Name: In vivo (in vivo) Metoda mikrodializy do zbierania dużych białek zewnątrzkomórkowych z płynu śródmiąższowego mózgu za pomocą sond odcinających o dużej masie cząsteczkowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Poznaj metodę mikrodializy in vivo do pobierania dużych białek z płynu śródmiąższowego mózgu u myszy. Technika ta umożliwia badanie sygnalizacji neuronalnej i usuwania odpadów w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez ''Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Brain Protein Aging and Dementia Control)(15H01552) od MEXT oraz Grant-in-Aid for Young Scientists (B) (16K20969). Autor dziękuje dr Davidowi M. Holtzmanowi i dr Johnowi R. Cirrito za porady techniczne podczas opracowywania tej metody.

Wszystkie badania na zwierzętach zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Wyższej Szkoły Medycznej Uniwersytetu Tokijskiego.
1. Zabieg przedoperacyjny
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem operacji przetrzyj wszystko 70% etanolem, aby utrzymać sterylne warunki. Zalecane jest wspomaganie termiczne za pomocą poduszki grzewczej.</li>
	<li>Znieczulić myszy przez dootrzewnowe wstrzyknięcie wodzianu chloralu (400 mg/kg). Potwierdź znieczulenie, wykonując uszczypnięcie palca u nogi. Zaleca się stosowanie meloksykamu SR podczas indukcji i buprenorfiny po wyzdrowieniu BID przez co najmniej 24 godziny.</li>
	<li>Ogol włosy maszynką do strzyżenia chirurgicznego. Zamocuj mysz w adapterze myszy i noworodka dla szczurów za pomocą pasków do uszu i zacisku na nos. 
	UWAGA: Na tym etapie bardzo ważne jest, aby upewnić się, że główka myszy jest zabezpieczona i nie porusza się obok siebie.</li>
	<li>Nałóż maść weterynaryjną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.</li>
</ol>
2. Chirurgia stereotaktyczna do implantacji kaniuli prowadzącej
<ol>
	<li>Ustaw adapter myszy i noworodka szczura na aparacie stereotaktycznym. Wykonaj strzałkowe nacięcie na skórze nad czaszką za pomocą skalpela. Zetrzyj krew i tkankę łączną z czaszki za pomocą wilgotnego bawełnianego wacika.</li>
	<li>Określ współrzędne dla obszaru mózgu będącego przedmiotem zainteresowania za pomocą atlasu mózgu. Przed rozpoczęciem pomiarów upewnij się, że linia środkowa jest prosta, aby wiertło można było przesuwać od AP do przodu i przez cały czas pozostawać na szwie linii środkowej. 
	UWAGA: W tym artykule użyto współrzędnych (A/P: -3,1 mm, M/L: -2,5 mm, D/V: -1,2 mm, 12 stopni) do celowania w tylny hipokamp.</li>
	<li>Czaszka poziomu A-P
	<ol>
		<li>Przymocuj wiertło do manipulatora ramy stereotaktycznej. Opuść wiertło, aż delikatnie dotknie lambdy i zapisz jego współrzędną brzuszną. Powtórz tę procedurę dla bregma. 
		UWAGA: Gdy czaszka jest wypoziomowana, pionowy pomiar bregmy jest równy wymiarowi lambdy. Jeśli nie, wyreguluj wysokość nosa clamp odpowiednio. Po wyrównaniu czaszki zapisz przednią/tylną, boczną współrzędną bregmy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Poziom czaszki lewo-prawo
	<ol>
		<li>Przesuń wiertło z bregmy na współrzędną (A/P: -3,1 mm, M/L: +2,0 mm), opuść wiertło do czaszki i zapisz współrzędną pionową. Następnie powtórz tę procedurę dla współrzędnych (A/P: -3,1 mm, M/L: -2,0 mm). 
		UWAGA: Jeśli czaszka jest wypoziomowana, te pionowe pomiary dwóch równoodległych punktów od linii środkowej są równe. Jeśli nie, wyreguluj wysokość nauszników.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ostrożnie wywierć otwór na zadziory w współrzędnej docelowej (A/P: -3.1 mm, M/L: -2.5 mm), aby wszczepić kaniulę prowadzącą. Jeśli średnica otworu w zadziorze nie jest wystarczająco duża, aby można było wszczepić kaniulę prowadzącą, wywierć kolejny otwór, który zachodzi na pierwszy. Wywierć kolejny otwór w prawej (po przeciwnej stronie) kości ciemieniowej i włóż kostną, która pomaga zabezpieczyć cement dentystyczny w 1.10 (patrz Rysunek 1B).</li>
	<li>Wytnij okrągły element blokujący z tylnej strony pokrywki probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml za pomocą żyletki i wykonaj "koronę". Korona ta służy do zapobiegania rozprzestrzenianiu się cementu dentystycznego na skórę. Umieść go na czaszce tak, aby otwory w zadziorach wykonane w kroku 2.5 pozostały w okręgu (Zobacz Rysunek 1).</li>
	<li>Skonfiguruj zestaw stereotaktyczny, umieszczając kaniulę prowadzącą na krótszym ramieniu adaptera stereotaktycznego i przymocuj go za pomocą nakrętki kołpakowej. Ustaw dłuższe ramię adaptera stereotaktycznego na zacisku elektrody. Przymocuj go do manipulatora aparatu stereotaktycznego (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1A).</li>
	<li>Obróć zestaw stereotax D-V na ramieniu manipulatora o 12 stopni (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1B). Przesunąć kaniulę prowadzącą do otworu zadziorowego wykonanego w 1.6. Powoli włóż kaniulę prowadzącą do mózgu, obniżając ją o 1.2 mm. 
	UWAGA: Kąt sondy jest specyficzny dla hipokampa; Inne obszary mogą wymagać innych kątów lub w ogóle nie wymagać kąta. Zapoznaj się z atlasem mózgu, aby uzyskać dokładne współrzędne. Osusz powierzchnię czaszki, ponieważ w przeciwnym razie cement nie będzie się przyklejał, a cementowa nasadka może się przemieścić</li>
	<li>Dodaj cement dentystyczny do korony, aby całkowicie pokryć zarówno metalową część kaniuli prowadzącej, jak i kostną na tyle, aby je zabezpieczyć. Nałóż dodatkowy cement dentystyczny, jeśli odsłonięta jest część czaszki.</li>
	<li>Poczekaj, aż cement dentystyczny całkowicie wyschnie (~12-20 min). Wyjmij adapter stereotaktyczny z elektrody clamp. Odkręć nakrętkę kołpakową i zastąp adapter stereotaktyczny atrapą sondy i dokręć nakrętkę kołpakową.</li>
	<li>Uwolnij mysz od aparatu stereotaktycznego i umieść ją samą w osobnej klatce. 
	UWAGA: Mysz nie powinna być pozostawiona bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą mostka. Sprawdzaj mysz codziennie, aż do dnia mikrodializy. Mysz otrzymuje NLPZ, takie jak karprofen, jeśli wydaje się, że odczuwa ból. W przypadku badań snu i czuwania konieczne jest odczekanie 2 tygodni, aby mysz przyzwyczaiła się do nowego środowiska10, ale inne rodzaje badań mogą wymagać krótszych okresów rekonwalescencji (np. 1-2 dni).</li>
</ol>
3. Konfiguracja mikrodializy
<ol>
	<li>Kontrola jakości sond: Napełnij jednorazową strzykawkę o pojemności 1 ml wodą destylowaną i podłącz ją do wylotu (krótszego portu) sondy za pomocą rurki byton. Zakryj palcami otwory wentylacyjne i delikatnie naciśnij tłok strzykawki, aby wlać wodę do sondy. Sprawdź, czy z wlotu sondy wypływa woda i czy nie ma wycieków na powierzchni membrany do mikrodializy.
	<ol>
		<li>Aktywacja sond: Zanurz membrany sondy w etanolu (70-100%) na dwie sekundy. Następnie ponownie wlej wodę destylowaną do sondy za pomocą strzykawki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie buforu perfuzyjnego: Aby uniknąć przywierania cząsteczek docelowych do rurek, dodać BSA, rozcieńczając 30% roztwór BSA do 4% sztucznym płynem rdzeniowo-rdzeniowym (1,3 mM CaCl2, 1,2 mMMgSO4, 3 mM KCl, 0,4 mM KH2PO4, 25 mM NaHCO3, 122 mM NaCl, pH = 7,35), który ściśle odpowiada stężeniu elektrolitu w płynie mózgowo-rdzeniowym, bezpośrednio przed użyciem. Przefiltrować bufor perfuzyjny przez strzykawkowy filtr o wielkości porów 0,1 μm . 
	UWAGA: 4% BSA poprawia regenerację przywierających białek, ale może poważnie ograniczyć dostarczanie związków, szczególnie w przypadku związków, które mają wysokie wiązanie BSA. Jest to jedna z zalet stosowania niższego stężenia BSA (np. 0,15%) w niektórych przypadkach3. Należy pamiętać, że BSA może bardzo łatwo się agregować, gdy jest mieszany przez wir lub płytkę mieszającą. Agregaty te mogą zatykać sondy lub pory membranowe. Zachowaj ostrożność podczas przygotowywania rozwiązania BSA, aby ograniczyć tę agregację</li>
	<li>Przygotuj dwie oddzielne linie dla wlotu i wylotu (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1C) i połącz obie linie za pomocą igły łączącej. Napełnij jednorazową strzykawkę o pojemności 3 ml wypełnioną buforem perfuzyjnym i połącz ją z końcówką wlotową rurki za pomocą igły. Napełnij całą rurkę buforem perfuzyjnym, uruchamiając pompę strzykawkową.</li>
	<li>Zatrzymaj pompę strzykawkową i wymień igłę łączącą przewód dolotowy i wylotowy na aktywowaną sondę do mikrodializy z kroku 3.3 (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1C). Przed tą wymianą załóż nakrętkę kołpakową na sondę.</li>
	<li>Zamontuj rurę rolkową w rurze wylotowej pompy rolkowej. Uruchomić pompę strzykawkową przy 10 μl/min, a następnie pompę rolkową przy nieco wolniejszym natężeniu przepływu (9,5-9,8 μl/min). Upewnij się, że usunąłeś wszystkie pęcherzyki powietrza z całego przewodu, co może mieć wpływ na odzyskiwanie, gdy dostaną się do sondy.</li>
	<li>Znieczul mysz z kroku 1.12 w taki sam sposób, jak w kroku 1.2. Załóż obrożę na mysz na jej szyję. Zdejmij nakrętkę kołpakową i atrapę sondy i powoli włóż sondę do mikrodializy z 3.4 przez kaniulę prowadzącą i dokręć nakrętkę kołpakową.</li>
	<li>Umieść mysz w klatce podłączonej do systemu swobodnego ruchu i przywiąż mysz do obroży. Kontynuuj pracę zarówno pompy strzykawkowej, jak i pompy rolkowej z natężeniem przepływu wskazanym w kroku 3.5 przez co najmniej 1 h. 
	UWAGA: Aby uzyskać zbieranie ISF od obudzonych zwierząt, w tym artykule zastosowano system swobodnego poruszania się, w którym klatka sama reaguje na ruch zwierzęcia, aby zapobiec skręcaniu się rurek. Alternatywnie można również zastosować krętliki do płynów dostępne w różnych firmach.</li>
	<li>Najpierw zatrzymać pompę rolkową, a następnie pompę strzykawkową. Ustaw żądane natężenie przepływu. Pompę strzykawkową należy uruchamiać o 20% szybciej niż pompę rolkową. 
	UWAGA: Na przykład, jeśli pracujesz z prędkością 1 μl/min, uruchom pompę strzykawkową z prędkością 1.2 μl/min. Optymalne natężenie przepływu należy określić empirycznie dla każdej cząsteczki.</li>
	<li>Pobieranie próbek ISF: umieścić wolny koniec rurki wylotowej na chłodzonym kolektorze frakcji. 
	UWAGA: Odpowiednia objętość próbki różni się w zależności od testów użytych do analizy.</li>
	<li>Po zakończeniu eksperymentu wyjmij sondę. (W razie potrzeby znieczulij mysz).Odzyskaj dane za pomocą myszy w taki sam sposób, jak w kroku 2.11. Analizuj zebrane ISF za pomocą metod takich jak HPLC lub ELISA.</li>
	<li>Aby umyć cały przewód po mikrodializie, ponownie podłącz rurki dolotowe i wylotowe, zastępując sondę igłą przyłączeniową i wlej rozcieńczony wybielacz do całej rurki, a następnie przepłucz ją wodą. Wysuszyć i przechowywać do wielokrotnego użytku. 
	UWAGA: Inne typy przewodów są dopuszczalne, jednak BSA w buforze perfuzyjnym może zatkać rurki o małej średnicy, dlatego rurki te są uważane za jednorazowego użytku. Rurki mogą być zużyte lub zatkane po wielokrotnym użyciu, więc przed użyciem upewnij się, że natężenie przepływu jest stałe.</li>
</ol>

<ol><li>Lei, Y., Han, H., Yuan, F., Javeed, A., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+brain+interstitial+system%3A+Anatomy%2C+modeling%2C+in+vivo+measurement%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">The brain interstitial system: Anatomy, modeling, in vivo measurement, and applications.</a> Progress in Neurobiology. 157, 230-246 (2017).</li>
<li>Kushikata, T., Hirota, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropeptide+microdialysis+in+free-moving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Neuropeptide microdialysis in free-moving animals.</a> Methods in Molecular Biology. 789, 261-269 (2011).</li>
<li>Cirrito, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+assessment+of+brain+interstitial+fluid+with+microdialysis+reveals+plaque-associated+changes+in+amyloid-beta+metabolism+and+half-life%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In vivo assessment of brain interstitial fluid with microdialysis reveals plaque-associated changes in amyloid-beta metabolism and half-life.</a> The Journal of Neuroscience. 23 (26), 8844-8853 (2003).</li>
<li>Emmanouilidou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+%CE%B1-synuclein+secretion+in+mouse+and+human+brain+parenchyma%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Assessment of α-synuclein secretion in mouse and human brain parenchyma.</a> PLoS One. 6 (7), 1-9 (2011).</li>
<li>Yamada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+microdialysis+reveals+age-dependent+decrease+of+brain+interstitial+fluid+tau+levels+in+P301S+human+tau+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In vivo microdialysis reveals age-dependent decrease of brain interstitial fluid tau levels in P301S human tau transgenic mice.</a> The Journal of Neuroscience. 31 (37), 13110-13117 (2011).</li>
<li>Ulrich, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+measurement+of+apolipoprotein+E+from+the+brain+interstitial+fluid+using+microdialysis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">In vivo measurement of apolipoprotein E from the brain interstitial fluid using microdialysis.</a> Molecular Neurodegeneration. 8 (1), 13(2013).</li>
<li>Emmanouilidou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+transmission+via+ATP-dependent+K%2B+channels+regulates+%CE%B1-synuclein+secretion+in+mouse+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">GABA transmission via ATP-dependent K+ channels regulates α-synuclein secretion in mouse striatum.</a> Brain. 139 (3), 871-890 (2016).</li>
<li>Takeda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seed-competent+high-molecular-weight+tau+species+accumulates+in+the+cerebrospinal+fluid+of+Alzheimer%27s+disease+mouse+model+and+human+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Seed-competent high-molecular-weight tau species accumulates in the cerebrospinal fluid of Alzheimer's disease mouse model and human patients.</a> Annals of Neurology. 80 (3), 355-367 (2016).</li>
<li>Yamada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+Microdialysis+of+brain+interstitial+fluid+for+the+determination+of+extracellular+tau+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In vivo Microdialysis of brain interstitial fluid for the determination of extracellular tau levels.</a> Methods in Molecular Biology. 1523, 285-296 (2017).</li>
<li>Kang, J. -E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid-%CE%B2+dynamics+are+regulated+by+orexin+and+the+sleep-wake+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Amyloid-β dynamics are regulated by orexin and the sleep-wake cycle.</a> Science. 326 (November), 1005-1008 (2009).</li>
<li>Cirrito, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+activity+regulates+interstitial+fluid+amyloid-beta+levels+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synaptic activity regulates interstitial fluid amyloid-beta levels in vivo.</a> Neuron. 48 (6), 913-922 (2005).</li>
<li>Bero, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+regulates+the+regional+vulnerability+to+amyloid-%CE%B2+deposition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity regulates the regional vulnerability to amyloid-β deposition.</a> Nature Neuroscience. 14 (6), 750-756 (2011).</li>
<li>Yamada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+regulates+extracellular+tau+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity regulates extracellular tau in vivo.</a> Journal of Experimental Medicine. 211 (3), 387-393 (2014).</li>
<li>Pooler, A. M., Phillips, E. C., Lau, D. H. W., Noble, W., Hanger, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+release+of+endogenous+tau+is+stimulated+by+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Physiological release of endogenous tau is stimulated by neuronal activity.</a> EMBO Reports. 14 (4), 389-394 (2013).</li>
<li>Castellano, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+apoE+isoforms+differentially+regulate+brain+amyloid-%CE%B2+peptide+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human apoE isoforms differentially regulate brain amyloid-β peptide clearance.</a> Science Translational Medicine. 3 (89), 89ra57(2011).</li>
<li>Yamada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+in+vivo+turnover+of+tau+in+a+mouse+model+of+tauopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">Analysis of in vivo turnover of tau in a mouse model of tauopathy.</a> Molecular Neurodegeneration. 10 (1), 55(2015).</li>
<li>Taylor, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+local+and+long-range+neuronal+network+dynamics+by+simultaneous+optogenetics%2C+reverse+microdialysis+and+silicon+probe+recordings+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Investigating local and long-range neuronal network dynamics by simultaneous optogenetics, reverse microdialysis and silicon probe recordings in vivo.</a> Journal of Neuroscience Methods. 235, 83-91 (2014).</li>
</ol>

Autor nie ma nic do zdradzienia.

Mikrodializa z membranami odcinającymi o dużej masie cząsteczkowej musi być obsługiwana w trybie push-pull, dlatego bardzo ważne jest, aby natężenie przepływu było dokładne i stałe. Niedokładność natężeń przepływu może być przyczyną powstawania pęcherzyków powietrza i niespójności w stężeniu próbki. Jeśli przepływ jest niespójny, sprawdź wszystkie połączenia pod kątem wycieków. Jeśli problem nadal występuje, może być konieczne ponowne uruchomienie z nowymi sondami i rurkami.
Sondy mikrodilayoz...

ISF obejmuje 15-20% całkowitej objętości mózgu i oferuje mikrośrodowisko krytyczne dla transdukcji sygnału, transportu substratu i usuwania odpadów1. W związku z tym możliwość pozyskiwania ISF od żywych zwierząt zapewni większe implikacje dla różnych procesów biologicznych, a także mechanizmu choroby. Mikrodializa in vivo jest jedną z niewielu metod, które pobierają próbki i określają ilościowo cząsteczki zewnątrzkomórkowe z ISF od obudzonych, swobodnie poruszających się zwierząt, a tym samym służy jako użyteczne narzędzie w dziedzinie badań neurobiologicznych2,3. W tej metodzie sondy mikrodializacyjne z półprzepuszczalnymi błonami są wprowadzane do mózgu i perfundowane buforem perfuzyjnym ze stosunkowo wolnym natężeniem przepływu (0,1-5 μl/min). Podczas tej perfuzji cząsteczki zewnątrzkomórkowe w ISF biernie dyfundują do sondy zgodnie z gradientem stężeń i zbierają się jako dializat. Chociaż ten artykuł koncentruje się na metodzie pobierania próbek ISF w mózgu, zarówno zasada, jak i metoda mogą być zastosowane do innych narządów poprzez odpowiednią modyfikację, jeśli to konieczne.
Mikrodializa została po raz pierwszy zastosowana na początku lat sześćdziesiątych i od tego czasu jest szeroko stosowana do zbierania małych cząsteczek, w tym aminokwasów lub neuroprzekaźników w mózgu. Jednak niedawna dostępność komercyjna sond do mikrodializy z membranami odcinającymi o dużej masie cząsteczkowej (100 kDa-3 MDa) rozszerzyła jej zastosowanie również na stosunkowo większe białka w ISF4,5,6,7. Badania z użyciem tych sond doprowadziły do ustalenia, że białka takie jak tau lub α-synukleina, które przez długi czas uważano za wyłącznie cytoplazmatyczne, są również fizjologicznie obecne w ISF4,5,8.
Jedną z trudności związanych z używaniem sond do mikrodializy z dużymi membranami odcinającymi (zazwyczaj ponad 1,000 kDa) jest to, że są one bardziej podatne na utratę płynu ultrafiltracyjnego z powodu wewnętrznego ciśnienia zgromadzonego w sondach. Zastosowane tutaj sondy do mikrodializy mają unikalną strukturę, aby uniknąć tego problemu. Ciśnienie nie zostanie wytworzone z powodu tej struktury, dlatego mikrodializa z tymi sondami powinna być prowadzona w trybie "push-pull" przy użyciu pompy strzykawkowej do perfuzji sond (=push) i pompy rolkowej/perystaltycznej do zbierania dialiatu pochodzącego z wylotu sondy (=pull)9 (Chociaż wymaga zarówno pomp push, jak i pull, Ze względu na otwory wentylacyjne znoszące ciśnienie znajdujące się w sondach, technicznie rzecz biorąc, system jest napędzany tylko przez pompę ciągnącą). Ten artykuł rozpoczyna się od stereotaktycznej chirurgii implantacji kaniuli prowadzącej i opisuje, jak skonfigurować linie mikrodializy w celu pobrania ISF przez sondy mikrodializ z membranami odcinającymi 1,000 kDa.

<table><tbody><tr><td>Mikropróbnik Univentor 820</td><td>Univentor</td><td>8303002</td><td>Chłodzony kolektor frakcji</td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa</td><td>KD scientific</td><td>KDS-101</td><td></td></tr><tr><td>Pompa rolkowa</td><td>Eicom mikrodializa</td><td>ERP-10</td><td></td></tr><tr><td>Samodzielny system Raturn</td><td>BASi</td><td>MD-1409</td><td>System swobodnie poruszający</td></tr><tr><td>się Zestaw klatek dwugatunkowych</td><td>BASi</td><td>CX-1600</td><td></td></tr><tr><td>Sonda do mikrodializy AtmosLM (długość trzonu 8 mm, długość membrany 2 mm)</td><td>Mikrodializa Eicom</td><td>PEP-8-02</td><td>Długość trzonka sondy, prowadnicy, sondy imitującej i adaptera stereotaktycznego powinna być identyczna.</td></tr><tr><td>Przewodnik do mikrodializy (długość trzonka 8 mm)</td><td>Eicom mikrodializa</td><td>PEG-8</td><td></td></tr><tr><td>Atrapa sondy do mikrodializy (długość trzonu 8 mm)</td><td>Eicom mikrodializa</td><td>PED-8</td><td></td></tr><tr><td>Śruba kostna</td><td>BASi</td><td>MD-1310</td><td></td></tr><tr><td>Super bond C& Zestaw B</td><td>Sunmedical</td><td></td><td>Cement dentystyczny</td></tr><tr><td>Instrument stereotaktyczny dla małych zwierząt z cyfrowym wyświetlaczem konsola</td><td>Kopf</td><td>Model 940</td><td>Aparat stereotaktyczny</td></tr><tr><td>Adapter myszy i noworodka</td><td>Stoelting</td><td>51625</td><td></td></tr><tr><td>Standardowe nauszniki i gumowe końcówki do myszy Stereotaxic</td><td>Stoelting</td><td>51648</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór albuminy z surowicy bydlęcej</td><td>Sigma</td><td>A7284-50ML</td><td>30% roztwór BSA</td></tr><tr><td>Rurka FEP (70 cm)</td><td>Mikrodializa Eicom</td><td>JF-10-70</td><td>Objętość wewnętrzna = 0,5 &mikro; L/cm</td></tr><tr><td>Rurka teflonowa (50 cm)</td><td>Mikrodializa Eicom</td><td>JT-10-50</td><td>Objętość wewnętrzna = 0,08 &mikro; L/cm</td></tr><tr><td>Rurka Byton</td><td>Mikrodializa Eicom</td><td>JB-30</td><td></td></tr><tr><td>Adapter ukłucia Luer Intramedic 23G</td><td>BD</td><td>427565</td><td>Igła z końcem</td></tr><tr><td>Rurka rolkowa</td><td>Mikrodializa Eicom</td><td>RT-5S</td><td>Objętość wewnętrzna = 4 &mikro; L</td></tr><tr><td>Nakrętka kołpakowa</td><td>Eicom mikrodializa</td><td>AC-5</td><td></td></tr><tr><td>0,25 ml probówka do mikrowirówki z nakrętką</td><td>QSP</td><td>503-Q</td><td>Probówki do kolektora frakcji</td></tr><tr><td>Adapter sterotaksyjny (długość trzonu 8 mm)</td><td>Eicom mikrodializa</td><td>PESG-8</td><td></td></tr><tr><td>Igła przyłączeniowa</td><td>Eicom mikrodializa</td><td>RTJ</td><td></td></tr><tr><td>Obroża dla zwierząt dla myszy</td><td>BASi</td><td>MD-1365</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw mikrosilnika obrotowego o dużej prędkości</td><td>FOREDOM</td><td>K.1070</td><td>Wiertarka</td></tr><tr><td>Pikrotoksyna</td><td>Sigma</td><td>P1675</td><td></td></tr><tr><td>Śrubokręt do kostnych</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Skalpel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wacik</td><td></td><td></td><td></td>bawełniany</tr><tr><td>Maszynka</td><td></td><td></td><td></td> do strzyżenia chirurgicznego</tr></tbody></table>

in vivo (in vivo) metoda mikrodializy do zbierania dużych białek zewnątrzkomórkowych z płynu śródmiąższowego mózgu za pomocą sond odcinających o dużej masie cząsteczkowej

In Vivo Microdialysis Method to Collect Large Extracellular Proteins from Brain Interstitial Fluid with High-molecular Weight Cut-off Probes

Mikrodializa in vivo to potężna technika pobierania ISF od przytomnych, swobodnie zachowujących się zwierząt, oparta na zasadzie dializy. Podczas gdy mikrodializa jest uznaną metodą, która mierzy stosunkowo małe cząsteczki, w tym aminokwasy lub neuroprzekaźniki, ostatnio została wykorzystana do oceny dynamiki większych cząsteczek w ISF za pomocą sond z błonami odcinającymi o dużej masie cząsteczkowej. Po użyciu takich sond mikrodializa musi być prowadzona w trybie push-pull, aby uniknąć narastania ciśnienia wewnątrz sond. Ten artykuł zawiera protokoły krok po kroku, w tym chirurgię stereotaktyczną i sposób konfigurowania linii mikrodializy w celu pobrania białek z ISF. Podczas mikrodializy leki mogą być podawane ogólnoustrojowo lub w bezpośrednim wlewie do ISF. Odwrotna mikrodializa to technika bezpośredniego wprowadzania związków do ISF. Włączenie leków do buforu perfuzyjnego mikrodializy pozwala im dyfundować do ISF przez sondy, jednocześnie zbierając ISF. Mierząc białko tau jako przykład, autor pokazuje, jak zmienia się jego poziom po stymulacji aktywności neuronalnej przez odwrotną mikrodializę pikrotoksyny. Opisano zalety i ograniczenia mikrodializy wraz z rozszerzonym zastosowaniem poprzez połączenie innych metod in vivo.

Aby stymulować lub hamować aktywność neuronalną w odwrotnej mikrodializie11,12,13, stosowano picrotoksynę, antagonistę receptora GABAA, lub tetrodotoksynę, bloker kanałów Na+. Wykazano, że uwalnianie białka tau jest stymulowane przez zwiększenie aktywności neuronalnej13,14. Zgodnie z tymi wcześniejszymi obserwacjami,...

Mikrodializa in vivo umożliwiła pobranie cząsteczek obecnych w płynie śródmiąższowym mózgu (ISF) od obudzonych, swobodnie zachowujących się zwierząt. W celu analizy stosunkowo dużych cząsteczek w ISF, niniejszy artykuł koncentruje się w szczególności na protokole mikrodializy przy użyciu sond z membranami odcinającymi o dużej masie cząsteczkowej.

In vivo (in vivo) Metoda mikrodializy do zbierania dużych białek zewnątrzkomórkowych z płynu śródmiąższowego mózgu za pomocą sond odcinających o dużej masie cząsteczkowej

In vivo microdialysis is a powerful technique to collect ISF from awake, freely-behaving animals based on a dialysis principle. While microdialysis is an ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie badań neurobiologicznych dotyczące tego, w jaki sposób transdukcja sygnału, transport substratu i usuwanie odpadów zachodzą w przestrzeniach zewnątrzkomórkowych mózgu. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona pobieranie próbek i ilościowe określanie dużych cząsteczek zewnątrzkomórkowych w płynie śródmiąższowym lub ISF obudzonych, swobodnie poruszających się zwierząt. Po potwierdzeniu braku reakcji na szczypanie palców, usuń włosy z czaszki znieczulonej myszy i użyj pasków na uszy i zacisku na nos, aby bezpiecznie przymocować zwierzę do adaptera.Nałóż maść na oczy zwierzęcia i umieść adapter na aparacie stereotaktycznym. Za pomocą skalpela wykonaj strzałkowo nacięcie skóry nad czaszką i przymocuj wiertło do manipulatora ramy stereotaktycznej. Opuść wiertło, aż delikatnie dotknie lambda i zresetuj współrzędną DV wiertła do zera.Następnie przesuń wiertło do bregma, aby zresetować współrzędne AP i ML do zera. Przesuń wiertło z bregmy do współrzędnej pionowej. Opuść wiertło do czaszki i ponownie ustaw współrzędną DV na zero.Po powtórzeniu procedury dla trzeciej współrzędnej, ostrożnie wywierć otwór w zadziorach na współrzędnej docelowej, a następnie drugi otwór po przeciwnej stronie kości ciemieniowej. Włóż kościaną do drugiego otworu i umieść element blokujący z 1,5-mililitrowej probówki do mikrowirówki na czaszce tak, aby otwory na zadziory znajdowały się w okręgu. Następnie umieść kaniulę prowadzącą na krótszym ramieniu adaptera stereotaktycznego i przymocuj kaniulę za pomocą nakrętki kołpakowej.Ustaw dłuższe ramię adaptera stereotaktycznego na zacisku elektrody i przymocuj ramię do manipulatora aparatu stereotaktycznego. Obróć zespół stereotaktyczny DV na ramieniu manipulatora o 12 stopni i przesuń kaniulę prowadzącą do otworu zadziorów. Następnie powoli opuść kaniulę prowadzącą na 1,2 milimetra do mózgu.Dodaj cement dentystyczny do korony, aż metalowa część kaniuli prowadzącej, śruba kostna i odsłonięta czaszka zostaną pokryte i zabezpieczone oraz pozwolą cementowi wyschnąć. Po 12 do 20 minutach wyjmij adapter stereotaktyczny z zacisku elektrody, odkręć nakrętkę kołpakową i zastąp adapter stereotaktyczny atrapą sondy. Następnie ponownie zakręć nakrętkę kołpakową, uwolnij mysz od aparatu stereotaktycznego i umieść samą mysz w osobnej klatce.Przed przystąpieniem do mikrodializy należy napełnić jednorazową strzykawkę o pojemności jednego mililitra wodą destylowaną i za pomocą rurki z witonem podłączyć strzykawkę do wylotu sondy do mikrodializy. Ręcznie zakryj otwory wentylacyjne i delikatnie naciśnij tłok strzykawki, aby nasycić sondę wodą. Upewnij się, że we wlocie sondy pojawiła się woda i że na powierzchnię membrany do mikrodializy wyciekła woda.Aby aktywować sondę, zanurz membrany sondy w 70-100% etanolu na dwie sekundy, a następnie dokonaj drugiego naparu z wody destylowanej. Podłączyć igłę łączącą do jednego przewodu wlotowego i wylotowego i załadować jednorazową trzymililitrową strzykawkę ze świeżo przygotowanym buforem perfuzyjnym. Podłącz strzykawkę wyposażoną w igłę z końcem do końcówki wlotowej rurki i użyj pompy strzykawkowej, aby napełnić cały przewód buforem perfuzyjnym.Gdy rurka jest pełna, wymień igłę łączącą między przewodami wlotowymi i wylotowymi z aktywowaną sondą do mikrodializy i nakrętką kołpakową i zamontuj rurkę rolkową w rurce wylotowej na pompie rolkowej. Uruchom pompę strzykawkową z prędkością 10 mikrolitrów na minutę, a pompę rolkową z prędkością 9,5-9,8 mikrolitrów na minutę. Teraz umieść obrożę na szyi znieczulonego zwierzęcia z wszczepioną kaniulą prowadzącą i zdejmij nakrętkę kołpakową i atrapę sondy.Powoli włóż sondę do mikrodializy przez kaniulę prowadzącą i dokręć nakrętkę kołpakową. Następnie umieść mysz w klatce podłączonej do systemu swobodnego ruchu i przywiąż mysz do obroży. Po upływie co najmniej jednej godziny należy kolejno zatrzymać pompę rolkową i pompę strzykawkową, ponownie uruchamiając pompy z pompą strzykawkową ustawioną na 20% szybciej niż pompa rolkowa i umieścić wolny koniec rurki wylotowej na schłodzonym kolektorze frakcji, aby zebrać ISF mózgu.Po uzyskaniu odpowiedniej objętości eksperymentalnej wyjmij sondę i zajmij się odzyskiwaniem myszy, jak pokazano. Zgodnie z wcześniejszymi obserwacjami, gdy 50-mikromolowa pikrotoksyna jest podawana za pomocą odwrotnej mikrodializy, jak wykazano u obudzonych myszy C57B6J, obserwuje się wzrost śródmiąższowych endogennych poziomów tau w porównaniu z poziomami mierzonymi u zwierząt leczonych kontrolą nośnika. Oprócz podawania leków, mikrodializa może być łączona z innymi metodami in vivo, takimi jak zapis EEG lub optogenetyka, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące tego, jak aktywność neuronalna wpływa na stężenie substratu w ISF.

in-vivo-microdialysis-method-to-collect-large-extracellular-proteins

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Monitorowanie poziomów neurotransmiterów pozakomórkowych w określonych obszarach mózgu swobodnie poruszających się zwierząt dostarcza wiedzy na temat związku między uwalnianiem neurotransmiterów a zachowaniem. Mikrodializa in vivo w połączeniu z detekcją elektrochemiczną zapewnia doskonałą rozdzielczość anatomiczną i chemiczną, a także informacje o tym, w jaki sposób podstawowa neurotransmisja ulega zmianom pod wpływem manipulacji farmakologicznych lub fizjologicznych.

Przeżywalna operacja stereotaktyczna u gryzoni

Modulacja zależnej od hipokampa przestrzennej pamięci roboczej poprzez bezpośrednią mikroiniekcję wewnątrzhipokampalną, połączoną z następującą po niej mikrodializą in vivo w celu oznaczania metabolitów u świadomych, aktywnych behawioralnie zwierząt.

Mikroiniekcja insuliny do hipokampa i mikrodializa in vivo podczas testów pamięci przestrzennej

Film przedstawia proces używania sondy do mikrodializy do zbierania białek zewnątrzkomórkowych z płynu śródmiąższowego (ISF) mózgu myszy. Sonda do mikrodializy, wyposażona w półprzepuszczalną membranę o dużej masie cząsteczkowej, jest wprowadzana do mózgu znieczulonej myszy za pomocą wszczepionej kaniuli prowadzącej. Sonda, podłączona do pomp, pozwala fizjologicznemu buforowi na perfuzję tkanki mózgowej i zmieszanie się z ISF. Białka w ISF dyfundują przez półprzepuszczalną błonę i są zbierane...

Mikrodializa płynu śródmiąższowego z mózgu myszy w celu wyizolowania białek zewnątrzkomórkowych

Powszechny protokół ekstrakcji białek przy użyciu buforu mocznikowego/tiomocznikowego/SDS dla tkanki mózgowej ludzi i myszy umożliwia identyfikację białek za pomocą 2D-DIGE i ich późniejszą charakterystykę za pomocą mini immunoblottingu 2DE. Metoda ta umożliwia uzyskanie bardziej powtarzalnych i wiarygodnych wyników z biopsji człowieka i modeli eksperymentalnych.

Konsensus białka pochodzenia mózgowego, protokół ekstrakcji do badania ludzkiego i mysiego proteomu mózgu przy użyciu immunoblottingu zarówno 2D-DIGE, jak i Mini 2DE

Mikrodializa jest powszechnie stosowaną techniką w badaniach neurobiologicznych. Dlatego sondy komercyjne są bardzo poszukiwane. W tej pracy szczegółowo wyjaśniono montaż sondy, aby zbudować niezawodną, koncentryczną, wykonaną na zamówienie sondę do mikrodializy za mniej niż 10 USD.

Wykonany na zamówienie projekt sondy do mikrodializy

Tutaj opisana jest metoda izolacji mikronaczyń mózgowych szczurów i przygotowania próbek błonowych. Protokół ten ma wyraźną zaletę polegającą na wytwarzaniu wzbogaconych próbek mikronaczyń o akceptowalnej wydajności białka od poszczególnych zwierząt. Próbki można następnie wykorzystać do solidnych analiz białek w śródbłonku mikronaczyniowym mózgu.

Prosta i powtarzalna metoda przygotowania próbek błonowych ze świeżo wyizolowanych mikronaczyń mózgu szczura

Tutaj opisujemy metodę mikrodializy in vivo do analizy uwalniania asparaginianu i glutaminianu w brzusznym hipokampie u szczurów z padaczką i bez padaczki, w połączeniu z zapisami EEG. Zewnątrzkomórkowe stężenia asparaginianu i glutaminianu mogą być skorelowane z różnymi fazami choroby.

Mikrodializa aminokwasów pobudzających podczas zapisów EEG u swobodnie poruszających się szczurów

Protokół tutaj zapewnia szczegółowe, dynamiczne pobieranie próbek płynu zewnątrzkomórkowego w czasie rzeczywistym z hipokampa obudzonych szczurów za pomocą systemu mikrodializy.

Dynamiczne pobieranie w czasie rzeczywistym płynu zewnątrzkomórkowego hipokampa od przytomnych szczurów za pomocą systemu mikrodializy

In vivo komunikacja międzykomórkowa leżąca u podstaw wielu chorób ośrodkowego układu nerwowego, takich jak glejak (GBM), jest notorycznie trudna do zmierzenia i scharakteryzowania. Opisujemy tutaj procedury mikroperfuzji otwartego przepływu mózgu (cOFM), które można zastosować do pobierania próbek składników płynu międzymiąższowego w podłużnym modelu zwierzęcym GBM.

Wykorzystanie mikroperfuzji otwartego przepływu mózgu do podłużnego pobierania płynu śródmiąższowego w zwierzęcym modelu glejaka

Opisane zostaną zewnątrzkomórkowe rejestracje aktywności neuronalnej z wykorzystaniem sond krzemowych u znieczulonego szczura. Technika ta pozwala na pozyskiwanie informacji z wielu obszarów mózgu od ponad 100 neuronów jednocześnie. Dostarcza ona informacji z rozdzielczością pojedynczych komórek na temat dynamiki zespołów neuronalnych w wielu obwodach lokalnych.

Rejestracja wielkoskalowych zespołów neuronalnych za pomocą sond krzemowych u znieczulonego szczura

Poznaj metodę mikrodializy in vivo do pobierania dużych białek z płynu śródmiąższowego mózgu u myszy. Technika ta umożliwia badanie sygnalizacji neuronalnej i usuwania odpadów w czasie rzeczywistym.

In vivo (in vivo) Metoda mikrodializy do zbierania dużych białek zewnątrzkomórkowych z płynu śródmiąższowego mózgu za pomocą sond odcinających o dużej masie cząsteczkowej (Wideo) | JoVE Journal

In vivo (in vivo) Metoda mikrodializy do zbierania dużych białek zewnątrzkomórkowych z płynu śródmiąższowego mózgu za pomocą sond odcinających o dużej masie cząsteczkowej

Przeglądaj więcej filmów