In Situ Mikroskopia do określania w czasie rzeczywistym morfologii pojedynczych komórek w bioprocesach
5 grudnia 2019
Urządzenie do mikroskopii fotooptycznej in situ zostało opracowane do monitorowania wielkości pojedynczych komórek bezpośrednio w zawiesinie komórki. Pomiar w czasie rzeczywistym odbywa się poprzez sprzężenie sondy fotooptycznej z możliwością sterylizacji z automatyczną analizą obrazu. Zmiany morfologiczne pojawiają się w zależności od stanu wzrostu i warunków uprawy.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące heterogeniczności populacji poprzez ocenę morfologiczną komórek. Mikroskopia in situ pozwala na zbadanie warunków uprawy, wydajności procesu i jakości produktu. Główną zaletą tej techniki jest pomiar in situ, który dostarcza danych w czasie rzeczywistym bez pobierania próbek lub ryzyka zanieczyszczenia.
Mikroskopia in situ w połączeniu z automatycznym rozpoznawaniem obrazów może dostarczyć dodatkowych informacji o strukturach komórkowych, kształcie i aglomeracji komórek poza rozmiarem. Możliwe jest również zmierzenie stężenia komórek. Metoda ta okazała się niezawodnym narzędziem.
Żadna alternatywna metoda nie dostarcza tych samych informacji w tak krótkim czasie i przy tak niewielkim wysiłku związanym z przygotowaniem próbki. Metoda została dostosowana do różnych bioprocesów i mikroorganizmów, grzybów strzępkowych SEC, mikroalergii i drożdży. Sonda jest używana w połączeniu z komputerem.
Sprzęt składa się z pojedynczej sondy prętowej z kamerą CCD o wysokiej rozdzielczości. Komórki, które przechodzą przez regulowaną szczelinę pomiarową, są obrazowane przez kamerę. Światło wpada do szczeliny naprzeciwko kamery, co oznacza, że oświetlenie odbywa się przez transmisję.
Ustaw parametry sprzętowe przy użyciu stężeń komórek, które obejmują oczekiwany zakres. Rozpocznij przygotowania do pomiarów offline. Użyj miernika grubości, aby wyregulować szczelinę pomiarową.
Następnie przekręć nakrętkę sondy, aby ustawić szczelinę pomiarową na pięcio- lub 10-krotność maksymalnej oczekiwanej średnicy ogniwa. Na komputerze otwórz oprogramowanie sterownika sondy. W oprogramowaniu wybierz żądaną sondę i przejdź do akcji sekcji.
Następnie naciśnij Połącz. Następnie przejdź do zakładki Sterowanie sondą i otwórz ją. Rozpocznij strumieniowe przesyłanie wideo, naciskając przycisk odtwarzania.
Zamocuj sondę na statywie i wykonaj następujące czynności dla każdego pomiaru. Pracuj z sondą i rozpyl etanol w szczelinie pomiarowej. Ostrożnie zetrzyj kurz i brud papierem optycznym.
W komputerze użyj podglądu na żywo, aby sprawdzić, czy szkło czujnika jest wolne od cząstek. Następnie umieść suchy papier optyczny w szczelinie pomiarowej w celu ustawienia ostrości. Przekręć wiążącą, aby ręcznie przesunąć ostrość.
Przestań ustawiać ostrość, gdy pojedyncze włókna papieru w szczelinie pomiarowej są wyraźnie widoczne. Teraz weź tubkę wypełnioną bulionem kulturowym. Zanurz mikroskop w bulionie, tak aby szczelina była całkowicie pokryta zawiesiną komórkową.
Użyj wiążących, aby precyzyjnie dostroić ostrość na komórkach. Po zakończeniu ustawiania ostrości nie zmieniaj go ponownie podczas eksperymentu. Wróć do oprogramowania eksperymentu.
Przejdź do menu Wyzwalanie. W menu Wyzwalanie ustaw liczbę klatek na sekundę. Do pomiarów offline zalecany jest jeden herc.
Stamtąd przejdź do pola Frames Per Trigger i ustaw je jako konieczne, aby uzyskać dobre statystyki. Tutaj około 200. Przejdź także do menu Ogólne.
Tam wybierz katalog, w którym zostaną zapisane obrazy. Rozpocznij akwizycję obrazu za pomocą przycisku Rozpocznij akwizycję wyzwalacza obrazu. Delikatnie przesuń rurkę, aby wywołać przepływ w szczelinie pomiarowej.
Użyj obrazów z pierwszego uruchomienia eksperymentu jako zestawu treningowego. Przygotuj oprogramowanie open source Fiji i upuść obrazy z eksperymentu w jego oknie. Po zakończeniu wybierz Analizuj, a następnie Narzędzia, a następnie Menedżer zwrotu z inwestycji.
Następnie wybierz narzędzie do zaznaczania. Na obrazie zdecyduj się na cząstkę do adnotacji, która jest ostra. Narysuj wokół niego okrąg za pomocą narzędzia do zaznaczania.
Naciśnij przycisk Dodaj, aby dodać adnotację do Menedżera zwrotu z inwestycji. Następnie wybierz narzędzie pędzla i wybierz odpowiedni rozmiar w pikselach. Użyj narzędzia Pędzel, aby zawęzić zaznaczenie.
Kontynuuj oznaczanie wszystkich interesujących Cię obiektów w ten sam sposób na około 15 obrazach. Zapisz pliki z adnotacjami i użyj ich jako zestawu treningowego. Gdy algorytm rozpoznawania jest wytrenowany i gotowy, użyj go do wizualizacji wyników.
W Analizatorze wyników przejdź do Plik, a następnie Importuj plik. Tam wybierz żądany plik wyników. Kontynuuj, naciskając przycisk Utwórz wykres.
Wybierz pozycję Wykres rozkładu. Spowoduje to wyświetlenie rozkładu morfologicznego kultury. Wróć do Utwórz wykres, aby wybrać opcję Wykres czułości.
Wyświetlane informacje mogą pomóc w określeniu, ile komórek należy przeanalizować, aby uzyskać żądaną dokładność. Wykonuj pomiary online po zakończeniu pomiarów offline. Aby uzyskać pomiary online, podłącz sondę bezpośrednio do bioreaktora.
Po podłączeniu odpowiednio wysterylizuj zespół. Wybierz pozycję Monitorowanie na pulpicie nawigacyjnym. Dostępny jest przycisk odtwarzania, aby rozpocząć pobieranie obrazu i przycisk stop, aby je zakończyć.
Naciśnij przycisk odtwarzania. W bioreaktorze rozpocznij inokulację kultury. Kamera przechwyci wideo z komórek i automatycznie zidentyfikuje je do analizy.
Monitorowanie dostarcza danych online o rozmiarach i kształtach komórek o różnych morfologiach podczas całej fermentacji. Wyniki w czasie rzeczywistym można formatować na różne sposoby, a także eksportować do dalszej analizy. Ten wykres skumulowanych rozkładów średnicy komórek S.Cerevisiae jest tworzony na podstawie danych analizowanych przy użyciu tej techniki.
Pokazuje, że automatyczne rozpoznawanie komórek jest w stanie odróżnić komórki pączkujące i niepączkujące. Krzywa bryłowa to rozkład podczas uprawy w ciągu trzech godzin. Krzywa przerywana to rozkład tej samej uprawy po siedmiu godzinach.
Krzywa przerywana reprezentuje dane zebrane po 13 godzinach. Procedura adnotacji jest czasochłonna, ale jest kluczem do osiągnięcia pożądanej dokładności identyfikacji komórek. Dzięki tej procedurze, jeśli czasy pomiaru są krótsze niż dynamika procesu, pomiar w czasie rzeczywistym może być wykorzystany do sterowania procesem.
Technika ta toruje drogę do wykorzystania pomiaru heterogeniczności populacji jako parametru procesu dla upraw mikroorganizmów od wczesnych etapów rozwoju procesu do skali produkcji.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Opracowano urządzenie do foto-optycznej mikroskopii in situ w celu monitorowania rozmiaru pojedynczych komórek bezpośrednio w zawiesinie komórkowej. Technika ta umożliwia pomiar zmian morfologicznych komórek w czasie rzeczywistym, w zależności od stanu ich wzrostu oraz warunków hodowli.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Techniki mikroskopowe
- Obrazowanie w czasie rzeczywistym
Wstęp
- Heterogeniczność populacji jest kluczowa dla zrozumienia zachowania komórkowego.
- Mikroskopia in situ dostarcza informacji o warunkach hodowli i jakości produktu.
- Zautomatyzowane rozpoznawanie obrazów usprawnia gromadzenie danych.
- Metoda ta minimalizuje ryzyko kontaminacji związane z pobieraniem próbek.
Cel badania
- Aby ocenić charakterystykę morfologiczną komórek w czasie rzeczywistym.
- Aby ocenić wpływ różnych warunków hodowli na wielkość i kształt komórek.
- Aby zapewnić niezawodne narzędzie do pomiaru stężeń komórek.
Zastosowane metody
- Urządzenie do foto-optycznej mikroskopii in situ
- Zautomatyzowana analiza obrazu
- Monitorowanie pojedynczych komórek w czasie rzeczywistym
- Ocena zmian morfologicznych
Główne wyniki
- Zbieranie danych w czasie rzeczywistym bez ryzyka kontaminacji.
- Możliwość pomiaru aglomeracji i struktury komórek.
- Niezawodna ocena wielkości i koncentracji komórek.
- Wgląd w wpływ warunków hodowli na morfologię komórek.
Wnioski
- Opracowana metoda jest skuteczna w badaniu dynamiki pojedynczych komórek.
- Mikroskopia in situ może znacząco zwiększyć nasze zrozumienie procesów komórkowych.
- Technika ta stanowi cenne narzędzie dla badaczy w dziedzinie biologii komórki.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Mikroskopia in situ w czasie rzeczywistym umożliwia bezpośrednie, wolne od zanieczyszczeń monitorowanie morfologii pojedynczych komórek oraz heterogeniczności populacji w bioprocesach. Możliwość ta dostarcza praktycznych informacji na temat stanu komórek, warunków procesu i jakości produktu, wspierając pewność predykcyjną w krytycznych punktach zwrotnych etapu odkryć i rozwoju. Integracja zautomatyzowanej analizy obrazu z modelami sieci neuronowych dodatkowo zwiększa niezawodność i skalowalność ocen morfologicznych w zróżnicowanych systemach mikrobiologicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia ilościową ocenę morfologii komórek jako funkcjonalny odczyt w celu ograniczenia ryzyka biologicznego.
- Wspiera identyfikację indukowanego procesem stresu komórkowego oraz przejść w stanach wzrostu istotnych dla walidacji celu.
- Ułatwia szybkie testowanie hipotez dotyczących wpływu warunków hodowli na fenotyp komórek.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zestandaryzowane, powtarzalne rozkłady rozmiarów i kształtów pojedynczych komórek na potrzeby opracowywania testów.
- Dostarcza ilościowe wyniki w czasie rzeczywistym, odpowiednie do przesiewania wysokoprzepustowego i optymalizacji procesów.
- Ogranicza ręczną obsługę próbek, minimalizując ryzyko kontaminacji i zwiększając wydajność operacyjną.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia monitorowanie heterogeniczności populacji jako biomarkera translacyjnego w celu zapewnienia spójności procesu.
- Wspiera ciągłość przejścia z wczesnego etapu opracowywania procesu do skali produkcyjnej poprzez korelację danych morfologicznych z aktywnością metaboliczną i akumulacją produktu.
- Usprawnia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju w oparciu o analizę ryzyka, dostarczając w czasie rzeczywistym specyficznych dla organizmu informacji morfologicznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta platforma mikroskopii in situ integruje etapy od wczesnego odkrywania, poprzez rozwój procesu, aż po produkcję, umożliwiając ciągłe monitorowanie i kontrolę morfologii komórek oraz dynamiki populacji.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków metabolicznych poprzez powiązanie zmian morfologicznych z warunkami hodowli i stanem komórek.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, ilościowe dane morfologiczne do oceny gotowości testów i analizy związków.
- Analityka: Zapewnia zautomatyzowaną analizę obrazu opartą na sieciach neuronowych w celu przeprowadzenia solidnego porównania statystycznego populacji komórek.
- Badania translacyjne: Koreluje monitorowanie morfologiczne z biomarkerami istotnymi dla procesu w celu zapewnienia ciągłości badań przedklinicznych i produkcji.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje skalowalną i adaptowalną do różnych organizmów platformę do ciągłego monitorowania i optymalizacji procesów.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i walidację celu poprzez ilościowe określenie heterogeniczności populacji oraz przesunięć morfologicznych.
- Wartość operacyjna: Optymalizuje przepływy pracy dzięki automatycznej analizie w czasie rzeczywistym i ograniczeniu ręcznej interwencji.
- Wartość strategiczna: Dostarcza wysokiej częstotliwości, praktycznych danych niezbędnych do podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu projektu (go/no-go) oraz wprowadzania korekt procesowych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój wielu procesów biotechnologicznych i organizmów.
Kwestie wdrożeniowe
- Wymaga wiedzy z zakresu adnotacji obrazów oraz trenowania sieci neuronowych w celu adaptacji do konkretnych organizmów.
- Wymaga sprzętu do mikroskopii o wysokiej rozdzielczości oraz kompatybilnej infrastruktury oprogramowania analitycznego.
- Wymaga standaryzacji protokołów adnotacji i analizy pomiędzy zespołami w celu zapewnienia powtarzalności.
- Adaptacja do nowych typów komórek lub procesów może wymagać dodatkowych adnotowanych zestawów treningowych.
- Adnotacja jest czasochłonna, ale ma kluczowe znaczenie dla osiągnięcia pożądanej dokładności w identyfikacji komórek.
