Name: Definiowanie regulowanej przez redoks aktywności chaperonu Hsp33 i mapowanie zmian konformacyjnych na Hsp33 przy użyciu spektrometrii mas wymiany wodorowo-deuterowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Poznaj metodę badania aktywności chaperonu Hsp33 podczas stresu oksydacyjnego przy użyciu spektrometrii mas HDX-MS. Technika ta pozwala analizować zmiany konformacyjne białek i zapobiegać ich agregacji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy są wdzięczni Meytal Radzinski za jej pomocne dyskusje i krytyczne przeczytanie artykułu, a także Patrickowi Griffinowi i członkom jego laboratorium za ich nieograniczoną pomoc podczas tworzenia platformy analizy HDX. Autorzy są wdzięczni Fundacji Niemiecko-Izraelskiej (I-2332-1149.9/2012), Binational Science Foundation (2015056), grantowi integracyjnemu Marie-Curie (618806), Izraelskiej Fundacji Naukowej (1765/13 i 2629/16) oraz Human Frontier Science Program (CDA00064/2014) za wsparcie finansowe.

1. Przygotowanie w pełni zredukowanych i w pełni utlenionych białek
<ol>
	<li>Przygotowanie w pełni zredukowanego białka 
	Uwaga: Tutaj opisujemy redukcję białka zawierającego i używamy roztworu ZnCl2 do przywrócenia zredukowanego stanu białka z włączeniem Zn. Roztwór ZnCl2 można wymienić lub wyrzucić. Należy zauważyć, że czas i temperatura procesu redukcji zależy od stabilności i funkcji białka, a zatem jest specyficzna dla każdego białka.
	<ol>
		<li>Rozmrozić próbkę białka na lodzie i odwirować ją w celu usunięcia kruszyw. Inkubować próbkę przez co najmniej 1,5 godziny w temperaturze 37 °C przy użyciu 5 mM DTT i 20 μM ZnCl2 (do 70% stężenia białka). 
		UWAGA: Temperatura na tym etapie jest zależna od białka i powinna być dostosowana do stabilności białka.</li>
		<li>Usuń naziemną telewizję cyfrową za pomocą kolumn odsalających. 
		UWAGA: Dostępne są różne kolumny odsalające. Poniższy protokół opisuje procedurę z wykorzystaniem określonych kolumn odsalających (patrz tabela materiałów). Przed użyciem innych kolumn odsalających zalecamy zbadanie ich skuteczności usuwania DTT i odzyskiwania białka, ponieważ niektóre kolumny odsalające mogą częściowo wchłonąć interesujące nas białko.
		<ol>
			<li>Zrównoważyć kolumnę buforem fosforanu potasu (KPi) (40 mM, pH 7,5), wypełniając kolumnę całkowicie buforem i pozwalając buforowi wypłynąć. Powtórz ten proces 2x.</li>
			<li>Wyjmij biały filtr krążkowy z kolumny, delikatnie dociskając go pęsetą i wyjmując; najłatwiej jest go wyjąć, gdy kolumna jest wypełniona buforem KPi. Ponownie napełnić kolumnę buforem KPi i odwirować ją przy 1 000 x g przez 3 minuty.</li>
			<li>Przenieść kolumnę do czystej probówki, powoli dodać próbkę białka do środka kolumny i odwirować ją przy 1 000 x g przez 2 minuty. Białko wolne od DTT znajduje się teraz w przepływie.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Sprawdź jego stężenie (np. użyj spektrometru UV/Vis) i zmierz jego absorbancję przy 280 nm. Oblicz stężenie białka za pomocą prawa Beera.</li>
		<li>Podzielić połowę próbek białka na podwielokrotności. Inkubować podwielokrotności w warunkach beztlenowych (np. w komorze beztlenowej) przez 20 minut w celu całkowitego usunięcia tlenu. Szczelnie zamknąć probówki folią z tworzywa sztucznego i przechowywać próbki w temperaturze -20 °C lub -80 °C, w zależności od zawartości białka. 
		UWAGA: Zamiast korzystać z komory beztlenowej, rurki można również flashować argonem w celu usunięcia tlenu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie w pełni utlenionego białka 
	UWAGA: Zaleca się przygotowanie utlenionych próbek białek z całkowicie zredukowanych białek (opisanych wcześniej). Zmniejszy to niejednorodność stopni utlenienia cystein. Możliwe jest stosowanie różnych odczynników utleniających; tutaj skupiamy się na nadtlenku wodoru (H2O2). 
	UWAGA: Unikaj nadmiernego utleniania, ponieważ może to prowadzić do niepożądanych wewnątrzcząsteczkowych wiązań dwusiarczkowych i nieodwracalnego utleniania różnych aminokwasów, w tym cysteiny, metioniny, tyrozyny i innych.
	<ol>
		<li>Do pozostałej próbki białka dodać 5 mM H2O2 (świeżo rozcieńczonej) i inkubować przez 3 godziny w temperaturze 40 °C, wstrząsając. 
		UWAGA: Temperatura na tym etapie jest zależna od białka i powinna być dostosowana do stabilności białka.</li>
		<li>Zrównoważyć kolumnę z buforem KPi (40 mM, pH 7,5), wypełniając kolumnę całkowicie buforem i pozwalając, aby bufor wypłynął. Powtórz ten proces 2x.</li>
		<li>Wyjmij biały filtr krążkowy z kolumny, delikatnie dociskając go pęsetą i wyjmując; najłatwiej jest go wyjąć, gdy kolumna jest wypełniona buforem KPi.</li>
		<li>Ponownie napełnić kolumnę buforem KPi i odwirować ją przy 1 000 x g przez 3 minuty.</li>
		<li>Przenieść kolumnę do czystej probówki, powoli dodać utlenioną próbkę białka do środka kolumny i odwirować ją przy 1000 x g przez 2 minuty; utlenione białko znajduje się teraz w przepływie.</li>
		<li>Sprawdzić stężenia białek jak w kroku 1.2.5, podzielić utlenione białka na podwielokrotności i przechowywać je w temperaturze -20 °C lub -80 °C, w zależności od białka.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Test agregacji rozpraszania światła
Uwaga: Wszystkie stężenia w tym teście są specyficzne dla białka opiekuńczego i substratu i powinny być skalibrowane. Wszystkie powinny być filtrowane 0,22 μm, ponieważ niezwykle ważne jest, aby były wolne od jakichkolwiek cząstek lub pęcherzyków powietrza, a kuwety były czyste i wolne od kurzu. Bardzo ważne jest, aby używać mieszadła umieszczonego w kuwecie kwarcowej. Sprawdź różne rozmiary i kształty mieszadeł, aby zapewnić skuteczne wymieszanie całego roztworu bez wytwarzania niepożądanych pęcherzyków powietrza. Ponadto w laboratoriach i obiektach dostępne są różne flouorospektrometry. W tym przypadku użyto specjalnego fluorospektrometru (patrz tabela materiałów). Różne instrumenty mają różną czułość, prędkość pomiaru i parametry samplera. W związku z tym dokładne parametry pomiarowe (np. szerokość pasma emisji i wzbudzenia, czułość i inne) powinny być zoptymalizowane przy użyciu znanego białka podatnego na agregację i odpowiadających mu warunków. Zaleca się stosowanie syntazy cytrynianu (CS) i/lub lucyferazy jako początkowych substratów w stężeniach nanomolowych.
<ol>
	<li>Test agregacji chemicznej
	<ol>
		<li>Przygotować denaturowany substrat przez inkubację 12 μM CS przez noc w 40 mM HEPES (pH 7,5) i 4,5 M GdnCl. Aby zachować pH, rozpuść GdnCl w 40 mM HEPES (pH 7,5).</li>
		<li>Otwórz oprogramowanie fluorospektrometru i przejdź do Pomiar przebiegu czasu. Ustaw parametry na: Temperatura: 25 °C; λem: 360; Szerokość pasma Em: 5 nm; λex: 360; Szerokość pasma Ex: 2,5 nm; i Interwał danych: 0,5 s.</li>
		<li>Przygotować próbkę, dodając 1 600 μl 40 mM HEPES do kuwety kwarcowej. Włóż kuwetę do uchwytu na próbkę i pozwól próbce osiągnąć żądaną temperaturę.</li>
		<li>Ustaw mieszanie na 600 obr./min i rozpocznij pomiar, aż do ustalenia linii bazowej. Utrzymuj mieszanie przez cały pomiar.</li>
		<li>Aby zmierzyć agregację CS przy braku białka opiekuńczego, po 120 s pomiaru dodać (delikatnie, ale szybko) 10 μl denaturowanego CS (końcowe stężenie 75 nM). Kontynuuj pomiar przez 1,200 s.</li>
		<li>Aby zmierzyć agregację CS w obecności Hsp33, po 60 s pomiaru dodać Hsp33 (stężenie końcowe 300 nM). Po dodatkowych 60 s dodać 10 μl denaturowanego CS (końcowe stężenie 75 nM). Kontynuuj pomiar przez 1 200 s. 
		UWAGA: Podczas dodawania substratu lub białka opiekuńczego, aby uniknąć wprowadzania pęcherzyków, należy użyć pipety o pojemności 10 μl.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test agregacji termicznej 
	UWAGA: Temperatura testu agregacji termicznej zależy od stabilności białka i powinna być dostosowana do każdego białka niezależnie.
	<ol>
		<li>Otwórz oprogramowanie fluorospektrometru i przejdź do Pomiar przebiegu czasu. Ustaw parametry w następujący sposób: Temperatura: 43 °C; λem: 360; Szerokość pasma emisji: 5 nm; λex: 360; Szerokość pasma wzbudzenia: 2,5 nm; i Interwał danych: 0,5 s.</li>
		<li>Przygotować próbkę, dodając 1 600 μl wstępnie ogrzanego 40 mM HEPES do kuwety kwarcowej. Włożyć kuwetę do uchwytu na próbkę i pozwolić, aby próbka osiągnęła temperaturę 43 °C.</li>
		<li>Ustaw mieszanie na 600 obr./min i rozpocznij pomiar, aż do ustalenia linii bazowej. Utrzymuj mieszanie przez cały pomiar.</li>
		<li>Aby zmierzyć agregację CS przy braku białka opiekuńczego, po 120 s pomiaru, delikatnie dodać CS (końcowe stężenie 125 nM) i kontynuować pomiar przez 1,200 s.</li>
		<li>Aby zmierzyć agregację CS w obecności Hsp33, po 60 s pomiaru, dodać Hsp33 (końcowe stężenie 600 nM). Po dodatkowych 60 s dodać CS (końcowe stężenie 125 nM). Kontynuuj pomiar przez 1 200 s. 
		UWAGA: Podczas dodawania substratu lub białka opiekuńczego należy unikać wkładania pęcherzyków powietrza.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza danych i usuwanie szumów przez Kfits 
	Uwaga: Kfits jest dostępny w użyciu Kfits został wcześniej opisany w Rimon et al.45
	<ol>
		<li>Prześlij plik danych. 
		UWAGA: Dane wejściowe to surowe wyniki pomiarów rozpraszania światła w formacie tekstowym rozdzielonym przecinkami lub tabulatorami.</li>
		<li>Aby usunąć wszelkie szumy, wybierz parametry analizy. Użyj najlepszego modelu automatycznego (zalecane), zaznacz Szum jest zawsze powyżej flagi sygnału.</li>
		<li>Ręcznie usuń oczywiste wartości odstające za pomocą zielonej i czerwonej regulowanej linii; ten krok przefiltruje szum powyżej zielonej linii i poniżej czerwonej linii.</li>
		<li>Ustaw linię bazową i krzywą dopasowania. Po zastosowaniu progu szumu pobierz przetworzone dane.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Spektrometria mas wymiany wodorowo-deuterowej
<ol>
	<li>Przygotowanie i próbek białek (kompleks Hsp33 i Hsp33-CS)
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć próbki białka do końcowego stężenia 1 mg/ml w 25 mM buforze Tris-HCl o pH 7,5 i przenieść je do fiolek o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Przygotować próbki kompleksu białko-substrat przez inkubację Hsp33 z CS w stosunku 1:1,5 w temperaturze 43 °C.
		<ol>
			<li>Dodawaj CS w sposób krokowy, aby uniknąć szybkiej agregacji i zapewnić owocne wiązanie między Hsp33 a termicznie rozłożonym CS.</li>
			<li>Stosować co najmniej cztery etapy (tj. za każdym razem dodać jedną czwartą końcowej objętości) i inkubować próbki przez 15 minut po każdym dodaniu, aby umożliwić ochronę CS przez Hsp33.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Usunąć wszelkie kruszywa za pomocą 30-minutowego wirowania w temperaturze 16 000 x g w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: Nowe kompleksy białkowo-substratowe muszą być przygotowywane na świeżo. Dodawanie substratu powinno odbywać się stopniowo; W przeciwnym razie nastąpi agregacja. Temperatura, podłoże i stężenia substratu są specyficzne dla białka.</li>
		<li>Przygotować bufor H (25 mM Tris-HCl, pH 7,5), który służy jako kontrola deuteracji, oraz bufor D (25 mM Tris-DCl, pH 7,09), który jest buforem deuteracyjnym. Przygotuj również świeży bufor hartowniczy (150 mM TCEP, 3 M GdnCl, 0,1% kwas mrówkowy). 
		UWAGA: Bufor wygaszający powinien być zoptymalizowany dla białka będącego przedmiotem zainteresowania, aby uzyskać maksymalne pokrycie jego sekwencji po trawieniu pepsyny.</li>
		<li>Przenieść wszystkie i próbki do fiolek i umieścić je w odpowiednich tacach. Przechowywać H i D w temperaturze 25 °C (taca 25 °C); z drugiej strony, próbki i bufor schładzający należy przechowywać w temperaturze 0 - 2 °C (taca 0 °C). Najpierw umieścić próbki w szklanych wkładkach o pojemności 150 μl (patrz tabela materiałów), a następnie przenieść je do fiolek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie instrumentu 
	UWAGA: Spektrometr masowy jest dostarczany z dwoma dołączonymi programami: jeden steruje pompami, a drugi steruje spektrometrem mas (patrz Tabela materiałów). Kolejne kroki zostaną opisane przy użyciu tych dwóch programów.
	<ol>
		<li>Ręcznie włącz wszystkie jednostki chłodzące. Gdy wszystkie systemy chłodzenia osiągną temperaturę docelową, ręcznie włącz zarówno wysokowydajną chromatografię cieczową (HPLC), jak i pompy podawcze. 
		UWAGA: W naszym przypadku składają się one z dwóch kąpieli chłodzących i komory chłodzącej (która zawiera pułapkę i kolumny analityczne). Jedna jednostka chłodząca chłodzi tacę w temperaturze 0 °C, podczas gdy druga utrzymuje tacę w temperaturze 25 °C; temperatura komory chłodzącej wynosi 1 - 2 °C.</li>
		<li>Otwórz oprogramowanie sterujące obiema pompami, jak również oprogramowanie sterujące spektrometrem masowym; upewnij się, że MS jest w trybie czuwania.</li>
		<li>Odłączyć zawór wylotowy HPLC od źródła MS i umyć układ najpierw roztworem "potrójnego środka czyszczącego" (1% kwas mrówkowy, 33% acetonitryl, 33% izopropanol, 33% metanol), następnie buforem B (80% acetonitrylu, 0,1% kwasu mrówkowego), a na końcu buforem A (0,1% kwas mrówkowy, pH 2,25), a następnie włożyć kolumnę pepsyny do układu. W przypadku wymiany należy oczyścić obie pompy przed kontynuowaniem.</li>
		<li>Upewnij się, że natężenie przepływu dla obu pomp wynosi 0,1 ml/min, a ciśnienie jest stabilne.</li>
		<li>Po umyciu układu przy stałym przepływie i stałym ciśnieniu, włóż wylot HPLC do źródła MS i włącz MS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Parametry spektrometru mas
	<ol>
		<li>Ustawić jonizację peptydową na jonizację elektronrozpylania (ESI) w temperaturze 175 °C, przepływ gazu w osłonie na 17, żarzenie gazu pomocniczego na 2, a napięcie rozpylania na 4,5 kV (rysunek uzupełniający 1).</li>
		<li>Ustaw parametry w następujący sposób dla próbek niedeuterowanych.
		<ol>
			<li>Ustaw parametry: Zakres skanowania m/z na 300 - 1500; Rozdzielczość do 70 000; Docelowy automatyczny regulator wzmocnienia (AGC) do 106; oraz maksymalny czas wstrzykiwania (IT) przy 100 ms. 
			UWAGA: 5 najbardziej intensywnych jonów o stanach naładowania od +2 do +6 (ich intensywność wyższa niż 1,3 x 104) i dynamicznym oknie 30 cali zostanie odizolowanych.</li>
			<li>Przeprowadź fragmentację jonów przez dysocjację zderzeniową o wyższej energii (HCD) w komórce wielokrotnego zderzenia ze znormalizowaną energią zderzenia (NCE) równą 28. Wykrywanie jonów fragmentacyjnych za pomocą tandemowych MS z rozdzielczością 35 000, celem AGC 105, maksymalnym IT przy 60 ms i oknem izolacji 2,0 m/z.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>W przypadku próbek deuterowanych należy stosować MS1 tylko o wyższej rozdzielczości 140 000 i innych podobnych parametrach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadzanie eksperymentu
	<ol>
		<li>Ustaw tace w następujący sposób.
		<ol>
			<li>Umieścić bufor H i D w podajniku o temperaturze 25 °C, a następnie umieścić próbki i bufor do gaszenia w zasobniku o temperaturze 0 °C.</li>
			<li>Umieść X pustych fiolek, wyrównanych na obu tacach, gdzie X = liczba próbek x liczba punktów czasowych. 
			UWAGA: W tacce o temperaturze 25 °C puste fiolki służą jako fiolki reakcyjne, a w tacce o temperaturze 0 °C służą jako fiolki do hartowania.</li>
			<li>Każda z pustych fiolek zawiera pustą szklaną wkładkę; wyrzuć i zastąp ją między eksperymentami. 
			UWAGA: W celu przeprowadzenia eksperymentu HDX w najbardziej efektywny i jak najmniej czasochłonny sposób, wykorzystano oprogramowanie, które pozwala na jednoczesne badanie próbek (rysunek uzupełniający 2). Kolejne kroki zostaną opisane przy użyciu tego oprogramowania.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Otwórz oprogramowanie. Skonfiguruj parametry programu, aby wykonać następujące czynności.
		<ol>
			<li>Inkubować każdą próbkę (5 μl) z 45 μl buforu D przez kilka minut, w zależności od wybranych punktów czasowych (np. 1, 3, 18, 40 i 100 min) w temperaturze 25 °C. Zamiast tego inkubować próbkę niedeuterowaną z 45 μl buforu H.</li>
			<li>Bezpośrednio po inkubacji wymieszać 50 μl deuterowanego białka z 50 μl lodowatego buforu hartującego i wstrzyknąć je do unieruchomionej kolumny pepsynowej (20 mm długości, 2,0 mm średnicy).</li>
			<li>Eluować wszelkie peptydy z kolumny pepsyny do kolumny wstępnej, przemłukując ją buforem A przez 6 minut z szybkością 50 μl/min. Przechowywać bufor A w komorze chłodzącej w temperaturze 0 °C.</li>
			<li>Wypłukać peptydy z kolumny wstępnej do kolumny analitycznej C18 (kolumna C18, 130 A, 1,7 μm, 2,1 mm x 50 mm, utrzymywane w temperaturze 0 °C) i rozdzielić je, stosując gradient liniowy acetonitrylu przy 100 μl/min. Uruchomić gradient acetonitrylu używając acetonitrylu 100% jako buforu B: 7 min przy 2%, 7 min przy 10 - 30%, 2,5 min przy 30 - 90%, 1,5 min przy 90%, szybkie nachylenie przez 1 min przy 90 - 8%, a na koniec wyrównaj kolumnę przez 4 min przy 2%.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zbuduj sekwencję biegową (patrz Dodatkowe <silna klasa="xfig">Rysunek 2): wprowadź wszystkie punkty czasowe, nazwy próbek i lokalizacje w zasobnikach, a także nazwy i lokalizacje. 
		UWAGA: Oprogramowanie umożliwia dostosowanie wszystkich różnych czasów pracy do programu, który uruchamia kilka próbek jednocześnie, skutecznie skracając czas działania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza danych 
	UWAGA: W procesie analizy danych pracujemy z kilkoma programami, w tym Proteome Discoverer i MaxQuant (darmowe oprogramowanie) do identyfikacji peptydów i analizy pokrycia sekwencji, a także HDX workbench, darmowym oprogramowaniem, które umożliwia analizę inkorporacji deuteru w białkach oraz porównanie szybkości HDX między różnymi zestawami eksperymentów. Kolejne kroki zostaną opisane przy użyciu tych programów.
	<ol>
		<li>Przeanalizuj pokrycie peptydowe próbki, przepuszczając niedeuterowane próbki kontrolne przez oprogramowanie (Dodatkowe <silna klasa = "xfig">Rysunek 3). Skonfiguruj oprogramowanie, korzystając z następujących parametrów.
		<ol>
			<li>Metodę Sequest HT należy stosować z nieenzymatycznym (niespecyficznym) rozszczepieniem. Poszukiwanie peptydów 4 - 144 aminokwasów o tolerancji masowej 7 ppm i 0,5 Da dla jonu i fragmentu prekursora. Pozwolić na dynamiczne utlenianie metioniny.</li>
			<li>Utwórz bazę danych dla białka, za pomocą której oprogramowanie może określić pokrycie peptydami. Eksportuj zidentyfikowane peptydy w formacie tekstowym.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przeanalizuj zdeuterowane wyniki za pomocą bezpłatnego oprogramowania HDX workbench58.
		<ol>
			<li>Otwórz edytor białek i zdefiniuj białko, wstawiając sekwencję białka i plik pokrycia peptydów.</li>
			<li>Następnie otwórz edytor kreatora eksperymentu instalacji i wprowadź wszystkie żądane dane wejściowe. 
			UWAGA: Program wymaga podania liczby próbek, liczby punktów czasowych, liczby powtórzeń, wartości pH i temperatury.</li>
			<li>Na koniec wprowadź parametry dotyczące użytego spektrometru mas, po czym program generuje listę wykrytych peptydów. 
			UWAGA: Oprogramowanie wykrywa peptydy "HDX", sprawdza klastry izotopowe i demonstruje wyraźną wizualizację deuteracji w próbkach.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Prezentacja danych
	<ol>
		<li>Oznacz regiony z deferentnym wychwytem deuteracyjnym na strukturze za pomocą oprogramowania PyMol lub dowolnego innego oprogramowania do wizualizacji.</li>
		<li>Wprowadzić poziomy wychwytu deuteru zamiast wartości współczynnika B. 
		Uwaga: Podstawowy samouczek można znaleźć na stronie https://pymolwiki.org/index.php/Practical_Pymol_for_Beginners.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym artykule przedstawiliśmy protokoły analizy aktywności opiekuńczej zależnej od redoks i charakterystyki zmian strukturalnych po związaniu białka klienta. Są to uzupełniające się metodologie definiowania potencjalnych kompleksów opiekuńczo-substratowych i analizy potencjalnych miejsc interakcji.
W tym przypadku zastosowaliśmy te protokoły do scharakteryzowania kompleksu między regulowanym przez redoks chaperonem Hsp33 a dobrze zbadanym substratem opiekuńczym CS. Przedstawiliśmy dwa różne r...

Komórki często napotykają nagromadzenie reaktywnych form tlenu (ROS) wytwarzanych jako produkty uboczne oddychania1,2, utlenianie białek i lipidów3,4, oraz dodatkowe procesy5,6,7. Pomimo korzystnej roli ROS w różnych procesach biologicznych, takich jak sygnalizacja komórkowa8,9 i odpowiedź immunologiczna10, może wystąpić brak równowagi między produkcją ROS a jego detoksykacją, prowadzący do stresu oksydacyjnego7. Biologicznymi celami ROS są białka, lipidy i kwasy nukleinowe, których utlenianie wpływa na ich strukturę i funkcję. W związku z tym akumulacja utleniaczy komórkowych jest silnie związana z różnorodnymi patologiami, w tym rakiem9,11, zapaleniem12,13 i starzeniem się14,15, i stwierdzono, że są zaangażowane w wystąpienie i progresję chorób neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Alzheimera, Parkinsona i ALS16,17,18.
Zarówno nowo zsyntetyzowane, jak i dojrzałe białka są bardzo wrażliwe na utlenianie ze względu na potencjalnie szkodliwe modyfikacje ich łańcuchów bocznych, które kształtują strukturę i funkcję białka19,20. Dlatego stres oksydacyjny zwykle prowadzi do rozległej inaktywacji białek, nieprawidłowego fałdowania i agregacji, co ostatecznie prowadzi do śmierci komórki. Jedną z eleganckich strategii komórkowych radzenia sobie z potencjalnymi uszkodzeniami wynikającymi z utleniania białek jest wykorzystanie białek opiekuńczych zależnych od redoks, które hamują powszechną agregację białek, zamiast tworzyć stabilne kompleksy z nieprawidłowo sfałdowanymi białkami klienta21,22,23. Te opiekuńcze białka opiekuńcze pierwszej linii są szybko aktywowane przez utlenianie specyficzne dla miejsca (zwykle na resztach cysteiny), które przekształca je w silne cząsteczki antyagregacyjne24. Ponieważ stres oksydacyjny powoduje zahamowanie oddychania i obniżenie poziomu ATP w komórkach25, kanoniczne białka opiekuńcze zależne od ATP są mniej skuteczne w warunkach stresu oksydacyjnego25,26,27. Dlatego aktywowane redoks białka opiekuńcze niezależne od ATP odgrywają istotną rolę w utrzymaniu homeostazy białek po akumulacji utleniaczy w bakteriach i eukariontach (np. Hsp3328 i RidA29 w bakteriach, Get330 w drożdżach, peroksyredoksyny31 u eukariontów). Aktywność tych białek opiekuńczych silnie zależy od odwracalnych strukturalnych zmian konformacyjnych wywołanych przez utlenianie specyficzne dla miejsca, które odkrywa hydrofobowe regiony zaangażowane w rozpoznawanie nieprawidłowo sfałdowanych białek klienta.
Badania nad mechanizmem antyagregacji i zasadami rządzącymi rozpoznawaniem białek klienta przez białka opiekuńcze nie są łatwe ze względu na dynamiczną i heterogeniczną naturę interakcji chaperon-substrate32,33,34,35,36,37. Jednak regulowane stresem białka opiekuńcze mają szansę pogłębić naszą wiedzę na temat funkcji antyagregacji ze względu na ich zdolność do: 1) uzyskania dwóch różnych form białka opiekuńczego, aktywnej (np. utlenionej) i nieaktywnej (np. zredukowanej), z wprowadzeniem lub usunięciem stanu stresu, który łatwo przełącza się między nimi (np., utleniacz i środek redukujący), 2) mają szeroki zakres substratów, 3) tworzą wysoce stabilne kompleksy z białkami klienta, które mogą być oceniane za pomocą różnych metodologii strukturalnych, oraz 4) koncentrują się wyłącznie na rozpoznawaniu i uwalnianiu substratu, w którym pośredniczą zmiany konformacyjne zależne od redoks, ponieważ większość tych białek opiekuńczych nie ma zdolności do fałdowania.
Tutaj analizujemy aktywność antyagregacyjną bakteryjnego restaurowanego przez redoks Hsp33, który jest istotnym składnikiem bakteryjnego systemu obronnego przed agregacją białek wywołaną utlenianiem28. Po redukcji Hsp33 jest ściśle pofałdowanym białkiem wiążącym bez aktywności opiekuńczej; jednak pod wpływem stresu oksydacyjnego Hsp33 ulega rozległym zmianom konformacyjnym, które odsłaniają regiony wiążące jego substrat38,39. Po utlenieniu uwalniany jest jon, który jest silnie związany z czterema wysoce konserwatywnymi resztami cysteiny domeny C-końcowej40. Powoduje to powstanie dwóch wiązań dwusiarczkowych, rozwinięcie domeny C-końcowej i destabilizację sąsiedniego regionu łącznikowego41. Regiony C-końcowe i łącznikowe są bardzo elastyczne i są definiowane jako wewnętrznie lub częściowo nieuporządkowane. Po powrocie do warunków bezstresowych cysteiny ulegają zmniejszeniu, a opiekun powraca do swojego naturalnego stanu fałdowania bez aktywności antyagregacyjnej. Ponowne fałdowanie białka opiekuńczego prowadzi do dalszego rozwijania się i destabilizacji związanego białka klienta, co powoduje jego transfer do kanonicznego układu opiekuńczego, DnaK/J, w celu ponownego fałdowania38. Analiza miejsc interakcji Hsp33 sugeruje, że Hsp33 wykorzystuje zarówno naładowane nieuporządkowane regiony, jak i hydrofobowe regiony na linkerze i domenie N-końcowej do wychwytywania nieprawidłowo sfałdowanych białek klienckich i zapobiegania ich agregacji38,42. W stanie złożonym te regiony są ukryte przez składany konsolidator i domenę C-terminal. Co ciekawe, region konsolidatora służy jako strażnik złożonego i nieaktywnego stanu Hsp33, "wyczuwając" stan składania sąsiedniej domeny C-terminala34. Po destabilizacji przez mutagenezę (albo przez mutację punktową, albo przez zaburzenie pełnej sekwencji), Hsp33 jest przekształcany w konstytutywnie aktywny chaperon, niezależnie od stanu redoks jego wrażliwych na redoks cystein 43.
Przedstawione tutaj protokoły pozwalają na monitorowanie zależnej od redoks aktywności opiekuńczej Hsp33, jak również na mapowanie zmian konformacyjnych podczas aktywacji i wiązania białek klienta. Metodologia ta może być zaadaptowana do badań nad innymi modelami rozpoznawania białka opiekuńczego-klienta, a także interakcji białko-białko niebędące białkami opiekuńczymi. Ponadto przedstawiamy protokoły przygotowania w pełni zredukowanych i utlenionych białek opiekuńczych, które mogą być wykorzystane w badaniach innych białek redoks-switch, w celu ujawnienia potencjalnych ról utleniania białek na aktywność białek.
Konkretnie, opisujemy procedurę monitorowania aktywności chaperonu in vitro i definiujemy jego specyficzność substratową w różnych typach agregacji białek (indukowanej chemicznie lub termicznie) za pomocą rozpraszania światła (LS) mierzonego przez fluorospektrometr44. Podczas agregacji rozpraszanie światła przy 360 nm gwałtownie wzrasta ze względu na rosnące zmętnienie. W ten sposób agregacja może być monitorowana w sposób zależny od czasu na tej długości fali. LS jest szybką i czułą metodą badania agregacji białek, a tym samym aktywności antyagregacyjnej białka będącego przedmiotem zainteresowania przy użyciu stężeń nanomolowych, umożliwiającej scharakteryzowanie parametrów kinetycznych związanych z agregacją białek w różnych warunkach. Co więcej, opisany tutaj protokół LS nie wymaga drogiego oprzyrządowania i można go łatwo ustalić w dowolnym laboratorium.
Niemniej jednak, uzyskanie "czystych" krzywych kinetycznych i wyprowadzenie parametrów kinetycznych białka z takich eksperymentów rozpraszania światła jest dość trudne, ze względu na szum i dużą liczbę wartości odstających generowanych przez pęcherzyki powietrza i duże agregaty. Aby pokonać tę przeszkodę, prezentujemy nowatorskie narzędzie graficzne, Kfits45, używane do redukcji poziomu szumów w różnych pomiarach kinetycznych, specjalnie dostosowane do danych kinetycznych agregacji białek. Oprogramowanie to zapewnia wstępne parametry kinetyczne do wczesnej oceny wyników i pozwala użytkownikowi szybko "wyczyścić" duże ilości danych bez wpływu na ich właściwości kinetyczne. Kfits jest zaimplementowany w Pythonie i dostępny w otwartym kodzie źródłowym pod adresem 45.
Jedno z najtrudniejszych pytań w tej dziedzinie dotyczy mapowania miejsc interakcji między białkami opiekuńczymi a ich białkami klienckimi oraz zrozumienia, w jaki sposób białka opiekuńcze rozpoznają szeroki zakres nieprawidłowo sfałdowanych substratów. Pytanie to komplikuje się jeszcze bardziej, gdy bada się wysoce dynamiczne kompleksy białkowe, które obejmują wewnętrznie nieuporządkowane białka opiekuńcze i podatne na agregację substraty. Na szczęście strukturalna spektrometria mas znacznie się rozwinęła w ciągu ostatniej dekady i z powodzeniem dostarczyła pomocnych podejść i narzędzi do analizy plastyczności strukturalnej i mapowania reszt zaangażowanych w rozpoznawanie białek46,47,48,49. Tutaj przedstawiamy jedną z takich technik - spektrometrię mas wymiany wodorowo-deuterowej (HDX-MS) - która umożliwia mapowanie zmian poziomu reszt w konformacji strukturalnej po modyfikacji białka lub wiązaniu białka z ligandem35,50,51,52,53,54,55. HDX-MS wykorzystuje ciągłą wymianę wodorów szkieletowych przez deuter, na szybkość której wpływa środowisko chemiczne, dostępność oraz wiązania kowalencyjne i niekowalencyjne56. HDX-MS śledzi te procesy wymiany za pomocą deuterowanego rozpuszczalnika, zwykle ciężkiej wody (D2O), i umożliwia pomiar w oparciu o zmianę masy cząsteczkowej następującą po wymianie wodoru na deuter. Wolniejsze tempo wymiany wodor-deuter może wynikać z udziału wodoru w wiązaniach wodorowych lub, po prostu, z przeszkody sterycznej, która wskazuje na lokalne zmiany w strukturze57. Zmiany w wiązaniu liganda lub modyfikacje potranslacyjne mogą również prowadzić do różnic w środowisku wodorowym, przy czym wiązanie skutkuje różnicami w szybkości wymiany wodorowo-deuterowej (HDX)46,53.
Zastosowaliśmy tę technologię do 1) mapowania regionów Hsp33, które szybko rozwijają się po utlenieniu, co prowadzi do aktywacji Hsp33, oraz 2) zdefiniowania potencjalnego interfejsu wiązania Hsp33 z jego pełnowymiarowym nieprawidłowo sfałdowanym substratem, syntazą cytrynianu (CS)38.
Metody opisane w tym manuskrypcie mogą być stosowane do badania funkcji białek in vitro zależnych od redoks, definiując aktywność antyagregacyjną i rolę zmian strukturalnych (jeśli takie istnieją) w funkcji białka. Metodologie te można łatwo dostosować do różnych systemów biologicznych i zastosować w laboratorium.

<table><tbody><tr><td>Chemikalia, Odczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl HPLC plus</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34998-2.5L</td><td>rozpuszczalnik</td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy Optima LC/MS</td><td>Fisher Chemicals</td> Suplement <td>rozpuszczalnikowy</td><td>A117-50</td></tr><tr><td>Alkohol izopropylowy, klasa HPLC</td><td>Fisher Chemicals</td><td>P750717</td><td>rozpuszczalnik</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Chemicals</td><td>A456-212</td><td>rozpuszczalnik</td></tr><tr><td>Tris(hydroksymetylo)aminometan</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>252859 bufor</td></tr><tr><td>Kwas trifluorooctowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>76-05-1</td><td>rozpuszczalnik</td></tr><tr><td>Woda do HPLC</td><td>Sigma Aldrich</td><td>270733-2,5L-M</td><td>rozpuszczalnik</td></tr><tr><td>ZnCl2, Chlorek</td><td>Merck</td><td>B0755416 308</td><td>odczynnik</td></tr><tr><td>DTT</td><td>goldbio</td><td>27565-41-9</td><td>środek redukujący</td></tr><tr><td>PD mini pułapka kolumny G-25 GE healthcare</td> GE <td>healthcare</td><td>29-9180-07</td><td>kolumna odsalająca</td></tr><tr><td>Fosforan potasu</td><td>Stany Zjednoczone Biochemical Corporation</td><td>20274</td><td>bufor</td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru 30%</td> <td>Merck</td><td>K46809910526</td><td>środek utleniający</td></tr><tr><td>syntaza cytrynianu</td><td>sigma aldrich</td><td>C3260</td><td>podłoże</td></tr><tr><td>HEPES bezkwasowy</td><td>bufor</td><td>sigma aldrich</td><td>7365-45-9</td></tr><tr><td>Gndcl</td><td>sigma aldrich</td><td>G3272-500G</td><td>denaturant</td></tr><tr><td>Roztwór chlorku deuteru</td><td>sigma aldrich</td><td>543047-10G</td><td>Bufor</td></tr><tr><td>Tlenek deuteru 99%</td> <td>sigma aldrich</td><td>151882-100G</td><td>rozpuszczalnik</td></tr><tr><td>TCEP</td><td>bioworld</td><td>42000058-2</td><td>środek</td></tr> <tr><td>redukującyMikrowkładka 150uL z wnętrzem trzpienia i Nóżki polimerowe, 29*5mm</td><td>La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml przezroczysta fiolka z krótkim gwintem gwint 9 mm, 11,6 * 32 mm</td><td>La-Pha-Pack -Kuweta kwarcowa Thermo Fischer Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Hellma 101-QS</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>strong>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jasco FP-8500 Fluorospektrometr</td><td>Jasco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer Comfort</td><td>Eppendorf</td><td>13058/0</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Megafuge 16R, stołowaWirówka</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH-metr, PB-11 sartorius</td><td>Sartorius</td><td>13119/0</td><td></td></tr><tr><td>AffiPro Immobilizowana kolumna pepsynowa (długość 20 mm, średnica 2,0 mm).</td><td>Kolumna wstępna AffiPro</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waters (ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard 130 & Aring;, 1.7um, 2.1mmx5mm)</td><td>Kolumna</td> analityczna Waters <td></td><td></td></tr><tr><td>C18 (kolumna ACQUITY UPLC Peptide BEH c18, 130 & Aring;, 1.7um, 2.1mmx50mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Winylowa komora anaerobowa z drzwiami śluzy</td><td>COY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Q-exactive-orbitrap spektrometr masowy</td><td>Thermo-Fischer Naukowy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>system PAL LHX - zrobotyzowany system do obsługi próbek HDX</td><td>System PAL</td><td>https://www.palsystem.com/index.php?id=840</td><td></td></tr><tr><td>Dionex Ultimate 3000, pompa XRS</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pompa pomocnicza Dionex AXP-MS</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie, Narzędzia programowe, Wyszukiwanie w bazie danych</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kfits: Dane agregacji dopasowań</td><td>http://kfits.reichmannlab.com/fitter/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>oprogramowanie Thermo Scientific Xcalibur</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30487</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Q Exactive MS Series Tune Interface (Tune)</td><td>https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/WS-MS-Q-Exactive-Calibration-Maintenance-iQuan2016-EN.pdf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Chronos (Axel Semrau)</td><td>http://www.axel-semrau.de/en/Software/Software+Solutions/Chronos-p-966.html</td><td></td><td></td></tr><tr><td>oprogramowanie Proteome Discoverer V1.4</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30795</td><td></td><td></td></tr><tr><td>oprogramowanie HDX Workbench</td><td>http://hdx.florida.scripps.edu/hdx_workbench/Home.html</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

definiowanie regulowanej przez redoks aktywności chaperonu hsp33 i mapowanie zmian konformacyjnych na hsp33 przy użyciu spektrometrii mas wymiany wodorowo-deuterowej

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

Żywe organizmy regularnie muszą radzić sobie z zmiennymi warunkami środowiska podczas swojego cyklu życia, w tym zmianami temperatury, pH, akumulacją reaktywnych form tlenu i innymi. Wahania te mogą prowadzić do rozległego rozwijania się białka, agregacji i śmierci komórki. W związku z tym komórki wyewoluowały dynamiczną i specyficzną dla stresu sieć molekularnych białek opiekuńczych, które utrzymują "zdrowy" proteom w warunkach stresu. Białka opiekuńcze niezależne od ATP stanowią jedną z głównych klas molekularnych białek opiekuńczych, które służą jako cząsteczki obronne pierwszej linii, chroniąc przed agregacją białek w sposób zależny od stresu. Jedną z cech wspólnych dla tych opiekunów jest ich zdolność do wykorzystania plastyczności strukturalnej do specyficznej dla stresu aktywacji, rozpoznawania i uwalniania nieprawidłowo złożonego klienta. 
W tym artykule skupiamy się na analizie funkcjonalnej i strukturalnej jednego z takich wewnętrznie nieuporządkowanych opiekunów, bakteryjnego Hsp33 regulowanego przez redoks, który chroni białka przed agregacją podczas stresu oksydacyjnego. W tym miejscu przedstawiamy zestaw narzędzi różnych technik do badania aktywności opiekuńczej regulowanej przez redoks, a także do mapowania zmian konformacyjnych białka opiekuńczego, leżących u podstaw jego aktywności. W szczególności opisujemy przepływ pracy, który obejmuje przygotowanie w pełni zredukowanych i całkowicie utlenionych białek, a następnie analizę aktywności antyagregacyjnej białka opiekuńczego in vitro przy użyciu rozpraszania światła, koncentrując się na stopniu aktywności antyagregacyjnej i jej kinetyce. Aby przezwyciężyć częste wartości odstające nagromadzone podczas testów agregacji, opisujemy zastosowanie Kfits, nowatorskiego narzędzia graficznego, które umożliwia łatwe przetwarzanie pomiarów kinetycznych. To narzędzie można łatwo zastosować do innych typów pomiarów kinetycznych w celu usunięcia wartości odstających i dopasowania parametrów kinetycznych. Aby skorelować funkcję ze strukturą białka, opisujemy konfigurację i przebieg techniki strukturalnej spektrometrii mas, spektrometrii mas wymiany wodorowo-deuterowej, która umożliwia mapowanie zmian konformacyjnych na chaperonie i substracie podczas różnych etapów aktywności Hsp33. Tę samą metodologię można zastosować do innych oddziaływań białko-białko i białko-ligand.

Dwie przedstawione metody umożliwiają śledzenie aktywności kinetycznej oraz dynamiki oddziaływań białkowych pomiędzy chaperonem a jego substratem. Ponadto protokół redukcji-utleniania pozwala na przygotowanie w pełni zredukowanego i w pełni utlenionego chaperonu, co zapewnia głębsze zrozumienie mechanizmu aktywacji niesfałdowanych chaperonów zależnych od stanu redoks.
W pierwszej kolejności wykorzystaliśmy rozpraszanie światła, ...

Jednym z najtrudniejszych warunków stresowych, z jakimi organizmy spotykają się w ciągu swojego życia, jest akumulacja utleniaczy. Podczas stresu oksydacyjnego komórki w dużym stopniu polegają na molekularnych białkach opiekuńczych. W tym miejscu przedstawiono metody wykorzystywane do badania regulowanej przez redoks aktywności antyagregacyjnej, a także do monitorowania zmian strukturalnych regulujących funkcję opiekuńczą za pomocą HDX-MS.

Definiowanie regulowanej przez redoks aktywności chaperonu Hsp33 i mapowanie zmian konformacyjnych na Hsp33 przy użyciu spektrometrii mas wymiany wodorowo-deuterowej

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

Przedstawiony tutaj przepływ pracy może pomóc poszerzyć naszą wiedzę na temat komórkowej roli białek opiekuńczych w warunkach stresu oksydacyjnego. W szczególności może pomóc w zrozumieniu, w jaki sposób białka opiekuńcze zapobiegają agregacji białek w warunkach rozwijania. Dla tych dwóch grzbietów różnych technik daje wgląd w działalność opiekunów segregowanych flagami.Może być również używany do badania innych białek pod kątem interakcji, takich jak interakcje społeczne enzymów i dynamika białek. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ wiąże się z użyciem różnych instrumentów, co może stanowić wyzwanie dla nowych użytkowników. Najpierw odwiruj wcześniej rozmrożoną próbkę białka, aby usunąć agregaty.Następnie dodać pięć milimolowych DTT i 20 mikromolowych chlorków i inkubować próbkę przez co najmniej 1,5 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby usunąć naziemną telewizję cyfrową, należy zrównoważyć kolumnę odsalającą z 40-milimolowym buforem fosforanu potasu, całkowicie wypełniając kolumnę buforem i pozwalając mu wypłynąć. Za pomocą pęsety delikatnie dociśnij biały filtr dyskowy w kolumnie i wyjmij go.Ponownie napełnić kolumnę buforem fosforanu potasu i odwirować w temperaturze 1000 razy G przez trzy minuty. Po odwirowaniu przenieść kolumnę do czystej probówki i powoli dodawać próbkę białka do środka kolumny. Odwirować kolumnę w temperaturze 1000 razy G przez dwie minuty, tak aby białko wolne od DTT znalazło się w przepływie.Teraz sprawdź stężenie białka i zmierz jego absorbancję przy 280 nanometrach. Podzielić połowę próbek białka na podwielokrotności. Inkubować podwielokrotności w warunkach beztlenowych przez 20 minut w celu całkowitego usunięcia tlenu.Następnie uszczelnij probówki folią z tworzywa sztucznego i przechowuj próbki w niskich temperaturach. Następnie dodaj świeżo przygotowany pięciomilimolowy nadtlenek wodoru do pozostałej próbki białka i inkubuj przez trzy godziny w temperaturze 40 stopni Celsjusza, wstrząsając. Po odwirowaniu sprawdź stężenie białka, a następnie podziel utlenione białka na podwielokrotności i przechowuj je w niskich warunkach.Przygotować zdenaturowany substrat przez inkubację 12 mikromolowej syntazy cytrynianu przez noc w 40 milimolowym chlorku HEPES i 4,5 molowym chlorku guanidyny. Następnego dnia otwórz oprogramowanie fluorospektrometru i przejdź do pomiaru przebiegu czasu. Ustaw szerokość pasma wzbudzenia na 2,5 nanometra.Długość fali wzbudzenia do 360 nanometrów. Długość fali emisji do 360 nanometrów. Szerokość pasma emisji do pięciu nanometrów.I interwał danych do 0,5 sekundy. Ustaw temperaturę na 25 stopni Celsjusza. Przygotuj próbkę, dodając 1600 mikrolitrów 40-milimolowych HEPES-ów do kuwety kwarcowej.Włóż kuwetę do uchwytu próbki fluorospektrometru, pozwalając próbce osiągnąć żądaną temperaturę. Po ustawieniu mieszania na 600 obr./min rozpocznij pomiar, aż do ustalenia linii bazowej. Aby zmierzyć agregację syntazy cytrynianu przy braku białka opiekuńczego, dodaj 10 mikrolitrów denaturowanej syntetazy cytrynianowej po 120 sekundach pomiaru.Następnie kontynuuj pomiar przez 1200 sekund. Aby zmierzyć agregację syntazy cytrynianowej w obecności Hsp33, dodaj Hsp33 60 sekund do pomiaru. Po dodatkowych 60 sekundach dodaj 10 mikrolitrów denaturowanej syntetazy cytrynianu i kontynuuj pomiar przez 1200 sekund.Następnie prześlij plik danych, aby przeprowadzić analizę danych i usunąć szumy przez Kfits. Aby usunąć wszelkie zakłócenia, wybierz parametry analizy, użyj automatycznego najlepszego modelu i wybierz szum, który jest zawsze powyżej sygnału. Ręcznie usuń oczywiste wartości odstające za pomocą zielonych i czerwonych regulowanych linii, które będą filtrować szumy powyżej zielonej linii i poniżej czerwonej linii.Następnie ustaw linię bazową i krzywą dopasowania. Po zastosowaniu progu szumu pobierz przetworzone dane. Przygotować próbki złożonych substratów białkowych, dodając syntetazę cytrynianu do Hsp33 w stosunku 1 do 1,5 w temperaturze 43 stopni Celsjusza.Stosować co najmniej cztery etapy i inkubować próbki przez 15 minut w temperaturze 43 stopni Celsjusza po każdym dodaniu, aby umożliwić tworzenie się złożonych. Odwirować próbki w temperaturze 16000 razy G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut, aby usunąć wszelkie osady. Następnie umieść próbki w szklanych wkładkach o pojemności 150 mikrolitrów i przenieś je do fiolek.Następnie umieść je na odpowiednich tacach. Przechowywać H i D w temperaturze 25 stopni Celsjusza, a próbki i bufor schładzający w temperaturze od zera do dwóch stopni Celsjusza. Następnie ręcznie włącz wszystkie jednostki chłodzące spektrometru masowego.Gdy wszystkie systemy chłodzenia osiągną temperaturę docelową, ręcznie włącz zarówno HPLC, jak i pompy podawcze. Otwórz oprogramowanie sterujące obiema pompami, a także oprogramowanie sterujące spektrometrem mas i upewnij się, że MS jest w trybie czuwania. Następnie odłącz zawór wylotowy HPLC od źródła MS.Najpierw umyj system potrójnym roztworem czyszczącym. Następnie z buforem B i na końcu z buforem A. Następnie włóż kolumnę pepsyny do systemu. Po umyciu układu przy stałym przepływie i stałym ciśnieniu, włóż zawór wylotowy HPLC do źródła MS i włącz MS.Teraz otwórz oprogramowanie. Zbuduj ciągłą sekwencję i wprowadź wszystkie punkty czasowe, nazwy próbek i lokalizacje w zasobnikach, a także nazwy i lokalizacje. Po zakończeniu serii przeanalizuj pokrycie peptydowe próbki, przepuszczając niedeuterowane próbki kontrolne przez oprogramowanie.Przenieś dane do oprogramowania HDX Workbench i przeanalizuj wyniki za pomocą oprogramowania. Zapisz wybrane peptydy i kontynuuj analizę wychwytu deuteru. Denaturacja chemiczna prowadzi do szybkiej agregacji syntetazy cytrynianu indukowanej ponownym fałdowaniem w pełni denaturowanego białka w niekorzystnych warunkach buforowych.Z drugiej strony, agregacja indukowana termicznie wynika ze stosunkowo powolnego rozwijania się natywnie pofałdowanego podłoża. W obu formach denaturacji dodanie utlenionego Hsp33 całkowicie zniosło agregację, obniżając odczyty 360 nanometrów do znikomych wartości. Obecność obniżonego Hsp33 nie miała wpływu na stabilność syntetazy cytrynianu i dała krzywą agregacji podobną do tej wykrytej przy braku białka opiekuńczego.Wzorzec deuteracji między związanym i niezwiązanym chrybonem opiekuńczym Hsp33 a jego syntetazą cytrynianu substratu ujawnia miejsce interakcji z klientem w domenie C-końcowego przełącznika redoks białka opiekuńczego. Zredukowany Hsp33 ma całkowicie uporządkowaną strukturę, ale staje się funkcjonalny, gdy wyczuwa stres oksydacyjny. Podczas gdy zredukowany związany i niezwiązany Hsp33 wytwarza podobne krzywe peptydowe, utleniony Hsp33 wykazuje 30% różnicę deuteracji między związanym i niezwiązanym chaperonem z określonymi obszarami związanego białka wskazującymi na przeszkodę allosteryczną.Po ustaleniu test rozpraszania można zakończyć w ciągu kilku godzin, podczas gdy metodologia DHEX może zostać zakończona w ciągu dwóch do czterech dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, ważne jest, aby planować z wyprzedzeniem. Należy pamiętać, że opisane warunki, takie jak temperatura, czas inkubacji i roztwory buforowe, są specyficzne dla białka i muszą być zoptymalizowane dla każdego białka.Zgodnie z tą procedurą można zastosować inne metodologie, takie jak sieciowanie lub wytrącanie, w celu uzupełnienia badań interakcji substratów opiekuńczych. Podsumowując, technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią strukturalną do zbadania plastyczności białek w molekularnych białkach opiekuńczych.

defining-hsp33-s-redox-regulated-chaperone-activity-mapping

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Konformacja i dynamika białek są kluczem do zrozumienia związku między strukturą a funkcją białka. Wymiana wodorowa w połączeniu ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości jest wszechstronną metodą badania dynamiki konformacyjnej białek, a także charakteryzowania interakcji białko-ligand i białko-białko, w tym interfejsów kontaktowych i efektów allosterycznych.

Analiza dynamiki białek za pomocą spektrometrii mas wymiany wodorowej

To badanie opisuje techniki biofizyczne, biochemiczne i molekularne do scharakteryzowania aktywności opiekuńczej Escherichia coli HdeB w warunkach kwaśnego pH. Metody te zostały z powodzeniem zastosowane do innych opiekuńczych chroniących przed kwasami, takich jak HdeA, i mogą być modyfikowane tak, aby działały w przypadku innych białek opiekuńczych i warunków stresu.

Wykrywanie zależnej od pH aktywności Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro i In Vivo

Elastyczność konformacyjna odgrywa kluczową rolę w funkcjonowaniu białek. W tym artykule opisujemy zastosowanie czasowo-rozdzielczej spektrometrii mas z jonizacją elektronrozpylającą sprzężoną z wymianą wodorowo-deuterową do badania szybkich zmian strukturalnych, które napędzają funkcję w uporządkowanych i nieuporządkowanych białkach.

Spektrometria mas z jonizacją wodorowo-deuterową z jonizacją elektrorozpylającą do badania struktury i dynamiki białek

Tutaj prezentujemy protokół do uzyskiwania trójkolorowych danych smFRET i ich analizy za pomocą 3D zespołowego modelu Ukrytego Markowa. Dzięki takiemu podejściu naukowcy mogą wyodrębnić informacje kinetyczne ze złożonych systemów białkowych, w tym kooperatywność lub skorelowane interakcje.

Wykorzystanie trójkolorowego jednocząsteczkowego FRET do badania korelacji oddziaływań białek

Syntetazy lantipeptydu katalizują wieloetapowe reakcje podczas biosyntezy naturalnych produktów peptydowych. W tym miejscu opisujemy ciągły, oddolny przepływ pracy spektrometrii mas z wymianą wodorowo-deuterową (HDX-MS), który można wykorzystać do badania dynamiki konformacyjnej syntetaz lantipeptydów, a także innych podobnych enzymów zaangażowanych w biosyntezę naturalnych produktów peptydowych.

Platforma spektrometrii mas z wymianą wodorowo-deuterową (HDX-MS) do badania biosyntetycznych enzymów peptydowych

Prezentowany tutaj jest protokół metody wymiany wodoru i deuteru (HDX) opartej na elektroforezie kapilarnej w połączeniu ze spektrometrią mas z góry na dół. Podejście to charakteryzuje różnicę w strukturach wyższego rzędu między różnymi gatunkami białek, w tym białkami w różnych stanach i różnymi proteoformami, poprzez prowadzenie jednoczesnej różnicowej separacji HDX i elektroforetycznej.

Wymiana wodorowo-deuterowa oparta na elektroforezie kapilarnej do konformacyjnej charakterystyki białek za pomocą spektrometrii mas z góry na dół

Strukturalny zespół monomerycznej alfa-synukleiny wpływa na jej fizjologiczne funkcje i właściwości fizykochemiczne. Niniejszy protokół opisuje, w jaki sposób przeprowadzić spektrometrię mas z wymianą milisekundową wodór/deuter i późniejsze analizy danych w celu określenia informacji konformacyjnych na monomerze tego wewnętrznie nieuporządkowanego białka w warunkach fizjologicznych.

Spektrometria mas z wymianą milisekundową wodoru i deuteru do badania dynamiki strukturalnej alfa-synukleiny w warunkach fizjologicznych

Tutaj prezentujemy protokoły oczyszczania kompleksów białkowych i ich separacji za pomocą niebieskiej natywnej STRONY, a następnie profilowania korelacji białek za pomocą ilościowej spektrometrii mas bez etykiet. Ta metoda jest przydatna do przekształcania interaktomów w odrębne kompleksy białkowe.

Rozwiązywanie kompleksów białkowych oczyszczonych z powinowactwa za pomocą Blue Native PAGE i profilowania korelacji białek

Kropelki lipidów są ważnymi organellami do replikacji kilku patogenów, w tym wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV). Opisujemy metodę izolowania kropelek lipidów do ilościowej spektrometrii mas powiązanych białek; Może być stosowany w różnych warunkach, takich jak infekcja wirusowa, stres środowiskowy lub leczenie farmakologiczne.

Izolacja kropelek lipidów do ilościowej analizy spektrometrii mas

Tutaj prezentujemy protokół do określania specyficzności proteazy w surowych ekstraktach tkanek myszy za pomocą spektrometrii MALDI-TOF.

Oznaczanie swoistości proteazy w ekstraktach tkanek myszy za pomocą spektrometrii mas MALDI-TOF: manipulowanie PH w celu wywołania zmian swoistości

Poznaj metodę badania aktywności chaperonu Hsp33 podczas stresu oksydacyjnego przy użyciu spektrometrii mas HDX-MS. Technika ta pozwala analizować zmiany konformacyjne białek i zapobiegać ich agregacji.

Definiowanie regulowanej przez redoks aktywności chaperonu Hsp33 i mapowanie zmian konformacyjnych na Hsp33 przy użyciu spektrometrii mas wymiany wodorowo-deuterowej (Wideo) | JoVE Journal

Definiowanie regulowanej przez redoks aktywności chaperonu Hsp33 i mapowanie zmian konformacyjnych na Hsp33 przy użyciu spektrometrii mas wymiany wodorowo-deuterowej

Przeglądaj więcej filmów