriony.

Ten trójwymiarowy wykres przedstawiający pojedynczy gen wirusa, gen gospodarza i ekspresję białka powierzchniowego gospodarza pokazuje, że ekspresja białka powierzchniowego CD4 i CD3 jest zmniejszona w komórkach dodatnich tat/rev pokazanych na zielono, mimo że transkrypty CD4 i CD3 są utrzymywane. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch do trzech dni. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić ukierunkowaną ocenę prototranskrypcji pojedynczej komórki, aby odpowiedzieć na pytania dotyczące genów i białek o zróżnicowanej ekspresji w komórkach zakażonych wirusem.