TreadWheel: Protokół treningu interwałowego dla delikatnie indukowanych ćwiczeń u Drosophila melanogaster

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie badań metabolicznych, takie jak ustalenie, czy określone interwencje związane ze stylem życia, takie jak ćwiczenia, mogą przynieść korzyści konkretnym osobom. Często osoby, które dopiero zaczynają stosować tę metodę, mają trudności z identyfikacją larw w pierwszym stadium rozwojowym. Kluczem jest zebranie larw prawie tej samej wielkości co jaja.

Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją wykorzystać do oceny wpływu ćwiczeń na wiele warunków eksperymentalnych i genotypów. Najpierw zmontuj komory układania dla każdej grupy eksperymentalnej. Nałóż porcję pasty drożdżowej na talerz z sokiem jabłkowym i przymocuj talerz do plastikowej butelki o pojemności sześciu uncji.

Talerze agarowe z sokiem jabłkowym są wytwarzane przez przygotowanie 3% roztworu agaru w kupionym w sklepie soku jabłkowym. A następnie napełnianie naczyń o wymiarach 35 na 10 milimetrów w 3/4 wysokości ściany. Pasta drożdżowa jest wytwarzana przez zmieszanie kupionych w sklepie aktywnych suchych drożdży z wodą w proporcji około dwóch mililitrów wody destylowanej na gram drożdży.

Trzymaj pastę luźno przykrytą, aby umożliwić odgazowanie i nałóż około trzech milimetrowych porcji na każdą płytkę. Butelka wykonana z polipropylenu musi być przygotowana z małymi otworami do wentylacji. Po przygotowaniu elementów do komory przystąp do załadunku dorosłych.

Gdy wszystkie dorosłe osobniki o pożądanym genotypie znajdą się w butelce, zakręć butelkę płytką i zabezpiecz zespół gumkami. Zapewnienie wystarczającej liczby dorosłych much do komór niosek prawdopodobnie wymaga rozpoczęcia budowania liczebności populacji na kilka pokoleń przed planowanym eksperymentem. Teraz zmieniaj talerze agarowe z sokiem jabłkowym dwa razy dziennie, raz rano i raz wieczorem.

Następnie pozwól jajom rozwijać się na zebranych płytkach przez 12 do 24 godzin, aby wykształcić się w larwy pierwszego stadium rozwojowego. Aby zebrać te larwy, użyj cienkiego pędzla lub kilofa wykonanego z elastycznej cienkiej igły i uchwytu. Dla każdej grupy eksperymentalnej przenieś 50 larw w pierwszym stadium rozwoju do fiolki ze świeżą żywnością i pozwól im rozwinąć się do dorosłości.

Aby upewnić się, że jesteś w stanie zebrać wystarczającą liczbę larw dla każdej z replik, upewnij się, że dostępni są badacze, którzy są skuteczni w zbieraniu larw, aby uzyskać potrzebne liczby. Po przepoczwarzeniu zbierz poczwarki, najpierw zwilżając je małym wilgotnym pędzlem. Następnie delikatnie zgarnij poczwarki ze ścianek fiolek za pomocą szpatułki.

Załaduj poczwarki do pustych fiolek. Następnie, po zamknięciu, przenieś dorosłe osobniki do standardowych fiolek z jedzeniem. Od jednego do pięciu dni po ekluzji oddziel muchy na podstawie płci i podziel każdą płeć na dwie grupy, eksperymentalną i kontrolowaną.

Utrzymuj dorosłe osobniki na poziomie 50 much w fiolce. Podawaj muchom świeże fiolki z żywymi drożdżami co dwa dni. Chociaż możliwe jest utrzymanie dorosłych bez suplementacji żywymi drożdżami, odkryliśmy, że dorośli osiągają lepsze wyniki z suplementem.

Suplementacja żywymi drożdżami jest zmienną, którą naukowcy mogą modyfikować, aby dopasować ją do swoich konkretnych celów badawczych. Urządzenie do ćwiczeń wykorzystuje prosty system pasów i kół pasowych napędzany silnikiem o zmiennej prędkości. Przed użyciem urządzenia do ćwiczeń wyjmij wszystkie dołączone do niego fiolki i skalibruj prędkość jego silnika za pomocą zasilacza tak, aby pełny okres obrotu wynosił 15 sekund.

Aby zmierzyć prędkość obrotową, przymocuj mały pędzel do pokrywy silnika i ustaw szczotkę tak, aby dotykała jednego z obracających się wsporników. Następnie zmierz liczbę wykonanych obrotów, licząc styki szczotki i wspornika na minutę. Korzystając ze skalibrowanej maszyny, kontynuuj pierwszy dzień ćwiczeń, zwykle w poniedziałek.

Wcisnąć zatyczki fiolek do fiolek. Pozostaw muszkom jeden centymetr miejsca w fiolkach kontrolnych i sześć centymetrów przestrzeni w fiolkach do ćwiczeń. Teraz umieść fiolki w zaciskach i daj im 10 minut, aby muchy się zaaklimatyzowały.

Przyrząd do ćwiczeń może pomieścić do 48 fiolek. Temperatura w pomieszczeniu powinna pozostać stała przez cały wielodniowy zabieg lub w razie potrzeby urządzenie do ćwiczeń może zmieścić się w inkubatorze. Projekt eksperymentalny składa się z pięciu kolejnych dni ćwiczeń w tygodniu.

Każdy dzień ćwiczeń składa się z naprzemiennych okresów ćwiczeń i odpoczynku. Każdego dnia do jednego z okresów ćwiczeń dodaje się pięć minut, tak aby w ciągu pięciodniowego tygodnia pracy wszystkie cztery okresy ćwiczeń wydłużyły się o pięć minut. Gdy muchy się zaaklimatyzują, rozpocznij pierwszy okres ćwiczeń.

Uruchom maszynę na 15 minut. Podczas pięciominutowego odpoczynku między okresami należy pozostawić fiolki na zaciskach. Po zakończeniu czwartego cyklu ćwiczeń przywróć korki fiolek z jedzeniem do ich normalnych pozycji i włóż muchy z powrotem do inkubatora.

Aby ustalić, czy ćwiczenia na TreadWheel wpłynęły na cechy metaboliczne, zmierzono magazynowanie trójglicerydów u Oregon R i żółtych białych much i znormalizowano je w stosunku do stężenia białka u much. Analiza statystyczna wykazała istotną interakcję genotypu poprzez wysiłek fizyczny wpływającą na magazynowanie trójglicerydów. Stwierdzono również znaczny efekt dymorficzny płciowy, przy czym samce magazynowały więcej trójglicerydów niż samice.

Samice ćwiczących much miały znacznie niższy poziom trójglicerydów niż ich niećwiczone odpowiedniki. Nie zaobserwowano tego u mężczyzn. Następnie muchy hodowano na zmiennych dietach, poddawano reżimowi ćwiczeń, a następnie testowano na ujemnym teście geotaksji podobnym do RING.

Samice osiągały znacznie wyższe wyniki, gdy były hodowane na diecie wysokotłuszczowej, niż podczas któregokolwiek z innych zabiegów. W przypadku samców ćwiczenia poprawiły wspinaczkę tylko wtedy, gdy były wychowywane na normalnej diecie. Dieta wysokotłuszczowa nie przyniosła żadnego efektu.

Co ciekawe, nastąpił spadek wydajności wspinaczkowej po ćwiczeniach u kobiet z linii DGRP 153, gdy były wychowywane na normalnej diecie. W związku z tym ćwiczenia mogą nie być jednolicie pozytywną interwencją dla wszystkich genotypów. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak testy glukozy w hemolimfie lub analizy długości życia, aby ocenić wpływ ćwiczeń na cukrzycę typu II lub długowieczność.

Technika ta pozwala naukowcom zajmującym się genetyką i metabolizmem badać rolę ćwiczeń w utrzymaniu zdrowia metabolicznego w organizmie modelowym Drosophila.