Definiowanie regulowanej przez redoks aktywności chaperonu Hsp33 i mapowanie zmian konformacyjnych na Hsp33 przy użyciu spektrometrii mas wymiany wodorowo-deuterowej

Przedstawiony tutaj przepływ pracy może pomóc poszerzyć naszą wiedzę na temat komórkowej roli białek opiekuńczych w warunkach stresu oksydacyjnego. W szczególności może pomóc w zrozumieniu, w jaki sposób białka opiekuńcze zapobiegają agregacji białek w warunkach rozwijania. Dla tych dwóch grzbietów różnych technik daje wgląd w działalność opiekunów segregowanych flagami.

Może być również używany do badania innych białek pod kątem interakcji, takich jak interakcje społeczne enzymów i dynamika białek. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ wiąże się z użyciem różnych instrumentów, co może stanowić wyzwanie dla nowych użytkowników. Najpierw odwiruj wcześniej rozmrożoną próbkę białka, aby usunąć agregaty.

Następnie dodać pięć milimolowych DTT i 20 mikromolowych chlorków i inkubować próbkę przez co najmniej 1,5 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby usunąć naziemną telewizję cyfrową, należy zrównoważyć kolumnę odsalającą z 40-milimolowym buforem fosforanu potasu, całkowicie wypełniając kolumnę buforem i pozwalając mu wypłynąć. Za pomocą pęsety delikatnie dociśnij biały filtr dyskowy w kolumnie i wyjmij go.

Ponownie napełnić kolumnę buforem fosforanu potasu i odwirować w temperaturze 1000 razy G przez trzy minuty. Po odwirowaniu przenieść kolumnę do czystej probówki i powoli dodawać próbkę białka do środka kolumny. Odwirować kolumnę w temperaturze 1000 razy G przez dwie minuty, tak aby białko wolne od DTT znalazło się w przepływie.

Teraz sprawdź stężenie białka i zmierz jego absorbancję przy 280 nanometrach. Podzielić połowę próbek białka na podwielokrotności. Inkubować podwielokrotności w warunkach beztlenowych przez 20 minut w celu całkowitego usunięcia tlenu.

Następnie uszczelnij probówki folią z tworzywa sztucznego i przechowuj próbki w niskich temperaturach. Następnie dodaj świeżo przygotowany pięciomilimolowy nadtlenek wodoru do pozostałej próbki białka i inkubuj przez trzy godziny w temperaturze 40 stopni Celsjusza, wstrząsając. Po odwirowaniu sprawdź stężenie białka, a następnie podziel utlenione białka na podwielokrotności i przechowuj je w niskich warunkach.

Przygotować zdenaturowany substrat przez inkubację 12 mikromolowej syntazy cytrynianu przez noc w 40 milimolowym chlorku HEPES i 4,5 molowym chlorku guanidyny. Następnego dnia otwórz oprogramowanie fluorospektrometru i przejdź do pomiaru przebiegu czasu. Ustaw szerokość pasma wzbudzenia na 2,5 nanometra.

Długość fali wzbudzenia do 360 nanometrów. Długość fali emisji do 360 nanometrów. Szerokość pasma emisji do pięciu nanometrów.

I interwał danych do 0,5 sekundy. Ustaw temperaturę na 25 stopni Celsjusza. Przygotuj próbkę, dodając 1600 mikrolitrów 40-milimolowych HEPES-ów do kuwety kwarcowej.

Włóż kuwetę do uchwytu próbki fluorospektrometru, pozwalając próbce osiągnąć żądaną temperaturę. Po ustawieniu mieszania na 600 obr./min rozpocznij pomiar, aż do ustalenia linii bazowej. Aby zmierzyć agregację syntazy cytrynianu przy braku białka opiekuńczego, dodaj 10 mikrolitrów denaturowanej syntetazy cytrynianowej po 120 sekundach pomiaru.

Następnie kontynuuj pomiar przez 1200 sekund. Aby zmierzyć agregację syntazy cytrynianowej w obecności Hsp33, dodaj Hsp33 60 sekund do pomiaru. Po dodatkowych 60 sekundach dodaj 10 mikrolitrów denaturowanej syntetazy cytrynianu i kontynuuj pomiar przez 1200 sekund.

Następnie prześlij plik danych, aby przeprowadzić analizę danych i usunąć szumy przez Kfits. Aby usunąć wszelkie zakłócenia, wybierz parametry analizy, użyj automatycznego najlepszego modelu i wybierz szum, który jest zawsze powyżej sygnału. Ręcznie usuń oczywiste wartości odstające za pomocą zielonych i czerwonych regulowanych linii, które będą filtrować szumy powyżej zielonej linii i poniżej czerwonej linii.

Następnie ustaw linię bazową i krzywą dopasowania. Po zastosowaniu progu szumu pobierz przetworzone dane. Przygotować próbki złożonych substratów białkowych, dodając syntetazę cytrynianu do Hsp33 w stosunku 1 do 1,5 w temperaturze 43 stopni Celsjusza.

Stosować co najmniej cztery etapy i inkubować próbki przez 15 minut w temperaturze 43 stopni Celsjusza po każdym dodaniu, aby umożliwić tworzenie się złożonych. Odwirować próbki w temperaturze 16000 razy G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut, aby usunąć wszelkie osady. Następnie umieść próbki w szklanych wkładkach o pojemności 150 mikrolitrów i przenieś je do fiolek.

Następnie umieść je na odpowiednich tacach. Przechowywać H i D w temperaturze 25 stopni Celsjusza, a próbki i bufor schładzający w temperaturze od zera do dwóch stopni Celsjusza. Następnie ręcznie włącz wszystkie jednostki chłodzące spektrometru masowego.

Gdy wszystkie systemy chłodzenia osiągną temperaturę docelową, ręcznie włącz zarówno HPLC, jak i pompy podawcze. Otwórz oprogramowanie sterujące obiema pompami, a także oprogramowanie sterujące spektrometrem mas i upewnij się, że MS jest w trybie czuwania. Następnie odłącz zawór wylotowy HPLC od źródła MS.

Najpierw umyj system potrójnym roztworem czyszczącym. Następnie z buforem B i na końcu z buforem A. Następnie włóż kolumnę pepsyny do systemu. Po umyciu układu przy stałym przepływie i stałym ciśnieniu, włóż zawór wylotowy HPLC do źródła MS i włącz MS.

Teraz otwórz oprogramowanie. Zbuduj ciągłą sekwencję i wprowadź wszystkie punkty czasowe, nazwy próbek i lokalizacje w zasobnikach, a także nazwy i lokalizacje. Po zakończeniu serii przeanalizuj pokrycie peptydowe próbki, przepuszczając niedeuterowane próbki kontrolne przez oprogramowanie.

Przenieś dane do oprogramowania HDX Workbench i przeanalizuj wyniki za pomocą oprogramowania. Zapisz wybrane peptydy i kontynuuj analizę wychwytu deuteru. Denaturacja chemiczna prowadzi do szybkiej agregacji syntetazy cytrynianu indukowanej ponownym fałdowaniem w pełni denaturowanego białka w niekorzystnych warunkach buforowych.

Z drugiej strony, agregacja indukowana termicznie wynika ze stosunkowo powolnego rozwijania się natywnie pofałdowanego podłoża. W obu formach denaturacji dodanie utlenionego Hsp33 całkowicie zniosło agregację, obniżając odczyty 360 nanometrów do znikomych wartości. Obecność obniżonego Hsp33 nie miała wpływu na stabilność syntetazy cytrynianu i dała krzywą agregacji podobną do tej wykrytej przy braku białka opiekuńczego.

Wzorzec deuteracji między związanym i niezwiązanym chrybonem opiekuńczym Hsp33 a jego syntetazą cytrynianu substratu ujawnia miejsce interakcji z klientem w domenie C-końcowego przełącznika redoks białka opiekuńczego. Zredukowany Hsp33 ma całkowicie uporządkowaną strukturę, ale staje się funkcjonalny, gdy wyczuwa stres oksydacyjny. Podczas gdy zredukowany związany i niezwiązany Hsp33 wytwarza podobne krzywe peptydowe, utleniony Hsp33 wykazuje 30% różnicę deuteracji między związanym i niezwiązanym chaperonem z określonymi obszarami związanego białka wskazującymi na przeszkodę allosteryczną.

Po ustaleniu test rozpraszania można zakończyć w ciągu kilku godzin, podczas gdy metodologia DHEX może zostać zakończona w ciągu dwóch do czterech dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, ważne jest, aby planować z wyprzedzeniem. Należy pamiętać, że opisane warunki, takie jak temperatura, czas inkubacji i roztwory buforowe, są specyficzne dla białka i muszą być zoptymalizowane dla każdego białka.

Zgodnie z tą procedurą można zastosować inne metodologie, takie jak sieciowanie lub wytrącanie, w celu uzupełnienia badań interakcji substratów opiekuńczych. Podsumowując, technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią strukturalną do zbadania plastyczności białek w molekularnych białkach opiekuńczych.