Name: In Situ Mikroskopia do określania w czasie rzeczywistym morfologii pojedynczych komórek w bioprocesach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Poznaj mikroskopię in situ do monitorowania morfologii pojedynczych komórek w czasie rzeczywistym. Ta metoda umożliwia ocenę wielkości, kształtu i aglomeracji komórek bez ryzyka zanieczyszczenia próbek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy są wdzięczni za wsparcie niemieckiego Federalnego Ministerstwa Gospodarki i Energii w ramach ZIM-Koop, projekt "Inspekcja Smart Process", nr grantu. ZF 4184201CR5.

<ol><li>Maaß, S., Rojahn, J., Hänsch, R., Kraume, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+drop+detection+using+image+analysis+for+online+particle+size+monitoring+in+multiphase+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Computers+%26+Chemical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Automated drop detection using image analysis for online particle size monitoring in multiphase systems.</a> Computers & Chemical Engineering. 45, 27-37 (2012).</li>
<li>Lemoine, A., Delvigne, F., Bockisch, A., Neubauer, P., Junne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+for+the+determination+of+population+heterogeneity+caused+by+inhomogeneous+cultivation+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Tools for the determination of population heterogeneity caused by inhomogeneous cultivation conditions.</a> Journal of biotechnology. 251, 84-93 (2017).</li>
<li>Marbà-Ardébol, A. M., Bockisch, A., Neubauer, P., Junne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sterol+synthesis+and+cell+size+distribution+under+oscillatory+growth+conditions+in+Saccharomyces+cerevisiae+scale-down+cultivations%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Sterol synthesis and cell size distribution under oscillatory growth conditions in Saccharomyces cerevisiae scale-down cultivations.</a> Yeast. 35 (2), 213-223 (2017).</li>
<li>Xiao, Y., Bowen, C. H., Liu, D., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+nongenetic+cell-to-cell+variation+for+enhanced+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Exploiting nongenetic cell-to-cell variation for enhanced biosynthesis.</a> Nature chemical biology. 12 (5), 339-344 (2016).</li>
<li>Beutel, S., Henkel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+sensor+techniques+in+modern+bioprocess+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+microbiology+and+biotechnology%22%5BJournal%5D)">In situ sensor techniques in modern bioprocess monitoring.</a> Applied microbiology and biotechnology. 91 (6), 1493(2011).</li>
<li>Belini, V. L., Wiedemann, P., Suhr, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+microscopy%3A+A+perspective+for+industrial+bioethanol+production+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+microbiological+methods%22%5BJournal%5D)">In situ microscopy: A perspective for industrial bioethanol production monitoring.</a> Journal of microbiological methods. 93 (3), 224-232 (2013).</li>
<li>Havlik, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+microalgal+cultivations+with+on-line%2C+flow-through+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Algal+Research%22%5BJournal%5D)">Monitoring of microalgal cultivations with on-line, flow-through microscopy.</a> Algal Research. 2 (3), 253-257 (2013).</li>
<li>Suhr, H., Herkommer, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+microscopy+using+adjustment-free+optics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomedical+optics%22%5BJournal%5D)">In situ microscopy using adjustment-free optics.</a> Journal of biomedical optics. 20 (11), 116007(2015).</li>
<li>Panckow, R. P., Reinecke, L., Cuellar, M. C., Maaß, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photo-Optical+In-Situ+Measurement+of+Drop+Size+Distributions%3A+Applications+in+Research+and+Industry%5BTitle%5D)+AND+%22Oil+Gas+Sci.+Technol.+-+Rev.+IFP+Energies%22%5BJournal%5D)">Photo-Optical In-Situ Measurement of Drop Size Distributions: Applications in Research and Industry.</a> Oil Gas Sci. Technol. - Rev. IFP Energies. 72 (3), 14(2017).</li>
<li>Marbà-Ardébol, A. -M., Emmerich, J., Neubauer, P., Junne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell-based+monitoring+of+fatty+acid+accumulation+in+Crypthecodinium+cohnii+with+three-dimensional+holographic+and+in+situ+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Process+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Single-cell-based monitoring of fatty acid accumulation in Crypthecodinium cohnii with three-dimensional holographic and in situ microscopy.</a> Process Biochemistry. 52, 223-232 (2017).</li>
<li>Porro, D., Vai, M., Vanoni, M., Alberghina, L., Hatzis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+and+modeling+of+growing+budding+yeast+populations+at+the+single+cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A+%3A+the+journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Analysis and modeling of growing budding yeast populations at the single cell level.</a> Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 75 (2), 114-120 (2009).</li>
<li>Brauer, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+growth+rate%2C+cell+cycle%2C+stress+response%2C+and+metabolic+activity+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast.</a> Molecular biology of the cell. 19 (1), 352-367 (2008).</li>
<li>Puxbaum, V., Gasser, B., Mattanovich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bud+tip+is+the+cellular+hot+spot+of+protein+secretion+in+yeasts%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+microbiology+and+biotechnology%22%5BJournal%5D)">The bud tip is the cellular hot spot of protein secretion in yeasts.</a> Applied microbiology and biotechnology. 100 (18), 8159-8168 (2016).</li>
<li>Marbà-Ardébol, A. M., Emmerich, J., Neubauer, P., Junne, S. Vol. P2. Prozessmesstechnik. 13. Dresdner Sensor-Symposium 201, Hotel Elbflorenz, Dresden, , 222-225 (2017).</li>
<li>Marbà-Ardébol, A. -M., Emmerich, J., Muthig, M., Neubauer, P., Junne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+the+budding+index+in+Saccharomyces+cerevisiae+batch+cultivations+with+in+situ+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+cell+factories%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of the budding index in Saccharomyces cerevisiae batch cultivations with in situ microscopy.</a> Microbial cell factories. 17 (1), 73(2018).</li>
<li>Marquard, D., Schneider-Barthold, C., Düsterloh, S., Scheper, T., Lindner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Online+monitoring+of+cell+concentration+in+high+cell+density+Escherichia+coli+cultivations+using+in+situ+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Online monitoring of cell concentration in high cell density Escherichia coli cultivations using in situ Microscopy.</a> Journal of biotechnology. 259, 83-85 (2017).</li>
<li>Marquard, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+microscopy+for+online+monitoring+of+cell+concentration+in+Pichia+pastoris+cultivations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biotechnology%22%5BJournal%5D)">In situ microscopy for online monitoring of cell concentration in Pichia pastoris cultivations.</a> Journal of biotechnology. 234, 90-98 (2016).</li>
<li>Camisard, V., Brienne, J., Baussart, H., Hammann, J., Suhr, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inline+characterization+of+cell+concentration+and+cell+volume+in+agitated+bioreactors+using+in+situ+microscopy%3A+application+to+volume+variation+induced+by+osmotic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+bioengineering%22%5BJournal%5D)">Inline characterization of cell concentration and cell volume in agitated bioreactors using in situ microscopy: application to volume variation induced by osmotic stress.</a> Biotechnology and bioengineering. 78 (1), 73-80 (2002).</li>
<li>Böhm, A., Ücker, A., Jäger, T., Ronneberger, O., Falk, T. ISOODL: Instance segmentation of overlapping biological objects using deep learning. 2018 IEEE 15th International Symposium on Biomedical Imaging, , 1225-1229 (2018).</li>
<li>Davey, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life%2C+Death%2C+and+In-Between%3A+Meanings+and+Methods+in+Microbiology%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Life, Death, and In-Between: Meanings and Methods in Microbiology.</a> Applied and environmental microbiology. 77 (16), 5571-5576 (2011).</li>
<li>Lodolo, E. J., Kock, J. L., Axcell, B. C., Brooks, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yeast+Saccharomyces+cerevisiae-the+main+character+in+beer+brewing%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+yeast+research%22%5BJournal%5D)">The yeast Saccharomyces cerevisiae-the main character in beer brewing.</a> FEMS yeast research. 8 (7), 1018-1036 (2008).</li>
<li>Albertin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+size+drives+industrial+Saccharomyces+cerevisiae.+alcoholic+fermentation+and+is+under+genetic+control%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Population size drives industrial Saccharomyces cerevisiae. alcoholic fermentation and is under genetic control.</a> Applied and environmental microbiology. 77 (8), 2772-2784 (2011).</li>
<li>Gomes, J., Chopda, V. R., Rathore, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+systems+analysis+and+control+for+implementing+process+analytical+technology+in+bioprocess+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Technology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Integrating systems analysis and control for implementing process analytical technology in bioprocess development.</a> Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 90 (4), 583-589 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do zadeklarowania.

Do pomiaru dynamiki morfologicznej grzybów, mikroalg i komórek drożdży wykorzystano ISM w postaci przedstawionej tutaj z tymi samymi lub bardzo podobnymi urządzeniami, co umożliwiło określenie aktywności wzrostu, a w przypadku glonów akumulacji produktu wewnątrzkomórkowego. Czujnik nie ma ruchomych części i może być bezpośrednio stosowany w każdym standardowym bioreaktorze zbiornikowym z mieszadłem, zarówno przez standardowy port, jak i w sterylizowalnym obejściu. Ponieważ drożdże są znacznie mniejsze niż glony, zmniejsz...

Cechy morfologiczne komórek są często związane ze stanem fizjologicznym, związek między formą a funkcją istnieje dla wielu zastosowań. Na morfologię pojedynczej komórki ma wpływ stan wzrostu, wiek komórki, osmotyczne i inne potencjalne stresy komórkowe lub akumulacja produktu. Zmiany morfologiczne komórek są często miarą żywotności wzrostu kultury. Wewnątrzkomórkowa synteza produktów, akumulacja lipidów w algach i tworzenie ciał inkluzyjnych u bakterii są również związane z wielkością komórki. Kolejnym czynnikiem, który warto zbadać, może być aglomeracja komórek, jak podsumowano niedawno2.
Niejednorodność populacji może być określana ilościowo na podstawie cech morfologicznych poszczególnych komórek. Badania wykazały, że heterogeniczność w obrębie kultury może być znacząca, np. w warunkach produkcji na dużą skalę3 na ogólną wydajność subpopulacji może mieć wpływ niska wydajność subpopulacji4.
Zazwyczaj, ocena cech morfologicznych komórek jest wykonywana przez ręczne pobieranie próbek lub za pomocą komory przepływowej by-pass sprzężonej z urządzeniem fotooptycznym. Prowadzi to do kilku ograniczeń: ograniczona ilość pozyskanych danych z trudem zapewnia statystycznie wiarygodne pomiary; opóźnienie czasowe między pobraniem próbek a dostępnością wyników może być zbyt duże w porównaniu z dynamiką procesu; A co najważniejsze, procedura pobierania próbek (lokalizacja portu pobierania próbek, wstępna obróbka próbki przed pomiarem, niekorzystne warunki w probówce do pobierania próbek lub obejściu) może wywołać błąd tendencyjny, ponieważ sama procedura pobierania próbek może już wpływać na morfologię komórki. Wreszcie, zawsze istnieje wysokie ryzyko zanieczyszczenia podczas pobierania próbek lub w roztworach obejściowych, jeśli nie można ich sterylizować na miejscu.
Zastosowanie mikroskopii in situ (ISM) może obejść kilka z tych problemów. Jeśli komórki zostaną wykryte automatycznie, można przeprowadzić poprawną identyfikację ich cech morfologicznych5. Do tej pory głównymi ograniczeniami tej metody były (i) czas oceny obrazów, który był zbyt długi dla zastosowań in situ, oraz (ii) słaba rozdzielczość obrazów, zwłaszcza przy dużej gęstości komórek. Chociaż pierwsze rozwiązania ISM obejmowały mechaniczne pobieranie próbek, rozcieńczanie sondy lub były ograniczone do systemu obejściowego6,7, dalsze podejścia pozwalają na bezpośrednie przechwytywanie zawiesiny komórek8.
Ostatnie osiągnięcia w ISM pozwalają na monitorowanie komórek w trybie line lub on-line na podstawie pojedynczej komórki, co zapewnia rozkład parametrów morfologicznych w czasie rzeczywistym bezpośrednio w zawiesinach komórkowych przy znacznie wysokich stężeniach komórek. Dzięki analizom off-line kluczowych parametrów komórek można zidentyfikować korelacje z informacjami dostarczanymi przez sprzężoną automatyczną detekcję komórek i ISM. Następnie uzyskuje się nowe konstrukcje miękkich czujników, w których niemierzalny parametr jest szacowany na podstawie morfologii pojedynczej komórki.
W tym raporcie, ISM jest przeprowadzany poprzez sprzężenie sondy fotooptycznej z automatyczną analizą obrazu. Technologia ISM składa się z jednoprętowej sondy sensorycznej, która umożliwia rejestrowanie obrazów w znanym zakresie ostrości w regulowanej szczelinie pomiarowej za pomocą kamery CCD o wysokiej rozdzielczości [MM-Ho = CCD GT2750 (2750x2200) i MM 2.1 = CMOS G507c (2464x2056)]. Oświetlenie lampą błyskową odbywa się przez transmisję. W związku z tym światło pochodzi z przeciwnej strony kamery9 i jego intensywność można regulować. Komórki przechodzą w sposób ciągły przez tę szczelinę wraz ze strumieniem cieczy. W związku z tym uzyskuje się reprezentatywną populację próby. Sonda może być zamontowana bezpośrednio do bioreaktora tak, aby sięgała do zawiesiny ogniwa, lub może być używana w sterylizowalnym by-passie. Obudowa czujnika jest podłączona do systemu przed sterylizacją, części optyczne są następnie montowane w obudowie.
Do tej pory badano odpowiednie mikroorganizmy przemysłowe, np. grzyby strzępkowe (średnica do ponad 200 μm), heterotroficzne mikroalgi Crypthecodinium cohnii (średnia średnica komórki 20 μm) oraz drożdże Saccharomyces cerevisiae (średnia średnica komórki 5 μm), były badane za pomocą tego lub podobnych urządzeń, które są pokrótce opisane.
Grzyby strzępkowe mają tendencję do tworzenia granulek w określonych warunkach uprawy. Są one o wielkości do kilkuset μm. Strzępki komórek grzyba rozwijają różną długość w zależności od naprężenia hydrodynamicznego w fazie płynnej. Ma to wpływ na aktywność metaboliczną i wzrostową, pobieranie substratu i uwalnianie produktu. Zastosowano ISM w celu określenia rozkładu wielkości granulek i szerokości stref o mniejszej gęstości biomasy na krawędziach granulek (dane własne niepublikowane).
Wielkość C. cohnii zmienia się między 15 a 26 μm, gdy komórki gromadzą wielonienasycony kwas tłuszczowy kwas dokozaheksaenowy (DHA) pod wpływem ograniczenia azotu. Ten biotechnologiczny proces produkcji DHA składa się z dwóch części: fazy wzrostu, w której komórki dzielą się i stają się mniejsze, oraz fazy produkcji, w której komórki gromadzą produkt, a tym samym stają się większe. W związku z tym wielkość komórki wykorzystano do określenia stanu procesu, w którym korzystny był wzrost lub produkcja DHA. Ostatecznie stwierdzono korelację między wielkością komórki a zawartością DHA. W tym przypadku technologia ISM pozwala monitorować wewnątrzkomórkową akumulację DHA w czasie rzeczywistym bez konieczności pobierania próbek, rozbijania komórek i wspólnej analizy metodą chromatografii gazowej10.
Pączkujące drożdże zwykle mają wielkość od 3 do 8 μm. Odsetek komórek, które są w stanie dojrzewania w danym momencie, zgodnie z opisem wskaźnika pączkowania (BI), dostarcza informacji o żywotności wzrostu11,12, a nawet udowodniono związek z wydzielaniem rekombinowanego białka13. Za pomocą ISM wyróżniono pączkujące i niepączkujące komórki drożdży (komórki z pączkiem i bez)14. Warunki stresowe mogą również prowadzić do szerszego zróżnicowania wielkości komórek w populacji drożdży, jak ostatnio wykazano w uprawach na małą skalę, w których naśladowano warunki upraw na dużą skalę z ograniczoną ilością składników odżywczych i były naśladowane3.
Dlatego ISM ma potencjał do monitorowania wzrostu, żywotności i tworzenia produktu na poziomie pojedynczej komórki podczas wszystkich etapów bioprocesu w celu identyfikacji optymalnych warunków uprawy lub w celu kontroli procesu. Opisane tutaj metody koncentrują się na zastosowaniach mikrobiologicznych z pojedynczymi komórkami, ale mają również zastosowanie do większych cząstek, takich jak komórki ludzkie i zwierzęce, aglomeraty komórkowe i granulki organizmów nitkowatych.

<table><tbody><tr><td>Czujnik MM 2.1 - MFC</td><td>SOPAT GmbH, Niemcy</td><td>n.a.Monokularowa</td> <td>sonda mikroskopowa Inline Wersja 2.1 z komórką przepływową Mirco</td></tr><tr><td>Wersja oprogramowania v1R.003.0092</td><td>SOPAT GmbH, Niemcy</td><td>n.a.Grubościomierz</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>b.n.Może</td><td></td> <td>to być dowolny dostawca, DIN 2275:2014-03</td></tr><tr><td>Etanol 70%</td><td>n.n.Może</td><td></td> <td>to być dowolny dostawca</td></tr><tr><td>Wersja instrukcji SOPAT 2.0.5</td><td>SOPAT GmbH, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Papier do soczewek optycznych</td><td>VWR</td><td>470150-460</td><td></td></tr><tr><td>Fidżi, ImageJ</td><td>open source</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml stożkowe probówki</td><td></td><td></td> wirówkowe <td>Może to być dowolny dostawca</td></tr></tbody></table>

in situ mikroskopia do określania w czasie rzeczywistym morfologii pojedynczych komórek w bioprocesach

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

Monitorowanie in situ w bioprocesach mikrobiologicznych ogranicza się głównie do właściwości chemicznych i fizycznych podłoża (np. wartości pH i stężenia tlenu rozpuszczonego). Niemniej jednak morfologia komórek może być odpowiednim wskaźnikiem optymalnych warunków, ponieważ zmienia się w zależności od stanu wzrostu, akumulacji produktu i stresu komórkowego. Co więcej, rozkład wielkości pojedynczych komórek dostarcza nie tylko informacji o warunkach uprawy, ale także o niejednorodności populacji. Aby uzyskać takie informacje, opracowano urządzenie do mikroskopii fotooptycznej in situ1, aby umożliwić monitorowanie rozkładu wielkości pojedynczej komórki bezpośrednio w zawiesinie komórek w bioreaktorach. Zautomatyzowana analiza obrazu jest sprzężona z mikroskopią opartą na modelu sieci neuronowej, który jest trenowany na obrazach z adnotacjami użytkownika. Kilka parametrów, które uzyskuje się na podstawie ujęć mikroskopu, jest skorelowanych z istotnymi cechami komórek w procesie, takimi jak ich aktywność metaboliczna. Do tej pory prezentowana seria sond mikroskopowych in situ była stosowana do pomiaru wielkości osadów w zawiesinach grzybów strzępkowych. Wykorzystano go do rozróżnienia wielkości pojedynczej komórki w hodowli mikroalg i powiązania jej z akumulacją lipidów. Kształt cząstek komórkowych był związany z pączkowaniem w kulturach drożdży. Analizę mikroskopową można ogólnie podzielić na trzy etapy: (i) akwizycja obrazu, (ii) identyfikacja cząstek oraz (iii) analiza danych. Wszystkie kroki muszą być dostosowane do organizmu, dlatego w celu uzyskania wiarygodnych wyników wymagane są określone informacje z adnotacjami. Możliwość monitorowania zmian w morfologii komórek bezpośrednio na linii lub w trybie on-line (w obejściu) umożliwia monitorowanie i kontrolowanie wartości w czasie rzeczywistym, zarówno w rozwoju procesu, jak i w skali produkcji. Jeśli dane off-line korelują z danymi w czasie rzeczywistym, obecne żmudne pomiary off-line z nieznanymi wpływami na rozmiar komórki stają się zbędne.

Pomyślnie przeprowadzono detekcję wielkości komórek w kulturach drożdży z wykorzystaniem ISM oraz zautomatyzowaną analizę obrazu w celu rozróżnienia komórek pączkujących od niepączkujących. Zarówno natężenie stroboskopu, jak i wybór szczeliny pomiarowej posiadają zakres tolerancji, w którym identyfikacja cząstek nie zostaje zaburzona. Na przykład komórki S. cerevisiae mierzono przy różnych natężeniach stroboskopu w zakresie zmienności 1% przy stężeniu suchej biomasy 4 g L-1<...

Urządzenie do mikroskopii fotooptycznej in situ zostało opracowane do monitorowania wielkości pojedynczych komórek bezpośrednio w zawiesinie komórki. Pomiar w czasie rzeczywistym odbywa się poprzez sprzężenie sondy fotooptycznej z możliwością sterylizacji z automatyczną analizą obrazu. Zmiany morfologiczne pojawiają się w zależności od stanu wzrostu i warunków uprawy.

In Situ Mikroskopia do określania w czasie rzeczywistym morfologii pojedynczych komórek w bioprocesach

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące heterogeniczności populacji poprzez ocenę morfologiczną komórek. Mikroskopia in situ pozwala na zbadanie warunków uprawy, wydajności procesu i jakości produktu. Główną zaletą tej techniki jest pomiar in situ, który dostarcza danych w czasie rzeczywistym bez pobierania próbek lub ryzyka zanieczyszczenia.Mikroskopia in situ w połączeniu z automatycznym rozpoznawaniem obrazów może dostarczyć dodatkowych informacji o strukturach komórkowych, kształcie i aglomeracji komórek poza rozmiarem. Możliwe jest również zmierzenie stężenia komórek. Metoda ta okazała się niezawodnym narzędziem.Żadna alternatywna metoda nie dostarcza tych samych informacji w tak krótkim czasie i przy tak niewielkim wysiłku związanym z przygotowaniem próbki. Metoda została dostosowana do różnych bioprocesów i mikroorganizmów, grzybów strzępkowych SEC, mikroalergii i drożdży. Sonda jest używana w połączeniu z komputerem.Sprzęt składa się z pojedynczej sondy prętowej z kamerą CCD o wysokiej rozdzielczości. Komórki, które przechodzą przez regulowaną szczelinę pomiarową, są obrazowane przez kamerę. Światło wpada do szczeliny naprzeciwko kamery, co oznacza, że oświetlenie odbywa się przez transmisję.Ustaw parametry sprzętowe przy użyciu stężeń komórek, które obejmują oczekiwany zakres. Rozpocznij przygotowania do pomiarów offline. Użyj miernika grubości, aby wyregulować szczelinę pomiarową.Następnie przekręć nakrętkę sondy, aby ustawić szczelinę pomiarową na pięcio- lub 10-krotność maksymalnej oczekiwanej średnicy ogniwa. Na komputerze otwórz oprogramowanie sterownika sondy. W oprogramowaniu wybierz żądaną sondę i przejdź do akcji sekcji.Następnie naciśnij Połącz. Następnie przejdź do zakładki Sterowanie sondą i otwórz ją. Rozpocznij strumieniowe przesyłanie wideo, naciskając przycisk odtwarzania.Zamocuj sondę na statywie i wykonaj następujące czynności dla każdego pomiaru. Pracuj z sondą i rozpyl etanol w szczelinie pomiarowej. Ostrożnie zetrzyj kurz i brud papierem optycznym.W komputerze użyj podglądu na żywo, aby sprawdzić, czy szkło czujnika jest wolne od cząstek. Następnie umieść suchy papier optyczny w szczelinie pomiarowej w celu ustawienia ostrości. Przekręć wiążącą, aby ręcznie przesunąć ostrość.Przestań ustawiać ostrość, gdy pojedyncze włókna papieru w szczelinie pomiarowej są wyraźnie widoczne. Teraz weź tubkę wypełnioną bulionem kulturowym. Zanurz mikroskop w bulionie, tak aby szczelina była całkowicie pokryta zawiesiną komórkową.Użyj wiążących, aby precyzyjnie dostroić ostrość na komórkach. Po zakończeniu ustawiania ostrości nie zmieniaj go ponownie podczas eksperymentu. Wróć do oprogramowania eksperymentu.Przejdź do menu Wyzwalanie. W menu Wyzwalanie ustaw liczbę klatek na sekundę. Do pomiarów offline zalecany jest jeden herc.Stamtąd przejdź do pola Frames Per Trigger i ustaw je jako konieczne, aby uzyskać dobre statystyki. Tutaj około 200. Przejdź także do menu Ogólne.Tam wybierz katalog, w którym zostaną zapisane obrazy. Rozpocznij akwizycję obrazu za pomocą przycisku Rozpocznij akwizycję wyzwalacza obrazu. Delikatnie przesuń rurkę, aby wywołać przepływ w szczelinie pomiarowej.Użyj obrazów z pierwszego uruchomienia eksperymentu jako zestawu treningowego. Przygotuj oprogramowanie open source Fiji i upuść obrazy z eksperymentu w jego oknie. Po zakończeniu wybierz Analizuj, a następnie Narzędzia, a następnie Menedżer zwrotu z inwestycji.Następnie wybierz narzędzie do zaznaczania. Na obrazie zdecyduj się na cząstkę do adnotacji, która jest ostra. Narysuj wokół niego okrąg za pomocą narzędzia do zaznaczania.Naciśnij przycisk Dodaj, aby dodać adnotację do Menedżera zwrotu z inwestycji. Następnie wybierz narzędzie pędzla i wybierz odpowiedni rozmiar w pikselach. Użyj narzędzia Pędzel, aby zawęzić zaznaczenie.Kontynuuj oznaczanie wszystkich interesujących Cię obiektów w ten sam sposób na około 15 obrazach. Zapisz pliki z adnotacjami i użyj ich jako zestawu treningowego. Gdy algorytm rozpoznawania jest wytrenowany i gotowy, użyj go do wizualizacji wyników.W Analizatorze wyników przejdź do Plik, a następnie Importuj plik. Tam wybierz żądany plik wyników. Kontynuuj, naciskając przycisk Utwórz wykres.Wybierz pozycję Wykres rozkładu. Spowoduje to wyświetlenie rozkładu morfologicznego kultury. Wróć do Utwórz wykres, aby wybrać opcję Wykres czułości.Wyświetlane informacje mogą pomóc w określeniu, ile komórek należy przeanalizować, aby uzyskać żądaną dokładność. Wykonuj pomiary online po zakończeniu pomiarów offline. Aby uzyskać pomiary online, podłącz sondę bezpośrednio do bioreaktora.Po podłączeniu odpowiednio wysterylizuj zespół. Wybierz pozycję Monitorowanie na pulpicie nawigacyjnym. Dostępny jest przycisk odtwarzania, aby rozpocząć pobieranie obrazu i przycisk stop, aby je zakończyć.Naciśnij przycisk odtwarzania. W bioreaktorze rozpocznij inokulację kultury. Kamera przechwyci wideo z komórek i automatycznie zidentyfikuje je do analizy.Monitorowanie dostarcza danych online o rozmiarach i kształtach komórek o różnych morfologiach podczas całej fermentacji. Wyniki w czasie rzeczywistym można formatować na różne sposoby, a także eksportować do dalszej analizy. Ten wykres skumulowanych rozkładów średnicy komórek S.Cerevisiae jest tworzony na podstawie danych analizowanych przy użyciu tej techniki.Pokazuje, że automatyczne rozpoznawanie komórek jest w stanie odróżnić komórki pączkujące i niepączkujące. Krzywa bryłowa to rozkład podczas uprawy w ciągu trzech godzin. Krzywa przerywana to rozkład tej samej uprawy po siedmiu godzinach.Krzywa przerywana reprezentuje dane zebrane po 13 godzinach. Procedura adnotacji jest czasochłonna, ale jest kluczem do osiągnięcia pożądanej dokładności identyfikacji komórek. Dzięki tej procedurze, jeśli czasy pomiaru są krótsze niż dynamika procesu, pomiar w czasie rzeczywistym może być wykorzystany do sterowania procesem.Technika ta toruje drogę do wykorzystania pomiaru heterogeniczności populacji jako parametru procesu dla upraw mikroorganizmów od wczesnych etapów rozwoju procesu do skali produkcji.

in-situ-microscopy-for-real-time-determination-single-cell-morphology

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

W niniejszym materiale prezentujemy protokoły przeprowadzania mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek na żywych komórkach bakteryjnych, co umożliwia wykrywanie, śledzenie i kwantyfikację funkcjonalnych kompleksów molekularnych.

Wizualizacja pojedynczych kompleksów molekularnych In vivo Wykorzystanie zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej

W wielu sytuacjach biologicznych i klinicznych korzystne jest badanie procesów komórkowych w ich naturalnym mikrośrodowisku. W niniejszym materiale opisujemy montaż i zastosowanie niedrogiego mikroskopu światłowodowego, który umożliwia obrazowanie w czasie rzeczywistym w hodowlach komórkowych, badaniach na zwierzętach oraz w badaniach klinicznych z udziałem pacjentów.

Wysokorozdzielcza mikroendoskopia światłowodowa do obrazowania komórkowego in situ

Źródło: Brzozowski, R. S. i in. Mikroskopia fluorescencyjna żywych komórek w celu badania lokalizacji białek podkomórkowych oraz zmian morfologii komórek u bakterii. J. Vis. Exp. (2019)Ten film demonstruje mikroskopię fluorescencyjną żywych komórek, aby wizualizować zmiany morfologiczne bakterii w czasie rzeczywistym. Opisuje etapy związane z obrazowaniem, akwizycją poklatkową oraz dekonwolucją w celu uzyskania obrazów o wysokiej rozdzielczości w czasie rzeczywistym.

Obrazowanie zmian morfologicznych u bakterii za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek

W tym protokole przedstawiono produkcję, konfigurację i podstawowe działanie mikroprzepływowego bioreaktora pikolitrowego (PLBR) do analizy pojedynczych komórek mikroorganizmów prokariotycznych. Mikroorganizmy istotne z przemysłowego punktu widzenia zostały przeanalizowane jako dowód zasadności, co pozwoliło na wgląd w tempo wzrostu, morfologię i niejednorodność fenotypową w określonych okresach czasu, co jest prawie niemożliwe przy użyciu konwencjonalnych metod.

Mikroprzepływowy bioreaktor pikoliterowy do analizy mikrobiologicznej pojedynczych komórek: produkcja, konfiguracja systemu i obsługa

Tutaj opisujemy procedurę obrazowania kompleksów wirusowych w cieczy w rozdzielczości nanometrowej za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego.

In situ TEM zespołów biologicznych w cieczy

Badania biomolekuł in vivo są kluczowe dla zrozumienia funkcji molekularnej w kontekście biologicznym. W tym miejscu opisujemy nowatorską metodę pozwalającą na internalizację biomolekuł fluorescencyjnych, takich jak DNA czy białka, do żywych mikroorganizmów. Przedstawiono i omówiono również analizę danych in vivo zarejestrowanych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Internalizacja i obserwacja biomolekuł fluorescencyjnych w żywych mikroorganizmach za pomocą elektroporacji

Mikroreologia śledząca cząstki bada lepkosprężystość materiałów. W tym przypadku technika ta jest wykorzystywana do określania lepkosprężystości, podatności pełzania i efektywnych ról sieciowania różnych składników matrycy biofilmu bakteryjnego. Matryca składa się z substancji polimerowych wydzielanych przez bakterie, a jej składniki decydują o budowie biofilmu i właściwościach mechanicznych.

In Situ Mapowanie właściwości mechanicznych biofilmów za pomocą mikroreologii śledzącej cząstki

Ten artykuł zawiera przewodnik krok po kroku do badania dynamiki lokalizacji subkomórkowej białek i monitorowania zmian morfologicznych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej o wysokiej rozdzielczości u Bacillus subtilis i Staphylococcus aureus.

Mikroskopia fluorescencyjna żywych komórek w celu zbadania lokalizacji białek subkomórkowych i zmian morfologii komórek u bakterii

Ten protokół wyjaśnia, jak przygotować i zamontować próbki bakterii do trójwymiarowego obrazowania na żywo oraz jak zrekonstruować trójwymiarowy kształt E. coli na podstawie tych obrazów.

Trójwymiarowe obrazowanie komórek bakteryjnych w celu dokładnego odwzorowania komórek i precyzyjnej lokalizacji białek

Obrazowanie komórek bakteryjnych to nowe podejście do biologii systemowej, skoncentrowane na definiowaniu statycznych i dynamicznych procesów, które dyktują funkcjonowanie dużych maszyn makromolekularnych. W tym przypadku integracja ilościowego obrazowania żywych komórek i tomografii krioelektronowej jest wykorzystywana do badania architektury i funkcji systemu wydzielania Legionella pneumophila typu IV.

Zastosowanie obrazowania żywych komórek i tomografii krioelektronowej w celu określenia czasoprzestrzennych cech systemu wydzielania kropk/icm Legionella pneumophila

Tomografia krio-STEM umożliwia wizualizację organelli nienaruszonych komórek bez osadzania, cięcia lub innych inwazyjnych przygotowań. Uzyskana rozdzielczość 3D mieści się obecnie w zakresie kilku nanometrów, przy polu widzenia kilku mikrometrów i dostępnej grubości rzędu 1 μm.

Wizualizacja organelli in situ za pomocą tomografii krio-STEM

Poznaj mikroskopię in situ do monitorowania morfologii pojedynczych komórek w czasie rzeczywistym. Ta metoda umożliwia ocenę wielkości, kształtu i aglomeracji komórek bez ryzyka zanieczyszczenia próbek.

In Situ Mikroskopia do określania w czasie rzeczywistym morfologii pojedynczych komórek w bioprocesach

Przeglądaj więcej filmów