Name: Generowanie mysiego ortotopowego modelu raka piersi z przerzutami i wykonywanie radykalnej mastektomii u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 5 s
Description: Poznaj metodę generowania mysiego ortotopowego modelu raka piersi z przerzutami i wykonywania radykalnej mastektomii. Technika bioluminescencyjna umożliwia ilościową ocenę obciążenia nowotworowego w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez grant NIH R01CA160688 oraz grant Susan G. Komen Foundation Investigator Initiated Research (IIR12222224) dla K.T. Myszy obrazy bioluminescencji zostały pozyskane przez współdzielony zasób Translational Imaging Shared Resource w Roswell Park Comprehensive Cancer Center, który był wspierany przez Cancer Center Support Grant (P30CA01656) i Shared Instrumentation grant (S10OD016450).

Uzyskano zgodę od Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Roswell Park Comprehensive Cancer Center dla wszystkich eksperymentów.
UWAGA: Uzyskano od dziewięciu do dwunastu tygodni samic myszy BALB/c. Zastosowano komórki 4T1-luc2, mysią linię komórkową gruczolakoraka sutka pochodzącą od myszy BALB/c, która została zaprojektowana do ekspresji lucyferazy. Komórki te są hodowane w pożywce Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS).
1. Przygotowanie instrumentów
<ol>
	<li>Rozmrozić zamrożoną galaretowatą mieszaninę białek (np. Matrigel) na lodzie w kapturze do hodowli tkankowych.</li>
	<li>Przed zabiegiem należy oczyścić i autoklawować dwa zestawy narzędzi chirurgicznych (nożyczki do mikrodysekcji, kleszcze Adson i uchwyt na igłę). Przygotuj wysterylizowane szwy jedwabne 5-0 i suchy sterylizator (gdy planowane są seryjne operacje).</li>
	<li>Przytnij włosy na środkowej klatce piersiowej myszy za pomocą maszynki do strzyżenia i oznacz myszy do identyfikacji, uderzając je w ucho przed operacją.</li>
	<li>Przygotuj stół zabiegowy, który można od razu wykorzystać do operacji.
	<ol>
		<li>Rozłóż wkładkę chłonną i przymocuj rogi taśmą, przymocuj stożki do nosa anestezjologicznego taśmą, umieść środek sterylizujący i dezynfekujący (chlorheksydyna, jod i 75% etanolu) obok przestrzeni operacyjnej i umieść myszy w kolejności działania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie komórek (dla 10 myszy)
UWAGA: Komórki powinny zostać zaszczepione w ciągu 1 godziny po odłączeniu od naczynia, aby uniknąć spadku żywotności komórek. W szczególności zawiesinę komórkową należy wymieszać z galaretowatą mieszaniną białek w ciągu 15 minut po odłączeniu komórek od naczynia, aby zachować ich żywotność.
<ol>
	<li>Hodowla komórek 4T1-luc2, linii komórkowej gruczolakoraka sutka myszy wykazującej ekspresję lucyferazy, w pożywce RPMI 1640 z 10% FBS w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C w 5% CO2 .</li>
	<li>Przemyć przylegające komórki 4T1-luc2 w 10-centymetrowym naczyniu z solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml. Dodać 1 ml 0,25% trypsyny za pomocą pipety P1000, a następnie inkubować próbkę w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Następnie dodać 4 ml pożywki wzrostowej (RPMI-1640 z 10% FBS) za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml i przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml w kapturze do hodowli tkankowej. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 180 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 2 ml PBS, a następnie policzyć komórki za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>Zawiesić 2 x 106 komórek 4T1-luc2 w 40 μl zimnego PBS (pH 7,4, 4 °C) w kapturze do hodowli tkankowej.</li>
	<li>Wymieszać 40 μl zawiesiny komórek z 360 μl galaretowatej mieszaniny białek w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml na lodzie w kapturze do hodowli tkankowych. 
	UWAGA: Końcowe stężenie wynosi 1 x 105/20 μL (1:9 PBS: galaretowata mieszanina białkowa). W przypadku modelu ortotopowego (bez mastektomii) użyto 1 x 104/20 μL końcowego stężenia, aby uniknąć osiągnięcia kryteriów eutanazji (wielkość guza > 2 cm) w ciągu dwóch tygodni.</li>
</ol>
3. Inokulacja komórek rakowych
<ol>
	<li>Umieść myszy w komorze indukcyjnej znieczulenia z 2-4% izofluranem i przepływem tlenu 0,2 l/min, aż myszy będą spokojnie oddychać (2-3 min).</li>
	<li>Chwycić mysz i wstrzyknąć podskórnie 0,05 mg/kg buprenorfiny w jej ramię.</li>
	<li>Potwierdź odpowiednie znieczulenie poprzez brak reakcji na uszczypnięcie palca u nogi. Włóż nos myszy do otworu maski myszy, która umożliwia znieczulenie wziewne z 2-4% izofluranem i przepływem tlenu 2 l/min podłączonym do kanistra z węglem drzewnym.</li>
	<li>Unieruchomij kończyny myszy za pomocą taśmy laboratoryjnej i wysterylizuj jej skórę za pomocą chlorheksydyny, jodu i 75% etanolu, używając bawełnianych wacików.</li>
	<li>Wykonaj 5-milimetrowe nacięcie skóry na środku przedniej ściany klatki piersiowej za pomocą sterylnych nożyczek do mikrodysekcji, podnieś skórę po prawej stronie obok nacięcia i odłącz skórę od ściany klatki piersiowej za pomocą nożyczek, a następnie odwróć skórę, aby odsłonić prawą poduszkę tłuszczową sutka #2.</li>
	<li>Ostrożnie wstrzyknąć 20 μl zawiesiny komórek rakowych za pomocą strzykawki insulinowej o pojemności 1 ml z igłą 28,5 G do poduszeczki tłuszczowej w bezpośrednim polu widzenia przez ranę. 
	UWAGA: Igła przechodzi przez ranę, a nie przez skórę. Trzymaj igłę w poduszce tłuszczowej przez 5 sekund przed jej wyciągnięciem, co daje czas na zestalenie się galaretowatej mieszanki białek.</li>
	<li>Zamknij nacięcia skóry poprzez zszycie, używając sterylnych niewchłanialnych szwów 5-0.</li>
	<li>Po operacji należy umieścić zwierzęta z powrotem w czystej klatce i monitorować je do czasu, aż wyzdrowieją i będą się swobodnie poruszać (po ~1-2 minutach). Jeśli zwierzę nie wydaje się być w dobrym stanie zdrowia w ciągu 24 godzin od zabiegu, należy podać buprenorfinę (0,2 mg/kg).</li>
	<li>Usunąć szwy w znieczuleniu (patrz krok 3.1) 7 dni po zabiegu.</li>
</ol>
4. Mastektomia
UWAGA: Czas mastektomii jest bardzo ważny. Jeśli zostanie to zrobione zbyt wcześnie, przerzuty do płuc nie wystąpią. Jeśli zostanie to zrobione zbyt późno, guz pierwotny zaatakował główne naczynia krwionośne, co sprawia, że całkowita resekcja onkologiczna jest trudna. W związku z tym przetestowano wiele punktów czasowych do mastektomii, aby określić, który punkt czasowy zapewnia odpowiednią równowagę w oczekiwaniu na przerzuty, zanim resekcja stanie się zbyt trudna. Po przeprowadzeniu tego w ponad 50 eksperymentach na myszach wykazano, że mastektomia po 8 dniach od inokulacji komórek rakowych (lub gdy rozmiar guza osiąga 5 mm) była idealnym momentem do osiągnięcia tej równowagi13.
<ol>
	<li>Znieczulić mysz 2-4% wziewnym izofluranem i wstrzyknąć buprenorfinę (patrz kroki 3.1 i 3.2).</li>
	<li>Unieruchomić mysz i wysterylizować jej skórę (patrz krok 3.4).</li>
	<li>Wykonaj 5 mm nacięcie skóry 2 mm w lewo od blizny pooperacyjnej, która została wykonana podczas początkowego zaszczepienia komórek rakowych, za pomocą nożyczek do mikrodysekcji. Przedłuż nacięcie w kierunku nasady kończyny przedniej, aby usunąć guz, skórę, w tym bliznę pooperacyjną, oraz zmianę w kontakcie z guzem, a także miskę pachowych węzłów chłonnych, w której przez większość czasu nie ma widocznego węzła chłonnego w czasie mastektomii13. Upewnij się, że nie uszkodzisz żyły pachowej.</li>
	<li>Zamknij ubytki skóry poprzez zszycie, używając sterylnych nici niewchłanialnych 5-0 w kształcie litery "Y".</li>
	<li>Tak samo jak w kroku 3.8, umieść mysz z powrotem w czystej klatce i monitoruj, aż dojdzie do siebie.</li>
	<li>Usuń szwy w znieczuleniu (patrz krok 3.1) 7 dni po zabiegu.</li>
</ol>
5. Bioluminescencyjna kwantyfikacja guza pierwotnego (inokulacja ortotopowa bez mastektomii) lub przerzutów do płuc (model mastektomii)
UWAGA: W celu ilościowego określenia obciążenia pierwotnym nowotworem, bioluminescencja jest mierzona 2x w tygodniu od dnia następującego po szczepieniu ortotopowym. W celu ilościowego określenia przerzutów do płuc bioluminescencję mierzy się 2 razy w tygodniu od dnia po mastektomii.
<ol>
	<li>Rozpuścić D-lucyferynę w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco do końcowego stężenia 15 mg/ml w okapie do hodowli tkankowej. Podzielić go na osłonięte światłem probówki mikrowirówkowe o pojemności 1,5 ml. Rozcieńczony roztwór przechowywać w temperaturze -80 °C. 
	UWAGA: Na mysz o wadze 20 g wymagane jest 200 μl rozcieńczonej D-lucyferyny.</li>
	<li>Otwórz oprogramowanie do obrazowania i kliknij Initialize. 
	UWAGA: Schłodzenie urządzenia sprzężonego z ładunkiem (CCD) zajmuje około 15 minut. Gdy przetwornik CCD osiągnie ustawioną temperaturę, kolor paska temperatury zmieni się z czerwonego na zielony.</li>
	<li>Przed obrazowaniem należy znieczulić myszy 2-4% izofluranem w dedykowanej komorze indukcyjnej (patrz krok 3.1).</li>
	<li>Zważ myszy.</li>
	<li>Wstrzyknąć 150 mg/kg D-lucyferyny dootrzewnowo w miejsce środkowej części brzucha za pomocą igły 28,5 G.</li>
	<li>Dopasuj każdą mysz ze stożkiem nosowym wewnątrz systemu obrazowania w pozycji leżącej na plecach (umieść maksymalnie pięć myszy w tym samym czasie). Utrzymuj znieczulenie na poziomie 1% - 3% izofluranu (w 100% tlenu) przez stożki nosowe podczas obrazowania.</li>
	<li>Rób obraz co 5 minut, aby wykrywać szczytową bioluminescencję przez 50 minut (lub do potwierdzonej szczytowej bioluminescencji).
	<ol>
		<li>Wybierz Luminescencja jako Auto, Binning jako Średnia, a Pole widzenia jako D.</li>
		<li>Kliknij przycisk Pobierz, aby przechwycić obraz.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść myszy z powrotem w klatce (klatkach) i monitoruj je, aż wyzdrowieją (patrz krok 3.8).</li>
</ol>
6. Kwantyfikacja obciążenia nowotworem z przerzutami do płuc za pomocą obrazowania ex vivo
UWAGA: Kwantyfikacja przerzutów do płuc ma zastosowanie do inokulacji ortotopowej zarówno z modelami mastektomii, jak i bez nich. W modelu mastektomii wybiera się obrazowanie ex vivo lub obserwację przeżycia, w zależności od celu. W modelu inokulacji ortotopowej (bez mastektomii) w większości przypadków kryteria eutanazji pierwotnej wielkości guza (> 2 cm) po około 21 dniach od inokulacji.
<ol>
	<li>Określić ilościowo zmiany przerzutowe w płucach 21 dni po inokulacji komórek rakowych za pomocą obrazowania ex vivo.</li>
	<li>Znieczulić myszy 2-4% izofluranem w dedykowanej komorze indukcyjnej (patrz krok 3.1).</li>
	<li>Zważ myszy.</li>
	<li>Wstrzyknąć dootrzewnowo 150 mg/kg D-lucyferyny (patrz krok 5.6).</li>
	<li>Poddaj myszy eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy, 15 minut po wstrzyknięciu.</li>
	<li>Otwórz brzuch, przecinając skórę i otrzewną w środkowej części brzucha, używając zakrzywionych nożyczek Mayo. Przedłuż nacięcie zarówno w prawo, jak i w lewo. Wyciągnij wątrobę kleszczami, aż przepona zostanie uwidoczniona; Następnie przetnij membranę.</li>
	<li>Za pomocą zakrzywionych nożyczek Mayo przetnij obustronne żebra od caudad (12. żeber) do cephalad (1. żeber), aby odsłonić płuca, odwracając przednią ścianę klatki piersiowej.</li>
	<li>Zidentyfikuj przełyk piersiowy, który wygląda jak sznur łączący płuca z kręgosłupem, podnosząc płuca za pomocą kleszczy, a następnie przeciąć przełyk za pomocą nożyczek do mikrodysekcji.</li>
	<li>Podnieś obustronne płuca i serce za pomocą kleszczy (stosując ciągnięcie ciągnące w dół, w kierunku głowodu do ogona), a następnie przeciąć tchawicę i główne naczynia do wierzchołka płuca na głowu, używając nożyczek do mikrodysekcji. 
	UWAGA: Pozwala to na odizolowanie płuc i serca od organizmu.</li>
	<li>Usuń serce z płuca za pomocą nożyczek do mikrodysekcji.</li>
	<li>Umieść płuca na 10-centymetrowej szalce Petriego.</li>
	<li>Uchwyć obraz bioluminescencji (patrz kroki 5.7.1 i 5.7.2) 5 minut po eutanazji (20 minut po wstrzyknięciu lucyferyny).</li>
</ol>

<ol><li>Rashid, O. M., Takabe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+for+exploring+the+pharmacokinetics+of+breast+cancer+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Metabolism+%26+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Animal models for exploring the pharmacokinetics of breast cancer therapies.</a> Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 11 (2), 221-230 (2015).</li>
<li>Schuh, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trials%2C+tribulations%2C+and+trends+in+tumor+modeling+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Trials, tribulations, and trends in tumor modeling in mice.</a> Toxicologic Pathology. 32, 53-66 (2004).</li>
<li>Katsuta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+breast+cancer+model+for+preclinical+immunotherapy+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">Modified breast cancer model for preclinical immunotherapy studies.</a> Journal of Surgical Research. 204 (2), 467-474 (2016).</li>
<li>Sidell, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composite+mandibulectomy%3A+a+novel+animal+model%5BTitle%5D)+AND+%22Otolaryngology-Head+and+Neck+Surgery%22%5BJournal%5D)">Composite mandibulectomy: a novel animal model.</a> Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 146 (6), 932-937 (2012).</li>
<li>Ewens, A., Mihich, E., Ehrke, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distant+metastasis+from+subcutaneously+grown+E0771+medullary+breast+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Research%22%5BJournal%5D)">Distant metastasis from subcutaneously grown E0771 medullary breast adenocarcinoma.</a> Anticancer Research. 25, 3905-3915 (2005).</li>
<li>Kocaturk, B., Versteeg, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+injection+of+breast+cancer+cells+into+the+mammary+fat+pad+of+mice+to+study+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Orthotopic injection of breast cancer cells into the mammary fat pad of mice to study tumor growth.</a> Journal of Visualized Experiments. (96), e51967(2015).</li>
<li>Rashid, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+syngeneic+orthotopic+murine+model+of+human+breast+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">An improved syngeneic orthotopic murine model of human breast cancer progression.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 147 (3), 501-512 (2014).</li>
<li>Bertozzi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence%2C+risk+factors%2C+and+prognosis+of+peritoneal+metastasis+from+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22SpringerPlus%22%5BJournal%5D)">Prevalence, risk factors, and prognosis of peritoneal metastasis from breast cancer.</a> SpringerPlus. 4, 688(2015).</li>
<li>Kennecke, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastatic+behavior+of+breast+cancer+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Metastatic behavior of breast cancer subtypes.</a> Journal of Clinical Oncology. 28 (20), 3271-3277 (2010).</li>
<li>Valero, M. G., Golshan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+the+Axilla+in+Early+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Treatment+and+Research%22%5BJournal%5D)">Management of the Axilla in Early Breast Cancer.</a> Cancer Treatment and Research. 173, 39-52 (2018).</li>
<li>National Comprehensive Cancer Network. Breast Cancer, NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/breast.pdf ">https://www.nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/breast.pdf </a> (2018).</li>
<li>Versteeg, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+tissue+factor+signaling+suppresses+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Inhibition of tissue factor signaling suppresses tumor growth.</a> Blood. 111 (1), 190-199 (2008).</li>
<li>Katsuta, E., Rashid, O. M., Takabe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+breast+cancer+mastectomy+model+that+predicts+patient+outcomes+for+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">Murine breast cancer mastectomy model that predicts patient outcomes for drug development.</a> Journal of Surgical Research. 219, 310-318 (2017).</li>
<li>Veenhof, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+stress+response+and+postoperative+immune+function+after+laparoscopy+or+open+surgery+with+fast+track+or+standard+perioperative+care%3A+a+randomized+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Surgical stress response and postoperative immune function after laparoscopy or open surgery with fast track or standard perioperative care: a randomized trial.</a> Annals of Surgery. 255 (2), 216-221 (2012).</li>
<li>Wei, S., Siegal, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surviving+at+a+distant+site%3A+The+organotropism+of+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Diagnostic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Surviving at a distant site: The organotropism of metastatic breast cancer.</a> Seminars in Diagnostic Pathology. 35 (2), 108-111 (2018).</li>
<li>Nagahashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingosine-1-phosphate+produced+by+sphingosine+kinase+1+promotes+breast+cancer+progression+by+stimulating+angiogenesis+and+lymphangiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Sphingosine-1-phosphate produced by sphingosine kinase 1 promotes breast cancer progression by stimulating angiogenesis and lymphangiogenesis.</a> Cancer Research. 72 (3), 726-735 (2012).</li>
<li>Jones, C., Lancaster, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+Operative+Technique+for+Mastectomy%5BTitle%5D)+AND+%22Surgical+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Evolution of Operative Technique for Mastectomy.</a> Surgical Clinics of North America. 98 (4), 835-844 (2018).</li>
<li>Rashid, O. M., Maurente, D., Takabe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Systematic+Approach+to+Preclinical+Trials+in+Metastatic+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Chemotherapy+%28Los+Angeles%29%22%5BJournal%5D)">A Systematic Approach to Preclinical Trials in Metastatic Breast Cancer.</a> Chemotherapy (Los Angeles). 5 (3), (2016).</li>
<li>Ramaswamy, S., Ross, K. N., Lander, E. S., Golub, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+signature+of+metastasis+in+primary+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">A molecular signature of metastasis in primary solid tumors.</a> Nature Genetics. 33 (1), 49-54 (2003).</li>
<li>Aoki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+model+of+long-term+obstructive+jaundice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">Murine model of long-term obstructive jaundice.</a> Journal of Surgical Research. 206 (1), 118-125 (2016).</li>
<li>Terracina, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+metastatic+murine+colon+cancer+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">Development of a metastatic murine colon cancer model.</a> Journal of Surgical Research. 199 (1), 106-114 (2015).</li>
<li>Rashid, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+tail+vein+injection+a+relevant+breast+cancer+lung+metastasis+model%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thoracic+Disease%22%5BJournal%5D)">Is tail vein injection a relevant breast cancer lung metastasis model?</a> Journal of Thoracic Disease. 5 (4), 385-392 (2013).</li>
<li>Rashid, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resection+of+the+primary+tumor+improves+survival+in+metastatic+breast+cancer+by+reducing+overall+tumor+burden%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery%22%5BJournal%5D)">Resection of the primary tumor improves survival in metastatic breast cancer by reducing overall tumor burden.</a> Surgery. 153 (6), 771-778 (2013).</li>
<li>Troy, T., Jekic-McMullen, D., Sambucetti, L., Rice, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+comparison+of+the+sensitivity+of+detection+of+fluorescent+and+bioluminescent+reporters+in+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Imaging%22%5BJournal%5D)">Quantitative comparison of the sensitivity of detection of fluorescent and bioluminescent reporters in animal models.</a> Molecular Imaging. 3 (1), 9-23 (2004).</li>
<li>Adams, S. T. Jr, Miller, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+D-luciferin%3A+expanding+the+scope+of+bioluminescence+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Beyond D-luciferin: expanding the scope of bioluminescence imaging in vivo.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 21, 112-120 (2014).</li>
<li>Close, D. M., Xu, T., Sayler, G. S., Ripp, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+bioluminescent+imaging+%28BLI%29%3A+noninvasive+visualization+and+interrogation+of+biological+processes+in+living+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">In vivo bioluminescent imaging (BLI): noninvasive visualization and interrogation of biological processes in living animals.</a> Sensors (Basel). 11 (1), 180-206 (2011).</li>
<li>Chen, H., Thorne, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+Methods+for+Molecular+In+Vivo+Optical+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Practical Methods for Molecular In Vivo Optical Imaging.</a> Current Protocols in Cytometry. 59 (1224), (2012).</li>
<li>Wurdinger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+secreted+luciferase+for+ex+vivo+monitoring+of+in+vivo+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A secreted luciferase for ex vivo monitoring of in vivo processes.</a> Nature Methods. 5 (2), 171-173 (2008).</li>
<li>Aoki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+sphingosine+kinase+1+worsens+pancreatic+cancer+peritoneal+carcinomatosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">Host sphingosine kinase 1 worsens pancreatic cancer peritoneal carcinomatosis.</a> Journal of Surgical Research. 205 (2), 510-517 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przez ostatnią dekadę opracowywaliśmy wiele modeli raka myszy, w tym modele raka piersi 3,7,13,16,20,21. Wcześniej wykazaliśmy, że ortotopowa inokulacja komórek raka piersi w tkance gruczołu sutkowego pod bezpośrednim widzeniem spowodowała większy guz o mniejszej zmienności wielkości w porównaniu z wstrzyknięciem komórek wokó...

Modele zwierzęce odgrywają kluczową rolę w badaniach nad rakiem. Gdy hipoteza zostanie udowodniona in vitro, należy ją przetestować in vivo w celu oceny jej przydatności klinicznej. Progresja raka i przerzuty są często lepiej uchwycone przez modele zwierzęce w porównaniu z modelami in vitro, dlatego konieczne jest przetestowanie nowego leku na modelu zwierzęcym jako badanie przedkliniczne w celu opracowania leku1,2. Jednak szczegóły techniczne eksperymentów na zwierzętach często nie są dobrze opisane w opublikowanych artykułach, co utrudnia pomyślne odtworzenie modelu. Rzeczywiście, autorzy, którzy stworzyli te modele ortotopowej inokulacji i mastektomii, przeszli przez długie i rygorystyczne procesy prób i błędów. Wskaźnik powodzenia nowotworzenia po inokulacji komórek rakowych jest jednym z kluczowych czynników decydujących o sukcesie i skuteczności badania na zwierzętach3. Linia komórkowa i liczba komórek do zaszczepienia, miejsce inokulacji i szczep myszy są ważnymi czynnikami. Powszechnie wiadomo, że istnieją ogromne różnice w wynikach eksperymentów na zwierzętach wynikające z różnic indywidualnych w porównaniu z technikami in vitro. Dlatego ważne jest, aby uzyskać stabilne wyniki, poprawić skuteczność eksperymentów na zwierzętach i uniknąć wprowadzających w błąd wyników.
Ten artykuł zawiera sprawdzone techniki4 do generowania modeli myszy ortotopowych i mastektomijnych raka piersi. Celem tych metod jest: 1) naśladowanie przebiegu progresji i leczenia raka piersi u ludzi oraz 2) przeprowadzanie eksperymentów in vivo z większą skutecznością i wyższymi wskaźnikami sukcesu w porównaniu z innymi technikami inokulacji raka piersi lub mastektomii. W ortotopowej inokulacji komórek rakowych, aby naśladować progresję raka piersi u ludzi, wybieramy poduszeczkę tłuszczową #2 jako miejsce inokulacji, które znajduje się w klatce piersiowej. W większości badań komórki raka piersi są inokulowane podskórnie5. Ta technika nie wymaga operacji, a zatem jest prosta i nieskomplikowana. Jednak mikrośrodowisko podskórne jest zupełnie inne niż mikrośrodowisko gruczołu sutkowego, co skutkuje różną progresją nowotworu, a nawet profilami molekularnymi6,7. Niektóre badania wykorzystują gruczoł sutkowy #4, który znajduje się w jamie brzusznej, jako miejsce inokulacji6. Ponieważ jednak gruczoły sutkowe #4 znajdują się w jamie brzusznej, najczęstszym wzorcem przerzutów jest rakowatość otrzewnej7, która występuje przy mniej niż 10% przerzutowego raka piersi8. Rak piersi generowany przez technikę przedstawioną tutaj, w gruczole sutkowym #2, daje przerzuty do płuc, które jest jednym z najczęstszych miejsc przerzutów raka piersi9.
Dzięki tej technice, celem jest również osiągnięcie wyższego wskaźnika nowotworzenia przy minimalnej zmienności wielkości guza w porównaniu z innymi technikami inokulacji raka piersi. Aby to zrobić, komórki rakowe zawieszone w galaretowatej mieszaninie białek są inokulowane pod bezpośrednim widzeniem przez środkowe nacięcie przedniej ściany klatki piersiowej. Technika ta powoduje wysoki wskaźnik nowotworzenia przy mniejszej zmienności wielkości i kształtu guza w porównaniu z wstrzyknięciem podskórnym lub niechirurgicznym, jak wcześniej informowano3,7.
Wprowadzamy również technikę radykalnej mastektomii u myszy, w której ortotopowy guz piersi jest wycinany wraz z otaczającymi go tkankami i pachowymi węzłami chłonnymi. W warunkach klinicznych standardem opieki nad pacjentkami z rakiem piersi bez choroby z odległymi przerzutami jest mastektomia10,11. Przed mastektomią przerzuty do pachowych węzłów chłonnych są badane za pomocą obrazowania i biopsji węzła wartowniczego. Jeśli nie ma dowodów na przerzuty do pachowych węzłów chłonnych, pacjentka jest następnie leczona całkowitą lub częściową mastektomią, w której pomija się resekcję pachowych węzłów chłonnych. Mastektomia całkowita jest techniką resekcji raka piersi z całą tkanką piersi en bloc, podczas gdy mastektomia częściowa polega na wycięciu raka piersi z marginesem otaczającej tylko normalnej tkanki piersi, zachowując w ten sposób pozostałą normalną tkankę piersi u pacjentki. Jednak pacjentki, które zachowały pozostałą normalną tkankę piersi po częściowej mastektomii, wymagają pooperacyjnej radioterapii, aby uniknąć miejscowego nawrotu10. Pacjentki, u których występują przerzuty do pachowych węzłów chłonnych, poddawane są radykalnej mastektomii, która usuwa raka piersi wraz ze wszystkimi normalnymi tkankami piersi i pachowymi węzłami chłonnymi oraz zaatakowanymi tkankami en bloc10,11. W modelu mysim nadzór nad przerzutami do pachowych węzłów chłonnych i/lub radioterapią pooperacyjną nie jest uzasadniony ani wykonalny. Dlatego stosujemy technikę radykalnej mastektomii, aby uniknąć miejscowych lub pachowych przerzutów do węzłów chłonnych.
Inokulacja komórek rakowych przez żyłę ogonową jest najczęstszym modelem przerzutów do płuc u myszy12, tak zwane "eksperymentalne przerzuty". Ten model jest łatwy do wygenerowania i nie wymaga operacji; Nie naśladuje jednak progresji raka piersi u ludzi, co może skutkować różnym zachowaniem choroby przerzutowej. Aby naśladować przebieg leczenia raka piersi u ludzi, w którym często dochodzi do przerzutów po mastektomii, guz pierwotny jest usuwany po ortotopowym zaszczepieniu komórek rakowych. Technika ta powoduje mniejszą liczbę nawrotów miejscowych w porównaniu z prostą resekcją guza, jak wcześniej informowano13, i jest przydatna w nowych terapiach, badaniach przedklinicznych i badaniach nad przerzutowym rakiem piersi. Opisane tutaj techniki mają zastosowanie w większości eksperymentów z modelami ortotopowymi raka piersi. Jednak ważne jest, aby wziąć pod uwagę, że galaretowata mieszanina białek może wpływać na mikrośrodowisko, a operacja może wpływać na stres/odpowiedź immunologiczną14. Dlatego badacze badający mikrośrodowisko i/lub stres/odpowiedź immunologiczną powinni być świadomi potencjalnych czynników zakłócających.

<table><tbody><tr><td>Nożyczki do mikro preparacji</td><td>Roboz</td><td>RS-5983</td><td>Do inokulacji komórek rakowych i mastektomii</td></tr><tr><td>Kleszcze Adson</td><td>Roboz</td><td>RS-5233</td><td>Do inokulacji komórek rakowych i mastektomii</td></tr><tr><td>Uchwyt igły</td><td>Roboz</td><td>RS-7830</td><td>Do inokulacji komórek rakowych i mastektomii</td></tr><tr><td>Mayo</td><td>Roboz</td><td>RS-6873</td><td>Do</td>szwów</tr> <tr><td></td><td>jedwabnych ex vivo 5-0Wygląd</td><td>774B</td><td>Do inokulacji komórek rakowych i mastektomii</td></tr><tr><td>Suchy sterylizator (Germinator 500)</td><td>Braintree Scientific</td><td>GER 5287-120V</td><td>Do inokulacji komórek rakowych i mastektomii</td></tr><tr><td>Maszynka do strzyżenia</td><td>Wahl</td><td>9908-717</td><td>Do inokulacji komórek rakowych i mastektomii</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354234</td><td>Do inokulacji komórek rakowych</td></tr><tr><td>D-Lucyferyna, sól potasowa</td><td>GOLD-Bio</td><td>LUCK-1K</td><td>Do ilościowego oznaczania bioluminescencji</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Insitute 1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td>Do hodowli komórkowej</td></tr><tr><td>Serubin bydlęcy</td><td>płodu Gibco</td><td>10437028</td><td>Do hodowli komórkowej</td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,25%)</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td>Do hodowli komórkowej</td></tr></tbody></table>

generowanie mysiego ortotopowego modelu raka piersi z przerzutami i wykonywanie radykalnej mastektomii u myszy

Generating a Murine Orthotopic Metastatic Breast Cancer Model and Performing Murine Radical Mastectomy

Modele mysie in vivo do oceny progresji raka piersi są niezbędne do badań nad rakiem, w tym do przedklinicznego rozwoju leków. Jednak większość szczegółów praktycznych i technicznych jest często pomijana w publikowanych rękopisach, co sprawia, że odtworzenie modeli jest trudne, zwłaszcza gdy dotyczy to technik chirurgicznych. Technologia bioluminescencji pozwala na ocenę niewielkich ilości komórek nowotworowych nawet wtedy, gdy guz nie jest wyczuwalny palpacyjnie. Wykorzystując komórki rakowe wykazujące ekspresję lucyferazy, opracowujemy technikę ortotopowej inokulacji raka piersi o wysokim wskaźniku nowotworzenia. Przerzuty do płuc ocenia się za pomocą techniki ex vivo. Następnie ustalamy model mastektomii z niskim wskaźnikiem nawrotów miejscowych, aby ocenić obciążenie guzem z przerzutami. W tym artykule szczegółowo opisujemy techniki chirurgiczne implantacji ortotopowej i mastektomii w przypadku raka piersi z wysokim wskaźnikiem nowotworzenia i niskim odsetkiem nawrotów miejscowych, odpowiednio, w celu poprawy skuteczności modelu raka piersi.

Celem modelu ortotopowego jest naśladowanie progresji nowotworu u ludzi (t.j. wzrostu guza pierwotnego, po którym następuje przerzut do węzłów chłonnych, a następnie odległy przerzut do płuc)15. Po inokulacji komórek nowotworowych regularnie (dwa do trzech razy w tygodniu) ilościowo określa się bioluminescencję (Rycina 1A). Bioluminescencja w płucach jest głębsza i mniejsza niż w zmianie pierwotnej. Bioluminescencja odzwiercie...

Wprowadzamy mysi ortotopowy model raka piersi i model radykalnej mastektomii z technologią bioluminescencji, aby określić ilościowo obciążenie guza, aby naśladować postęp ludzkiego raka piersi.

Generowanie mysiego ortotopowego modelu raka piersi z przerzutami i wykonywanie radykalnej mastektomii u myszy

In vivo mouse models to assess breast cancer progression are essential for cancer research, including preclinical drug developments. However, the majority ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie raka piersi dotyczące tego, jak naśladować progresję i leczenie raka piersi u ludzi w modelu mysim. Główną zaletą tego mysiego modelu raka piersi jest to, że ma on wysoki wskaźnik nowotworzenia po implantacji ortotopowej i niski wskaźnik nawrotów miejscowych po mastektomii. Zacznij od potwierdzenia braku reakcji na szczypanie palca u znieczulonej samicy myszy i przyklejenia kończyn zwierzęcia do deski chirurgicznej.Za pomocą sterylnych wacików bawełnianych wysterylizuj obszar operacyjny chlorheksydyną, jodem i 75% etanolem. I wykonaj pięciomilimetrowe nacięcie skóry pośrodku przedniej ściany klatki piersiowej. Następnie podnieś prawą stronę skóry przylegającą do nacięcia i użyj sterylnych nożyczek do mikrodysekcji, aby oderwać skórę od ściany klatki piersiowej.Odwróć skórę, aby odsłonić prawą poduszeczkę tłuszczową sutka numer dwa i użyj jednomililitrowej strzykawki insulinowej wyposażonej w igłę o rozmiarze 28,5, aby ostrożnie wstrzyknąć 20 mikrolitrów zawiesiny komórek rakowych przez ranę do poduszeczki tłuszczowej. Przytrzymaj igłę w poduszce tłuszczowej przez pięć sekund, aby galaretowata mieszanina białek komór

generating-murine-orthotopic-metastatic-breast-cancer-model

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Film demonstruje technikę ortotopowej inokulacji raka piersi na modelu mysim. Technika ta zapewnia wysoki wskaźnik nowotworzenia przy mniejszej zmienności wielkości i kształtu guza w porównaniu z wstrzyknięciem podskórnym lub niechirurgicznym.

Wstrzyknięcie ortotopowe: wszczepianie komórek rakowych specyficznych tkankowo dorosłej myszy

Ten film opisuje technikę radykalnej mastektomii, która jest używana do chirurgicznego usunięcia całego gruczołu sutkowego myszy w celu zbadania progresji raka.

Radykalna mastektomia: chirurgiczne usunięcie całego gruczołu sutkowego myszy w celu zbadania progresji raka

Rak jest złożoną chorobą, na którą wpływ ma tkanka otaczająca guz, a także lokalne mediatory pro- i przeciwzapalne. Dlatego ortotropowe modele iniekcyjne, a nie modele podskórne, mogą być przydatne do badania progresji raka w sposób, który lepiej naśladuje ludzką patologię.

Ortotopowe wstrzyknięcie komórek raka piersi do poduszeczki tłuszczowej sutka myszy w celu zbadania wzrostu guza.

Opisany jest ortotopowy model pierwotnego guza raka piersi i chirurgiczne usunięcie pierwotnego guza w celu przedłużenia życia myszy w celu wytworzenia spontanicznych przerzutów. Wzrost i progresja guza są monitorowane i oznaczane ilościowo za pomocą obrazowania fluorescencyjnego lucyferazy.

Ortotopowy mysi model spontanicznych przerzutów raka piersi

Aby wyjaśnić wieloetapowy proces rozprzestrzeniania się raka jajnika w otrzewnej, obecne badanie przedstawia mysi eksperymentalny model pierwotnego rozwoju guza i przerzutów do otrzewnej poprzez ortotopową inokulację tymi komórkami nowotworowymi.<br...

Mysi eksperymentalny model pierwotnego rozwoju guza i przerzutów do otrzewnej za pomocą ortotopowej inokulacji komórkami raka jajnika

Brakuje modeli przedklinicznych oceniających terapię adjuwantową ukierunkowaną na przerzuty raka piersi. Aby temu zaradzić, opracowaliśmy mysi model przerzutów de novo gruczolakoraka sutka do płuc, w którym terapie stosowane w trybie adjuwantowym (pooperacyjna resekcja guzów pierwotnych) mogą być oceniane pod kątem skuteczności w oddziaływaniu na wcześniej zasiane przerzuty do płuc.

Procedury chirurgiczne i metodyka przedklinicznego mysiego modelu przerzutów raka sutka de novo

Tutaj prezentujemy protokół wszczepiania komórek raka piersi do poduszeczki tłuszczowej w prosty, mniej inwazyjny i łatwy w obsłudze sposób, a ten mysi ortotopowy model raka piersi z odpowiednim środowiskiem poduszeczki tłuszczowej może być wykorzystany do badania różnych aspektów raka.

Ortotopowe wstrzyknięcie komórek raka piersi do poduszeczki tłuszczowej sutka myszy

Ta praca wstępnie ustawia zaawansowany protokół do dokładnej oceny obciążenia guza poprzez detekcję zielonego białka fluorescencyjnego i sygnałów bioluminescencji, a także integrację ilościowej techniki wykrywania molekularnego.

Badanie potrójnie ujemnego raka piersi przy użyciu ortotopowego modelu raka piersi

Modele ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów (PDX) oraz genetycznie modyfikowane modele myszy do przeszczepu wiernie odwzorowują ludzką chorobę i są preferowanymi modelami do podstawowych i translacyjnych badań nad rakiem piersi. W tym miejscu opisano metodę ortotopowego przeszczepiania fragmentów guza piersi do poduszeczki tłuszczowej sutka w celu zbadania biologii guza i oceny odpowiedzi na lek.

Ortotopowe przeszczepy guzów piersi jako modele przedkliniczne raka piersi

Obecny protokół opisuje wstrzykiwanie komórek do kostniakomięsaka kości piszczelowej w celu wygenerowania modeli myszy z ortotopowym kostniakomięsakiem i przerzutami do płuc.

Wstrzyknięcie komórek kostniakomięsaka piszczelowego w celu wygenerowania ortotopowego kostniakomięsaka i mysich modeli przerzutów do płuc

Manuskrypt opisuje metodologię ustalania oraz monitorowania wzrostu podłużnego spontanicznych przerzutów do płuc z ortotopowo wstrzykiwanych guzów piersi, które mogą być interwencyjne na wszystkich etapach kaskady przerzutowej.

In vivo (in vivo) Obrazowanie w celu pomiaru spontanicznych przerzutów do płuc komórek guza piersi wstrzykniętych ortotopowo

Poznaj metodę generowania mysiego ortotopowego modelu raka piersi z przerzutami i wykonywania radykalnej mastektomii. Technika bioluminescencyjna umożliwia ilościową ocenę obciążenia nowotworowego w czasie rzeczywistym.

Generowanie mysiego ortotopowego modelu raka piersi z przerzutami i wykonywanie radykalnej mastektomii u myszy

Przeglądaj więcej filmów