Name: Manipulowanie żywymi komórkami w celu zbudowania stabilnego zespołu komórkowego 3D bez sztucznego rusztowania (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: Poznaj metodę budowania stabilnych trójwymiarowych zespołów komórkowych bez sztucznego rusztowania przy użyciu polimerów hydrofilowych i pęset optycznych. Technika ta umożliwia precyzyjną manipulację pojedynczymi komórkami w inżynierii tkankowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy dziękują Shu Hashimoto, Aoi Yoshida i Taeko Ohta z Uniwersytetu Doshisha za ich hojną pomoc przy przygotowaniu eksperymentu. Prace te były wspierane przez KAKENHI (15H02121, 15K05400, 25103012, 50587441) oraz przez Program Wspierany przez MEXT dla Fundacji Badań Strategicznych na Uniwersytetach Prywatnych. Badania te były również wspierane przez polski grant Konsorcjum Naukowego KNOW (Leading National Research Centre) "Zdrowe Zwierzę – Bezpieczna Żywność", decyzja Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego nr 05-1/KNOW2/2015.

1. Przygotowanie komórek
<ol>
	<li>Utrzymuj mysie komórki nabłonka gruczołu sutkowego NAMRU (komórki NMuMG) z 5 ml D-MEM zawierającym 10% (v) płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% (v) penicyliny-streptomycyny (P / S) w kolbie o długości25 cm 3. Usuń zmodyfikowaną pożywkę Eagle's (D-MEM) firmy Dulbecco, zawierającą 10% FBS i 1% P/S.</li>
	<li>Dodać 3-5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) (-) o temperaturze 37 °C do kolby. Należy pamiętać, że pH PBS wynosi 7,1-7,3.</li>
	<li>Usunąć cały PBS z kolby za pomocą aspiratora.</li>
	<li>Dodać 1,5 ml trypsyny o temperaturze 37 °C (0,25% m/v) do kolby.</li>
	<li>Inkubować kolbę przez około 1-2 minuty w temperaturze 37 °C w inkubatorze z użyciem CO2 .</li>
	<li>Dodać 3,5 ml D-MEM zawierającego 10% FBS i 1% P/S do kolby. Odpipetować do mieszania.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę komórek do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i odwirowywać przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Należy pamiętać, że promień obrotu i prędkość obrotowa wirówki wynoszą odpowiednio 16,6 cm i 1500 obr./min. W tym stanie względna siła odśrodkowa wynosi 417 x g.</li>
	<li>Dodać 5 ml świeżego D-MEM (10% FBS i 1% P/S) do kolby po zassaniu pożywki (w razie potrzeby kriokonserwować komórki roztworem do krioprezerwacji, postępując zgodnie ze wskazówkami producenta).</li>
</ol>
2. Przygotowanie dekstranu (DEX)
<ol>
	<li>Przygotować 80 mg/ml roztworu DEX, mieszając 10 ml D-MEM (10% FBS, 1% P/S) i 0,8 g DEX. Należy pamiętać, że roztwór DEX można przefiltrować za pomocą filtra strzykawkowego (0,22 μm) po odpowiednim czasie hodowli komórek.</li>
	<li>Przygotować zawiesinę komórkową zawierającą 40 mg/ml pożywki DEX przez zmieszanie 200 μl roztworu DEX i 200 μl zawiesiny komórek przygotowanej w 2.1. Należy zauważyć, że gęstość liczbowa komórek w roztworze wynosi około 2,3×105 komórek/ml.</li>
</ol>
3. Przygotowanie do pracy z laserem i mikroskopią
<ol>
	<li>Włącz laser (fala ciągła, długość fali 1,064 nm) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1a). Należy pamiętać, że użycie wiązki laserowej o długości fali w zakresie od czerwieni do bliskiej podczerwieni jest najbardziej skuteczne; Ten obszar długości fali nazywany jest oknem diagnostyczno-terapeutycznym<klasa SUP="xref">10, ponieważ jest minimalnie absorbowany przez komórki.</li>
	<li>Kliknij dwukrotnie ikonę oprogramowania.</li>
	<li>Kliknij dwukrotnie ikony (1) kamery, (2) diody elektroluminescencyjnej (LED), (3) regulacji ostrości i (4) ruchomego stage. Na wyświetlaczach odpowiadających (1)-(4) pojawi się (Rysunek 1b).</li>
</ol>
4. Manipulacja komórkami za pomocą laserowego systemu pułapkowania
<ol>
	<li>Umieścić 20 μl próbki przygotowanej w kroku 2.2 na dolnej szklance pokrywowej (grubość 0,17 mm, rozmiar = 30 mm × 40 mm) i przykryć ją górnym szkłem nakrywkowym (grubość 0,17 mm, wielkość = 18 mm × 18 mm), z separacją zapewnioną przez dwie przekładki (grubość 0,17 mm, wielkość = 10 mm × 24 mm), jak pokazano w Rysunek 2. Należy pamiętać, że te okulary nie wymagają specjalnej powłoki.</li>
	<li>Umieścić celę próbki przygotowaną w kroku 4.1 na dolnej soczewce obiektywu (zanurzenie w wodzie ok. 10 μl, powiększenie = 60X, odległość robocza = 0,28 mm, apertura numeryczna = 1,2)).</li>
	<li>Zamocuj górną soczewkę obiektywu (zanurzenie w wodzie o wielkości ok. 10 μl, powiększenie = 60X, odległość robocza = 2 mm, apertura numeryczna = 1,0) w górnej części celi próbki.</li>
	<li>Włącz światło LED, klikając ikonę 2 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1b).</li>
	<li>Dostosuj odległość między próbką a dolną soczewką obiektywu, klikając ikony na panelu 3 (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1b), aż znajdzie się w ostrości.</li>
	<li>Naświetlić wiązki laserowe w pozycji 1 i pozycji 2 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B) próbki, klikając ikony I, II i III (<silna klasa="xfig">Rysunek 1b).</li>
	<li>Ustaw intensywność każdej wiązki laserowej na 1 500 mW, wprowadzając tę wartość w ikonie IV (<silna klasa="xfig">Rysunek 1b).</li>
	<li>Przesuń etap próbki, klikając ikonę 4 wskazującą kierunki (Rysunek 1b), aż komórka zostanie uwięziona w pozycji 1 (Rysunek 1b).</li>
	<li>Przeciągnij kursor wskazujący pozycję 2 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1b), aż inna komórka zostanie uwięziona w pozycji 2.</li>
</ol>
5. Budowa trójwymiarowej (3D) struktury komórkowej
<ol>
	<li>Manipuluj pojedynczą komórką tak, aby stykała się z inną komórką. Utrzymuj ten stan przez 300 s; Oznacza to, że każda komórka jest naświetlana laserem przez 300 s.</li>
	<li>Zapisz oś X-Y pokazaną w Rysunek 1b.</li>
	<li>Skonstruuj dowolny zespół komórek 2D, łapiąc i transportując inną komórkę do komórek.</li>
	<li>Zbuduj zespół komórkowy 3D, przesuwając stół montażowy w górę i w dół.</li>
	<li>Upewnij się, że zespół pozostaje stabilny po wyłączeniu lasera.</li>
</ol>

<ol><li>Aloysious, N., Nair, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+survival+and+function+of+islet-like+clusters+differentiated+from+adipose+stem+cells+on+a+three-dimensional+natural+polymeric+scaffold%3A+an+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Enhanced survival and function of islet-like clusters differentiated from adipose stem cells on a three-dimensional natural polymeric scaffold: an in vitro study.</a> Tissue Engineering Part A. 20 (9-10), 1508-1522 (2014).</li>
<li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li>
<li>Kirkham, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+assembly+of+complex+cellular+microenvironments+using+holographic+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Precision assembly of complex cellular microenvironments using holographic optical tweezers.</a> Scientific Reports. 5, 8577(2015).</li>
<li>Liu, Y., Rayatpisheh, S., Chew, S. Y., Chan-Park, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+endothelial+cells+on+3D+cultured+smooth+muscle+cells+in+a+biomimetic+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Impact of endothelial cells on 3D cultured smooth muscle cells in a biomimetic hydrogel.</a> ACS Applied Materials & Interfaces. 4 (3), 1378-1387 (2012).</li>
<li>Liu, Z. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dextran-based+hydrogel+formed+by+thiol-Michael+addition+reaction+for+3D+cell+encapsulation%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces+B%22%5BJournal%5D)">Dextran-based hydrogel formed by thiol-Michael addition reaction for 3D cell encapsulation.</a> Colloids and Surfaces B. 128, 140-148 (2015).</li>
<li>McKee, C., Perez-Cruet, M., Chavez, F., Chaudhry, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+three-dimensional+culture+system+for+long-term+expansion+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Simplified three-dimensional culture system for long-term expansion of embryonic stem cells.</a> World Journal of Stem Cells. 7 (7), 1064-1077 (2015).</li>
<li>Sadovska, L., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29248729">A novel 3D heterotypic spheroid model for studying extracellular vesicle-mediated tumor and immune cell communication.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2017).</li>
<li>Srinivasan, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+Salivary+Human+Stem%2FProgenitor+Cells+Undergo+Microenvironment-Driven+Acinar-Like+Differentiation+in+Hyaluronate+Hydrogel+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Primary Salivary Human Stem/Progenitor Cells Undergo Microenvironment-Driven Acinar-Like Differentiation in Hyaluronate Hydrogel Culture.</a> Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 110-120 (2017).</li>
<li>Yoshida, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.mdpi.com/2073-4360/9/8/319">Manipulating living cells to construct a 3D single-cell assembly without an artificial scaffold.</a> Polymers. 9, 319(2017).</li>
<li>Anderson, R. R., Parrish, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+photothermolysis%3A+precise+microsurgery+by+selective+absorption+of+pulsed+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Selective photothermolysis: precise microsurgery by selective absorption of pulsed radiation.</a> Science. 220, 524-527 (1983).</li>
<li>Hashimoto, S., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0009261416303207">Formation of Stable Cell-Cell Contact without a Solid/Gel Scaffold: Non-invasive Manipulation by Laser under Depletion Interaction with a Polymer.</a> Chemical Physics Letters. 655, 11-16 (2016).</li>
<li>Rauch, P., Jähnke, T. <a target="_blank" href="https://www.cambridge.org/core/journals/microscopy-today/article/optical-tweezers-for-quantitative-force-measurements-and-live-cell-experiments/D4853D94DFD7AE988E656F49A1DA49FB">Optical Tweezers for Quantitative Force Measurements and Live Cell Experiments.</a> Microscopy Today. 22, 26-30 (2014).</li>
<li>Ichikawa, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18315348">Tilt control in optical tweezers.</a> Journal of Biomedical Optics. 13, 010503(2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Niniejsze badanie pokazuje konkretne zastosowanie naszych ostatnich raportów 9,11 na temat wykorzystania rozpuszczalnych polimerów do budowy jednokomórkowych zespołów 3D. Takie zespoły są stabilnie formowane w roztworze masowym, gdy liczba komórek wynosi do 10 i mogą być utrzymywane przez pojedynczą wiązkę laserową. Zespoły wytrącają się na powierzchni szkła, gdy jest więcej niż 10 komórek. Chociaż eksperymenty są wciąż w początkowej fazie, spodziewamy się, że nowatorska metodologia może być potężnym narzędziem do budowy jednokomórkowych zespołów 3D nowej generacji, które są niezbędne do postępu w dziedzinie biologii komórki i medycyny regeneracyjnej.
W roztworze niezawierającym polimeru komórki odpychają się nawzajem z powodu odpychania elektrostatycznego wynikającego z ładunku powierzchniowego, siły odpychania hydratacji, efektu odpychania glikokaliksu i falowania błony. Nasze poprzednie badanie wykazało, że pary komórek mogą być stabilne przez długi czas, gdy komórki są traktowane PEG. Co ważniejsze, udany transport pary komórek do regionu bez PEG, po tym, jak komórki były utrzymywane w kontakcie przez 5 minut w PEG, sugeruje, że kontakt komórkowy jest utrzymywany w stabilny sposób. Jest to dobrze wyjaśnione w kategoriach efektu wyczerpania11 i zasadniczo ten sam mechanizm dotyczy zestawów komórkowych generowanych za pomocą DEX9. Nasze obecne wyniki sugerują, że inne rodzaje naturalnych makrocząsteczek mogą być również wykorzystane do budowy stabilnych zestawów komórkowych 3D.
Dla szybkiego transportu komórek ważne jest stężenie polimeru. Ogólnie rzecz biorąc, lepkość roztworu drastycznie wzrasta, gdy polimer rozpuszcza się powyżej stężenia nakładającego się. W tym stanie trudno jest manipulować komórkami za pomocą pęsety optycznej. W związku z tym doświadczenie należy przeprowadzić poniżej stężenia nakładającego się. Dla roztworu DEX stężenie nakładające się wynosi ok. 50 mg/ml (lepkość kinetyczna wynosi 5,5 mm2/s). Jak pokazano w Ref. 9, zaobserwowano stabilny zespół komórkowy, gdy stężenie DEX wynosiło od 10 mg / ml do 40 mg / mL. Wynik ten sugeruje, że efekt zubożenia jest wystarczająco duży, aby utrzymać stabilny kontakt komórka-komórka, nawet gdy stężenie DEX jest niższe niż stężenie nakładające się. Wykazano, że dodatek DEX nie wpływa na żywotność komórek do 40 mg/ml 9.
Opracowanie metody budowy zespołów komórkowych 3D jest ważne w dziedzinie medycyny regeneracyjnej, ponieważ naśladowanie mikrośrodowiska komórkowego in vivo poprzez strukturyzację pojedynczych komórek może ułatwić tworzenie tkanek pochodzących z komórek macierzystych. Do tej pory używaliśmy obecnego protokołu do konstruowania zestawów komórkowych przy użyciu komórek Neuro2A9 oprócz komórek NMuMG. Mamy nadzieję, że uda nam się ustalić eksperymentalną metodologię konstruowania trójwymiarowych zespołów komórkowych większej liczby komórek o różnej morfologii. System pęset optycznych opracowany przez Ichikawę i wsp.13 miałoby zastosowanie do tego celu, ponieważ orientacja komórek może być kontrolowana. Dalsze badania w tym kierunku powinny być obiecujące.

Podczas gdy ludzkie tkanki składają się z kilku zespołów komórek i mogą pomóc w utrzymaniu homeostazy organizmu, pojedyncze komórki same w sobie również odgrywają ważną rolę poprzez interakcję między komórkami. Dlatego ważne jest, aby wyjaśnić, w jaki sposób pojedyncze komórki mogą być stymulowane przez sygnały zewnętrzne i w jaki sposób przekazują takie sygnały innym przylegającym komórkom. W tym celu ustalono kilka metod budowy jednokomórkowych zespołów 3-wymiarowych (3D) opartych na jednej komórce1,2,3,4,5,6,7,8. Jednak materiały używane do budowy zespołów komórkowych można jeszcze ulepszyć. Na przykład syntetyczne żele i polimery, w tym glikol polietylenowy (PEG), mają pewne chemiczne właściwości fizykochemiczne i mogą wpływać na komórki docelowe (np. toksyczność).
Niedawno opisaliśmy nowy system, który może generować jednokomórkowy zestaw komórek 3D za pomocą dekstranu (DEX) poprzez ustanowienie stabilnego kontaktu komórka-komórka9. Uznaliśmy, że technologia ta może być przydatna w kilku dziedzinach badań, w tym w medycynie regeneracyjnej, a nawet biologii nowotworów. W tym raporcie opisujemy, w jaki sposób manipulujemy pojedynczymi komórkami i konstruujemy trójwymiarowe (3D) zespoły komórkowe w obecności różnych hydrofilowych biomakrocząsteczek, w tym DEX, bez sztucznego rusztowania.

<table><tbody><tr><td>Mikroskop IX71</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>Dextran(200 000; klasa biologii molekularnej)</td><td>Wako</td><td>CAS.NO&nbsp; 9004-54-0</td><td></td></tr><tr><td>System pułapkowania laserowego (NanoTracker 2)</td><td>JPK Instruments</td><td>S/N T-05-0200</td><td></td></tr><tr><td>Górna soczewka obiektywu</td><td>Olympus</td><td>LUMPLFLN60XW</td><td></td></tr><tr><td>Dolna soczewka obiektywowa</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO60XW</td><td></td></tr><tr><td>Szkło pokrywy górnej</td><td>MATUNAMI</td><td>C022401</td><td></td></tr><tr><td>Szkło osłonowe pośrednie (dystans)</td><td>MATUNAMI-wykonane</td><td></td> <td>na zamówienie (rozmiar = 10mm&razy; 10 mm, grubość = 0,17 mm)</td></tr><tr><td>Dolna pokrywa szklana</td><td>MATUNAMI</td><td>C030401</td><td></td></tr><tr><td>Kamera</td><td>Źródło obrazowania</td><td>DFK 31AF03</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie</td><td>JPK Instruments</td><td>NanoTracker2 Oprogramowanie</td><td></td></tr><tr><td>PFM Komórki NMuMG&nbsp;</td><td>RIKEN BRC</td><td>RCB2868</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Wako</td><td>166-23555</td><td></td></tr><tr><td>Bankier komórkowy</td><td>Nippon Zenyaku Kogyo</td><td>ZR621</td><td></td></tr><tr><td>D-MEM</td><td>Wako Pure Chem. Ind., Japonia</td><td>044-29765</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Cell Culture Biosci., Nichirei Biosci. Inc., Japonia</td><td>172012-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Wako Pure Chem. Ind., Japonia</td><td>161-23181</td><td></td></tr></tbody></table>

manipulowanie żywymi komórkami w celu zbudowania stabilnego zespołu komórkowego 3d bez sztucznego rusztowania

Manipulating Living Cells to Construct Stable 3D Cellular Assembly Without Artificial Scaffold

Medycyna regeneracyjna i inżynieria tkankowa oferują wiele zalet w leczeniu trudnych do opanowania chorób, a kilka badań wykazało znaczenie trójwymiarowych (3D) zespołów komórkowych w tych dziedzinach. Sztuczne rusztowania były często używane do budowy zespołów komórkowych 3D. Jednak rusztowania używane do budowy zespołów komórkowych są czasami toksyczne i mogą zmieniać właściwości komórek. W związku z tym korzystne byłoby ustanowienie nietoksycznej metody ułatwiającej kontakt komórka-komórka. W tym artykule przedstawiono nowatorską metodę konstruowania stabilnych zespołów komórkowych za pomocą pęsety optycznej z dekstranem. Jedną z zalet tej metody jest to, że w ciągu kilku minut nawiązuje stabilny kontakt między komórkami. Ta nowa metoda pozwala na konstruowanie trójwymiarowych zespołów komórkowych w naturalnym hydrofilowym polimerze i oczekuje się, że będzie przydatna do konstruowania jednokomórkowych zespołów 3D nowej generacji w dziedzinie medycyny regeneracyjnej i inżynierii tkankowej.

Rysunek 1 przedstawia mikroskop oraz oprogramowanie wykorzystane w niniejszym badaniu. Rysunek 2 jest schematyczną prezentacją procedury nanoszenia roztworu próbki zawierającego komórki. Rysunek 3 demonstruje tworzenie struktury piramidalnej przy użyciu dwowiązkowych pęset optycznych. W przypadku powodzenia eksperymentu, te agregaty komórkowe pozostają stabilne nawet po wyłączeniu lasera.
<img alt="System ultradźwiękowy (a) i oprogramowanie analityczne (b) do śledzenia pozycji w badaniu obrazowania medycznego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57815/57815fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: (a) System sterowania dla systemu pułapkowania laserowego (NanoTracker2 (11)). System jest aktywowany poprzez włączenie przełącznika lasera zgodnie z krokami ①-③. (b) Oprogramowanie do sterowania systemem pułapkowania laserowego. Kamera, oświetlenie LED, regulacja ostrości oraz ruchoma platforma są aktywowane poprzez kliknięcie odpowiednio ikon ①, ②, ③ i ④. Obraz mikroskopowy jest wyświetlany w panelu 1. Sterowanie włączaniem/wyłączaniem oświetlenia LED znajduje się w panelu 2. Ostrość jest regulowana w panelu 3. Wiązki laserowe są emitowane w pozycjach 1 i 2 poprzez kliknięcie ikon od I do IV. Szczegóły dotyczące tego systemu pułapkowania laserowego podano w Ref. (12). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57815/57815fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Proces przygotowania preparatu do mikroskopii; schemat przedstawia montaż i konfigurację obrazowania do analizy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57815/57815fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Reprezentatywny schemat rozmieszczenia szkiełka przedmiotowego. 20 µL próbki (zawiesina komórek zawierająca dekstran) jest nanoszona na szkiełko i wykorzystywana do manipulacji laserowej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57815/57815fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Struktura komórkowa; schemat porównania modeli molekularnych; mikroskopia; analiza biologii komórki." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57815/57815fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: a) Zespoły komórek nabłonkowych (NMuMG) o zamierzonym kształcie w medium z DEX (40 mg/mL): jako przykład klastra 3D przedstawiono piramidę. b) Przedstawiono również schematyczny rysunek piramidowego zespołu komórkowego 3D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57815/57815fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Pokazujemy nowatorską metodę konstruowania jednokomórkowego trójwymiarowego (3D) montażu bez sztucznego rusztowania.

Manipulowanie żywymi komórkami w celu zbudowania stabilnego zespołu komórkowego 3D bez sztucznego rusztowania

Regenerative medicine and tissue engineering offer several advantages for the treatment of intractable diseases, and several studies have demonstrated the ...

Ta nowatorska metodologia pozwala nam konstruować trójwymiarowe zespoły, dostosowane do pożądanych pojedynczych komórek, w wodnym roztworze buforowym zawierającym niespecyficzny polimer hydrofilowy, poprzez ustanowienie stabilnego kontaktu komórka-komórka. W tym filmie pokażemy, w jaki sposób manipulujemy pożądanymi pojedynczymi komórkami i konstruujemy zestawy komórkowe 3D bez sztucznego rusztowania. Tutaj pokażemy procedurę eksperymentalną w naszym pożywce na przykładzie Dekstranu.Na początek utrzymuj komórki nabłonka gruczołu sutkowego myszy NAMRU za pomocą pięciu mililitrów DMEM, zawierającego 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny, w kolbie o pojemności 25 centymetrów sześciennych przez dwa do trzech dni. Gdy będziesz gotowy do kontynuowania, użyj aspiratora, aby usunąć uzupełniony DMEM i dodaj od trzech do pięciu mililitrów PBS, który jest wstępnie podgrzany do 37 stopni Celsjusza, aby umyć komórki. Za pomocą aspiratora usunąć cały PBS z kolby.Dodaj 1,5 mililitra trypsyny podgrzanej do 37 stopni Celsjusza. Inkubować w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej jedną do dwóch minut. Następnie dodaj 3,5 mililitra DMEM zawierającego 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny.Pipetować w górę i w dół, aby wymieszać. Przenieś zawiesinę komórkową do 15-mililitrowej probówki wirówkowej i odwiruj ją w temperaturze 417 razy G przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Następnie odessać pożywkę.Dodaj pięć milimetrów świeżego DMEM zawierającego 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny. W razie potrzeby użyj roztworu do krioprezerwacji, aby dokonać krioprezerwacji komórek zgodnie z instrukcjami producenta. Najpierw wymieszaj 10 mililitrów DMEM uzupełnionego 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny z 0,8 grama dekstranu, aby przygotować 80 miligramów na mililitr roztworu dekstranu.Zmieszaj 200 mikrolitrów tego roztworu dekstranu z 200 mikrolitrami wcześniej przygotowanej zawiesiny komórek, aby utworzyć zawiesinę komórkową zawierającą 40 miligramów na mililitr pożywki z dekstranem. Aby rozpocząć, włącz laser, zwróć uwagę, że najskuteczniejsze jest użycie wiązki laserowej o długości fali w zakresie od czerwieni do bliskiej podczerwieni. Następnie otwórz oprogramowanie, klikając dwukrotnie ikonę oprogramowania.Kliknij dwukrotnie ikonę kamery i zwróć uwagę, że pojawi się odpowiedni wyświetlacz. Następnie kliknij dwukrotnie ikony diody elektroluminescencyjnej, regulacji ostrości i ruchomego sceny, aby otworzyć również ich wyświetlacze. Najpierw umieść dwie szklane przekładki na szkiełku podstawowym dolnej pokrywy.Przenieść 20 mikrolitrów, wcześniej przygotowaną zawiesinę komórkową uzupełnioną dekstranem na dolne szkiełko podstawowe. Następnie umieść szkiełko pokrywowe na przekładkach zakrywających zawieszenie ogniwa. Umieść próbkę na dolnej soczewce obiektywu z 10 mikrolitrami wody destylowanej do mikroskopii zanurzeniowej w wodzie.Przymocuj górną soczewkę obiektywu w górnej części sample cell za pomocą 10 mikrolitrów wody destylowanej. Następnie kliknij przycisk włączania/wyłączania w oknie oświetlenia mikroskopu, aby włączyć diodę LED. Kliknij przyciski kierunkowe w oknie pozycjonowania obiektywu, aby wyregulować odległość między próbką a dolną soczewką obiektywu, aż do uzyskania ostrości.Ustaw intensywność każdej wiązki laserowej na 1500 miliwatów w oknie tłumienia sygnału. Następnie kliknij dwie ikony lasera, aby napromieniować wiązki laserowe w pozycji pierwszej i drugiej. Kliknij przyciski kierunkowe w oknie pozycjonowania próbki, aby przesunąć stolik próbki, aż komórka zostanie uwięziona w pozycji pierwszej.Kliknij i przeciągnij kursor wskazujący pozycję drugą, aż inna komórka zostanie uwięziona w pozycji drugiej. Na początek manipuluj pojedynczą komórką tak, aby stykała się z inną komórką. Utrzymuj ten stan przez 300 sekund, tak aby komórka była wystawiona na działanie lasera przez 300 sekund.Zapisz oś x-y. Złap kolejną komórkę w pułapkę i przetransportuj ją do pierwszych dwóch komórek, aby skonstruować dowolny zestaw komórek 2D. Następnie przesuń stół montażowy w górę i w dół, aby skonstruować zestaw komórkowy 3D.Upewnij się, że zespół jest nadal stabilny nawet po wyłączeniu lasera. W tym badaniu rozpuszczalne polimery są wykorzystywane do budowy zespołów 3D pojedynczych komórek. Przykładowa konstrukcja wykonana za pomocą pęsety optycznej z podwójną wiązką jest pokazana tutaj.Jeśli eksperyment się powiedzie, te zespoły komórkowe pozostają stabilne nawet po wyłączeniu lasera. Ta nowa metodologia służy do budowy zespołów komórkowych 3D w środowisku wodnym z naturalnym hydrofilowym polimerem. Oczekuje się, że rozpocznie się budowa tego rodzaju zestawów komórkowych nowej generacji z niektórymi potężnymi narzędziami w dziedzinie medycyny regeneracyjnej i inżynierii tkankowej.

manipulating-living-cells-to-construct-stable-3d-cellular-assembly

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Przedstawiamy dwa procesy mikrofabrykacji porowatych polimerowych chipów do trójwymiarowej hodowli komórek. Pierwszy z nich to tłoczenie na gorąco w połączeniu z procesem spawania oparami rozpuszczalnika. Drugi wykorzystuje niedawno opracowany proces mikrotermoformowania w połączeniu z technologią śladów jonowych, co prowadzi do znacznego uproszczenia produkcji.

Mikrofabrykacja rusztowań w skali chipa do trójwymiarowej hodowli komórek

Niniejszy artykuł przedstawia wszechstronną metodę tworzenia pierścieni tkankowych pochodzenia komórkowego poprzez samoorganizację komórkową. Komórki mięśni gładkich zasiane w pierścieniowatych studzienkach agarozowych agregują i kurczą się, tworząc wytrzymałe tkanki trójwymiarowe (3D) w ciągu 7 dni. Pierścienie tkankowe o skali milimetrowej nadają się do testów mechanicznych i służą jako podstawowe elementy do montażu tkanek.

Kierowana samoorganizacja komórkowa w celu wytwarzania pierścieni tkankowych pochodzenia komórkowego do analiz biomechanicznych i inżynierii tkankowej

W niniejszej pracy opisujemy zastosowanie samoorganizującego się rusztowania trójwymiarowego do hodowli ludzkich komórek progenitorowych neuronów. Przedstawiamy protokół uwalniania komórek z rusztowań w celu ich późniejszej analizy, np. za pomocą cytometrii przepływowej. Protokół ten może zostać dostosowany do innych typów komórek w celu przeprowadzenia szczegółowych badań mechanistycznych.

Hodowla ludzkich komórek progenitorowych neuronów w trójwymiarowym samoorganizującym się hydrożelu peptydowym

Aby stworzyć wysoce zorganizowane struktury złożonej tkanki, należy złożyć wiele typów materiałów i komórek w zintegrowany kompozyt.  Ten kombinatoryczny projekt obejmuje warstwowe arkusze komórek specyficzne dla narządów z dwoma odrębnymi materiałami pochodzenia biologicznego, zawierającymi silną włóknistą podstawę macierzy oraz komórki śródbłonka w celu usprawnienia tworzenia nowych naczyń.

Inżynieria tkankowa: budowa wielokomórkowego rusztowania 3D do dostarczania warstwowych arkuszy komórkowych

A kartezjańska biodrukarka została zaprojektowana i wyprodukowana, aby umożliwić osadzanie wielu materiałów w precyzyjnych, powtarzalnych geometriach, jednocześnie umożliwiając kontrolę czynników środowiskowych. Korzystając z trójwymiarowej biodrukarki, można drukować i łatwo odtwarzać złożone i żywotne konstrukcje.

Żywotność biodrukowanych konstruktów komórkowych przy użyciu drukarki kartezjańskiej z trzema dozownikami

Ten protokół opisuje platformę do produkcji samodzielnie składających się pierścieni tkankowych w różnych rozmiarach przy użyciu dostosowanej formy z tworzywa sztucznego wydrukowanej w 3D. Negatywy PDMS są utwardzane w formie wydrukowanej w 3D; następnie agaroza jest odlewana w utwardzonych negatywach PDMS. Komórki są wysiewane do powstałych studzienek agarozowych, gdzie agregują się w pierścienie tkankowe.

Wytwarzanie niestandardowych studzienek agarozowych do wysiewu komórek i samomontażu pierścieni tkankowych przy użyciu form drukowanych w 3D

Tutaj prezentujemy protokół uzyskiwania systemów hodowli 3D w samoorganizujących się rusztowaniach peptydowych, aby promować różnicowanie odróżnicowanych ludzkich chondrocytów stawowych w tkankę podobną do chrząstki.

Hodowla komórek ssaków w trójwymiarowych rusztowaniach peptydowych

Przedstawiamy procedurę kontrolowania początkowego kształtu klastra komórkowego w trójwymiarowej matrycy zewnątrzkomórkowej w celu uzyskania powtarzalnego formowania wzoru. Sześcienne urządzenie zawierające dwa różne hydrożele jest wykorzystywane do uzyskania wielokierunkowego obrazowania w celu tworzenia wzoru tkankowego.

Wstępna kontrola klastrów komórkowych 3D w hybrydowym urządzeniu do tworzenia sześcianów żelowych w celu tworzenia powtarzalnych wzorów

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę produkcji trzech różnych typów sferoidów w sposób, który czyni je odpowiednimi do badań przesiewowych i analiz na dużą skalę o wysokiej zawartości. Ponadto przedstawiono przykłady pokazujące, w jaki sposób można je analizować na poziomie sferoidalnym i poszczególnych komórek.

Niezawodna metoda produkcji sferoid na dużą skalę do zastosowań związanych z przesiewaniem i analizą o wysokiej zawartości

Sferoidy komórkowe były uważane za jeden z potencjalnych modeli w dziedzinie zastosowań biologicznych. W tym artykule opisano protokoły skalowalnego generowania sferoid komórkowych za pomocą urządzenia do montażu akustycznego 3D, które zapewnia wydajną metodę solidnego i szybkiego wytwarzania jednolitych sferoid komórkowych.

Trójwymiarowe akustyczne urządzenie montażowe do masowej produkcji sferoid komórkowych

Poznaj metodę budowania stabilnych trójwymiarowych zespołów komórkowych bez sztucznego rusztowania przy użyciu polimerów hydrofilowych i pęset optycznych. Technika ta umożliwia precyzyjną manipulację pojedynczymi komórkami w inżynierii tkankowej.

Manipulowanie żywymi komórkami w celu zbudowania stabilnego zespołu komórkowego 3D bez sztucznego rusztowania

Przeglądaj więcej filmów