Manipulowanie żywymi komórkami w celu zbudowania stabilnego zespołu komórkowego 3D bez sztucznego rusztowania
26 października 2018
Pokazujemy nowatorską metodę konstruowania jednokomórkowego trójwymiarowego (3D) montażu bez sztucznego rusztowania.
Ta nowatorska metodologia pozwala nam konstruować trójwymiarowe zespoły, dostosowane do pożądanych pojedynczych komórek, w wodnym roztworze buforowym zawierającym niespecyficzny polimer hydrofilowy, poprzez ustanowienie stabilnego kontaktu komórka-komórka. W tym filmie pokażemy, w jaki sposób manipulujemy pożądanymi pojedynczymi komórkami i konstruujemy zestawy komórkowe 3D bez sztucznego rusztowania. Tutaj pokażemy procedurę eksperymentalną w naszym pożywce na przykładzie Dekstranu.
Na początek utrzymuj komórki nabłonka gruczołu sutkowego myszy NAMRU za pomocą pięciu mililitrów DMEM, zawierającego 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny, w kolbie o pojemności 25 centymetrów sześciennych przez dwa do trzech dni. Gdy będziesz gotowy do kontynuowania, użyj aspiratora, aby usunąć uzupełniony DMEM i dodaj od trzech do pięciu mililitrów PBS, który jest wstępnie podgrzany do 37 stopni Celsjusza, aby umyć komórki. Za pomocą aspiratora usunąć cały PBS z kolby.
Dodaj 1,5 mililitra trypsyny podgrzanej do 37 stopni Celsjusza. Inkubować w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej jedną do dwóch minut. Następnie dodaj 3,5 mililitra DMEM zawierającego 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny.
Pipetować w górę i w dół, aby wymieszać. Przenieś zawiesinę komórkową do 15-mililitrowej probówki wirówkowej i odwiruj ją w temperaturze 417 razy G przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Następnie odessać pożywkę.
Dodaj pięć milimetrów świeżego DMEM zawierającego 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny. W razie potrzeby użyj roztworu do krioprezerwacji, aby dokonać krioprezerwacji komórek zgodnie z instrukcjami producenta. Najpierw wymieszaj 10 mililitrów DMEM uzupełnionego 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny z 0,8 grama dekstranu, aby przygotować 80 miligramów na mililitr roztworu dekstranu.
Zmieszaj 200 mikrolitrów tego roztworu dekstranu z 200 mikrolitrami wcześniej przygotowanej zawiesiny komórek, aby utworzyć zawiesinę komórkową zawierającą 40 miligramów na mililitr pożywki z dekstranem. Aby rozpocząć, włącz laser, zwróć uwagę, że najskuteczniejsze jest użycie wiązki laserowej o długości fali w zakresie od czerwieni do bliskiej podczerwieni. Następnie otwórz oprogramowanie, klikając dwukrotnie ikonę oprogramowania.
Kliknij dwukrotnie ikonę kamery i zwróć uwagę, że pojawi się odpowiedni wyświetlacz. Następnie kliknij dwukrotnie ikony diody elektroluminescencyjnej, regulacji ostrości i ruchomego sceny, aby otworzyć również ich wyświetlacze. Najpierw umieść dwie szklane przekładki na szkiełku podstawowym dolnej pokrywy.
Przenieść 20 mikrolitrów, wcześniej przygotowaną zawiesinę komórkową uzupełnioną dekstranem na dolne szkiełko podstawowe. Następnie umieść szkiełko pokrywowe na przekładkach zakrywających zawieszenie ogniwa. Umieść próbkę na dolnej soczewce obiektywu z 10 mikrolitrami wody destylowanej do mikroskopii zanurzeniowej w wodzie.
Przymocuj górną soczewkę obiektywu w górnej części sample cell za pomocą 10 mikrolitrów wody destylowanej. Następnie kliknij przycisk włączania/wyłączania w oknie oświetlenia mikroskopu, aby włączyć diodę LED. Kliknij przyciski kierunkowe w oknie pozycjonowania obiektywu, aby wyregulować odległość między próbką a dolną soczewką obiektywu, aż do uzyskania ostrości.
Ustaw intensywność każdej wiązki laserowej na 1500 miliwatów w oknie tłumienia sygnału. Następnie kliknij dwie ikony lasera, aby napromieniować wiązki laserowe w pozycji pierwszej i drugiej. Kliknij przyciski kierunkowe w oknie pozycjonowania próbki, aby przesunąć stolik próbki, aż komórka zostanie uwięziona w pozycji pierwszej.
Kliknij i przeciągnij kursor wskazujący pozycję drugą, aż inna komórka zostanie uwięziona w pozycji drugiej. Na początek manipuluj pojedynczą komórką tak, aby stykała się z inną komórką. Utrzymuj ten stan przez 300 sekund, tak aby komórka była wystawiona na działanie lasera przez 300 sekund.
Zapisz oś x-y. Złap kolejną komórkę w pułapkę i przetransportuj ją do pierwszych dwóch komórek, aby skonstruować dowolny zestaw komórek 2D. Następnie przesuń stół montażowy w górę i w dół, aby skonstruować zestaw komórkowy 3D.
Upewnij się, że zespół jest nadal stabilny nawet po wyłączeniu lasera. W tym badaniu rozpuszczalne polimery są wykorzystywane do budowy zespołów 3D pojedynczych komórek. Przykładowa konstrukcja wykonana za pomocą pęsety optycznej z podwójną wiązką jest pokazana tutaj.
Jeśli eksperyment się powiedzie, te zespoły komórkowe pozostają stabilne nawet po wyłączeniu lasera. Ta nowa metodologia służy do budowy zespołów komórkowych 3D w środowisku wodnym z naturalnym hydrofilowym polimerem. Oczekuje się, że rozpocznie się budowa tego rodzaju zestawów komórkowych nowej generacji z niektórymi potężnymi narzędziami w dziedzinie medycyny regeneracyjnej i inżynierii tkankowej.
Przegląd
To badanie przedstawia nową metodologię konstruowania trójwymiarowych (3D) zespołów komórkowych z pojedynczych komórek bez użycia sztucznych szkieletów. Proces polega na manipulowaniu pojedynczymi komórkami w wodnym medium zawierającym polimer hydrofilowy.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Inżynieria tkankowa
- Medycyna regeneracyjna
Tło
- 3D zespoły komórkowe są kluczowe dla rozwoju inżynierii tkankowej.
- Tradycyjne metody często polegają na sztucznych szkieletach.
- Użycie naturalnych polimerów może ulepszać interakcje między komórkami.
- To badanie bada nowe podejście z użyciem świetlnych pincet.
Cel badania
- Opracowanie metody tworzenia stabilnych 3D struktur komórkowych.
- Wyeliminowanie potrzeby sztucznych szkieletów w złożeniu komórek.
- Wykorzystanie polimerów hydrofilowych dla lepszego kontaktu komórka-komórka.
Zastosowane metody
- Przygotowanie zawiesin komórkowych z dekstranem.
- Użycie pincet świetlnych do manipulowania pojedynczymi komórkami.
- Ustanowienie stabilnych kontaktów komórka-komórka dla zespołu.
- Obserwacja stabilności zespołu po zastosowaniu lasera.
Główne wyniki
- Udane zbudowanie 3D zespołów komórkowych bez szkieletów.
- Zespoły pozostały stabilne po wyłączeniu lasera.
- Wykazano skuteczność stosowania polimerów hydrofilowych.
- Przedstawiono nową metodologię dla przyszłych zastosowań w medycynie regeneracyjnej.
Konkluzje
- Ta metoda oferuje obiecującą alternatywę dla tradycyjnych podejść opartych na szkieletach.
- Otwierają nowe szlaki dla badań w inżynierii tkankowej.
- Przyszłe badania mogą eksplorować różne typy komórek i kombinacje polimerów.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Constructing stable 3D cellular assemblies without artificial scaffolds addresses a critical challenge in regenerative medicine and tissue engineering by reducing toxicity and preserving native cell properties. This method leverages optical tweezers and hydrophilic polymers to enable rapid, reproducible cell-cell contact, supporting predictive confidence in early discovery and translational research. Its scaffold-free approach enhances biological relevance and portfolio flexibility for next-generation tissue models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cell-cell interaction mechanisms in a controlled, scaffold-free environment.
- Supports functional validation of cellular behaviors relevant to tissue formation and repair.
- Facilitates mechanistic de-risking by minimizing artificial scaffold-induced artifacts.
- Improves predictive confidence for downstream tissue engineering applications.
Screening & Assay Development
- Prepares validated 3D cellular assemblies for compound screening and phenotypic assays.
- Enhances assay reproducibility by standardizing cell assembly conditions using optical tweezers.
- Enables quantitative assessment of cell-cell contact stability and assembly formation.
- Supports scalable workflows for evaluating bioactive molecules in physiologically relevant systems.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant tissue models for regenerative medicine research.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation by maintaining native cell properties.
- Reduces translational risk by avoiding scaffold-related confounders in model systems.
- Enables risk-adjusted advancement of tissue engineering candidates.
Pipeline & Workflow Integration
This scaffold-free assembly method integrates into the discovery-to-preclinical continuum, supporting early hypothesis testing, lead identification, and translational model development.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis-driven studies of cell-cell interactions and tissue assembly mechanisms.
- Screening: Provides reproducible, quantitative 3D assemblies for compound evaluation and assay development.
- Analytics: Delivers measurable outputs on assembly stability and cell contact duration for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical validation with physiologically relevant tissue constructs.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for diverse cell types and tissue engineering applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in tissue assembly studies.
- Operational Value: Standardizes 3D assembly formation, improving reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions by minimizing scaffold-related risks and artifacts.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of regenerative medicine and tissue engineering programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical manipulation and live cell handling.
- Needs access to laser tweezers, microscopy, and hydrophilic polymer reagents.
- Demands cross-team standardization of assembly protocols and measurement criteria.
- Adaptable to various cell types but may require optimization for different biological systems.
- Limited by the need for specialized instrumentation and operator training.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:48
Preparation of Cells
2:41
Preparation of Dextran
3:18
Preparation for Laser and Microscopy
3:55
Cell Manipulation Using the Laser Trapping System
5:30
Construction of a 3-Dimensional Cell Structure
6:10
Results: Analysis Stable 3D Cellular Assembly
6:35
Conclusion
