Manipulowanie żywymi komórkami w celu zbudowania stabilnego zespołu komórkowego 3D bez sztucznego rusztowania

Ta nowatorska metodologia pozwala nam konstruować trójwymiarowe zespoły, dostosowane do pożądanych pojedynczych komórek, w wodnym roztworze buforowym zawierającym niespecyficzny polimer hydrofilowy, poprzez ustanowienie stabilnego kontaktu komórka-komórka. W tym filmie pokażemy, w jaki sposób manipulujemy pożądanymi pojedynczymi komórkami i konstruujemy zestawy komórkowe 3D bez sztucznego rusztowania. Tutaj pokażemy procedurę eksperymentalną w naszym pożywce na przykładzie Dekstranu.

Na początek utrzymuj komórki nabłonka gruczołu sutkowego myszy NAMRU za pomocą pięciu mililitrów DMEM, zawierającego 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny, w kolbie o pojemności 25 centymetrów sześciennych przez dwa do trzech dni. Gdy będziesz gotowy do kontynuowania, użyj aspiratora, aby usunąć uzupełniony DMEM i dodaj od trzech do pięciu mililitrów PBS, który jest wstępnie podgrzany do 37 stopni Celsjusza, aby umyć komórki. Za pomocą aspiratora usunąć cały PBS z kolby.

Dodaj 1,5 mililitra trypsyny podgrzanej do 37 stopni Celsjusza. Inkubować w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej jedną do dwóch minut. Następnie dodaj 3,5 mililitra DMEM zawierającego 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny.

Pipetować w górę i w dół, aby wymieszać. Przenieś zawiesinę komórkową do 15-mililitrowej probówki wirówkowej i odwiruj ją w temperaturze 417 razy G przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Następnie odessać pożywkę.

Dodaj pięć milimetrów świeżego DMEM zawierającego 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny. W razie potrzeby użyj roztworu do krioprezerwacji, aby dokonać krioprezerwacji komórek zgodnie z instrukcjami producenta. Najpierw wymieszaj 10 mililitrów DMEM uzupełnionego 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny z 0,8 grama dekstranu, aby przygotować 80 miligramów na mililitr roztworu dekstranu.

Zmieszaj 200 mikrolitrów tego roztworu dekstranu z 200 mikrolitrami wcześniej przygotowanej zawiesiny komórek, aby utworzyć zawiesinę komórkową zawierającą 40 miligramów na mililitr pożywki z dekstranem. Aby rozpocząć, włącz laser, zwróć uwagę, że najskuteczniejsze jest użycie wiązki laserowej o długości fali w zakresie od czerwieni do bliskiej podczerwieni. Następnie otwórz oprogramowanie, klikając dwukrotnie ikonę oprogramowania.

Kliknij dwukrotnie ikonę kamery i zwróć uwagę, że pojawi się odpowiedni wyświetlacz. Następnie kliknij dwukrotnie ikony diody elektroluminescencyjnej, regulacji ostrości i ruchomego sceny, aby otworzyć również ich wyświetlacze. Najpierw umieść dwie szklane przekładki na szkiełku podstawowym dolnej pokrywy.

Przenieść 20 mikrolitrów, wcześniej przygotowaną zawiesinę komórkową uzupełnioną dekstranem na dolne szkiełko podstawowe. Następnie umieść szkiełko pokrywowe na przekładkach zakrywających zawieszenie ogniwa. Umieść próbkę na dolnej soczewce obiektywu z 10 mikrolitrami wody destylowanej do mikroskopii zanurzeniowej w wodzie.

Przymocuj górną soczewkę obiektywu w górnej części sample cell za pomocą 10 mikrolitrów wody destylowanej. Następnie kliknij przycisk włączania/wyłączania w oknie oświetlenia mikroskopu, aby włączyć diodę LED. Kliknij przyciski kierunkowe w oknie pozycjonowania obiektywu, aby wyregulować odległość między próbką a dolną soczewką obiektywu, aż do uzyskania ostrości.

Ustaw intensywność każdej wiązki laserowej na 1500 miliwatów w oknie tłumienia sygnału. Następnie kliknij dwie ikony lasera, aby napromieniować wiązki laserowe w pozycji pierwszej i drugiej. Kliknij przyciski kierunkowe w oknie pozycjonowania próbki, aby przesunąć stolik próbki, aż komórka zostanie uwięziona w pozycji pierwszej.

Kliknij i przeciągnij kursor wskazujący pozycję drugą, aż inna komórka zostanie uwięziona w pozycji drugiej. Na początek manipuluj pojedynczą komórką tak, aby stykała się z inną komórką. Utrzymuj ten stan przez 300 sekund, tak aby komórka była wystawiona na działanie lasera przez 300 sekund.

Zapisz oś x-y. Złap kolejną komórkę w pułapkę i przetransportuj ją do pierwszych dwóch komórek, aby skonstruować dowolny zestaw komórek 2D. Następnie przesuń stół montażowy w górę i w dół, aby skonstruować zestaw komórkowy 3D.

Upewnij się, że zespół jest nadal stabilny nawet po wyłączeniu lasera. W tym badaniu rozpuszczalne polimery są wykorzystywane do budowy zespołów 3D pojedynczych komórek. Przykładowa konstrukcja wykonana za pomocą pęsety optycznej z podwójną wiązką jest pokazana tutaj.

Jeśli eksperyment się powiedzie, te zespoły komórkowe pozostają stabilne nawet po wyłączeniu lasera. Ta nowa metodologia służy do budowy zespołów komórkowych 3D w środowisku wodnym z naturalnym hydrofilowym polimerem. Oczekuje się, że rozpocznie się budowa tego rodzaju zestawów komórkowych nowej generacji z niektórymi potężnymi narzędziami w dziedzinie medycyny regeneracyjnej i inżynierii tkankowej.