Ocena funkcji oddechowych u przytomnych myszy za pomocą dwukomorowej pletyzmografii
10 lipca 2018
Celem tego artykułu jest dostarczenie szczegółowego opisu zalecanych procedur oceny funkcji oddechowych u świadomych myszy za pomocą dwukomorowej pletyzmografii.
Technika ta pomoże odpowiedzieć na kluczowe pytania w różnych dziedzinach, w tym w badaniach nad układem oddechowym, farmakologii bezpieczeństwa i opracowywaniu leków. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona odczyty, którym można zaufać w ocenie funkcji oddechowej u przytomnych zwierząt, zarówno na początku badania, jak i podczas wyzwań. Technika ta jest szczególnie przydatna, gdy protokół eksperymentalny wymaga niewielkiego odchylenia od normalnego stanu fizjologicznego zwierząt.
Zwierzę jest skrępowane, ale poza tym oddycha normalnie, co pozwala na ocenę wzorca oddychania oraz niedrożności dróg oddechowych. W dniu eksperymentu rozpocznij sesję eksperymentalną i załaduj odpowiedni plik konfiguracyjny. Wprowadź eksperyment i informacje o zwierzęciu.
Po zakończeniu kliknij przycisk uruchamiania u dołu okna. Kontynuuj kalibrację systemu. Skalibruj każde miejsce i sygnał wejściowy osobno.
Włącz generator przepływu polaryzacyjnego podłączony do komory głowicy za pomocą kawałka rurki i wyreguluj natężenie przepływu. Zamknij górny otwór komory głowicy zaślepką. Odłącz tylny panel komory piersiowej.
Następnie mocno włóż narzędzie kalibracyjne do gumowego otworu między głowicą a komorą korpusu, aby utworzyć hermetyczne uszczelnienie. Zamknij i ponownie zamocuj tylny panel komory piersiowej. Z menu paska narzędzi oprogramowania przejdź do opcji Strojenie, a następnie Kalibruj.
Przejdź do opcji Wejście pierwsze i wybierz opcję Kalibruj, aby otworzyć okno dialogowe kalibracji sygnału przepływu w klatce piersiowej. Sprawdź, czy parametry wymienione w oknie dialogowym kalibracji wyświetlają odpowiednie ustawienia. Niska wartość naprężenia fizycznego powinna wynosić zero.
Wysoka wartość przyłożonego naprężenia fizycznego powinna wynosić minus 20 mililitrów na sekundę, a próbki powinny być ustawione na integrację. Po zakończeniu kliknij niski w oknie próbek. Sprawdź, czy generowany sygnał jest stały w oknie wyświetlacza, a następnie kliknij zamknij.
Podłącz strzykawkę o pojemności 20 mililitrów przez boczny port komory piersiowej za pomocą plastikowego łącznika w kawałku rurki. Wybierz wysoko w oknie próbek i natychmiast wstrzyknij 20 mililitrów powietrza do komory w ciągu dwóch sekund przy jak najbardziej stałym natężeniu przepływu. Sprawdź, czy wygenerowany sygnał pojawia się w całości w oknie wyświetlacza.
Użyj ikony strzałki, aby sprawdzić, czy sygnał jest wyśrodkowany i symetryczny wokół linii zerowej. Następnie kliknij Zamknij. Usuń wszelkie przesunięcia od zera, klikając Usuń przesunięcie AC w oknie próbek.
Skalibruj komorę głowy w podobny sposób jak komorę piersiową, wybierając wejście numer dwa. Tym razem ustaw wysoką wartość na plus 20 mililitrów na sekundę zamiast minus 20. Pracuj w cichym miejscu oddalonym od pomieszczenia mieszkalnego.
Przed rozpoczęciem doświadczenia należy przyzwyczaić zwierzęta do krępowania i procedur. Ponieważ nie jest inwazyjny i nie wymaga znieczulenia, praca w warunkach, w których zwierzę jest wygodne, dobrze przystosowane i spokojne, ograniczy skłonność do przeciekania włosów między komorami, a tym samym zmaksymalizuje jakość danych. Zważ zwierzęta.
Wybierz odpowiedni krępujący krępujący dla zwierzęcia. Umieść zwierzę w unieruchomieniu, zaczynając od tylnego otworu. Pomocne może być trzymanie urządzenia w pionie.
Gdy zwierzę znajdzie się na miejscu, włóż tylny tłok i delikatnie zablokuj go na miejscu, nie stosując nadmiernej siły. Sprawdź wzrokowo, czy zwierzę oddycha normalnie. W razie potrzeby dostosuj jego położenie, przesuwając mechanizm blokujący.
Upewnij się, że nozdrza zwierzęcia wystają poza stożek nosa, a pysk opiera się o wewnętrzne ścianki ogranicznika. Odłącz tylny panel komory piersiowej. Włożyć krępujący krępujący zwierzę przez gumowy otwór w komorze piersiowej i zamknąć komorę.
Zamocuj komorę głowy, zapewnij odchylenie przepływu i pozwól zwierzęciu zrelaksować się przez co najmniej pięć minut. Gdy zwierzę się uspokoi, uruchom protokół poleceń, wybierając pierwszy krok, a następnie kliknij Wykonaj. Sprawdź na ekranie komputera, czy sygnały oddechowe zwierzęcia są regularne i płynne.
Oprogramowanie automatycznie wyświetla obliczone parametry na zasadzie oddech po oddechu. Sprawdź, czy parametry zwierzęcia są stabilne. Rejestruj wzorzec oddychania w warunkach wyjściowych przez maksymalnie 10 minut.
W przypadku protokołów obejmujących podawanie substancji badanej w aerozolu, najpierw należy dostosować nebulizator pod kątem czasu i cyklu pracy zgodnie z wymaganiami. Wykonaj wyzwanie pojazdu i nagraj odpowiedź. W razie potrzeby należy wystawić zwierzę na działanie rosnących stężeń substancji badanej poprzez zmianę stężenia w nebulizatorze i stopniowe eskalację.
Zapisuj odpowiedź po każdym podaniu. W tym przykładzie testuje się 15 miligramów na mililitr metacholiny. Szczytowy wzrost swoistego oporu dróg oddechowych jest rejestrowany chwilę później, a następnie obserwuje się, że powoli wraca do wartości wyjściowej.
Pod koniec sesji doświadczalnej należy zwrócić zwierzę do jego pokoju i klatki. Pomiędzy sesjami należy oczyścić komory pletyzmografu i przepłukać nebulizator wodą. Przejdź do analizy danych zgodnie z opisem w protokole tekstowym.
Pokazano tutaj wynik powtórnej oceny funkcji oddechowej na początku badania przez trzy kolejne dni w dwóch grupach myszy BALB/c. Kontrolny i jeden z alergicznym zapaleniem płuc. Stabilne i porównywalne wartości uzyskano dla wybranych parametrów dostarczanych przez dwukomorową pletyzmografię.
Wartości te zostały wykreślone dla częstości oddechów, objętości tytułu, wentylacji minutowej, przerwy w wdechu, przepływu w połowie objętości wydechowej i właściwego oporu dróg oddechowych. Zmiany w funkcji oddechowej i odpowiedzi na zwiększające się dawki wdychanej metacholiny przeprowadzono również w kolejnych dniach w celu oceny stopnia reakcji u myszy kontrolnych i alergicznych C57BL/6. Wyniki wskazują na oczekiwany postępujący wzrost swoistego oporu dróg oddechowych wraz ze zwiększaniem dawek metacholiny z nadmiernym stopniem reakcji u alergicznych myszy w drugim i trzecim dniu.
Następnego dnia zmierzono rezystancję newtonowską techniką wymuszonej oscylacji. Zmiany tego parametru odzwierciedlają głównie zmiany oporu dużych przewodzących dróg oddechowych. Zmierzona oporność newtonowska na początku badania i w odpowiedzi na metacholinę dobrze korelowała ze zmierzonym specyficznym oporem dróg oddechowych uzyskanym poprzedniego dnia u tych samych zwierząt.
Technika ta jest wygodna do oceny wielu zwierząt jednocześnie, uchwycenia kinetyki ostrej reakcji, a także do pomiaru funkcji oddechowych w powtarzający się sposób podczas eksperymentu trwającego kilka dni. Po procedurze można zastosować inne metody, takie jak technika wymuszonej asocjacji, w celu uzupełnienia oceny o bezpośrednie pomiary mechaniki oddechowej, takiej jak opór dróg oddechowych. Pletyzmografia dwukomorowa stanowi naprawdę interesujące podejście do oceny wzorca oddychania i geografii niedrożności dróg oddechowych, zwłaszcza gdy protokół eksperymentalny wymagał, aby zwierzęta były przytomne.
Przegląd
Ten artykuł szczegółowo opisuje procedury oceny funkcji oddechowych u świadomych myszy za pomocą pletyzmografii dwukomorowej. Technika ta jest kluczowa dla badań nad układem oddechowym i rozwoju leków.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Badania nad układem oddechowym
- Bezpieczeństwo farmakologiczne
- Rozwój leków
Tło
- Pletyzmografia dwukomorowa pozwala na ocenę funkcji oddechowych bez stosowania znieczulenia.
- Technika utrzymuje normalny fizjologiczny stan zwierzęcia.
- Zapewnia wiarygodne dane na temat wzorców oddychania i obturacji dróg oddechowych.
- Aklimatyzacja zwierząt jest niezbędna dla jakości danych.
Cel badania
- Zapewnienie szczegółowego protokołu oceny funkcji oddechowych u myszy.
- Poprawa rozumienia reakcji oddechowych w różnych warunkach.
- Ułatwienie testowania leków i ewaluacji bezpieczeństwa.
Stosowane metody
- Kalibracja systemu pletyzmograficznego.
- Ograniczanie ruchów zwierząt w komfortowy sposób.
- Rejestrowanie podstawowych wzorców oddychania.
- Podawanie substancji testowych przez aerosol.
Główne wyniki
- Stabilne parametry oddechowe rejestrowano przez kolejne dni.
- Odpowiedzi na metacholinę oceniono u myszy kontrolnych i alergicznych.
- Zaobserwowano wzrost oporu dróg oddechowych przy rosnącym dawkowaniu metacholinem.
- Dane wykazały istotne różnice w reaktywności pomiędzy grupami.
Wnioski
- Pletyzmografia dwukomorowa jest skuteczna w ocenie funkcji oddechowych.
- Metoda zapewnia wiarygodne dane zarówno w stanie podstawowym, jak i po wyzwaniu.
- Jest odpowiednia do oceny działania leków w badaniach nad układem oddechowym.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Assessing respiratory function in conscious animals is critical for preclinical safety pharmacology and respiratory drug development, where maintaining physiological relevance improves translational confidence. Double-chamber plethysmography enables non-invasive, repeated measurements of breathing patterns and airway resistance in unrestrained, spontaneously breathing mice, supporting mechanistic de-risking of inhaled therapeutics. The technique provides quantitative, reproducible readouts that align with early discovery to lead optimization workflows by delivering reliable baseline and challenge-response data without anesthetic confounders.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to airway reactivity and bronchoconstriction pathways in disease models.
- Operational Value: Supports functional target validation by measuring physiological outputs in conscious animals under baseline and challenged conditions.
- Predictive Value: Provides respiratory function readouts that help de-risk target engagement and mechanism of action in early-stage programs.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Delivers standardized, quantitative parameters such as specific airway resistance, tidal volume, and minute ventilation for compound screening.
- Reproducibility: Enables parallel monitoring of multiple animals and repeated assessments over days, improving assay robustness.
- Scalability: Compatible with aerosolized substance administration, supporting dose-response profiling in safety pharmacology.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Demonstrated utility in allergic inflammation models, enabling evaluation of genotype-phenotype correlations in respiratory disease.
- Translational Continuity: Connects discovery-phase respiratory phenotypes to preclinical validation through consistent, anesthesia-free measurements.
- Risk-Adjusted Decisions: Facilitates go/no-go assessments by quantifying responsiveness to bronchoconstrictive agents like methacholine across experimental groups.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation, particularly for respiratory and inhaled therapeutic programs requiring functional respiratory endpoints.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of airway obstruction mechanisms and pathway modulation in genetic or disease models.
- Screening: Enables assay standardization and reproducible quantification of respiratory parameters for compound effect assessment.
- Analytics: Provides breathe-by-breathe calculated parameters including specific airway resistance and flow metrics for comparative condition analysis.
- Translational Research: Maintains physiological continuity from in vivo discovery to preclinical studies by avoiding anesthetic artifacts.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for longitudinal respiratory monitoring across multiple studies and compound series.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by delivering physiologically relevant respiratory data in conscious, unrestrained animals.
- Operational Value: Ensures standardization, reproducibility, and minimal procedural bias through acclimatization and bias flow control.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by reducing false positives from anesthetic or stress-induced respiratory artifacts.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of respiratory compounds based on validated, repeatable airway resistance measurements.
Implementation Considerations
- Requires expertise in animal handling, restrainer use, and plethysmograph system operation.
- Depends on calibrated instrumentation, bias flow generators, and nebulizer systems for aerosol delivery.
- Necessitates cross-team standardization of acclimatization protocols and environmental controls to minimize data variability.
- Involves adaptation considerations across mouse strains and disease models, as demonstrated in BALB/c and C57BL/6 backgrounds.
- Limited by potential hair leaks and chamber seal integrity, which can be mitigated through proper animal acclimatization and quiet experimental conditions.
