Name: Pomiar sztywności miękkich podłoży silikonowych do badań mechanobiologicznych przy użyciu szerokokątnego mikroskopu fluorescencyjnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: Poznaj metodę pomiaru modułu Younga miękkich żeli silikonowych przy użyciu szerokokątnego mikroskopu fluorescencyjnego. Technika ta umożliwia badanie odpowiedzi komórkowych na sztywność podłoża w mechanobiologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Margaret Gardel za hojne umożliwienie korzystania z reometru. Dziękujemy za wsparcie ze strony NIH (1R15GM116082), które umożliwiło tę pracę.

1. Wytwarzanie miękkiego podłoża silikonowego
<ol>
	<li>Odważ 1,75 g komponentu A oraz 1,75 g komponentu B (A:B = 1:1) z zestawu miękkiego elastomeru silikonowego, używając (polistyrenowych) tacek wagowych.</li>
	<li>Dodaj komponent A do komponentu B w tacy wagowej i mieszaj przez 5 min za pomocą odpowiedniego aplikatora.</li>
	<li>Przelej powyższą mieszaninę do 35 mm szalki Petriego. Pozostaw mieszaninę na kilka minut, aby równomiernie rozprzestrzeniła się w szalce. 
	Uwaga: Wybór średnicy szalki Petriego oraz ilości miękkiego silikonu determinuje grubość warstwy silikonu. W tym przypadku grubość wyniesie około 3,5 mm; więcej informacji na temat wyboru grubości elastomeru znajduje się w sekcji Dyskusja.</li>
	<li>Umieść szalkę Petriego z mieszaniną silikonową bez przykrycia w komorze próżniowej na 15 min w celu usunięcia pęcherzyków powietrza. W tym czasie rozgrzej płytę grzewczą do 70 °C.</li>
	<li>Gdy płyta grzewcza osiągnie 70 °C, połóż na niej szkiełko przedmiotowe, a następnie ustaw na szkiełku szalkę Petriego z mieszaniną silikonową. Pozostaw silikon do utwardzenia w 70 °C przez 30 min. Nie kładź polistyrenowej szalki bezpośrednio na płytę grzewczą, ponieważ może ona ulec stopieniu.</li>
</ol>
2. Sprzęganie fluorescencyjnych mikrokulek z miękkim silikonem
<ol>
	<li>Umieść utwardzony miękki silikon (w odkrytej szalce Petriego) w komorze głębokiego UV (obudowie z lampą głębokiego UV o długościach fal światła 185 i 254 nm). Naświetlaj próbkę miękkiego silikonu (~5 - 10 cm od lampy UV) światłem głębokim UV przez 5 min.
	<ol>
		<li>Podczas naświetlania silikonu światłem głębokim UV wykonaj kroki 2.2 - 2.6 opisane poniżej. Po naświetlaniu głębokim UV odgazuj komorę przez co najmniej 5 min przed wyjęciem próbki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W międzyczasie odważ 19 mg 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiimidu (EDC) do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL i dodaj 500 μL wody dejonizowanej (DI). Rozpuść EDC, delikatnie wstrząsając probówką.</li>
	<li>W oddzielnej probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL odważ 11 mg N-hydroksysulfosukcynimidu (sulfo-NHS), dodaj 500 μL wody DI i rozpuść sulfo-NHS, delikatnie wstrząsając probówką. Następnie połącz roztwory EDC i sulfo-NHS w jednej probówce do mikrocentryfugi.</li>
	<li>Do tego roztworu EDC/sulfo-NHS dodaj 30 μL zmodyfikowanych karboksylowo fluorescencyjnych mikrokulek o średnicy 0,44 μm w kolorze czerwonym (lub w dowolnym innym kolorze fluorescencji, zależnie od dostępnych kostek filtrów w mikroskopie fluorescencyjnym) z roztworu zapasowego o stężeniu 1% w/v.</li>
	<li>Do mieszaniny EDC/sulfo-NHS/kulek dodaj 0,02 mg kolagenu I (z ogona szczura, stężenie zapasowe 4 mg/mL w 0,02 M kwasie octowym), aby uzyskać stężenie około 0,02 mg/mL.</li>
	<li>Krótko wymieszaj mieszaninę EDC/NHS/kulek/kolagenu I za pomocą wstrząsarki vortex, aby zapewnić równomierne rozproszenie kulek przed sprzęganiem.</li>
	<li>Nanieś pipetą 1 mL mieszaniny EDC/NHS/kulek/kolagenu I na kawałek parafilmu położony na innej płytkiej, płaskiej pokrywce (o mniejszej średnicy). Odwróć szalkę Petriego z miękkim silikonem i połóż ją na tej mieszaninie w taki sposób, aby powierzchnia miękkiego silikonu stykała się z mieszaniną, ale nie dotykała bezpośrednio powierzchni pokrywki mniejszej szalki Petriego znajdującej się poniżej. Aby unieść odwróconą szalkę Petriego, użyj jednego lub dwóch szkiełek podstawowych pod każdą stroną odstępu odwróconej szalki Petriego. 
	Uwaga: W celu zapoznania się ze sposobem wykonania kroku 2.7 należy odnieść się do Rysunku 1.</li>
	<li>Przykryj próbkę folią aluminiową i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 min.</li>
	<li>Wyjmij szalkę Petriego z miękkim silikonem i postaw ją w pozycji prawidłowej (silikonem do góry).</li>
	<li>Przemyj powierzchnię miękkiego silikonu solą fizjologiczną buforowaną fosforanowo (PBS), dodając do szalki 2 mL PBS (pH 7.4). Pozostaw na kilka minut. Odessaj PBS i ponownie przemyj silikon 2 mL PBS. Pozostaw silikon do dalszego utwardzania przez około dobę. W tym celu umieść próbkę miękkiego silikonu w PBS w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
</ol>
3. Pomiar sztywności silikonu za pomocą wgniecenia sferycznego z użyciem fluorescencyjnego mikroskopu szerokopolowego
<ol>
	<li>Wyjmij szalkę Petriego z miękkim silikonem i upewnij się, że zawiera ona co najmniej 1 mL PBS, tak aby powierzchnia silikonu znajdowała się kilka mm poniżej powierzchni cieczy.</li>
	<li>Używając pęsety z ostrymi końcami, umieść pięć cyrkonowych kul wciskowych o średnicy 1 mm na miękkim silikonie. Zanurz kule w medium ciekłym i upuść je w pewnej odległości od krawędzi warstwy silikonu oraz w odległości co najmniej 5 średnic wcisku od pozostałych wciszczików. 
	Uwaga: Po upuszczeniu nad powierzchnią cieczy kule mogą nie zanurzyć się w medium (pływać) z powodu napięcia powierzchniowego cieczy.</li>
	<li>Umieść szalkę Petriego z miękkim silikonem na stoliku mikroskopu w taki sposób, aby możliwe było obrazowanie przez dno szalki Petriego.</li>
	<li>Korzystając z obrazowania fazowego z obiektywem 10X (np. suchym obiektywem 10X o NA 0,30), zlokalizuj kulę wciskową i ustaw ją w ostrości.</li>
	<li>Wykonaj i zapisz obraz fazowy części lub całości wciszczika. Jeśli jest to możliwe, zastosuj skanowanie kafelkowe (tile scan). Jeśli wciszczik posiada widoczne defekty, odrzuć go i zastąp innym.</li>
	<li>Podczas obrazowania fazowego na żywo przesuń obraz w lewo od krawędzi wciszczika, tak aby lewa krawędź kadru znajdowała się w odległości co najmniej ~1,5 R od środka wciszczika. Upewnij się, że środek wciszczika pozostaje widoczny po prawej stronie, blisko prawej krawędzi kadru obrazu. Wykonaj obraz fazowy i zapisz go.</li>
	<li>Przełącz źródło światła mikroskopu na oświetlenie dla czerwonego kanału fluorescencyjnego. Pozostawiając współrzędne x i y bez zmian (pozycja x-y środka wciszczika wewnątrz, ale blisko prawej krawędzi kadru), wykonaj ostrzenie w dół (zmniejsz Z), aż czerwone fluorescencyjne mikrokulki pod środkiem kuli wciskowej znajdą się tuż poza zakresem ostrości.</li>
	<li>Wykonaj stos obrazów (z-stack) z obrazem dla każdego przyrostu z o wartości 0,5 µm, aż mikrokulki w górnej warstwie silikonu w miejscu oddalonym od wciszczika (blisko lewej krawędzi kadru obrazowania) znajdą się poza zakresem ostrości.</li>
	<li>Powtórz kroki 3.4 – 3.8 dla pozostałych wciszczików w próbce.</li>
</ol>
4. Obliczanie sztywności silikonu (modułu Younga)
<ol>
	<li>Otwórz obraz fazowy indentora w programie ImageJ, wybierz narzędzie linii i zmierz średnicę indentora w pikselach. Kliknij i przytrzymaj punkt na krawędzi indentora, przesuń kursor do punktu diametralnie przeciwległego na krawędzi i odczytaj długość w pikselach wyświetloną na pasku stanu głównego okna ImageJ przed zwolnieniem kursora.
	<ol>
		<li>Upewnij się, że jednostką długości są piksele, klikając Analyze | Set Scale i sprawdzając pole Unit of length.</li>
		<li>Przelicz promień indentora z pikseli na μm, uwzględniając powiększenie obiektywu i rozmiar piksela kamery CCD (R w μm = R w pikselach x rozmiar piksela kamery CCD w μm / powiększenie obiektywu).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Otwórz w ImageJ stos obrazów (z-stack) kanału czerwonego dla mikrokulek (jeśli mikrokuleczki są czerwone fluorescencyjnie), klikając File | Import | Image Sequence, wybierz dowolny obraz ze stosu i kliknij OK, aby otworzyć stos. 
	Uwaga: F1 to numer klatki, w której mikrokuleczki pod środkiem indentora są w optymalnym ostrzeniu, a F2 to numer klatki, w której mikrokuleczki (w obszarze oddalonym o ok. 1,5 R od środka kuleczki) w pobliżu lewej krawędzi klatki są w optymalnym ostrzeniu. Różnica w osi z między tymi dwiema klatkami to głębokość wgłębienia δ.
	<ol>
		<li>Używając narzędzia linii w ImageJ, narysuj linię przez wyraźnie zarysowaną mikrokuleczkę na obrazie. Kliknij Analyze | Plot Profile, a następnie przycisk Live, aby uzyskać aktualny profil intensywności wzdłuż linii dla danej kuleczki podczas wyboru różnych klatek. Klatka, która daje najwyższą wartość maksymalnej intensywności, może zostać wybrana jako klatka w ostrości.</li>
		<li>Ponieważ przyrost w osi z między klatkami w stosie wynosi 0,5 μm, oblicz głębokość wgłębienia w μm jako δ = (F2-F1) x 0,5.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oblicz siłę wywartą na żel przez indentor wynikającą z jego ciężaru (pomniejszoną o przeciwną siłę wyporu), czyli siłę wgłębienia F, jako iloczyn objętości indentora x (gęstość indentora - gęstość medium ciekłego) x przyspieszenie ziemskie. Użyj równania F = (4/3) x 3,142 x (R3) x (ρindentora - ρmedium) x g, gdzie R to promień indentora, ρindentora to gęstość indentora, ρmedium to gęstość medium ciekłego, a g to przyspieszenie ziemskie (9,81 m/s2). Wyraź wszystkie wielkości po prawej stronie w jednostkach SI, aby otrzymać F (w N).</li>
	<li>Oblicz moduł Younga (E) silikonu, korzystając ze zmodyfikowanego11 równania modelu Hertza12: 
	<img alt="Wzór na moduł sprężystości, E = c*[3(1-v²)F]/4R⁰.⁵δ¹.⁵, równanie do analizy wgłębienia." src="/files/ftp_upload/57797/57797eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 1"> 
	Gdzie: 
	c = współczynnik korekcyjny modyfikujący następujący po nim zapis modelu Hertza; 
	v = liczba Poissona żelu silikonowego (przyjęta jako 0,5 dla materiałów nieściśliwych7); 
	F = siła wgłębienia; 
	R = promień indentora; oraz 
	δ = głębokość wgłębienia. 
	Wyraź wszystkie wielkości po prawej stronie w jednostkach SI, aby otrzymać E w Pa.
	<ol>
		<li>Oblicz współczynnik korekcyjny c w następujący sposób3: 
		<img alt="Równanie równowagi statycznej; złożony wzór; zastosowanie edukacyjne i badawcze" src="/files/ftp_upload/57797/57797eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 2"> 
		Gdzie: 
		<img alt="Równanie χ dla analizy równowagi statycznej; wzór zawiera R, δ, h; koncepcja matematyczna." src="/files/ftp_upload/57797/57797eq3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 3"> 
		<img alt="Równanie współczynnika aerodynamicznego; wzór: a = -(1.2876-1.4678v+1.3442v^2)/(1-v)." src="/files/ftp_upload/57797/57797eq4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 4">; oraz 
		<img alt="Równanie do obliczania \(b\) w mechanice materiałów; b jako funkcja v; zawiera wzór matematyczny." src="/files/ftp_upload/57797/57797eq5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 5">. 
		Należy zauważyć, że ten współczynnik korekcyjny powinien być stosowany wyłącznie wtedy, gdy miękki silikon dobrze przylega do znajdującej się pod nim szalki Petriego (lub sztywnego silikonu), co ma miejsce w tym przypadku.</li>
		<li>Oblicz wysokość h warstwy miękkiego silikonu na podstawie ilości dodanego silikonu i średnicy szalki Petriego. Alternatywnie wyznacz h bezpośrednio, określając współrzędną z górnej i dolnej powierzchni warstwy silikonu za pomocą obrazowania fazowego (drobne zanieczyszczenia stają się widoczne na obu powierzchniach). Zauważ, że dla dużego h (h2 &gt; Rδ), współczynnik korekcyjny c jest bliski 1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powtórz kroki 4.1 - 4.4 dla każdego indentora. Wyznacz średnią z modułów Younga otrzymanych dla każdego indentora, aby uzyskać średni moduł Younga dla próbki silikonu.</li>
</ol>

<ol><li>Handorf, A. M., Zhou, Y., Halanski, M. A., Li, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+stiffness+dictates+development%2C+homeostasis%2C+and+disease+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Organogenesis%22%5BJournal%5D)">Tissue stiffness dictates development, homeostasis, and disease progression.</a> Organogenesis. 11 (1), 1-15 (2015).</li>
<li>Pelham, R. J., Wang, Y. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+locomotion+and+focal+adhesions+are+regulated+by+substrate+flexibility%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (25), 13661-13665 (1997).</li>
<li>Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+movement+is+guided+by+the+rigidity+of+the+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Cell movement is guided by the rigidity of the substrate.</a> Biophysical Journal. 79, 144-152 (2000).</li>
<li>Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+cells+feel+and+respond+to+the+stiffness+of+their+Substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue cells feel and respond to the stiffness of their Substrate.</a> Science. 310, 1139-1143 (2005).</li>
<li>Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyacrylamide+hydrogels+for+cell+mechanics%3A+steps+toward+optimization+and+alternative+uses%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses.</a> Methods in Cell Biology. 83, 29-46 (2007).</li>
<li>Johnston, I. D., McCluskey, D. K., Tan, C. K. L., Tracey, M. C. <a target="_blank" href="http://iopscience.iop.org/article/10.1088/0960-1317/24/3/035017/meta">Mechanical characterization of bulk Sylgard 184 for microfluidics and microengineering.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 24 (3), 035017(2014).</li>
<li>Style, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+force+microscopy+in+physics+and+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Traction force microscopy in physics and biology.</a> Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).</li>
<li>Lee, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+the+cytoplasmic+domain+of+N-cadherin+reduces%2C+but+does+not+eliminate%2C+traction+force-transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Deletion of the cytoplasmic domain of N-cadherin reduces, but does not eliminate, traction force-transmission.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 478 (4), 1640-1646 (2016).</li>
<li>Frey, M. T., Engler, A., Discher, D. E., Lee, J., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopic+methods+for+measuring+the+elasticity+of+gel+substrates+for+cell+culture%3A+microspheres%2C+microindenters%2C+and+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microscopic methods for measuring the elasticity of gel substrates for cell culture: microspheres, microindenters, and atomic force microscopy.</a> Methods Cell Biol. 83, 47-65 (2007).</li>
<li>Lee, D., Rahman, M. M., Zhou, Y., Ryu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+confocal+microscopy+indentation+method+for+hydrogel+elasticity+measurement%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional confocal microscopy indentation method for hydrogel elasticity measurement.</a> Langmuir. 31 (35), 9684-9693 (2015).</li>
<li>Dimitriadis, E. K., Horkay, F., Maresca, J., Kachar, B., Chadwick, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+elastic+moduli+of+thin+layers+of+soft+material+using+the+atomic+force+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Determination of elastic moduli of thin layers of soft material using the atomic force microscope.</a> Biophysical Journal. 82 (5), 2798-2810 (2002).</li>
<li>Hertz, H. <a target="_blank" href="https://www.degruyter.com/view/j/crll.1882.issue-92/crll.1882.92.156/crll.1882.92.156.xml">Über die Berührung fester elastischer Körper.</a> Journal für die reine und angewandte Mathematik. 92, 156-171 (1882).</li>
<li>Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Théry, M., Piel, M. Protein micropatterns: a direct printing protocol using deep UVs. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0091679X10970088">Microtubules: In Vivo</a>. Cassimeris, L., Tran, P. , Academic Press. Burlington, San Diego. 133-146 (2010).</li>
<li>Bashirzadeh, Y., Qian, S., Maruthamuthu, V. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0924424717321118">Non-intrusive measurement of wall shear stress in flow channels.</a> Sensors and Actuators A: Physical. 271, 118-123 (2018).</li>
<li>Muhamed, I., Chowdhury, F., Maruthamuthu, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+tools+to+study+cellular+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineering+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Biophysical tools to study cellular mechanotransduction.</a> Bioengineering (Basel). 4 (1), 12(2017).</li>
<li>Dumbali, S. P., Mei, L., Qian, S., Maruthamuthu, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+sheet-averaged+tension+within+a+large+epithelial+cell+colony%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Endogenous sheet-averaged tension within a large epithelial cell colony.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 139 (10), 101008(2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Chociaż metoda wgłębiania kuli jest łatwa do wdrożenia, należy zwrócić szczególną uwagę na wybór wgłębnika i grubość próbki miękkiego silikonu. Równanie użyte do obliczenia modułu Younga jest ważne w zestawie warunków11i są one zwykle spełnione, gdy grubość próbki silikonu wynosi > 10% promienia wgłębienia i < ~13x promień wgłębienia. Stwierdziliśmy, że grubość silikonu 5 - 10x promień wgłębienia była dobrym wyborem, przy czym grubość próbki nie jest zbyt duża (tj. obiektywna odległość ro...

Komórki w tkankach miękkich znajdują się w mikrośrodowisku, którego sztywność mieści się w zakresie kilopaskalów1, w przeciwieństwie do naczyń z kultur tkankowych, których sztywność jest o kilka rzędów wielkości większa. Wczesne eksperymenty z komórkami na miękkich podłożach pokrytych białkiem macierzy zewnątrzkomórkowej wykazały, że sztywność podłoża wpływa na to, jak komórki poruszają się, a także przylegają do macierzy zewnątrzkomórkowej poniżej2,3. W rzeczywistości sztywność podłoża zasadniczo wpływa na funkcję komórki4 w sposób podobny do wszechobecnych sygnałów biochemicznych. Żele poliakrylamidowe (pokryte białkami macierzy zewnątrzkomórkowej) to (przenikające wodę) hydrożele, które są szeroko stosowane jako substraty do hodowli komórkowych w badaniach mechanobiologicznych5. Polidimetylosiloksan (PDMS), najpowszechniejszy silikon (polisiloksan), jest szeroko stosowany jako sztywny silikon o sztywności megapaskalowej do produkcji w skali mikronów6. Ostatnio miękkie podłoża silikonowe o sztywności w bardziej fizjologicznie istotnym zakresie kilopaskali zostały wykorzystane jako substraty do hodowli komórkowych w badaniach mechanobiologicznych7,8.
Do pomiaru sztywności elastycznych podłoży użyto kilku metod, w tym mikroskopii sił atomowych, makroskopowej deformacji całych próbek podczas rozciągania, reologii i wgłębień za pomocą kulek i sferycznie zakończonych mikroindentorów9. Chociaż każda technika ma swoje zalety i wady, wgłębienie za pomocą kuli jest szczególnie prostą, ale dość dokładną metodą, która wymaga jedynie dostępu do szerokokątnego mikroskopu fluorescencyjnego. Wgłębienie za pomocą metalowej kuli zostało użyte do zmierzenia sztywności hydrożeli we wcześniejszych pracach3,9,10. Wczesne prace, które wykazały znaczenie sztywności substratu dla ruchu komórki, wykorzystały tę metodę do określenia sztywności podłoża hydrożelowego3. Ostatnio mikroskopia konfokalna została również wykorzystana do eleganckiej charakteryzacji10.
Tutaj prezentujemy krok po kroku protokół przygotowania miękkiego podłoża silikonowego, sprzężenia fluorescencyjnych koralików (i białka macierzy zewnątrzkomórkowej, takiego jak kolagen I) tylko z górną powierzchnią, obrazowania kuli z wcięciem i górnej powierzchni za pomocą odpowiednio obrazowania fazowego i fluorescencyjnego, a na koniec analizujemy obrazy w celu obliczenia modułu Younga podłoża silikonowego. Tak przygotowane miękkie podłoże silikonowe może być z łatwością wykorzystane do eksperymentów z mikroskopią siły pociągowej. Zastosowanie sztywnego silikonu (zamiast szalki Petriego) jako bazy dla miękkiego silikonu umożliwia również badania mechanobiologiczne z wykorzystaniem zewnętrznego rozciągania. Tam, gdzie jest to uzasadnione, wskazuje się również względy praktyczne niezbędne do uniknięcia ewentualnych powikłań.

<table><tbody><tr><td>CY 52-276 A/B zestaw elastomeru silikonowego</td><td>&nbsp; Dow Corning</td><td>CY 52-276</td><td>Przechowywać w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Pierce EDC</td><td>Fisher Scientific PI22980</td><td></td><td>Przechowywać w temperaturze -20&deg; C</td></tr><tr><td>Thermo Naukowy&nbsp; Środek sieciujący Pierce Sulfo-NHS</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-24510</td><td>Sklep pod adresem 4&deg; C</td></tr><tr><td>Karboksylowe fluorescencyjne różowe cząstki, 0,4-0,6 i mikro; m, 2 ml</td><td>Spherotech, Inc.</td><td>CFP-0558-2</td><td>Przechowywać w 4&deg; C, nie zamrażać</td></tr><tr><td>1,0 mm Koraliki cyrkonowe myte kwasem</td><td>OPS Diagnostics LLC</td><td>BAWZ 1000-250-33</td><td></td></tr><tr><td>Głęboka komora UV z odsysaczem ozonu</td><td>Novascan Technologies, Inc.</td><td>PSD-UV4, OES-1000D</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny szerokokątny</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMi8</td><td></td></tr><tr><td>Collagen I, z ogona szczura</td><td>Corning</td><td>354236</td><td>Stężenie zapasów = 4 mg/ml; przechowywać w 4&deg; C</td></tr><tr><td>ImageJ-NIH</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>oprogramowanie w domenie publicznej</td></tr></tbody></table>

pomiar sztywności miękkich podłoży silikonowych do badań mechanobiologicznych przy użyciu szerokokątnego mikroskopu fluorescencyjnego

Stiffness Measurement of Soft Silicone Substrates for Mechanobiology Studies Using a Widefield Fluorescence Microscope

Tkanki miękkie w ludzkim ciele zazwyczaj mają sztywność w zakresie kilopaskali (kPa). W związku z tym udowodniono, że elastyczne substraty silikonowe i hydrożelowe są użytecznymi substratami do hodowli komórek w fizycznym mikrośrodowisku, które częściowo naśladuje warunki in vivo. W tym miejscu przedstawiamy prosty protokół charakterystyki modułów Younga izotropowych liniowych substratów sprężystych zwykle stosowanych w badaniach mechanobiologicznych. Protokół polega na przygotowaniu miękkiego podłoża silikonowego na szalce Petriego lub sztywnym silikonie, pokryciu górnej powierzchni podłoża silikonowego koralikami fluorescencyjnymi, użyciu kuli w skali milimetrowej do wcięcia górnej powierzchni (grawitacyjnie), obrazowaniu koralików fluorescencyjnych na wciętej powierzchni silikonu za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i analizie wynikowych obrazów w celu obliczenia modułu Younga podłoża silikonowego. Sprzężenie górnej powierzchni substratu z modułami białka macierzy zewnątrzkomórkowej (oprócz kulek fluorescencyjnych) pozwala na łatwe wykorzystanie substratu silikonowego do posiewu komórek i późniejszych badań z wykorzystaniem eksperymentów z mikroskopią sił trakcyjnych. Zastosowanie sztywnego silikonu, zamiast szalki Petriego, jako bazy miękkiego silikonu, umożliwia zastosowanie badań mechanobiologicznych obejmujących rozciąganie zewnętrzne. Szczególną zaletą tego protokołu jest to, że szerokokątny mikroskop fluorescencyjny, który jest powszechnie dostępny w wielu laboratoriach, jest głównym sprzętem niezbędnym do tej procedury. Demonstrujemy ten protokół, mierząc moduł Younga miękkich podłoży silikonowych o różnych modułach sprężystości.

Korzystając z protokołu opisanego powyżej, przygotowaliśmy miękki silikon w 35 mm szalce Petriego, utwardziliśmy go w temperaturze 70 °C przez 30 min, a następnie przyłączyliśmy fluorescencyjne mikrokulki (oraz kolagen I) do górnej powierzchni, zgodnie ze schematem przedstawionym na Rysunku 1. Promieniowanie Deep UV było wcześniej stosowane do docelowego przyłączania białek do podłoży13. Należy zauważyć, że (I) zastosowane tutaj wa...

Substraty o sztywności w zakresie kilopaskali są przydatne do badania reakcji komórek na fizjologicznie istotną sztywność mikrośrodowiska. Za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego o szerokim polu widzenia można określić moduł Younga miękkich żeli silikonowych za pomocą wgłębienia z odpowiednią kulą.

Pomiar sztywności miękkich podłoży silikonowych do badań mechanobiologicznych przy użyciu szerokokątnego mikroskopu fluorescencyjnego

Soft tissues in the human body typically have stiffness in the kilopascal (kPa) range. Accordingly, silicone and hydrogel flexible substrates have been ...

Metoda ta może być wykorzystana do kategoryzacji substratów wykorzystywanych do badania kluczowych zjawisk w mechanobiologii, migracji komórek i pierwszej generacji. Główną zaletą tej techniki jest to, że wymaga ona użycia mikroskopu szerokokątnego, czyli sprzętu powszechnie dostępnego w wielu laboratoriach. Metodę tę można zastosować do pomiaru modułu Younga żelu krzemowego lub poliakrylamidowego, a także dowolnego miękkiego izotropowego liniowego materiału sprężystego.Tak przygotowane i scharakteryzowane tą metodą podłoże może być również wykorzystane do eksperymentów samorozciągających ze sztywną bazą silikonową. Aby wytworzyć miękkie podłoże silikonowe po odważeniu około 1,75 grama każdego ze składników A i B z zestawu miękkiego elastomeru silikonowego, dodaj większość zważonej porcji składnika A do tacki wagowej z polistyrenu składnika B i użyj odpowiedniego aplikatora w sztyfcie, aby wymieszać oba składniki razem przez pięć minut. Przenieś mieszaninę na 35-milimetrową szalkę Petriego i pozwól substratowi równomiernie rozprowadzić się na szalce Petriego przez kilka minut.Następnie umieść szalkę Petriego w komorze próżniowej na 15 minut, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza i podgrzej płytę grzejną. Gdy płyta grzejna osiągnie 70 stopni Celsjusza, umieść szklane szkiełko na płycie grzejnej i umieść szalkę Petriego na szklanej stronie. Następnie pozwól silikonowi utwardzić się w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez 30 minut.Aby połączyć miękki silikon z koralikami fluorescencyjnymi, umieść utwardzony silikon w głębokiej komorze UV, w odległości od pięciu do dziesięciu centymetrów od lampy UV i wystaw próbkę na działanie głębokiego światła UV przez pięć minut. Podczas obróbki silikonu rozpuść 19 miligramów EDC w 500 mikrolitrach dejonizowanej wody w 1,5-mililitrowej probówce do mikrowirówki. I przekręć rurkę, aby rozpuścić substancję chemiczną.Następnie dodaj 500 mikrolitrów wody dejonizowanej do 11 miligramów sulfo-NHS w drugiej 1,5 mililitrowej probówce. I wir, aby rozpuścić substancję chemiczną. Następnie połącz roztwory EDC i sulfo-NHS w jedną probówkę do mikrowirówki.Teraz dodaj 30 mikrolitrów odpowiedniej zawiesiny mikrokulek modyfikowanych karboksylanem fluoro-4 i 0,02 miligrama kolagenu 1 z ogona szczura do mieszaniny. Po krótkim wirowaniu umieść kawałek Parafilmu na pokrywie drugiej pokrywki o mniejszej średnicy i przenieś jeden mililitr mieszaniny EDC-NHS Bead Collagen 1 do Parafilmu. Odwrócić szalkę Petriego zawierającą miękki silikon nad mieszanką, podtrzymując szalkę z obu stron dwoma szklanymi szkiełkami, tak aby miękka silikonowa powierzchnia stykała się z roztworem kulki bez bezpośredniego dotykania powierzchni pokrywki o mniejszej średnicy poniżej.Następnie przykryj próbkę folią aluminiową na 30 minut w temperaturze pokojowej, przed dwukrotnym umyciem silikonu dwoma mililitrami PBS na pranie i pozwól silikonowi utwardzić się pionowo w dwóch mililitrach świeżego PBS w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Następnego ranka użyj spiczastej pęsety, aby udrapować pięciomilimetrowe wgłębienia w kształcie kuli cyrkonowej na miękkim silikonie pod co najmniej jednym mililitrem PBS w odległości co najmniej jednego mililitra PBS od krawędzi warstwy silikonu i co najmniej pięciu średnic wgłębień od lokalizacji innych wgłębników. Następnie umieść miskę z miękkiego silikonu na stoliku mikroskopu szerokokątnego i użyj obiektywu 10x, aby uzyskać obraz fazowy całego wgłębienia bez widocznych wad.Po zapisaniu obrazu wybierz odpowiedni kanał fluorescencyjny do wizualizacji mikrokulek fluorescencyjnych. Gdy środek wgłębu znajduje się w pobliżu prawej krawędzi ramki, zmniejszaj współrzędne z, aż fluorescencyjne mikrokulki pod środkiem wgłębnika sfery staną się nieostre. Następnie należy uzyskać stos Z z obrazem dla każdego przyrostu Z o 0,5 mikrometra, aż mikrokulki w górnej warstwie silikonu w pobliżu lewej krawędzi ramki obrazowania wejdą do środka, a następnie staną się nieostre.Aby obliczyć sztywność silikonu, najpierw otwórz obraz fazy wgłębu w ImageJ i kliknij Analizuj i ustaw skalę oraz sprawdź jednostkę długości, aby potwierdzić, że długość jest ustawiona na piksele. Korzystając z narzędzia linia, kliknij i przytrzymaj punkt na krawędzi wcięcia, przesuwając kursor do punktu na diametralnie przeciwnej krawędzi, aby zmierzyć średnicę wgłębienia i zanotuj długość w pikselach na pasku stanu głównego okna ImageJ przed zwolnieniem kursora. Następnie otwórz menu plik i wybierz opcję importuj sekwencję obrazów, aby umożliwić wybranie obrazu w stosie z fluorescencyjnych obrazów mikrokulek i kliknij OK, aby otworzyć stos.Korzystając z narzędzia linia, narysuj linię w poprzek dobrze zdefiniowanego mikrokoralika na jednym obrazie i kliknij przycisk Analizuj profil wydruku na żywo, aby uzyskać zaktualizowaną intensywność skanowania linii w poprzek ściegu, zaznaczając różne ramki. Klatka, która daje najwyższą wartość maksymalnej intensywności, może być następnie wybrana jako klatka, na której ustawiona jest ostrość. Obrazy fluorescencyjne mikrokulek na górnej powierzchni silikonu, wykonane w pozycji ramki x-y, umieszczają obszar pod wgłębnikiem po prawej stronie ramki.Region po lewej stronie ramki jest następnie wybierany jako obszar oddalony od wgłębnika. W tym reprezentatywnym zestawie skanów linii intensywności mierzonych na pojedynczym mikrokuli, ostrość zmienia się w krokach co 0,5 mikrometra. Wartość Z odpowiadająca ostremu obrazowi może być następnie obiektywnie wybrana na podstawie wartości Z odpowiadającej skanowaniu liniowemu o najwyższej maksymalnej intensywności.W tym przypadku moduł Younga silikonu dla różnych proporcji mieszaniny składników A:B został uzyskany w oparciu o metodę, jak pokazano poniżej. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować miękkie podłoża silikonowe, przyłożyć do nich koraliki fluorescencyjne i zmierzyć sztywność podłoża za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego o szerokim polu widzenia.

stiffness-measurement-soft-silicone-substrates-for-mechanobiology

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Przedstawiamy dwa niezależne narzędzia oparte na mikroskopii, służące do pomiaru indukowanych odkształceń jądra i cytoszkieletu w pojedynczych, żywych komórkach przylegających w odpowiedzi na globalne lub lokalne przyłożenie naprężenia. Techniki te są wykorzystywane do określenia sztywności jądra (tj. odkształcalności) oraz do badania wewnątrzkomórkowej transmisji sił pomiędzy jądrem a cytoszkieletem.

Analizy biofizyczne służące do badania właściwości mechanicznych interfazy jądra komórkowego: aplikacja odkształcenia podłoża i manipulacja mikroiłką

W niniejszej pracy opisujemy szybką i prostą metodę pomiaru sztywności komórek. Ogólna zasada tego podejścia polega na pomiarze deformacji błony w odpowiedzi na ściśle określone podciśnienie przyłożone do powierzchni komórki za pomocą mikropipety. Metoda ta stanowi potężne narzędzie do badania właściwości biomechanicznych komórek przytwierdzonych do podłoża.

Aspiracja mikropipetą komórek przytwierdzonych do podłoża w celu oszacowania sztywności komórek

Ten artykuł demonstruje protokół charakteryzujący właściwości mechaniczne żywych komórek za pomocą mikrowgłębienia za pomocą mikroskopu sił atomowych (AFM).

Pomiar właściwości mechanicznych żywych komórek za pomocą mikroskopii sił atomowych

Tutaj opisana jest metoda, która umożliwia szybkie, efektywne i niedrogie przygotowanie żeli poliakrylamidowych w formacie wielodołkowej płytki. Metoda nie wymaga specjalistycznego sprzętu i może być z łatwością zaadoptowana przez każde laboratorium badawcze. Byłoby to szczególnie przydatne w badaniach skoncentrowanych na zrozumieniu odpowiedzi komórek zależnych od sztywności.

Prosty test sztywności wielodołkowej na bazie poliakrylamidu do badania odpowiedzi komórek zależnych od sztywności

Nowatorski protokół obrazowania został opracowany przy użyciu niestandardowego mechanicznego siłownika napędzanego silnikiem, aby umożliwić pomiar reakcji w czasie rzeczywistym na mechaniczne naprężenia w żywych komórkach. Istotny z punktu widzenia mechanobiologii system może nanosić szczepy do 20%, umożliwiając jednocześnie obrazowanie w czasie zbliżonym do rzeczywistego za pomocą mikroskopii konfokalnej lub mikroskopii sił atomowych.

Obrazowanie żywych komórek podczas rozciągania mechanicznego

Przedstawiamy szczegółowe protokoły izolacji aort od myszy i pomiaru ich modułu sprężystości za pomocą mikroskopii sił atomowych.

Pomiar sztywności mysich aort ex vivo za pomocą mikroskopii sił atomowych

Korzystając z wcześniej zaprojektowanego urządzenia do mechanicznego obciążania przylegających komórek, ten artykuł opisuje przeprojektowaną geometrię podłoża i dostosowane urządzenie do obrazowania pojedynczych komórek w wysokiej rozdzielczości z obiektywem 100x zanurzenia w olejku.

Obrazowanie dynamiki jądrowej w wysokiej rozdzielczości w żywych komórkach pod wpływem jednoosiowego odkształcenia rozciągającego

Niedawno zidentyfikowaliśmy usztywnienie naczyń włosowatych siatkówki jako nowy paradygmat dysfunkcji siatkówki związanej z cukrzycą. W protokole tym omówiono etapy izolacji naczyń włosowatych siatkówki myszy i macierzy podśródbłonkowej z kultur śródbłonka siatkówki, a następnie opisano technikę pomiaru sztywności za pomocą mikroskopii sił atomowych.

Izolacja naczyń włosowatych siatkówki myszy i macierzy podśródbłonkowej do pomiaru sztywności za pomocą mikroskopii sił atomowych

Tutaj prezentujemy wszechstronne urządzenie do rozciągania równoosiowego, które jest uruchamiane pneumatycznie i kompatybilne z mikroskopią o wysokiej rozdzielczości.

Równoosiowe urządzenie rozciągające do konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek o dużym powiększeniu

Samoorganizujące się monowarstwy (SAMs) utworzone z długołańcuchowych alkanotioli na złocie stanowią precyzyjnie zdefiniowane podłoża do tworzenia wzorów białkowych oraz ograniczania przestrzeni wzrostu komórek. Mikro kontaktowy druk heksadekanotiolu przy użyciu stempla z polidimetylosiloksanu (PDMS), a następnie wypełnienie wolnych przestrzeni monomerem alkanotiolu zakończonym grupą glikolową, pozwala na uzyskanie wzoru, w którym białka i komórki adsorbują wyłącznie do obszaru z nadrukowanym...

Tworzenie dwuwymiarowych wzorowanych podłoży do ograniczania przestrzeni białek i komórek

Poznaj metodę pomiaru modułu Younga miękkich żeli silikonowych przy użyciu szerokokątnego mikroskopu fluorescencyjnego. Technika ta umożliwia badanie odpowiedzi komórkowych na sztywność podłoża w mechanobiologii.

Pomiar sztywności miękkich podłoży silikonowych do badań mechanobiologicznych przy użyciu szerokokątnego mikroskopu fluorescencyjnego (Wideo) | JoVE Journal

Pomiar sztywności miękkich podłoży silikonowych do badań mechanobiologicznych przy użyciu szerokokątnego mikroskopu fluorescencyjnego

Przeglądaj więcej filmów