Name: Śledzenie ekspresji genów poprzez wykrywanie aktywności β-galaktozydazy w całych zarodkach myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Poznaj metodę wykrywania aktywności β-galaktozydazy w całych zarodkach myszy do badania ekspresji genów w biologii rozwoju. Protokół ten umożliwia szybką i czułą wizualizację wzorców ekspresji genów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Służbie Histopatologicznej za pomoc techniczną w Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC). Dziękujemy również dr Motoharu Seiki za uprzejme dostarczenie myszy Mt4-mmpLacZ oraz dr Alicii G. Arroyo za wsparcie naszego projektu i za jej krytyczne odczytanie manuskryptu. Pragniemy podziękować Peterowi Bonneyowi za korektę tego artykułu. Prace te zostały wsparte przez Universidad Europea de Madrid w formie grantu (#2017UEM01) przyznanego C.S.C.

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Etyki Doświadczeń na Zwierzętach CNIC (Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares) i Comunidad Autónoma de Madrid, aby zapewnić minimalne cierpienie zwierząt.
1. Pobieranie zarodków od ciężarnych myszy (od E8.5 do E12.5)
<ol>
	<li>Uśmiercać ciężarne myszy przez zwichnięcie szyjki macicy lub wdychanie CO2 . Dzień pierwszego zaobserwowanego czopu pochwowego uznano za dzień embrionalny 0,5 (E0,5).</li>
	<li>Połóż zwierzę w pozycji leżącej na podkładce chłonnej i oczyść skórę brzucha myszy 70% etanolem. 
	UWAGA: Sterylność nie jest wymagana w kolejnych krokach.</li>
	<li>Uszczypnij i unieś skórę brzucha za pomocą kleszczy mysich.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie przez skórę i ścianę brzucha, 2 do 4 cm pionowo w poprzek linii środkowej brzucha za pomocą nożyczek chirurgicznych.</li>
	<li>Odsłoń brzuch i usuń rogi macicy od matki za pomocą kleszczy, przecinając naczynia krwionośne wzdłuż wewnętrznej krzywizny macicy nożyczkami chirurgicznymi.</li>
	<li>Usunąć sznur zarodków i przenieść go na szalkę Petriego na lodzie zawierającą 10 ml lodowatego 0,01 M buforu fosforanowego soli fizjologicznej o pH 7,4 (PBS).</li>
	<li>Ostrożnie wypreparuj zarodki z macicy pod mikroskopem stereoskopowym na szalce Petriego z 10 ml świeżego, lodowatego PBS. Chwyć ścianę mięśniową kleszczami zegarmistrzowskimi, aby odsłonić worek owodniowy, a następnie rozerwij błonę owodniową, aby usunąć zamknięty zarodek i woreczek żółtkowy za pomocą końcówek kleszczy.</li>
	<li>Zbierz zarodki rodzeństwa z miotu od ciężarnych myszy we wczesnych stadiach (od E8.5 do E12.5) (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
	<li>Przenieś zarodki do świeżego naczynia z 10 ml zimnego 1x PBS za pomocą zakrzywionych kleszczy lub, w przypadku bardzo małych zarodków (E8,5-E9,5), użyj plastikowych pipet transferowych w celu pobrania próbek bez uszkodzenia zarodków.</li>
	<li>Przed rozpoczęciem utrwalania należy pobrać próbkę zarodka do probówki mikrowirówkowej w celu genotypowania poprzez wycięcie małego kawałka zarodka lub pobranie błony owodniowej w najmniejszych zarodkach (od E8,5 do E9,5) za pomocą kleszczyków zegarmistrzowskich. 
	UWAGA: Genotypowanie LacZ określa się za pomocą starterów reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR): do przodu, 5'-ATCGTGGGTGGTTGAACTG-3'; rewers, 5'-CGAGGCGTTAACCGTCAGCA -3'.</li>
</ol>
2. Utrwalanie zarodków myszy
<ol>
	<li>Przenieść każdy zarodek do probówki do mikrowirówki o pojemności 2 ml z zaokrągloną podstawą, zawierającej 1 ml 1x PBS. 
	UWAGA: Wykonaj wszystkie kroki opisane w protokole w tych probówkach z mieszaniem za pomocą wytrząsarki na kółkach.</li>
	<li>Myj zarodki w 1x PBS przez 1 minutę w temperaturze pokojowej, aby wyeliminować pozostałą krew. Użyj plastikowych pipet transferowych, aby zmienić płyny w probówkach.</li>
	<li>Utrwal zarodek w 1 ml 0,125% aldehydu glutarowego na lodzie. 
	UWAGA: Czas utrwalenia zależy od wielkości zarodka: 20 min dla zarodków E8,5-E9,5, 30 min dla zarodków E10,5 i 1 h dla zarodków E12,5.</li>
	<li>Usuń utrwalacz i umyj zarodki w 1x PBS dwa razy przez 10 minut w temperaturze pokojowej przed przetworzeniem próbki do barwienia X-gal.</li>
</ol>
3. Cała góra β-galaktozydaza Histochemia zarodków myszy
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem procedury należy przygotować bufor X-Gal Rinse i roztwór do barwienia X-Gal (patrz Tabela 1 i Tabela Materiałów). Użyć zarodków rodzeństwa z miotu typu dzikiego (WT) jako kontroli negatywnej reakcji enzymatycznej.</li>
	<li>Inkubować zarodki w buforze X-Gal Rinse przez 10 minut w temperaturze pokojowej (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2).</li>
	<li>Inkubować zarodki w roztworze barwiącym X-Gal przez 2 godziny do nocy w temperaturze 37 °C, chroniąc przed światłem. Okresowo monitoruj reakcję barwną za pomocą mikroskopu preparacyjnego, aż do momentu zaobserwowania wystarczającej intensywności niebieskiego zabarwienia bez tła w zarodku. Utrzymuj pH roztworu między 8 a 9, aby zmniejszyć tło podczas całego barwienia. Jeśli roztwór barwiący zacznie zmieniać kolor na jasny, zastąp go świeżym roztworem substratu, aby przedłużyć reakcję enzymatyczną.</li>
	<li>Zatrzymaj reakcję, gdy pożądany sygnał zostanie uzyskany przez mycie zarodków w probówce mikrowirówkowej z 1 ml 1x PBS dwa razy przez 10 minut każdy w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przenieś barwione zarodki do 1 ml 4% paraformaldehydu (PFA) w celu ich ponownego utrwalenia, przez 1 godzinę do nocy w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Zarodki mogą być przechowywane w 4% PFA/PBS przez dłuższy czas w temperaturze 4 °C lub mogą być natychmiast przetworzone w celu sekcji. Ten ostatni etap utrwalania ma kluczowe znaczenie dla długotrwałej konserwacji wzoru barwienia.</li>
	<li>Umyj zarodki w 1 ml 1x PBS dwa razy przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Opcja 1: Usunąć zarodki przez zanurzenie w serii roztworów o rosnącym stężeniu glicerolu (20%, 40%, 60% i 80% glicerolu w 1x PBS) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w każdym roztworze. 
	UWAGA: Na tym etapie myj zarodki w 80% glicerolu przez dłuższy czas, nawet dni, aż zostaną usunięte, a następnie przechowuj je w 80% glicerolu w temperaturze 4 °C na tym etapie (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). Zaleca się dodanie bardzo małej ilości azydku sodu lub kryształu tymolu do zarodków przechowywanych w temperaturze 4 °C w glicerolu lub 1x PBS, aby zapobiec rozwojowi pleśni. Po oczyszczeniu, całe zarodki wierzchowca mogą być użyte do fotografowania (krok 4).</li>
	<li>Opcja 2: Przetwarzanie zarodków w celu osadzenia parafiny i cięcia za pomocą mikrotomu (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). Udokumentuj wzorzec ekspresji w całych barwionych zarodkach przed sekcją (kroki 4 i 5).</li>
</ol>
4. Fotografia całych embrionów górskich
<ol>
	<li>Aby sfotografować całe zarodki barwione przed sekcją, przenieś je na szalkę Petriego przygotowaną na podstawie zestalonej 1-2% agarozy w 1x PBS.</li>
	<li>Przykryj zarodek całkowicie 10 ml 1x PBS w naczyniach pokrytych agarozą, aby zapobiec odwodnieniu i odbiciu podczas fotografowania przez płyn.</li>
	<li>Zorientuj zarodek zanurzony w 1x PBS za pomocą kleszczy. W przypadku starszych zarodków (E10.5-E12.5) należy wykonać mały otwór w agarozie za pomocą kleszczyków, aby umieścić i ustawić w nim próbkę pod różnymi kątami i uniknąć swobodnego unoszenia się podczas fotografowania.</li>
	<li>Umieść naczynie na stoliku mikroskopu stereoskopowego, używając światła przechodzącego (pod stolikiem). Przełączaj się między regulacją "ciemnego pola" i "jasnego pola", aby ustawić żądane oświetlenie podczas fotografowania i zoptymalizować przezroczystość próbki. 
	UWAGA: Użyj oświetlenia światłowodowego w przypadku zarodków w późniejszym stadium, aby uniknąć odbicia na powierzchni zarodka. Podczas fotografowania oczyszczonych zarodków postępuj zgodnie z tą samą procedurą, ale przenieś je na szalkę Petriego zawierającą 100% glicerolu i całkowicie je zanurz.</li>
</ol>
5. Osadzanie parafiny i cięcie zarodków wybarwionych X-galem
<ol>
	<li>Osadzanie wosku parafinowego
	<ol>
		<li>Usunąć zarodki barwione X-galem z 4 °C (krok 3.5) i umyć je 1 ml 1x PBS trzy razy, aby usunąć nadmiar utrwalacza.</li>
		<li>Przenieś każdy zarodek do kasety histologicznej za pomocą kleszczy.</li>
		<li>Umieść kasety zawierające zarodki w zlewce, a następnie odwodnij, przepuszczając je przez serię stopniowanych etanoli w temperaturze pokojowej: 70% etanolu, raz przez 30 minut; 96% etanolu, dwa razy przez 30 minut każda; 100% etanolu, dwa razy po 30 minut każdy. 
		UWAGA: Zarodki mogą być przechowywane w 70% etanolu przez nieokreślony czas w temperaturze 4 °C, aż do rozpoczęcia procesu odwodnienia.</li>
		<li>Inkubować całą kasetę w izopropanolu przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Za pomocą kleszczy przenieść kasety do szklanego koryta barwiącego zawierającego wstępnie podgrzany izopropanol i pozostawić w suszarce w temperaturze 60 °C na 30 minut.</li>
		<li>Umieścić kasety w nowym szklanym korycie barwiącym zawierającym mieszaninę 50% izopropanolu / 50% stopionego wosku parafinowego i pozostawić na 4 godziny w piecu o temperaturze 60 °C.</li>
		<li>Inkubować kasety z zarodkami z dwiema przemianami stopionego wosku parafinowego, każda przez 30 minut w temperaturze 60 °C.</li>
		<li>Pod koniec końcowego płukania parafiną otwórz kasetę i przenieś każdy zarodek do oddzielnej formy do zatapiania tkanek, aby wyświetlić próbkę pod mikroskopem stereoskopowym.</li>
		<li>Napełnij studzienkę stopionym woskiem parafinowym w temperaturze 60 °C. Użyj podgrzewanych kleszczy, aby wosk był stopiony i ostrożnie ustaw zarodek w formie. 
		UWAGA: Właściwa orientacja próbki jest krytycznym krokiem do przekroju zarodka w pożądanej płaszczyźnie.</li>
		<li>Zanim parafina zastygnie w formie, umieść kasetę bez pokrywki na wierzchu bloku i napełnij ją stopionym woskiem parafinowym. Pozostaw pozostały wosk do ostygnięcia przez noc w temperaturze pokojowej, aż stężeje.</li>
		<li>Gdy parafina całkowicie zastygnie, wyjmij stały blok z formy i przechowuj bloki parafiny w temperaturze pokojowej lub w temperaturze 4 °C do momentu przekroju14.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cięcie parafiny
	<ol>
		<li>Ustaw ostrze na mikrotomie i ustaw grubość 5-7 μm. 5.2.2. Schłodzić blok parafiny na lodzie i przyciąć go do sześcianu lub piramidy.</li>
		<li>Przymocuj blok do uchwytu mikrotomu, używając niewielkiej ilości stopionego wosku.</li>
		<li>Ustaw blok w odpowiedniej orientacji, aby uzyskać optymalne cięcie. Pokrój bloki parafiny na plastry o grubości 5-7 μm w temperaturze pokojowej za pomocą standardowego mikrotomu.</li>
		<li>Za pomocą cienkiego pędzla umieść sekcje w łaźni wodnej o temperaturze pokojowej w celu manipulowania i wybierania plastrów.</li>
		<li>Pobrać skrawki z łaźni wodnej za pomocą szkiełka mikroskopowego i przenieść je do łaźni wodnej o temperaturze 42 °C w celu rozciągnięcia.</li>
		<li>Wyjmij skrawki z kąpieli wodnej i delikatnie umieść je na szkiełkach mikroskopu adhezyjnego.</li>
		<li>Szkiełka należy dobrze wysuszyć w suszarce w temperaturze 37 °C przez noc, aby sekcje całkowicie przylegały, w przeciwnym razie mogą się zgubić podczas barwienia. 
		UWAGA: Szkiełka należy przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu rozpoczęcia procedur barwienia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Deparafinowanie i barwienie przeciwstawne skrawków parafiny zabarwionych X-Galem
	<ol>
		<li>Umieścić szkiełka podstawowe na tacy mikroskopowej w piekarniku w temperaturze 60 °C na co najmniej 45 minut, aby wosk parafinowy stał się bardziej płynny.</li>
		<li>Przenieś szkiełka na stojak i użyj szklanych naczyń do barwienia, aby wykonać następujące czynności: zanurzyć ruszt w słoikach do barwienia zawierających alkohole o malejących stężeniach w celu całkowitego usunięcia parafiny i nawodnienia tkanek: izopropanol na 5 minut w temperaturze 60 °C; izopropanol na 3 minuty; 100% etanol przez 2 minuty; 96% etanol przez 1 minutę; 70% etanol na 1 minutę w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Dwukrotnie opłucz sekcje w wodzie destylowanej, aby upewnić się, że nie ma pozostałości alkoholu.</li>
		<li>Skrawki przeciw barwieniu za pomocą barwnika (np. roztworu Nuclear-Fast Red) przez 5 minut (zwykle między 3-8 minutami) w temperaturze pokojowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). 
		UWAGA: To barwienie pomaga ujawnić ogólną strukturę tkanki w skrawkach.</li>
		<li>Po barwieniu umyj szkiełka w wodzie destylowanej przez 1 minutę i sprawdź barwienie przekrojów w mikroskopie. 
		UWAGA: Jeśli pożądane zabarwienie jest zbyt słabe, ponownie przeciwbejcuj sekcje przez dłuższy czas.</li>
		<li>Sekcje odwadniania w następujących seriach ze wzrostem stężenia etanolu: dwa prania w 95% etanolu przez 2 minuty każde, dwa mycia w 100% etanolu przez 2 minuty każde i, aby uniknąć rozpuszczenia niebieskich osadów, tylko jedno szybkie mycie w ksylenie.</li>
		<li>Wyjmij szkiełka ze stojaka jeden po drugim i umieść je na kartce papieru. Następnie zamontuj i nakryj każde szkiełko za pomocą syntetycznego, trwałego podłoża montażowego. 
		UWAGA: Ksylen jest produktem łatwopalnym, którego opary są drażniące i szkodliwe dla zdrowia ludzkiego i organizmów wodnych. Musi być manipulowany w kapturze i wymaga użycia odpowiedniego sprzętu ochronnego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnego interesu finansowego.

Gen LacZ E. coli jest szeroko stosowany jako reporter w badaniach nad wzorcami ekspresji genów ze względu na jego wysoką czułość i łatwość wykrywania. Niniejszy protokół opisuje klasyczną metodę wykrywania ekspresji β-gal w oparciu o reakcję enzymatyczną, która jest łatwa i szybka do przeprowadzenia, a także niedroga. Metoda ta może być również stosowana bez większych modyfikacji w przypadku całych zarodków, nienaruszonych narządów, skrawków tkanek kriostatu lub hodowanych komórek.
Do...

Aby opisać specyficzne wzorce ekspresji genów, użycie genów reporterowych jako markerów było najważniejsze od Drosophila do ssaków. W eksperymentach z udziałem zwierząt transgenicznych i nokautujących, bakteryjny gen β-galaktozydazy (LacZ) Escherichia coli (E. coli) jest jednym z najczęściej stosowanych1,2,3,4. β-galaktozydaza (β-gal) katalizuje hydrolizę β-galaktozydów (takich jak laktoza) do swoich cukrów prostych (glukozy i galaktozy)<klasa sup="xref">5. Jego najczęściej stosowanym substratem jest X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolilo-β-D-galaktopyranozyd), glikozyd, który jest hydrolizowany przez β-galaktozydazę, dając początek 5-bromo-4-chloro-3-hydroksyindolowi i galaktozie. Pierwszy jest utleniany do dimeru, który w połączeniu z żelazocyjankiem potasu i żelazocyjankiem wytwarza charakterystyczny nierozpuszczalny, niebieski osad (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1) <klasa sup = "xref">6.
Gen LacZ zaczął być używany jako gen reporterowy ponad trzydzieści lat temu7,8. Zazwyczaj LacZ jest wprowadzany za endogennym promotorem w miejsce otwartej ramki odczytu, dzięki czemu może być stosowany w hodowlach bakteryjnych i komórkowych do wizualizacji komórek zawierających określoną insercję, a także u zwierząt transgenicznych jako znacznik endogennych wzorców ekspresji genów podczas rozwoju9. W związku z tym wizualizacja aktywności β-galaktozydazy była szeroko stosowana u Drosophila w celu zrozumienia procesów rozwojowych i komórkowych od pojedynczych komórek do całych tkanek. Genetyka Drosophila sprzyja generowaniu stabilnych linii, w których zmodyfikowany konstrukt elementu P zawierający gen reporterowy LacZ jest wstawiany w losowych miejscach w genomie. Tak więc, gdy jest umieszczony pod wpływem elementów wzmacniających, może napędzać swoją ekspresję w sposób specyficzny dla tkanki, co pozwoliło na systematyczną analizę wzorców ekspresji wielu genów w ciągu ostatnich dwóch dekad10. Ponadto wykorzystanie myszy transgenicznych do monitorowania ekspresji genu LacZ umożliwia również wykrywanie zdarzeń rekombinacji genów za pośrednictwem rekombinacji za pośrednictwem Cre-loxP oraz lokalizację zmutowanych pochodnych embrionalnych komórek macierzystych w analizach chimerycznych11, co ułatwia kontrolę ekspresji LacZ w określonych tkankach, a także czasowo. Ponadto, w całych zarodkach, wykrycie aktywności β-galaktozydazy może powodować zróżnicowane wzorce barwienia o różnej intensywności, które można wygodnie obserwować na różnych etapach rozwoju w celu analizy czasowych zmian w ekspresji genów8,12.
W tym artykule prezentujemy protokół do wizualizacji ekspresji genów poprzez barwienie X-gal w całej tkance wierzchowca we wczesnych stadiach rozwojowych embrionów myszy. Przedstawiamy tę metodę histochemiczną jako bardzo czułą i niedrogą technikę, która sprzyja dokładnemu wykrywaniu znakowanych komórek zarówno w całych próbkach wierzchowców, jak i na poziomie komórkowym po tkankach lub zarodkach zatopionych w parafinie. Metoda pozwala na bezpośrednią wizualizację barwienia w tkance myszy z minimalnym tłem w porównaniu z innymi metodami13.

<table><tbody><tr><td>ODCZYNNIKI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>24137-1L-R</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>SCHARLAU</td><td>50004/ LE3Q2014</td><td></td></tr><tr><td>Wodne medium</td><td>montażowe VECTOR LABS</td><td>H-5501</td><td></td></tr><tr><td>Syntetyczne media montażowe</td><td>MERCK</td><td>100579</td><td></td></tr><tr><td>96% Etanol</td><td>PROLABO</td><td></td><td></td>20824365</tr><tr><td>99,9% Etanol absolutny</td><td>SCHARLAU</td><td>ET00021000</td><td></td></tr><tr><td>50% Roztwór aldehydu glutarowego</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>G6403-100ml</td><td></td></tr><tr><td>85% Glicerol</td><td>MERCK</td><td>104094</td><td></td></tr><tr><td>99,9% Glicerol</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Sześciowodny chlorek magnezu</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>63064</td><td></td></tr><tr><td>Niejonowy środek powierzchniowo czynny (Nonidet P-40)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>542334</td><td></td></tr><tr><td>Nuclear Fast Red Przeciwbarwienie</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>N3020</td><td></td></tr><tr><td>Pastylki parafinowe</td><td>MERCK</td><td>111609</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>158127-500g</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (tabletki)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P4417-50TAB</td><td></td></tr><tr><td>Żelazocyjanian potasu</td><td>MERCK</td><td>1049840500</td><td></td></tr><tr><td>Żelazocyjanek potasu</td><td>MERCK</td><td>1049731000</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>S8032</td><td></td></tr><tr><td>Deoksycholan sodu</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>Diwodorofosforan sodu jednowodny</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>106346</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuwodny</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>71638</td><td></td></tr><tr><td>Tymol</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>T0501</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek Tris (Tris HCl)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>10812846001 (Roche)</td><td></td></tr><tr><td>X-GAL</td><td>VENN NOVA</td><td>R-0004-1000</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>VWR CHEMICALS</td><td>VWRC28973.363</td><td></td></tr><tr><td>EQUIPMENT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe plastikowe krioformy 15x15x5 mm</td><td>SAKURA</td><td>4566</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom rotacyjny</td><td>Leica</td><td>RM2235</td><td></td></tr><tr><td>Kasety</td><td>Oxford Trade</td><td>OT-10-9046</td><td></td></tr><tr><td>Okulary nakrywkowe do mikroskopu 24x60 mm</td><td>VWR</td><td>ECN631-1575</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>Thermo Scientific, MENZEL-GL&Auml; SER</td><td>AGAA000001#12E</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe adhezyjne</td><td>Thermo Scientific, MENZEL-GL&Auml; SER</td><td>J1820AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Flotacja Kąpiel wodna</td><td>Leica</td><td>HI1210</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe niskoprofilowe ostrza mikrotomu</td><td>Feather</td><td>UDM-R35</td><td></td></tr><tr><td>Piec parafinowy</td><td>J.R. SELECTA</td><td></td> 2000205 Dozownik parafiny do wosku <td></td></tr><tr><td></td><td>J.R. SELECTA</td><td></td><td></td></tr> 4000490 <tr><td>Stereoskop</td><td>Leica</td><td>DM500</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek polipropylenowych 2,0 mL</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>T2795</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek polipropylenowych 1,5 mL</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>T9661</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka oscylacyjna</td><td>IKA Labortechnik</td><td>HS250 BASIC</td><td></td></tr><tr><td>Mieszadło z płytą grzejną</td><td>Bibby</td><td>HB502</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka wirowa</td><td>IKA Labortechnik</td><td>MS1</td><td></td></tr><tr><td>Waga laboratoryjna</td><td>GRAM</td><td>FH-2000</td><td></td></tr><tr><td>Waga precyzyjna</td><td>Sartorius</td><td>ISO9001</td><td></td></tr><tr><td>pHhmeter</td><td>Crison</td><td>Basic 20</td><td></td></tr><tr><td>Światłowód</td><td>Optech</td><td>PL2000</td><td></td></tr></tbody></table>

Śledzenie ekspresji genów poprzez wykrywanie aktywności β-galaktozydazy w całych zarodkach myszy

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Gen LacZ Escherichia coli, kodujący β-galaktozydazę, jest głównie używany jako reporter ekspresji genów i jako znacznik w badaniach nad liniami komórkowymi. Klasyczna reakcja histochemiczna opiera się na hydrolizie substratu X-gal w połączeniu z jonami żelaza i żelaza, w wyniku czego powstaje nierozpuszczalny niebieski osad, który jest łatwy do wizualizacji. Dlatego aktywność β-galaktozydazy służy jako marker wzorca ekspresji genu będącego przedmiotem zainteresowania w miarę postępu rozwoju. W tym miejscu opisujemy standardowy protokół wykrywania aktywności β-galaktozydazy we wczesnych całych zarodkach myszy oraz późniejszą metodę cięcia parafiny i barwienia przeciwstawnego. Dodatkowo zapewniona jest procedura klarowania całych zarodków, aby lepiej uwidocznić barwienie X-gal w głębszych obszarach zarodka. Wykonując tę procedurę, uzyskuje się spójne wyniki, chociaż konieczna jest optymalizacja warunków reakcji w celu zminimalizowania aktywności tła. Należy również wziąć pod uwagę ograniczenia w teście, szczególnie w odniesieniu do wielkości zarodka w barwieniu całego wierzchowca. Nasz protokół zapewnia czułą i niezawodną metodę wykrywania β-galaktozydazy podczas rozwoju myszy, która może być dalej stosowana do sekcji kriostatu, a także całych narządów. W ten sposób dynamiczne wzorce ekspresji genów w trakcie rozwoju można łatwo analizować za pomocą tego protokołu w całych zarodkach, ale także szczegółową ekspresję na poziomie komórkowym można ocenić po przekroju parafiny.

W niniejszej pracy przedstawiamy wyniki zastosowania standardowego protokołu reakcji histochemicznej β-galaktozydazy z użyciem X-gal jako substratu w całych embrionach myszy (Rycina 1 i Rycina 2). Korzystając z tego protokołu, badamy ekspresję błonowej metaloproteinazy macierzy typu 4 (Mt4-mmp) na różnych etapach rozwoju embrionalnego (E9,5, E1,5 i E12,5) z wykorzystaniem mutantów myszy Mt4-mmp, które wykazują ekspresję reportera...

Tutaj opisujemy standardowy protokół wykrywania aktywności β-galaktozydazy we wczesnych zarodkach całych myszy oraz metodę sekcji parafiny i przeciwbarwienia. Jest to łatwa i szybka procedura monitorowania ekspresji genów podczas rozwoju, która może być również stosowana do skrawków tkanek, narządów lub hodowanych komórek.

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Metoda ta może przynieść odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biologii rozwoju, takie jak badanie wzorców ekspresji genów podczas rozwoju embrionalnego. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że jest ona bardzo czuła, łatwa i szybka do wykonania oraz umożliwia bezpośrednią wizualizację barwienia w całej tkance wierzchowca lub w wyższej rozdzielczości po przekroju parafinowym próbki. Procedurę zademonstrują dr Maria Jose Blanco, dr Anabel Learte, dr Emma Munoz i dr Miguel Marchena.Wszyscy są starszymi post-docami z mojego laboratorium. Rozpocznij od inkubacji transgenicznych zarodków utrwalonych aldehydem glutarowym eksprymujących galaktozydazę w świeżo przygotowanym buforze do płukania X-gal przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Wykorzystanie zarodków wytworzonych w miocie typu dzikiego jako kontroli ujemnej reakcji enzymatycznej. Następnie zastąp bufor płuczący roztworem barwiącym X-gal o pH 8-9. Chronić przed światłem i inkubować przez 2 godziny do nocy w temperaturze 37

tracing-gene-expression-through-detection-galactosidase-activity

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

W niniejszej pracy opisujemy wydajną, wysokoprzepustową metodę hybrydyzacji in situ (ISH) służącą do wizualizacji wzorców ekspresji mRNA w przekrojach rozwijającej się tkanki prostaty zarodka myszy. Metodę tę można łatwo dostosować do wizualizacji wzorców ekspresji mRNA w innych tkankach myszy lub w tkankach innych gatunków.

Metoda wysokoprzepustowej hybrydyzacji in situ do charakteryzacji wzorców ekspresji mRNA w dolnym odcinku dróg moczowo-płciowych płodu myszy

Opisujemy test z reporterem fluorescencyjnym służący do szybkiej identyfikacji i charakterystyki genów regulujących utrzymanie oraz samoodnawianie embrionalnych komórek macierzystych myszy.

Analiza reporterowa Oct4GiP w celu badania genów regulujących utrzymanie i samoodnawianie macierzystych komórek embrionalnych myszy

Ten film demonstruje technikę oceny aktywności kwasu retinowego w zarodkach myszy. Po wyizolowaniu komórek z zarodków myszy, komórki są hodowane wspólnie z komórkami reporterowymi kwasu retinowego (RA). Komórki embrionalne wytwarzają RZS, który indukuje ekspresję beta-galaktozydazy w komórkach reporterowych, wskazując na aktywność RA w komórkach embrionalnych.

Wykorzystanie komórek reporterowych w kokulturze do badania produkcji kwasu retinowego przez komórki embrionalne myszy

Prezentujemy tutaj zoptymalizowany protokół genotypu, barwienia i przygotowania płodów myszy do obrazowania obwodowych projekcji aksonów nocyceptora u całego zwierzęcia, jako skuteczną metodę oceny fenotypów wzrostu aksonów czuciowych u genetycznie modyfikowanych myszy.

Obrazowanie w całości projekcji czuciowych aksonów zarodków myszy

Wykorzystując binarną strategię genetyczną, dostarczamy szczegółowy protokół śledzenia obwodów neuronalnych u myszy, które wyrażają komplementarne znaczniki transsynaptyczne po rekombinacji za pośrednictwem Cre. Ponieważ specyficzna dla komórki produkcja znaczników jest zakodowana genetycznie, nasze eksperymentalne podejście jest odpowiednie do badania tworzenia i dojrzewania obwodów nerwowych podczas rozwoju mysiego embrionalnego mózgu w rozdzielczości pojedynczej komórki.

Warunkowe genetyczne śledzenie transsynaptyczne w embrionalnym mózgu myszy

Ten protokół przedstawia metodę przeprowadzania ilościowej, jednokomórkowej analizy in situ ekspresji białek w celu zbadania specyfikacji linii u mysich zarodków przedimplantacyjnych. Opisano procedury niezbędne do pobierania blastocyst, wykrywania białek metodą immunofluorescencyjną w całości montowanej, obrazowania próbek pod mikroskopem konfokalnym oraz segmentacji jądrowej i analizy obrazu.

Analiza ilościowa ekspresji białek w celu zbadania specyfikacji linii w zarodkach myszy przed implantacją

Celem tego protokołu jest opisanie metody funkcji utraty i zysku, która ma zastosowanie do identyfikacji neogeniny jako specyficznego dla etapu receptora, który prowadzi do trofektodermy i różnicowania wewnętrznej masy komórkowej w preimplantacyjnych zarodkach myszy.

Podejście oparte na utracie i wzmocnieniu funkcji w celu zbadania determinantów wczesnego losu komórek w preimplantacyjnych zarodkach myszy

Tutaj prezentujemy protokół promujący integrację transgenów i produkcję założycielskich myszy transgenicznych z wysoką skutecznością poprzez proste wstrzyknięcie wektora lentiwirusowego w przestrzeń okołobrewą zapłodnionego oocytu.

Produkcja transgenicznych myszy za pośrednictwem lentiwirusa: prosta i wysoce skuteczna metoda bezpośredniego badania założycieli

Prezentujemy protokoły do badania rozwoju serca myszy za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej na pełnych zarodkach myszy wypreparowanych z komorowych specyficznych dla komór MLC-2v-tdPomidorowych myszy reporterowych. Metoda ta pozwala nam bezpośrednio uwidocznić każdy etap powstawania komory podczas rozwoju serca myszy bez pracochłonnych metod histochemicznych.

Analiza rozwoju komory serca podczas embriogenezy myszy z wykorzystaniem epifluorescencji całej góry

Ten artykuł ustanawia linię produkcyjną dla wysokiej jakości zawiesin pojedynczych komórek i jąder zarodków myszy do sekwencjonowania pojedynczych komórek i jąder.

Sekwencjonowanie jednokomórkowego RNA zmutowanych całych zarodków myszy: od epiblastu do końca gastrulacji

Opisujemy metody wizualizacji początkowej transkrypcji podczas aktywacji genomu zygotycznego w pojedynczych komórkach we wczesnej embriogenezie.

Wizualizacja aktywacji genomu zygotycznego w pojedynczych komórkach wczesnych zarodków

Poznaj metodę wykrywania aktywności β-galaktozydazy w całych zarodkach myszy do badania ekspresji genów w biologii rozwoju. Protokół ten umożliwia szybką i czułą wizualizację wzorców ekspresji genów.

Śledzenie ekspresji genów poprzez wykrywanie aktywności β-galaktozydazy w całych zarodkach myszy

Przeglądaj więcej filmów