Name: Ocena funkcji oddechowych u przytomnych myszy za pomocą dwukomorowej pletyzmografii (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-10T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Poznaj metodę dwukomorowej pletyzmografii do oceny funkcji oddechowych u przytomnych myszy. Technika ta umożliwia pomiar wzorców oddychania i oporu dróg oddechowych bez znieczulenia, co jest kluczowe w badaniach nad rozwojem leków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

SML jest wspierany przez stypendium z Canadian Institutes of Health Research, MG jest wspierany przez stypendium z Respiratory Health Network FRQS (Fonds de recherche du Québec - Santé), a YB jest naukowcem z FRQS.
WKŁAD AUTORÓW 
Wszyscy autorzy przyczynili się do powstania koncepcji rękopisu i/lub filmu. Dane zebrały SML i LD. SML, LD, YB, DM, DB i AR przyczyniły się do analizy danych, generowania rycin i pisania rękopisów. W przygotowanie scenariusza filmu zaangażowani byli YB, AR, KL i MG. Spektakl został wykonany przez YB, KL i MG.

Następujące procedury zostały zatwierdzone przez Komitet Opieki nad Zwierzętami Instytutu Serca i Płuc w Quebecu zgodnie z wytycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami (CCAC).
1. Przygotowanie
<ol>
	<li>studiować
	<ol>
		<li>(Krytyczne) Przed przeprowadzeniem jakiegokolwiek eksperymentu należy uzyskać odpowiednie zgody (np. IACUC) i szkolenia (np. w zakresie obchodzenia się ze zwierzętami).</li>
		<li>Zapoznaj się ze sprzętem i oprogramowaniem operacyjnym. Przeczytaj instrukcje obsługi i, jeśli to konieczne, utwórz plik konfiguracyjny, aby zdefiniować liczbę lokalizacji, sygnałów wejściowych, analizatorów i parametrów. 
		nuta: Upewnij się, że wybrałeś wysoką częstotliwość próbkowania (2 KHz).</li>
		<li>Skonfiguruj ustawienia analizatorów dla interesujących Cię parametrów.
		<ol>
			<li>Wybierz pozycję Dostrajanie na pasku narzędzi, a następnie pozycję Analizatory.</li>
			<li>Dostosuj próg przepływu do wartości, która prawidłowo rozdziela oddechy (mysz: 0,5 ml/s) i wybierz Ti + Te, aby obliczyć częstość oddechów.</li>
			<li>Ustaw wartość ciśnienia atmosferycznego (760 mm Hg) i określ maksymalne odchylenie objętości wdechowej/wydechowej, aby oddech został uznany za prawidłowy (mysz: 20%).</li>
			<li>Kliknij Ustawienie w polu Obliczone parametry, aby dostosować limity akceptacji. 
			nuta: W opisanych eksperymentach na myszach zastosowano następujące ustawienia: czas wdechu, od 50 do 170 ms; czas wygaśnięcia, od 40 do 180 ms; częstotliwość oddychania, od 30 do 450 uderzeń na minutę; opór właściwy dróg oddechowych, od 0 do 15 cmH2O·s; przepływ śródwydechowy z dokładnością co najmniej 3 miejsc po przecinku.</li>
			<li>Po zakończeniu wybierz pozycję Zastosuj i zamknij, aby zamknąć okno dialogowe.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Z menu paska narzędzi ponownie przejdź do opcji Strojenie, a następnie Pamięć masowa, aby ustawić żądaną szybkość przechowywania danych. Kliknij Zastosuj i zamknij, aby wyjść z okna. 
		nuta: Zazwyczaj stosuje się średnią co 10 s.</li>
		<li>Utwórz protokół w oprogramowaniu operacyjnym, aby zdefiniować sekwencję poleceń i żądany czas dla każdego z nich. Przykład jest wyświetlany w Rysunek 1.</li>
		<li>Jeżeli doświadczenie obejmuje podawanie substancji w aerozolu, należy przygotować odpowiednie roztwory i rozcieńczenia zgodnie ze stężeniami, które mają być badane.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>zwierzę
	<ol>
		<li>Pracuj w cichym miejscu oddalonym od pomieszczenia mieszkalnego. Pozwól zwierzętom dostosować się do zmiany środowiska.</li>
		<li>Zważ zwierzęta i wybierz odpowiedni rozmiar pasa.</li>
		<li>(Krytyczne) Przyzwyczaj zwierzęta do unieruchomienia i procedur przed rozpoczęciem doświadczenia. W zależności od projektu eksperymentu może być konieczne wielokrotne sesje aklimatyzacyjne o wydłużającym się czasie trwania (np. 5-30 min). 
		Uwaga: Zwierzęta, które się nie aklimatyzują, powinny zostać usunięte z badania.
		<ol>
			<li>Podczas każdej sesji aklimatyzacyjnej należy umieścić zwierzę w unieruchomieniu, zaczynając od tylnego otworu; pomocne może być trzymanie urządzenia w pozycji pionowej.</li>
			<li>Gdy zwierzę znajdzie się na miejscu, włóż tylny tłok i delikatnie zablokuj go na miejscu, nie stosując nadmiernej siły.</li>
			<li>(Krytyczne) Sprawdź wzrokowo, czy zwierzę oddycha normalnie. W razie potrzeby dostosuj jego położenie, przesuwając mechanizm blokujący. Upewnij się, że nozdrza zwierzęcia wystają poza stożek nosa, a pysk opiera się o wewnętrzne ścianki ogranicznika.</li>
			<li>Odczepić tylny panel komory piersiowej, włożyć ogranicznik z zwierzęciem przez gumowy otwór w komorze piersiowej i zamknąć komorę.</li>
			<li>Zamocuj komorę głowicy i zapewnij przepływ odchylenia. Użyj przepływu 0,5 l/min dla myszy.</li>
			<li>Pozwól zwierzęciu zrelaksować się przez 5 minut.</li>
			<li>Gdy zwierzę się uspokoi, rozpocznij rejestrowanie sygnałów przepływu przez nos i klatkę piersiową. Sprawdź na ekranie komputera, czy ślady są gładkie i czy wykazują regularny wzorzec oddychania; zobacz przykład w Rysunek 2. 
			nuta: Jeżeli protokół obejmuje podawanie substancji w aerozolu, do procedury aklimatyzacji można włączyć prowokację solą fizjologiczną.</li>
			<li>Pod koniec każdej sesji należy wyjąć zwierzę z komory piersiowej i krępowania, a następnie umieścić je z powrotem w klatce i pomieszczeniu</li>.
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>sprzęt
	<ol>
		<li>W dniu eksperymentu rozpocznij sesję eksperymentalną i załaduj odpowiedni plik konfiguracyjny. 
		nuta: Sprawdź, czy zawiera żądany protokół eksperymentu.</li>
		<li>Przejdź do opcji Uruchom w menu paska narzędzi. Wprowadź informacje o eksperymencie i zwierzęciu. Po zakończeniu kliknij przycisk Uruchom u dołu okna.</li>
		<li>Kontynuuj kalibrację systemu. Skalibruj każde miejsce i sygnał wejściowy osobno.
		<ol>
			<li>Włącz generator przepływu polaryzacyjnego, podłącz go do komory głowicy za pomocą kawałka rurki i wyreguluj natężenie przepływu.</li>
			<li>Zamknij górny otwór komory głowicy zaślepką.</li>
			<li>Odłącz tylny panel komory piersiowej, mocno włóż narzędzie kalibracyjne do gumowego otworu między głową a komorą ciała, aby utworzyć hermetyczne uszczelnienie. Następnie zamknij i ponownie zamocuj tylny panel komory piersiowej.</li>
			<li>Sprawdź, czy boczny port komory piersiowej jest zaślepiony.</li>
			<li>Z menu paska narzędzi oprogramowania przejdź do Strojenie, a następnie Kalibruj.</li>
			<li>Przejdź do Wejście 1 (klatka piersiowa) i wybierz opcję Kalibruj, aby uruchomić okno dialogowe kalibracji sygnału przepływu w klatce piersiowej.</li>
			<li>(Krytyczny) Sprawdź, czy parametry wymienione w oknie dialogowym kalibracji wyświetlają odpowiednie ustawienia, tj. Niskie naprężenie fizyczne: 0; Obciążenie fizyczne zastosowane wysoką wartością: -20 mL/s; Próbki: Integracja. Po zakończeniu kliknij Niski w oknie Próbki.</li>
			<li>Sprawdź, czy generowany sygnał jest stały w oknie wyświetlacza, a następnie kliknij Zamknij.</li>
			<li>Podłącz strzykawkę o pojemności 20 ml przez boczny port komory piersiowej za pomocą plastikowego łącznika i kawałka rurki.</li>
			<li>(Krytyczne) Wybierz Wysoki w oknie Próbki i natychmiast wstrzyknij 20 ml powietrza do komory w ciągu 2 sekund przy jak najbardziej stałym natężeniu przepływu.</li>
			<li>Sprawdź, czy wygenerowany sygnał pojawia się w całości w oknie wyświetlacza. Użyj ikony strzałki, aby sprawdzić, czy sygnał jest wyśrodkowany i symetryczny wokół linii zerowej. Następnie kliknij Zamknij. Usuń wszelkie przesunięcia od zera, klikając Usuń przesunięcie AC w oknie Samples 
			nuta: W razie potrzeby kalibrację wysokiej wartości można powtórzyć.</li>
			<li>Sprawdź, czy wynikowy skalowany zakres wejściowy mieści się w zalecanym zakresie (mysz: od ±280 do ±420 ml/s). (Krytyczny) Powtórz kroki kalibracji, jeśli wartości wykraczają poza dopuszczalny zakres.</li>
			<li>Skalibrować komorę głowy w podobny sposób jak komorę piersiową (krok 1.3.3.6). Tym razem wybierz Wejście 2 (nosowe). 
			Uwaga: (Ważne) Wartość wysokiej wartości zastosowanego obciążenia fizycznego musi być ustawiona na +20 ml/s. Spowoduje to zmianę biegunowości przepływu w komorze przedniej w stosunku do komory tylnej. W związku z tym, gdy zwierzę oddycha, dwa sygnały przepływu będą prawie w fazie, z wyjątkiem opóźnienia użytego do obliczenia sRaw.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Pomiary funkcji płuc
<ol>
	<li>Zważ zwierzęta i zanotuj ich masę ciała.</li>
	<li>Umieścić zwierzę w unieruchomieniu i umieścić je w komorze pletyzmografu piersiowego (kroki od 1.2.3.1 do 1.2.3.5).</li>
	<li>Pozwól zwierzęciu zrelaksować się przez co najmniej 5 minut.</li>
	<li>Uruchom protokół poleceń, wybierając pierwszy krok, a następnie kliknij Wykonaj.</li>
	<li>Sprawdź na ekranie komputera, czy sygnały oddechowe zwierzęcia są regularne i płynne (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). Oprogramowanie automatycznie wyświetla obliczone parametry na zasadzie oddech po oddechu. Sprawdź, czy parametry zwierzęcia są stabilne.</li>
	<li>Rejestruj wzorzec oddychania w warunkach wyjściowych przez maksymalnie 10 minut.</li>
	<li>Dla protokołów obejmujących podawanie substancji badanej za pomocą aerozolu, należy postępować, co następuje:
	<ol>
		<li>Dostosuj czas włączenia nebulizatora i cykl pracy zgodnie z wymaganiami. 
		nuta: W przykładach przedstawionych w tym artykule nebulizator pracował w 5% cyklu pracy przez 10 s.</li>
		<li>Wykonaj wyzwanie dla pojazdu (np. sól fizjologiczna) i nagraj odpowiedź.</li>
		<li>W razie potrzeby należy wystawić zwierzę na działanie rosnących stężeń substancji badanej poprzez zmianę stężenia w nebulizatorze w stopniach eskalacji (np. podwajanie stężeń). Zapisuj odpowiedź po każdym podaniu.</li>
		<li>Pod koniec sesji doświadczalnej, jeśli nie zostanie to wykonane automatycznie, zatrzymaj nagrywanie i wróć do klatki i pomieszczenia dla zwierząt.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W razie potrzeby wybierz pozycję Uruchom z menu paska narzędzi, aby uruchomić inną sesję eksperymentalną.
	<ol>
		<li>Pomiędzy sesjami wyczyść komory pletyzmografu i przepłucz nebulizator wodą. 
		nuta: Użycie alkoholu może spowodować nieodwracalne uszkodzenie pletyzmografu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Jeśli badanie obejmuje wielokrotne oceny w czasie, powtórz całą sekwencję pomiarową w każdym wybranym punkcie czasowym. 
	nuta: Rozsądnie zaleca się uzupełnienie badania o kilka precyzyjnych pomiarów mechaniki oddechu i/lub objętości płuc1,15.</li>
</ol>
3. Analiza danych
Uwaga: Oprogramowanie automatycznie zapisuje plik eksperymentalny i eksportuje zarejestrowane parametry po zamknięciu sesji eksperymentalnej.
<ol>
	<li>Obliczyć średnią wyjściową dla parametrów będących przedmiotem zainteresowania dla każdego zwierzęcia i grupy doświadczalnej. 
	Uwaga: W tabeli 1 wymieniono szereg typowych parametrów, podzielonych na kategorie w zależności od rodzaju dostarczanych przez nie informacji.</li>
	<li>W stosownych przypadkach należy ocenić wpływ badanej substancji w aerozolu na parametry będące przedmiotem zainteresowania przy każdym stężeniu, przyjmując określony punkt (np. wartość maksymalną lub minimalną), średnią lub pełny przebieg czasowy; można również rozważyć normalizację do wartości wyjściowej.</li>
	<li>Raportowanie wyników za pomocą grupowania średnich i błędów w formie tabelarycznej lub graficznej. Przeanalizuj wyniki statystycznie. 
	Uwaga: W niniejszym badaniu zastosowano dwukierunkowe ANOVA z powtarzanymi pomiarami do oceny wpływu metakoliny, alergenu – roztoczy kurzu domowego (HDM) – i ich interakcji na różne odczyty DCP (sRaw i EF50), a także na różne odczyty FOT (R,N, G i H), w obu szczepach myszy. Wielokrotne testy porównawcze Sidaka zostały następnie wykorzystane do określenia stężeń metacholiny, przy których myszy alergiczne różnią się od myszy kontrolnych. Te same testy zastosowano do oceny wpływu dni, HDM i ich interakcji na początku badania (tj. przed metacholiną) na odczyty niedrożności dróg oddechowych (sRaw i EF50) oraz wzorca wentylacji (BF, TV, MV i EIP). Korelacje Pearsona wykorzystano do oceny korelacji między sRaw uzyskanym za pomocą DCP a RN uzyskanym za pomocą FOT. Wszystkie analizy statystyczne i wykresy zostały wykonane przy użyciu alternatywnego standardowego oprogramowania statystycznego (np. GraphPad Prism). P ≤ 0,05 uznano za wystarczające do odrzucenia hipotezy zerowej.</li>
</ol>

<ol><li>McGovern, T. K., Robichaud, A., Fereydoonzad, L., Schuessler, T. F., Martin, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+respiratory+system+mechanics+in+mice+using+the+forced+oscillation+technique%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Evaluation of respiratory system mechanics in mice using the forced oscillation technique.</a> J Vis Exp. (75), e50172(2013).</li>
<li>Bates, J. H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CORP%3A+Measurement+of+lung+function+in+small+animals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol+%281985%29%22%5BJournal%5D)">CORP: Measurement of lung function in small animals.</a> J Appl Physiol (1985). 123 (5), 1039-1046 (2017).</li>
<li>Bates, J. H., Irvin, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+lung+function+in+mice%3A+the+phenotyping+uncertainty+principle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Measuring lung function in mice: the phenotyping uncertainty principle.</a> J Appl Physiol. 94 (4), 1297-1306 (2003).</li>
<li>Lim, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+respiratory+function+in+mice+using+unrestrained+whole-body+plethysmography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Measuring respiratory function in mice using unrestrained whole-body plethysmography.</a> J Vis Exp. (90), e51755(2014).</li>
<li>Enhorning, G., van Schaik, S., Lundgren, C., Vargas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+plethysmography%2C+does+it+measure+tidal+volume+of+small+animals%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Physiol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Whole-body plethysmography, does it measure tidal volume of small animals?</a> Can J Physiol Pharmacol. 76 (10-11), 945-951 (1998).</li>
<li>Vijayaraghavan, R., Schaper, M., Thompson, R., Stock, M. F., Alarie, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristic+modifications+of+the+breathing+pattern+of+mice+to+evaluate+the+effects+of+airborne+chemicals+on+the+respiratory+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Characteristic modifications of the breathing pattern of mice to evaluate the effects of airborne chemicals on the respiratory tract.</a> Arch Toxicol. 67 (7), 478-490 (1993).</li>
<li>Willis, D. N., Liu, B., Ha, M. A., Jordt, S. E., Morris, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Menthol+attenuates+respiratory+irritation+responses+to+multiple+cigarette+smoke+irritants%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Menthol attenuates respiratory irritation responses to multiple cigarette smoke irritants.</a> FASEB J. 25 (12), 4434-4444 (2011).</li>
<li>Neuhaus-Steinmetz, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+development+of+airway+hyperresponsiveness+and+acute+airway+obstruction+in+a+mouse+model+of+allergic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Arch+Allergy+Immunol%22%5BJournal%5D)">Sequential development of airway hyperresponsiveness and acute airway obstruction in a mouse model of allergic inflammation.</a> Int Arch Allergy Immunol. 121 (1), 57-67 (2000).</li>
<li>Glaab, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tidal+midexpiratory+flow+as+a+measure+of+airway+hyperresponsiveness+in+allergic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Tidal midexpiratory flow as a measure of airway hyperresponsiveness in allergic mice.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 280 (3), L565-L573 (2001).</li>
<li>Glaab, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+measurement+of+midexpiratory+flow+indicates+bronchoconstriction+in+allergic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol+%281985%29%22%5BJournal%5D)">Noninvasive measurement of midexpiratory flow indicates bronchoconstriction in allergic rats.</a> J Appl Physiol (1985). 93 (4), 1208-1214 (2002).</li>
<li>Pennock, B. E., Cox, C. P., Rogers, R. M., Cain, W. A., Wells, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+noninvasive+technique+for+measurement+of+changes+in+specific+airway+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol+Respir+Environ+Exerc+Physiol%22%5BJournal%5D)">A noninvasive technique for measurement of changes in specific airway resistance.</a> J Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol. 46 (2), 399-406 (1979).</li>
<li>DeLorme, M. P., Moss, O. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+function+assessment+by+whole-body+plethysmography+in+restrained+versus+unrestrained+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Toxicol+Methods%22%5BJournal%5D)">Pulmonary function assessment by whole-body plethysmography in restrained versus unrestrained mice.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 47 (1), 1-10 (2002).</li>
<li>Flandre, T. D., Leroy, P. L., Desmecht, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+somatic+growth%2C+strain%2C+and+sex+on+double-chamber+plethysmographic+respiratory+function+values+in+healthy+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol+%281985%29%22%5BJournal%5D)">Effect of somatic growth, strain, and sex on double-chamber plethysmographic respiratory function values in healthy mice.</a> J Appl Physiol (1985). 94 (3), 1129-1136 (2003).</li>
<li>Criee, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Body+plethysmography--its+principles+and+clinical+use%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Med%22%5BJournal%5D)">Body plethysmography--its principles and clinical use.</a> Respir Med. 105 (7), 959-971 (2011).</li>
<li>Robichaud, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+full-range+pressure-volume+curves+in+mice+and+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol+%281985%29%22%5BJournal%5D)">Automated full-range pressure-volume curves in mice and rats.</a> J Appl Physiol (1985). 123 (4), 746-756 (2017).</li>
<li>Mizutani, N., Goshima, H., Nabe, T., Yoshino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+C3a-induced+IL-17+plays+a+critical+role+in+an+IgE-mediated+late-phase+asthmatic+response+and+airway+hyperresponsiveness+via+neutrophilic+inflammation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Complement C3a-induced IL-17 plays a critical role in an IgE-mediated late-phase asthmatic response and airway hyperresponsiveness via neutrophilic inflammation in mice.</a> J Immunol. 188 (11), 5694-5705 (2012).</li>
<li>Nabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+basophils+and+mast+cells+infiltrating+the+lung+by+multiple+antigen+challenges+in+asthmatic+responses+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Roles of basophils and mast cells infiltrating the lung by multiple antigen challenges in asthmatic responses of mice.</a> Br J Pharmacol. 169 (2), 462-476 (2013).</li>
<li>Morris, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immediate+sensory+nerve-mediated+respiratory+responses+to+irritants+in+healthy+and+allergic+airway-diseased+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol+%281985%29%22%5BJournal%5D)">Immediate sensory nerve-mediated respiratory responses to irritants in healthy and allergic airway-diseased mice.</a> J Appl Physiol (1985). 94 (4), 1563-1571 (2003).</li>
<li>Merazzi, D., Mortola, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+changes+in+ambient+temperature+on+the+Hering-Breuer+reflex+of+the+conscious+newborn+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of changes in ambient temperature on the Hering-Breuer reflex of the conscious newborn rat.</a> Pediatr Res. 45 (3), 370-376 (1999).</li>
<li>Rao, R., Nagarkatti, P. S., Nagarkatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delta%289%29+Tetrahydrocannabinol+attenuates+Staphylococcal+enterotoxin+B-induced+inflammatory+lung+injury+and+prevents+mortality+in+mice+by+modulation+of+miR-17-92+cluster+and+induction+of+T-regulatory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Delta(9) Tetrahydrocannabinol attenuates Staphylococcal enterotoxin B-induced inflammatory lung injury and prevents mortality in mice by modulation of miR-17-92 cluster and induction of T-regulatory cells.</a> Br J Pharmacol. 172 (7), 1792-1806 (2015).</li>
<li>Agrawal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+mucin+secretion+with+MARCKS-related+peptide+improves+airway+obstruction+in+a+mouse+model+of+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol+%281985%29%22%5BJournal%5D)">Inhibition of mucin secretion with MARCKS-related peptide improves airway obstruction in a mouse model of asthma.</a> J Appl Physiol (1985). 102 (1), 399-405 (2007).</li>
<li>Mabalirajan, U., Aich, J., Agrawal, A., Ghosh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mepacrine+inhibits+subepithelial+fibrosis+by+reducing+the+expression+of+arginase+and+TGF-beta1+in+an+extended+subacute+mouse+model+of+allergic+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mepacrine inhibits subepithelial fibrosis by reducing the expression of arginase and TGF-beta1 in an extended subacute mouse model of allergic asthma.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 297 (3), L411-L419 (2009).</li>
<li>Desmet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+experimental+asthma+by+decoy-mediated+local+inhibition+of+activator+protein-1%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Treatment of experimental asthma by decoy-mediated local inhibition of activator protein-1.</a> Am J Respir Crit Care Med. 172 (6), 671-678 (2005).</li>
<li>Zang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+C+Fibers+Modulate+MMP-12+Production+via+PAR2+and+Are+Involved+in+the+Long-Term+Airway+Inflammation+and+Airway+Hyperresponsiveness+Induced+by+Respiratory+Syncytial+Virus+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Pulmonary C Fibers Modulate MMP-12 Production via PAR2 and Are Involved in the Long-Term Airway Inflammation and Airway Hyperresponsiveness Induced by Respiratory Syncytial Virus Infection.</a> J Virol. 90 (5), 2536-2543 (2015).</li>
<li>Shukla, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carryover+of+cigarette+smoke+effects+on+hematopoietic+cytokines+to+F1+mouse+litters%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Carryover of cigarette smoke effects on hematopoietic cytokines to F1 mouse litters.</a> Mol Immunol. 48 (15-16), 1809-1817 (2011).</li>
<li>Murphy, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+function+assessment+in+safety+pharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Respiratory function assessment in safety pharmacology.</a> Curr Protoc Pharmacol. , Chapter 10 Unit10 19 (2003).</li>
<li>Lofgren, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restrained+whole+body+plethysmography+for+measure+of+strain-specific+and+allergen-induced+airway+responsiveness+in+conscious+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol+%281985%29%22%5BJournal%5D)">Restrained whole body plethysmography for measure of strain-specific and allergen-induced airway responsiveness in conscious mice.</a> J Appl Physiol (1985). 101 (5), 1495-1505 (2006).</li>
<li>DiMaria, G. U., Wang, C. G., Bates, J. H., Guttmann, R., Martin, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partitioning+of+airway+responses+to+inhaled+methacholine+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol+%281985%29%22%5BJournal%5D)">Partitioning of airway responses to inhaled methacholine in the rat.</a> J Appl Physiol (1985). 62 (3), 1317-1323 (1987).</li>
<li>Hoymann, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+function+measurements+in+rodents+in+safety+pharmacology+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Lung function measurements in rodents in safety pharmacology studies.</a> Front Pharmacol. 3, 156(2012).</li>
<li>Agrawal, A., Singh, S. K., Singh, V. P., Murphy, E., Parikh, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partitioning+of+nasal+and+pulmonary+resistance+changes+during+noninvasive+plethysmography+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol+%281985%29%22%5BJournal%5D)">Partitioning of nasal and pulmonary resistance changes during noninvasive plethysmography in mice.</a> J Appl Physiol (1985). 105 (6), 1975-1979 (2008).</li>
<li>McLeod, R. L., Young, S. S., Erickson, C. H., Parra, L. E., Hey, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+nasal+obstruction+in+the+allergic+guinea+pig+using+the+forced+oscillation+method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Toxicol+Methods%22%5BJournal%5D)">Characterization of nasal obstruction in the allergic guinea pig using the forced oscillation method.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 48 (3), 153-159 (2002).</li>
<li>Miyahara, S., Miyahara, N., Takeda, K., Joetham, A., Gelfand, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiologic+assessment+of+allergic+rhinitis+in+mice%3A+role+of+the+high-affinity+IgE+receptor+%28FcepsilonRI%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Physiologic assessment of allergic rhinitis in mice: role of the high-affinity IgE receptor (FcepsilonRI).</a> J Allergy Clin Immunol. 116 (5), 1020-1027 (2005).</li>
</ol>

DB i AR są wykorzystywane przez SCIREQ Scientific Respiratory Equipment Inc., podmiot komercyjny zajmujący się tematami związanymi z treścią tego artykułu. DB posiada również akcje własne. SCIREQ Inc. jest firmą należącą do grupy emka TECHNOLOGIES.

Możliwość pomiaru czynności płuc u przytomnych zwierząt jest wyraźnie uzasadniona w badaniach nad układem oddechowym. Ogólnie rzecz biorąc, DCP jest interesującym podejściem do oceny funkcji wentylacji układu oddechowego u zwierząt przytomnych i oddychającychspontanicznie 26. Dokładniej rzecz ujmując, DCP lub jego wariant head-out często zapewnia właściwą równowagę między jakością dostarczanych informacji a pożądanym poziomem inwazyjności3 (Tabela 2). Technika ta może być dostosowana do różnych gatunków (np. myszy, szczura, świnki morskiej) lub wielkości zwierząt i może być wykorzystywana w wielu zastosowaniach badawczych. Jest to szczególnie przydatne do oceny wielu zwierząt jednocześnie w ramach równoległego badania, do monitorowania funkcji oddechowych w powtarzalny sposób oraz do uchwycenia kinetyki reakcji w czasie. Ponadto technika jest prosta i można się jej nauczyć w stosunkowo krótkim czasie. W niniejszym artykule jako przykład wykorzystano protokół wykorzystujący pomiary DCP u myszy w celu opisania praktycznych aspektów tej powściągliwej techniki pletyzmografii, a także w celu omówienia krytycznych kroków i związanych z nimi wyników.
Podczas pracy ze zwierzętami przytomnymi konieczne jest kontrolowanie warunków otoczenia (np. ciche pomieszczenie z ograniczoną liczbą osób lub aktywnością) w celu uzyskania powtarzalnych wyników. Ponieważ krępujące są dostępne w różnych wymiarach, ważne jest, aby zacząć od odpowiedniego rozmiaru, aby ruchy oddechowe były niezakłócone. Jest to również pomocne i często wymagane w celu przyzwyczajenia zwierząt do warunków i procedur doświadczalnych, ponieważ u myszy dobrze wiadomo, że krępowanie wpływa na częstotliwość oddychania12. W zależności od projektu eksperymentu lub warunków może być potrzebnych wiele sesji o przyrostowym czasie trwania. Wreszcie, danie zwierzętom czasu na rozpoczęcie eksperymentu na dostosowanie się do zmiany pomieszczenia i niezbędnego obchodzenia się z nim jest prostym czynnikiem, który okazał się skuteczny w zapewnieniu, że wzorzec oddychania jest konsekwentnie regularny i zrelaksowany na początku badania. Praca w warunkach, w których zwierzęta czują się komfortowo, są dobrze przystosowane i spokojne, będzie również korzystna pod względem zmienności wyników i jakości. Ogranicza również wywołane stresem uwalnianie katecholaminy, która może zwiększać kaliber dróg oddechowych i łagodzić wywołane zwężenie oskrzeli.
Ważne jest, aby zrozumieć, że istnieje potrzeba jak najbardziej hermetycznego oddzielenia przepływów przez nos i klatkę piersiową. W zależności od badanego systemu lub gatunku, mechanizm uszczelniający może różnić się kształtem, a także skutecznością. W DCP, który opisaliśmy w niniejszym dokumencie, pieczęć powstaje między pyskiem zwierzęcia a urządzeniem krępującym. Podczas oceny funkcji oddechowej za pomocą DCP konieczne jest również zapewnienie wystarczającego i ciągłego przepływu odchylenia, ponieważ spadek poziomu tlenu dostępnego dla zwierzęcia spowoduje znaczące efekty. Uwzględnienie dobrostanu zwierzęcia w unieruchomieniu ogranicza skłonność do wycieków powietrza powstałych w wyniku pobudzenia, a tym samym maksymalizuje jakość danych. Z drugiej strony, złamanie pieczęci spowoduje albo odrzucenie zestawów danych, albo niedoszacowanie niektórych parametrów.
Oprócz umożliwienia oddzielnego rejestrowania sygnału przepływu przez nos, komora głowy jest zwykle używana do wystawiania zwierzęcia na działanie substancji w aerozolu. Jak pokazano w tym artykule, można to wykorzystać do przeprowadzenia testu bronchoprowokacji, aby wykazać różne stopnie reakcji. W takich eksperymentach może być konieczne dostosowanie zakresu badanych stężeń w zależności od gatunku, szczepu lub płci badanych zwierząt. Jak wykazano wcześniej 8,9,10,27, obecne wyniki pokazują, że zmiany w sRaw wywołane metacholiną dobrze korelowały z inwazyjnymi pomiarami FOT oporu dróg oddechowych. Wyniki pokazują również, że technika DCP nie jest tak czuła jak FOT ze względu na jej zdolność do wykrywania dysfunkcji oddechowej i identyfikowania zmienionej odpowiedzi zlokalizowanej w dolnych przedziałach płuc (tkance płucnej i/lub małych obwodowych drogach oddechowych). Ponieważ drogi oddechowe zwierzęcia są nienaruszone, obecność górnych dróg oddechowych, które odpowiadają za największą część całkowitego oporu oddechowego wobec przepływu powietrza28, może wpływać na rozprowadzanie i osadzanie aerozolu, a także tłumić wkład dolnych dróg oddechowych w pomiar. Tabela 3 podsumowuje inne różnice między techniką DCP a FOT. Wreszcie, chociaż teoretycznie możliwe byłoby oszacowanie całkowitego oporu dróg oddechowych zwierzęcia (w tym górnych dróg oddechowych) na podstawie pomiaru sRaw, ogólnie zaleca się uzupełnienie oceny DCP inwazyjną techniką pomiaru, taką jak FOT29, w celu uzyskania bezpośrednich pomiarów szczegółowej mechaniki układu oddechowego. W zależności od celów badania można również rozważyć pomiary oporu górnych dróg oddechowych 30,31,32.
Konkluzja Ze względu na ograniczony stopień inwazyjności, DCP jest techniką, która może zaspokoić ważną potrzebę w badaniach nad układem oddechowym. Jest w stanie zapewnić dokładne odczyty wzorca wentylacji u przytomnych zwierząt przy jednoczesnym niekwestionowanym wskaźniku niedrożności przepływu powietrza. Uzyskane informacje uzupełniają również informacje uzyskane w przypadku bardziej inwazyjnych podejść.

Coraz częstsze wykorzystywanie małych zwierząt do modelowania chorób układu oddechowego u ludzi skłoniło do opracowania technik ilościowej oceny funkcji układu oddechowego u tych zwierząt. Obecnie technika wymuszonej oscylacji (FOT) jest uznawana za najbardziej precyzyjne podejście do oceny mechaniki oddechowej u małych zwierząt1,2. Jednak, jak stwierdzono zgodnie z zasadą niepewności fenotypowania, to, co zyskuje się na precyzji pomiaru za pomocą FONT, jest równoważone utratą nieinwazyjności3. Rzeczywiście, pomiary FOT są uzyskiwane w ściśle kontrolowanych warunkach eksperymentalnych, które wymagają znieczulenia, tracheotomii lub intubacji doustnej, a także wentylacji mechanicznej; Scenariusz daleki od rzeczywistości.
W sytuacjach, w których wymagania eksperymentalne zabraniają stosowania środków znieczulających lub wymagają niewielkiego lub żadnego odchylenia od naturalnego stanu fizjologicznego zwierzęcia, można rozważyć dwukomorową pletyzmografię (DCP). Jak sama nazwa wskazuje, układ DCP składa się z dwóch połączonych sztywnych komór zbudowanych tak, aby jak najbardziej hermetycznie odizolować głowę (lub nos) zwierzęcia w przedniej komorze, od klatki piersiowej, w tylnej komorze. W obrębie zestawu zwierzę jest przytomne i oddycha spontanicznie, będąc skrępowanym. Ponieważ ścianki komór nie mogą się rozszerzać ani chować, ruch powietrza do wewnątrz i na zewnątrz zwierzęcia generuje odpowiedni, ale przeciwny kształt fali wewnątrz tylnej komory, w wyniku sprężania/dekompresji otaczającego powietrza. W ten sposób można jednocześnie rozdzielić i uchwycić przebieg spowodowany przepływem przez nos w komorze przedniej i ten związany z ruchem klatki piersiowej w komorze tylnej. W zależności od konstrukcji konfiguracji DCP, przebiegi te mogą być uzyskiwane za pomocą zestawu przetworników ciśnienia lub pneumatachografów, aby odpowiednio rejestrować zmiany ciśnienia w komorze lub przepływu powietrza do i z komór w funkcji czasu. To drugie podejście jest obecnie bardziej powszechne.
Podczas gdy częstotliwość oddychania zwierzęcia może być dokładnie określona za pomocą dowolnego rodzaju technik pletyzmografii, sytuacja nie jest taka sama w przypadku określania objętości oddechowej i związanych z nią parametrów wentylacji (np. wentylacja minutowa, objętość wydechowa, itp.). W przeciwieństwie do techniki pletyzmografu całego ciała (WBP), w której objętość oddechowa zwierzęcia jest szacowana na podstawie sygnału pudełkowego4,5, technika DCP zapewnia dokładną ocenę objętości oddechowej. Jest to związane z bezpośrednim nabywaniem ruchów klatki piersiowej zwierzęcia w tylnej komorze, które są proporcjonalne do zmian objętości płuc podczas oddychania.
Oprócz tych dokładnych parametrów wentylacji (np. objętość oddechowa, częstotliwość oddychania i minutowa wentylacja), niektóre zaburzenia w kształcie cyklu oddechowego mogą być również wykorzystane do zbadania aspektów neuronalnych, które regulują napęd oddechowy lub odruchy oddechowe. Konkretnym przykładem takiego zastosowania może być ocena potencjału drażniącego substancji wdychanych na neurony czuciowe górnych dróg oddechowych6. W tym przypadku czas trwania pauzy na początku wydechu jest określany za pomocą parametru zwanego pauzą końcowo-wdechową (EIP), określanego również jako czas trwania hamowania6. Przedłużenie tej przerwy przez substancję drażniącą wiąże się z zamknięciem głośni zwierzęcia, powodując mierzalny okres hamowania w pierwszej części wydechu 6,7.
Kolejną ważną zaletą DCP jest to, że dostarcza dwóch sprawdzonych i niekwestionowanych parametrów, które są wrażliwe na przeszkody w przepływie powietrza. Jeden z nich nazywa się przepływem w objętości wydechowej w połowie pływu i jest w skrócie EF508,9,10. Jest to przepływ powietrza w połowie objętości każdego oddechu oddechowego podczas wydechu. EF50 jest ekstrahowany ze śladu przepływu w klatce piersiowej i dzięki temu może być mierzony bez komory przedniej (tj. w konfiguracji typu head-out). Drugi nazywa się specyficznym oporem dróg oddechowych i jest w skrócie sRaw11,12,13. Oznaczenie sRaw wymaga jednoczesnego rejestrowania przepływów przez nos i klatkę piersiową zwierzęcia, ponieważ są one obliczane na podstawie opóźnienia czasowego między tymi oddzielnymi śladami oddechowymi w punkcie zerowego przepływu na końcu wdechu. Uzasadnienie opisujące podstawę, na której to opóźnienie odnosi się do sRaw, zostało wcześniej wyjaśnione11. Mówiąc prościej, zmiany objętości płuc poprzedzają ruch powietrza, ponieważ musi rozwinąć się gradient ciśnienia, aby napędzać przepływ powietrza. U zdrowego zwierzęcia oddychającego spokojnie opóźnienie to jest zazwyczaj bardzo małe. Jednak na gradient ciśnienia, który jest wymagany do dostosowania się do danego przepływu (np. przepływu wystarczającego do zapewnienia odpowiedniej wentylacji), ma wpływ stopień oporu dróg oddechowych. Na przykład podczas zwężenia oskrzeli gradient ciśnienia potrzebny do dostosowania się do danego przepływu jest większy, co oznacza, że zwierzę musi ciężej pracować, aby oddychać. Większy gradient ciśnienia w klatce piersiowej zwierzęcia oznacza również, że większa część przepływu do i z tylnej komory jest spowodowana dekompresją/kompresją powietrza w klatce piersiowej, co jest częścią całkowitego rozszerzania/cofania klatki piersiowej, która jest niezgodna z przepływem przez nos. Zwiększony opór spowodowany zwężeniem oskrzeli zwiększy zatem opóźnienie między tylną a przednią komorą, a tym samym zwiększy sRaw. Na gradient ciśnienia, który napędza przepływ powietrza do i na zewnątrz płuc, wpływa również początkowa objętość gazu w klatce piersiowej (TGV). Na przykład przy większej TGV rozszerzanie/cofanie klatki piersiowej potrzebne do wytworzenia danego gradientu ciśnienia jest większe (po prostu dlatego, że przemieszczenie objętościowe, które jest wymagane do wytworzenia danego gradientu ciśnienia, jest większe), co oznacza również, że zwierzę musi ciężej pracować, aby oddychać. Ponownie, te dodatkowe przemieszczenia klatki piersiowej są wymagane do dekompresji/sprężania powietrza w klatce piersiowej, a zatem są niezgodne z przepływem przez nos. Tak więc zwiększony TGV zwiększy również opóźnienie między komorami, a tym samym zwiększy sRaw. Jak widać, zarówno zwężenie oskrzeli, jak i zwiększony TGV powodują ważniejszy wysiłek związany z wciąganiem i wyprowadzaniem powietrza z płuc. Takie jest w istocie fizjologiczne znaczenie sRaw. Reprezentuje pracę wymaganą do oddychania5,14.
Dlatego ważne jest, aby zrozumieć, że na sRaw wpływają dwa różne czynniki: opór dróg oddechowych i TGV. W rzeczywistości sRaw może być wyrażony jako iloczyn oporu dróg oddechowych i TGV11. Świadome zwierzęta mogą dowolnie modyfikować swoje TGV, tak aby dostosować swoją wentylację do danego środowiska. W takich warunkach, gdy naturalny stan fizjologiczny zwierzęcia pozostaje niezmieniony, niemożliwe jest rozróżnienie, czy zmiana sRaw wynika ze zmiany oporu dróg oddechowych, ze zmiany TGV, czy też z mieszanki tych dwóch. W związku z tym zaleca się uzupełnienie oceny DCP o bardziej inwazyjne pomiary mechaniki oddechowej i/lub objętości płuc, takie jak te dostarczane przez FOT1,15.
Do tej pory DCP był używany w różnych aplikacjach badawczych. Technika ta może być stosowana z komorą głowy lub bez niej w celu ilościowej i dokładnej oceny wpływu różnych substancji, takich jak środki farmaceutyczne, alergeny, substancje drażniące lub inne mediatory, na funkcje oddechowe u przytomnych małych zwierząt16,17,18. Przednia komora może być również używana jako komora naświetlająca substancje aerozolowe lub zmienne stężenia gazów (hipoksja, hiperkapnia itp.)19. Dogodnie pozwala na jednoczesny pomiar ostrych skutków tych ekspozycji. W rzeczywistości jednym z powszechnych zastosowań DCP jest ocena stopnia reakcji na metacholinę w aerozolu w różnych modelach chorób układu oddechowego20,21,22,23,24,25.
Chociaż technika DCP wydaje się prosta, niektóre praktyczne wyzwania mogą potencjalnie zniechęcić niedoświadczonych użytkowników lub pogorszyć dokładność i powtarzalność wyników. Niniejsza praca zawiera szczegółowy opis zalecanych procedur w celu skutecznego rejestrowania funkcji oddechowych przez DCP u przytomnych, skrępowanych, spontanicznie oddychających myszy. Opis jest specyficzny dla podanego sprzętu (patrz Tabela materiałów). Użyteczność i wartość DCP wykazano również we wspólnym modelu alergicznego zapalenia płuc w dwóch szczepach myszy testowanych na początku badania i w odpowiedzi na metacholinę w aerozolu.

<table><tbody><tr><td>Chlorek acetylo-&beta;-metylocholiny&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-2251</td> Sól fizjologiczna buforowana <td>fosforanem metacholiny</td></tr><tr><td></td><td>Multicell</td><td>311-506-CL</td><td>PBS 10X</td></tr><tr><td>Ekstrakt z roztoczy kurzu domowego</td><td>GREER</td><td>290902</td><td>HDM&nbsp;</td></tr><tr><td>Kompletny system DCP</td><td>&nbsp; SCIREQ Inc. /emka TECHNOLOGIES</td><td></td><td></td></tr><tr><td>oprogramowanie iox</td><td>&nbsp; SCIREQ Inc. /emka TECHNOLOGIES</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aerogen Aeroneb nebulizator</td><td>&nbsp; SCIREQ Inc. /emka TECHNOLOGIES</td><td></td><td></td></tr><tr><td>kompletny system flexiVent FX</td><td>&nbsp; SCIREQ Inc. /emka TECHNOLOGIES</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ocena funkcji oddechowych u przytomnych myszy za pomocą dwukomorowej pletyzmografii

Assessment of Respiratory Function in Conscious Mice by Double-chamber Plethysmography

Zmiany objętości powietrza wywołane przez świadomy podmiot oddychający spontanicznie w pudełku ciała są podstawą pletyzmografii, techniki używanej do nieinwazyjnej oceny niektórych cech funkcji oddechowych u ludzi, jak również u zwierząt laboratoryjnych. Niniejszy artykuł koncentruje się na zastosowaniu dwukomorowej pletyzmografii (DCP) u małych zwierząt. Zawiera on podstawowe informacje na temat metodologii, a także szczegółową procedurę krok po kroku, która pozwala skutecznie ocenić funkcję oddechową u przytomnych, spontanicznie oddychających zwierząt w sposób nieinwazyjny. DCP może być używany do monitorowania funkcji oddechowych wielu zwierząt równolegle, a także do identyfikacji zmian wywołanych przez substancje aerozolowe w wybranym okresie czasu i w powtarzający się sposób. Eksperymenty na myszach kontrolnych i alergicznych są wykorzystywane w niniejszym dokumencie w celu wykazania użyteczności techniki, wyjaśnienia powiązanych parametrów wynikowych, a także omówienia powiązanych zalet i wad. Ogólnie rzecz biorąc, DCP zapewnia ważne i teoretycznie rzetelne odczyty, którym można zaufać w ocenie funkcji oddechowych przytomnych małych zwierząt zarówno na początku badania, jak i po wyzwaniach z substancjami w aerozolu.

Celem tego artykułu jest dostarczenie szczegółowego opisu zalecanych procedur oceny funkcji oddechowych u świadomych myszy za pomocą dwukomorowej pletyzmografii.

Ocena funkcji oddechowych u przytomnych myszy za pomocą dwukomorowej pletyzmografii

Air volume changes created by a conscious subject breathing spontaneously within a body box are at the basis of plethysmography, a technique used to ...

Technika ta pomoże odpowiedzieć na kluczowe pytania w różnych dziedzinach, w tym w badaniach nad układem oddechowym, farmakologii bezpieczeństwa i opracowywaniu leków. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona odczyty, którym można zaufać w ocenie funkcji oddechowej u przytomnych zwierząt, zarówno na początku badania, jak i podczas wyzwań. Technika ta jest szczególnie przydatna, gdy protokół eksperymentalny wymaga niewielkiego odchylenia od normalnego stanu fizjologicznego zwierząt.Zwierzę jest skrępowane, ale poza tym oddycha normalnie, co pozwala na ocenę wzorca oddychania oraz niedrożności dróg oddechowych. W dniu eksperymentu rozpocznij sesję eksperymentalną i załaduj odpowiedni plik konfiguracyjny. Wprowadź eksperyment i informacje o zwierzęciu.Po zakończeniu kliknij przycisk uruchamiania u dołu okna. Kontynuuj kalibrację systemu. Skalibruj każde miejsce i sygnał wejściowy osobno.Włącz generator przepływu polaryzacyjnego podłączony do komory głowicy za pomocą kawałka rurki i wyreguluj natężenie przepływu. Zamknij górny otwór komory głowicy zaślepką. Odłącz tylny panel komory piersiowej.Następnie mocno włóż narzędzie kalibracyjne do gumowego otworu między głowicą a komorą korpusu, aby utworzyć hermetyczne uszczelnienie. Zamknij i ponownie zamocuj tylny panel komory piersiowej. Z menu paska narzędzi oprogramowania przejdź do opcji Strojenie, a następnie Kalibruj.Przejdź do opcji Wejście pierwsze i wybierz opcję Kalibruj, aby otworzyć okno dialogowe kalibracji sygnału przepływu w klatce piersiowej. Sprawdź, czy parametry wymienione w oknie dialogowym kalibracji wyświetlają odpowiednie ustawienia. Niska wartość naprężenia fizycznego powinna wynosić zero.Wysoka wartość przyłożonego naprężenia fizycznego powinna wynosić minus 20 mililitrów na sekundę, a próbki powinny być ustawione na integrację. Po zakończeniu kliknij niski w oknie próbek. Sprawdź, czy generowany sygnał jest stały w oknie wyświetlacza, a następnie kliknij zamknij.Podłącz strzykawkę o pojemności 20 mililitrów przez boczny port komory piersiowej za pomocą plastikowego łącznika w kawałku rurki. Wybierz wysoko w oknie próbek i natychmiast wstrzyknij 20 mililitrów powietrza do komory w ciągu dwóch sekund przy jak najbardziej stałym natężeniu przepływu. Sprawdź, czy wygenerowany sygnał pojawia się w całości w oknie wyświetlacza.Użyj ikony strzałki, aby sprawdzić, czy sygnał jest wyśrodkowany i symetryczny wokół linii zerowej. Następnie kliknij Zamknij. Usuń wszelkie przesunięcia od zera, klikając Usuń przesunięcie AC w oknie próbek.Skalibruj komorę głowy w podobny sposób jak komorę piersiową, wybierając wejście numer dwa. Tym razem ustaw wysoką wartość na plus 20 mililitrów na sekundę zamiast minus 20. Pracuj w cichym miejscu oddalonym od pomieszczenia mieszkalnego.Przed rozpoczęciem doświadczenia należy przyzwyczaić zwierzęta do krępowania i procedur. Ponieważ nie jest inwazyjny i nie wymaga znieczulenia, praca w warunkach, w których zwierzę jest wygodne, dobrze przystosowane i spokojne, ograniczy skłonność do przeciekania włosów między komorami, a tym samym zmaksymalizuje jakość danych. Zważ zwierzęta.Wybierz odpowiedni krępujący krępujący dla zwierzęcia. Umieść zwierzę w unieruchomieniu, zaczynając od tylnego otworu. Pomocne może być trzymanie urządzenia w pionie.Gdy zwierzę znajdzie się na miejscu, włóż tylny tłok i delikatnie zablokuj go na miejscu, nie stosując nadmiernej siły. Sprawdź wzrokowo, czy zwierzę oddycha normalnie. W razie potrzeby dostosuj jego położenie, przesuwając mechanizm blokujący.Upewnij się, że nozdrza zwierzęcia wystają poza stożek nosa, a pysk opiera się o wewnętrzne ścianki ogranicznika. Odłącz tylny panel komory piersiowej. Włożyć krępujący krępujący zwierzę przez gumowy otwór w komorze piersiowej i zamknąć komorę.Zamocuj komorę głowy, zapewnij odchylenie przepływu i pozwól zwierzęciu zrelaksować się przez co najmniej pięć minut. Gdy zwierzę się uspokoi, uruchom protokół poleceń, wybierając pierwszy krok, a następnie kliknij Wykonaj. Sprawdź na ekranie komputera, czy sygnały oddechowe zwierzęcia są regularne i płynne.Oprogramowanie automatycznie wyświetla obliczone parametry na zasadzie oddech po oddechu. Sprawdź, czy parametry zwierzęcia są stabilne. Rejestruj wzorzec oddychania w warunkach wyjściowych przez maksymalnie 10 minut.W przypadku protokołów obejmujących podawanie substancji badanej w aerozolu, najpierw należy dostosować nebulizator pod kątem czasu i cyklu pracy zgodnie z wymaganiami. Wykonaj wyzwanie pojazdu i nagraj odpowiedź. W razie potrzeby należy wystawić zwierzę na działanie rosnących stężeń substancji badanej poprzez zmianę stężenia w nebulizatorze i stopniowe eskalację.Zapisuj odpowiedź po każdym podaniu. W tym przykładzie testuje się 15 miligramów na mililitr metacholiny. Szczytowy wzrost swoistego oporu dróg oddechowych jest rejestrowany chwilę później, a następnie obserwuje się, że powoli wraca do wartości wyjściowej.Pod koniec sesji doświadczalnej należy zwrócić zwierzę do jego pokoju i klatki. Pomiędzy sesjami należy oczyścić komory pletyzmografu i przepłukać nebulizator wodą. Przejdź do analizy danych zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Pokazano tutaj wynik powtórnej oceny funkcji oddechowej na początku badania przez trzy kolejne dni w dwóch grupach myszy BALB/c. Kontrolny i jeden z alergicznym zapaleniem płuc. Stabilne i porównywalne wartości uzyskano dla wybranych parametrów dostarczanych przez dwukomorową pletyzmografię.Wartości te zostały wykreślone dla częstości oddechów, objętości tytułu, wentylacji minutowej, przerwy w wdechu, przepływu w połowie objętości wydechowej i właściwego oporu dróg oddechowych. Zmiany w funkcji oddechowej i odpowiedzi na zwiększające się dawki wdychanej metacholiny przeprowadzono również w kolejnych dniach w celu oceny stopnia reakcji u myszy kontrolnych i alergicznych C57BL/6. Wyniki wskazują na oczekiwany postępujący wzrost swoistego oporu dróg oddechowych wraz ze zwiększaniem dawek metacholiny z nadmiernym stopniem reakcji u alergicznych myszy w drugim i trzecim dniu.Następnego dnia zmierzono rezystancję newtonowską techniką wymuszonej oscylacji. Zmiany tego parametru odzwierciedlają głównie zmiany oporu dużych przewodzących dróg oddechowych. Zmierzona oporność newtonowska na początku badania i w odpowiedzi na metacholinę dobrze korelowała ze zmierzonym specyficznym oporem dróg oddechowych uzyskanym poprzedniego dnia u tych samych zwierząt.Technika ta jest wygodna do oceny wielu zwierząt jednocześnie, uchwycenia kinetyki ostrej reakcji, a także do pomiaru funkcji oddechowych w powtarzający się sposób podczas eksperymentu trwającego kilka dni. Po procedurze można zastosować inne metody, takie jak technika wymuszonej asocjacji, w celu uzupełnienia oceny o bezpośrednie pomiary mechaniki oddechowej, takiej jak opór dróg oddechowych. Pletyzmografia dwukomorowa stanowi naprawdę interesujące podejście do oceny wzorca oddychania i geografii niedrożności dróg oddechowych, zwłaszcza gdy protokół eksperymentalny wymagał, aby zwierzęta były przytomne.

assessment-respiratory-function-conscious-mice-double-chamber

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Eksperymentalne modele mysie astmy alergicznej oferują nowe możliwości badania patogenezy choroby oraz opracowywania nowych terapii. Modele te są odpowiednie do pomiaru czynników kontrolujących alergiczną odpowiedź immunologiczną, zapalenie dróg oddechowych i patofizjologię płuc.

Mysi model astmy indukowanej alergenem

Niniejszy protokół zawiera szczegółowy opis krok po kroku procedur wymaganych do wykonania pomiarów mechaniki układu oddechowego, jak również oceny reakcji dróg oddechowych na wdychaną metacholinę u myszy przy użyciu techniki wymuszonej oscylacji (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc, Kanada).

Ocena mechaniki układu oddechowego u myszy przy użyciu techniki wymuszonej oscylacji

Ocena fizjologii układu oddechowego tradycyjnie opierała się na technikach, które wymagają unieruchomienia lub uspokojenia zwierzęcia. Nieskrępowana pletyzmografia całego ciała zapewnia jednak precyzyjną, nieinwazyjną, ilościową analizę fizjologii układu oddechowego w modelach zwierzęcych. Ponadto technika ta umożliwia wielokrotną ocenę układu oddechowego myszy, co pozwala na badania podłużne.

Pomiar funkcji oddechowych u myszy za pomocą nieskrępowanej pletyzmografii całego ciała

Nieskrępowana pletyzmografia barometryczna służy do ilościowego określenia wzorca oddychania u obudzonych myszy. Pokazujemy, że 15-sekundowe segmenty w ustandaryzowanym protokole wyświetlają podobne wartości do wydłużonego czasu cichego oddychania. Metodologia ta pozwala również na ilościowe określenie bezdechu i przyspieszonych oddechów w ciągu pierwszej godziny w komorze.

Metoda uzyskiwania wzorca oddychania u starzejących się myszy za pomocą nieskrępowanej pletyzmografii barometrycznej

Ten protokół przedstawia budowę i wykorzystanie uproszczonego aparatu do pletyzmografii całego ciała do nieinwazyjnego monitorowania postępu bakteryjnej choroby układu oddechowego.

Uproszczona pletyzmografia całego ciała w celu scharakteryzowania funkcji płuc podczas melioidozy oddechowej

Clamp hiperinsulinemiczno-euglikemiczny, lub clamp insulinowy, jest złotym standardem w ocenie działania insuliny in vivo. Opisano metodę przeprowadzania clampów insulinowych u myszy. Obejmuje ona metodę cewnikowania tętniczego, która pozwala na wykonywanie eksperymentów na świadomych, nieskrępowanych myszach przy minimalnym stresie.

Zaciski hiperinsulinemiczno-euglikemiczne u świadomych, nieunieruchomionych myszy

Celem tej publikacji jest przedstawienie naszej oryginalnej pracy nad wielomięśniowym powierzchniowym podejściem elektromiograficznym do ilościowego charakteryzowania wzorców aktywacji mięśni oddechowych u osób z przewlekłym uszkodzeniem rdzenia kręgowego za pomocą analizy wektorowej.

Ocena aktywacji mięśni oddechowych za pomocą oceny kontroli motorycznej oddechu (RMCA) u osób z przewlekłym uszkodzeniem rdzenia kręgowego

Dysfunkcja prawej komory (RV) jest kluczowa dla patogenezy chorób sercowo-naczyniowych, jednak dostępne są ograniczone metodologie jej oceny. Ostatnie postępy w obrazowaniu ultrasonograficznym zapewniają nieinwazyjną i dokładną opcję podłużnego badania RV. W tym artykule szczegółowo opisujemy krok po kroku metodę echokardiograficzną wykorzystującą mysi model przeciążenia ciśnienia RV.

Ocena struktury i funkcji prawej komory serca w mysim modelu zwężenia tętnicy płucnej za pomocą echokardiografii przezklatkowej

Określenie współczynnika filtracji kłębuszkowej (GFR) jest złotym standardem do oceny ogólnej funkcji nerek. Jednak tradycyjne procedury pomiaru tego parametru są kłopotliwe i wymagają dużej inwestycji czasu. W tym miejscu opisujemy szybszą i minimalnie inwazyjną metodę przezskórnego oznaczania GFR.

Przezskórna ocena czynności nerek u świadomych gryzoni

To badanie opisuje udane wygenerowanie nowego modelu zwierzęcego przewlekłej obturacyjnej choroby płuc (POChP) poprzez wielokrotne wystawianie myszy na działanie wysokich stężeń ozonu.

Generowanie modelu przewlekłej obturacyjnej choroby płuc u myszy poprzez powtarzającą się ekspozycję na ozon

Poznaj metodę dwukomorowej pletyzmografii do oceny funkcji oddechowych u przytomnych myszy. Technika ta umożliwia pomiar wzorców oddychania i oporu dróg oddechowych bez znieczulenia, co jest kluczowe w badaniach nad rozwojem leków.

Ocena funkcji oddechowych u przytomnych myszy za pomocą dwukomorowej pletyzmografii

Przeglądaj więcej filmów