Name: Hodowla i transfekcja komórek pierwotnych danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Naucz się hodowli i transfekcji komórek pierwotnych danio pręgowanego z zarodków i mózgu dorosłych osobników. Ta metoda umożliwia obrazowanie żywych komórek z wysoką rozdzielczością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy T. Fritschowi, A. Wolf-Asseburgowi, I. Lindemu i S.-M. Tokarskiemu za doskonałą opiekę nad zwierzętami i wsparcie techniczne. Jesteśmy wdzięczni wszystkim członkom laboratorium Köster za intensywne i pomocne dyskusje. Wyrażamy wdzięczność za dofinansowanie ze strony Deutsche Forschungsgemeinschaft (KO 1949/5-1) oraz kraju związkowego Dolna Saksonia Niedersächsisches Vorab (VWZN2889).

<ol><li>Ablain, J., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+fish+and+men%3A+using+zebrafish+to+fight+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Of fish and men: using zebrafish to fight human diseases.</a> Trends in Cell Biology. 23, 584-586 (2013).</li>
<li>Sassen, W. A., Köster, R. <a target="_blank" href="https://www.ingentaconnect.com/content/doaj/11799870/2015/00002015/00000001/art00004">A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish.</a> Advances in Genomics and Genetics. , 151(2015).</li>
<li>Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+Gal4-UAS+technique+for+targeted+gene+expression+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish.</a> Mechanisms of Development. 80, 153-158 (1999).</li>
<li>Köster, R. W., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+transgene+expression+in+living+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Tracing transgene expression in living zebrafish embryos.</a> Developmental Biology. 233, 329-346 (2001).</li>
<li>Driever, W., Rangini, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+cell+line+derived+from+zebrafish+%28Brachydanio+rerio%29+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology+-+Animal%22%5BJournal%5D)">Characterization of a cell line derived from zebrafish (Brachydanio rerio) embryos.</a> In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 29A, 749-754 (1993).</li>
<li>Badakov, R., Jaźwińska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transfection+of+primary+zebrafish+fibroblasts+by+nucleofection%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Efficient transfection of primary zebrafish fibroblasts by nucleofection.</a> Cytotechnology. 51, 105-110 (2006).</li>
<li>Senghaas, N., Köster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+and+transfecting+zebrafish+PAC2+fibroblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Culturing and transfecting zebrafish PAC2 fibroblast cells.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book.+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , 5th Edition, University of Oregon. Eugene. (2007).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Basic methods in cellular and molecular biology. Using a hemacytometer to count cells. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells">https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells</a> (2017).</li>
<li>Rupp, R. A., Snider, L., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+embryos+regulate+the+nuclear+localization+of+XMyoD%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Xenopus embryos regulate the nuclear localization of XMyoD.</a> Genes & Development. 8, 1311-1323 (1994).</li>
<li>Piperno, G., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+specific+for+an+acetylated+form+of+alpha-tubulin+recognize+the+antigen+in+cilia+and+flagella+from+a+variety+of+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies specific for an acetylated form of alpha-tubulin recognize the antigen in cilia and flagella from a variety of organisms.</a> Journal of Cell Biology. 101 (6), 2085-2094 (1985).</li>
<li>Barden, J. A., Miki, M., Hambly, B. D., Dos Remedios, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+the+phalloidin+and+nucleotide-binding+sites+on+actin%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Localization of the phalloidin and nucleotide-binding sites on actin.</a> European Journal of Biochemistry. 162 (3), 583-588 (1987).</li>
<li>Kapuscinski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DAPI%3A+a+DNA-specific+fluorescent+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnic+%26+Histochemistry%22%5BJournal%5D)">DAPI: a DNA-specific fluorescent probe.</a> Biotechnic & Histochemistry. 70 (5), 220-233 (1995).</li>
<li>Gupta, T., Mullins, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+organs+from+the+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Dissection of organs from the adult zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments. 37, E1717(2010).</li>
<li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263, 802-805 (1994).</li>
<li>Stornaiuolo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KDEL+and+KKXX+retrieval+signals+appended+to+the+same+reporter+protein+determine+different+trafficking+between+endoplasmic+reticulum%2C+intermediate+compartment%2C+and+Golgi+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">KDEL and KKXX retrieval signals appended to the same reporter protein determine different trafficking between endoplasmic reticulum, intermediate compartment, and Golgi complex.</a> Molecular Biology of the Cell. 14, 889-902 (2003).</li>
<li>Lithgow, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+proteins+to+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Targeting of proteins to mitochondria.</a> FEBS Letters. 476, 22-26 (2000).</li>
<li>Nagai, T., Ibata, K., Park, E. S., Kubota, M., Mikoshiba, K., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variant+of+yellow+fluorescent+protein+with+fast+and+efficient+maturation+for+cell-biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications.</a> Nature Biotechnology. 20, 87-90 (2002).</li>
<li>Sassen, W. A., Lehne, F., Russo, G., Wargenau, S., Dübel, S., Köster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+zebrafish+primary+cell+culture+for+transfection+and+live+cellular+and+subcellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Embryonic zebrafish primary cell culture for transfection and live cellular and subcellular imaging.</a> Developmental Biology. 430, 18-31 (2017).</li>
<li>Horesh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Doublecortin%2C+a+stabilizer+of+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Doublecortin, a stabilizer of microtubules.</a> Human Molecular Genetics. 8, 1599-1610 (1999).</li>
<li>Shaner, N. C., Campbell, R. E., Steinbach, P. A., Giepmans, B. N. G., Palmer, A. E., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+monomeric+red%2C+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 22, 1567-1572 (2004).</li>
<li>Distel, M., Hocking, J. C., Volkmann, K., Köster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+centrosome+neither+persistently+leads+migration+nor+determines+the+site+of+axonogenesis+in+migrating+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The centrosome neither persistently leads migration nor determines the site of axonogenesis in migrating neurons in vivo.</a> Journal of Cell Biology. 191, 875-890 (2010).</li>
<li>Matsuda, T., Miyawaki, A., Nagai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurement+of+protein+dynamics+inside+cells+using+a+rationally+designed+photoconvertible+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Direct measurement of protein dynamics inside cells using a rationally designed photoconvertible protein.</a> Nature Methods. 5, 339-345 (2008).</li>
<li>Archer, B. T., Ozçelik, T., Jahn, R., Francke, U., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+and+chromosomal+localizations+of+two+human+genes+encoding+synaptobrevins+1+and+2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Structures and chromosomal localizations of two human genes encoding synaptobrevins 1 and 2.</a> Journal of Biological Chemistry. 265, 17267-17273 (1990).</li>
<li>Griesbeck, O., Baird, G. S., Campbell, R. E., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+the+environmental+sensitivity+of+yellow+fluorescent+protein.+Mechanism+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reducing the environmental sensitivity of yellow fluorescent protein. Mechanism and applications.</a> Journal of Biological Chemistry. 276, 29188-29194 (2001).</li>
<li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bright+monomeric+green+fluorescent+protein+derived+from+Branchiostoma+lanceolatum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum.</a> Nature Methods. 10, 407-409 (2013).</li>
<li>Campbell, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+monomeric+red+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Procedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A monomeric red fluorescent protein.</a> Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 7877-7882 (2002).</li>
<li>Peri, F., Nüsslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+neuronal+degradation+by+microglia+reveals+a+role+for+v0-ATPase+a1+in+phagosomal+fusion+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Live imaging of neuronal degradation by microglia reveals a role for v0-ATPase a1 in phagosomal fusion in vivo.</a> Cell. 133, 916-927 (2008).</li>
<li>Godinho, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+amacrine+cell+neurites+to+appropriate+synaptic+laminae+in+the+developing+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina.</a> Development. 132, 5069-5079 (2005).</li>
<li>Jusuf, P. R., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ptf1a+is+expressed+transiently+in+all+types+of+amacrine+cells+in+the+embryonic+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Development%22%5BJournal%5D)">Ptf1a is expressed transiently in all types of amacrine cells in the embryonic zebrafish retina.</a> Neural Development. 4, 34(2009).</li>
<li>Kani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proneural+gene-linked+neurogenesis+in+zebrafish+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Proneural gene-linked neurogenesis in zebrafish cerebellum.</a> Developmental Biology. 343, 1-17 (2010).</li>
<li>Distel, M., Wullimann, M. F., Köster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+Gal4+genetics+for+permanent+gene+expression+mapping+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Procedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish.</a> Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 13365-13370 (2009).</li>
<li>Choorapoikayil, S., Overvoorde, J., den Hertog, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deriving+cell+lines+from+zebrafish+embryos+and+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Deriving cell lines from zebrafish embryos and tumors.</a> Zebrafish. 10, 316-332 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Tutaj przedstawiamy dwa różne protokoły hodowli komórek pierwotnych z zarodków danio pręgowanego z 2 dpf lub mózgu dorosłego danio pręgowanego.
Przygotowanie pierwotnych kultur komórkowych z danio pręgowanego o wartości 2 dpf jest stosunkowo łatwe do wykonania dla każdego, kto ma doświadczenie w podstawowych technikach hodowli komórkowych. Jednak, aby uzyskać dobre i powtarzalne wyniki, niezbędna jest wystarczająca liczba zarodków jako materiału wyjściowego (100 to minimum). Podczas hodowli za...

Danio pręgowany (Danio rerio, D. rerio) jest popularnym modelowym kręgowcem dla wielu dziedzin badań podstawowych i biomedycznych1. Zarodki danio pręgowanego rozwijają się szybko po macicy, są przezroczyste i mieszczą się pod mikroskopem, zapewniając tym samym doskonałe warunki do badania rozwoju kręgowców w żywym organizmie. Ze względu na podatność genetyczną danio pręgowanego2, ustanowiono wiele stabilnych transgenicznych linii reporterowych z ekspresją różnych markerów fluorescencyjnych specyficznych dla typu komórki, co pozwala na obserwację określonych populacji komórek. Społeczność danio pręgowanego oferuje szeroką gamę tak zwanych linii napędowych Gal4, które przenoszą transgen wyrażający syntetyczny gen Kal4TA4 (lub odpowiednik KalTA3 GalFF) z domeną wiążącą Gal4-DNA drożdży połączonych z domenami aktywacji transkrypcji wirusa pod kontrolą wzmacniaczy specyficznych dla typu komórki. Te linie sterujące są krzyżowane z liniami efektorowymi, które przenoszą transgeny składające się ze zdefiniowanej sekwencji aktywującej (UAS) połączonej z genem reporterowym. Białko Kal4TA4 wiąże się z elementem UAS, aktywując w ten sposób selektywną ekspresję genu reporterowego typu komórkowego 3,4. Takie podejście pozwala na bardzo zróżnicowane badania kombinatoryczne prawie wszystkich dostępnych elementów wzmacniających i reporterowych u zwierząt podwójnie transgenicznych.
Jednak dogłębne obrazowanie na żywo z naciskiem na pojedyncze komórki lub ich zawartość subkomórkową jest ograniczone w całym i ciągle zmieniającym się zarodku. Aby odpowiedzieć na konkretne pytania biologiczne komórek z najwyższą rozdzielczością, często preferowane jest stosowanie kultur komórkowych. Istnieją pewne linie komórkowe danio pręgowanego, ale są one uważane za silnie wyselekcjonowane5,6,7 i ich rozmnażanie jest często czasochłonne. Co więcej, wszystkie dostępne linie komórkowe pochodzą z fibroblastów, co ogranicza eksperymenty z wykorzystaniem hodowli komórkowych do jednego typu komórek. W związku z tym opracowaliśmy zarówno skuteczny, jak i łatwy w użyciu protokół przygotowania komórek pierwotnych bezpośrednio z zarodków danio pręgowanego i mózgu dorosłego danio pręgowanego, wraz z podejściami mającymi na celu wydłużenie żywotności hodowli i poszerzenie różnorodności hodowanych typów komórek. Ponadto przedstawiamy procedurę transfekcji embrionalnych komórek pierwotnych za pomocą konstruktów ekspresyjnych dla markerów organelli fluorescencyjnych. W ten sposób morfologie komórkowe i struktury subkomórkowe mogą być analizowane z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową w różnych typach komórek, które zachowują swoje kluczowe cechy.

<table><tbody><tr><td>Linie rybne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AB (typ dziki)</td><td></td><td></td><td>ustanowiony przez Streisingera i współpracowników, dostępny w Międzynarodowym Centrum Zasobów Zebrafish (ZIRC)</td></tr><tr><td>Tg(ptf1a:eGFP)jh1</td><td></td><td></td>, <td>w którym wzmacniacz genu danio pręgowanego ptf1a napędza ekspresję białka fluorescencyjnego EGFP (Parsons et al., 2007)</td></tr><tr><td>Tg(XITubb:DsRed)zf148</td><td></td><td></td><td>stabilna linia transgeniczna, w której Xenopus specyficzny dla neuronów promotor beta tubuliny napędza ekspresję białka fluorescencyjnego DsRed&nbsp; (Peri i N&uuml; sslein-Volhard, 2008)</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</strong</td><td>>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>wirówka</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>model 5804 R</td></tr><tr><td>System obrazowania ChemiDoc MP</td><td>BioRad</td><td></td><td>model XRS+, służy do pozyskiwania czarno-białych obrazów szalek Petriego zawierających 1 da zarodki</td></tr><tr><td>konfokalny laserowy mikroskop skaningowy</td><td>Leica microsystems</td><td></td><td>model SP8, wyposażony w 28 &deg; Skrzynka temperaturowa C i obiektywowy</td></tr><tr><td>mikroskop epifluorescencyjny</td><td>63X Leica microsystems</td><td></td><td>model DM5500B, wyposażony w kąt 28 stopni; Skrzynka temperaturowa C i obiektyw 40X</td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell z przedłużaczem pojemności</td><td>Urządzenie do elektroporacji</td><td>BioRad</td><td>1652661</td></tr><tr><td>Wytrząsarka pozioma</td><td>Inkubator GFL</td><td></td><td>model 3011</td></tr><tr><td>do hodowli komórkowych (28 &deg; C)</td> <td>Inkubator modelowy</td> <td>Memmerta</td><td></td> I</tr><tr><td>inkubator dla zarodków (28 &deg; C)</td> <td>Mikroskop świetlny Heraeus</td><td></td><td>typ B6120</td></tr><tr><td></td><td>Mikropipety Zeiss</td><td></td><td>model TELAVAL 31</td></tr><tr><td>Sterylny stół roboczy</td><td></td> Gilson <td></td>Bio Base <td></td> z pęsetą z przepływem laminarnym i światłem UV</tr><tr><td></td><td>Dumont</td><td></td><td>Style 5,</td></tr><tr><td></td><td></td> pionowy rotator rurkowy Inox Labinco BV <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>model LD-79</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image Lab Oprogramowanie</td><td>BioRad</td><td></td><td>do systemu obrazowania ChemiDoc MP od BioRad</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Zdrowie</td><td></td><td>używane do liczenia zarodków o wartości 1 dpf poprzez zastosowanie narzędzia do liczenia cząstek do odpowiednich obrazów czarno-białych; Rasband, W.S., ImageJ, U.S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/. (1997-2016).</td></tr><tr><td>LAS X</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>do mikroskopów konfokalnych i epifluorescencyjnych firmy Leica Microsystems</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Company</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</strong</td></tr><tr><td>>Plasmids</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCS-DCX-tdTomato</td><td>K&ouml; ster Lab</td><td># 1599</td><td>oparty na szkielecie pCS2+ (Rupp et al., 1994)</td></tr><tr><td>pCS-eGFP</td><td>K&ouml; ster Lab</td><td># 7</td><td>oparty na szkielecie pCS2+ (Rupp et al., 1994)</td></tr><tr><td>pCS-H2B-mseCFP</td><td>K&ouml; ster Lab</td><td># 2379</td><td>oparty na szkielecie pCS2+ (Rupp et al., 1994)</td></tr><tr><td>pCS-mClover</td><td>K&ouml; ster Lab</td><td># 3865</td><td>oparty na szkielecie pCS2+ (Rupp et al., 1994)</td></tr><tr><td>pCS-MitoTag-YFP</td><td>K&ouml; ster Lab</td><td># 2199</td><td>oparty na szkielecie pCS2+ (Rupp et al., 1994)</td></tr><tr><td>pCS-ss-RFP-KDEL</td><td>K&ouml; ster Lab</td><td># 4330</td><td>oparty na szkielecie pCS2+ (Rupp et al., 1994)</td></tr><tr><td>pCS-VAMP1-mCitrine</td><td>K&ouml; ster Lab</td><td># 2291</td><td>oparty na szkielecie pCS2+ (Rupp et al., 1994)</td></tr><tr><td>pSK-UAS:mCherry</td><td>K&ouml; ster Lab</td><td># 1062</td><td>oparty na pBluescript-szkielet plazmidów Stratagene</td></tr><tr><td>numery odnoszą się do wpisów w bazie danych K&ouml; laboratorium ster. Plazmidy są dostępne na życzenie.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Wyroby z tworzyw sztucznych i szkła</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Sitko do komórek Falcon (40 &micro; m)</td><td>FALCON</td><td>REF 352340</td><td>dystrybuowany przez BD Bioscience, używany jako " Podbierak" zanurzać zarodki z żółtkiem w etanolu i szybko przenosić je na pożywkę do hodowli świeżych komórek</td></tr><tr><td>1,5 ml probówki reakcyjne</td><td>Sarstedt</td><td>72690550</td><td></td></tr><tr><td>płytka 24-dołkowa</td><td>Sarstedt</td><td>83.3922</td><td></td></tr><tr><td>50 ml probówka sokołowa</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.004</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 96-dołkowa</td><td>Sarstedt</td><td>83.3924.005</td><td></td></tr><tr><td>EasyStrainer (40 &mikro; m)</td> <td>Greiner Bio-One</td><td>542 040</td><td>ze szczelinami wentylacyjnymi; służy do filtrowania komórek po kuwecie elektroporacyjnej dysocjacji za pośrednictwem kolagenazy</td></tr><tr><td>(0,4 cm)</td><td>Kisker</td><td>4905022</td><td></td></tr><tr><td>szklane szkiełka nakrywkowe</td><td>Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH</td><td>1051201</td><td></td></tr><tr><td>Preparaty mikroskopowe</td><td>Thermo Fisher Scientific (Menzel Gl&auml; ser)</td><td>631-0845</td><td></td></tr><tr><td>Komora Neubauera</td><td>Henneberg-Sander GmbH</td><td>9020-01</td><td></td></tr><tr><td>Pipety Pasteura (plastik; 3 mL)</td><td>A. Hartenstein</td><td>PP05</td><td></td></tr><tr><td>Szalki Petriego (plastik; średnica 10 cm)</td><td>Sarstedt</td><td>821473</td><td>do zarodków danio pręgowanego</td></tr><tr>końcówki<td>do pipet</td><td>Sarstedt</td><td>Blue (1000 &micro; l): 70762; Żółty (200 &mikro; l): 70760002; Biały (10 &mikro; L): 701116</td><td></td></tr><tr><td>sterylne szalki do hodowli komórkowych (tworzywo sztuczne; średnica 3 cm)</td><td>TPP Techno Plastic Products AG</td><td>93040</td><td></td></tr><tr><td>sterylne szalki do hodowli komórkowych (tworzywo sztuczne; średnica 6 cm)</td><td>Sterylne szalki Petriego 72690550</td><td></td><td></td>Sarstedt</tr><tr><td>(plastik; średnica 10 cm)</td><td>Sarstedt</td><td>83.3902</td><td>do sekcji mózgu</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Chemikalia i odczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>chlorek sodu</td><td>Roth</td><td>0601.1</td><td></td></tr><tr><td>4 % paraformaldehyd w 1x PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16005</td><td></td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>tetrahydrat azotanu wapnia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1396</td><td></td></tr><tr><td>etanol p.a. 100%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46139</td><td></td></tr><tr><td>kozioł i alfa-mysz IgG (specyficzny dla Fc) Sprzężony z FITC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31547</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Roth</td><td>9105.4</td><td></td></tr> smar <tr><td>wysokopróżniowy</td><td>DOW CORNING</td><td>3826-50</td><td>smar silikonowy stosowany do samodzielnie wykonanych naczyń ze szklanym dnem</td></tr><tr><td>siarczan magnezu siedmiowodny</td><td>Merck</td><td>105886</td><td></td></tr><tr><td>błękit metylenowy</td><td>Serva</td><td>29198.01</td><td></td></tr><tr><td>Monoklonalna antytubulina, przeciwciało acetylowane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6793</td><td></td></tr><tr><td>Aqua-Poly/Mount (podłoże montażowe)</td><td>Polyscience</td><td>18606</td><td></td></tr><tr><td>poli-L-lizyna</td><td>Biochrom</td><td>L 7240</td><td></td></tr><tr><td>chlorek potasu</td><td>Merck</td><td>104938</td><td></td></tr><tr><td>Mleko odtłuszczone</td><td>Roth</td><td>68514-61-4</td><td></td></tr><tr><td>Texas Red-X Phalloidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T7471</td><td></td></tr><tr><td>Trikaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>Synonim: 3-aminobenzoesan etylu metanosulfonian</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>BioRad</td><td>1610407</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Gibco firmy Life Technologies</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Enzymes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>kolagenaza (Typ 2)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17101015</td><td>rozpuścić proszek w pożywce do hodowli komórkowej (8 mg/ml) i sterylnie przefiltrować roztwór, przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 °; C</td></tr><tr><td>pronaza (ze Streptomyces griseus)</td> <td>Roche</td><td>11459643001</td><td>dystrybuowana przez Sigma-Aldrich, rozpuszczać w 30% Danieau (10 mg/ml) i przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Pożywka i roztwory do hodowli komórkowych</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x PBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)</td><td>Gibco firmy Life Technologies</td><td>14190-169</td><td>dystrybuowany przez Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Pożywka niezależna od CO2</td><td>Gibco firmy Life Technologies</td><td></td><td>18045054 dystrybuowana przez Thermo Fisher Naukowa</td></tr><tr><td>filtrowana surowica bydlęca (FBS)</td><td>PAN-Biotech</td><td></td><td>indywidualna partia</td></tr><tr><td>glutaminy 100x</td><td>Gibco firmy Life Technologies</td><td></td><td>25030081 dystrybuowana przez Thermo Fisher</td></tr><tr><td>Scientific Leibovitz's L-15 medium</td><td>Gibco by Life Technologie</td><td>11415049</td><td>dystrybuowane przez Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>PenStrep (10 000 U/mL)</td><td>Gibco przez Life Technologies</td><td>15140148</td><td>dystrybuowane przez Thermo Fisher Scientific</td></tr></tbody></table>

hodowla i transfekcja komórek pierwotnych danio pręgowanego

Culture and Transfection of Zebrafish Primary Cells

Zarodki ryb danio pręgowanych są przezroczyste i szybko rozwijają się poza matką, co pozwala na doskonałe obrazowanie in vivo dynamicznych procesów biologicznych u nienaruszonych i rozwijających się kręgowców. Jednak szczegółowe obrazowanie morfologii różnych typów komórek i struktur subkomórkowych jest ograniczone w całych wierzchowcach. W związku z tym opracowaliśmy skuteczny i łatwy w użyciu protokół hodowli żywych komórek pierwotnych z zarodków danio pręgowanego i tkanek dorosłych.
W skrócie, 2 zarodki danio pręgowanego dpf są dechorionowane, deyolkowane, sterylizowane i dysocjowane na pojedyncze komórki za pomocą kolagenazy. Po etapie filtracji komórki pierwotne są umieszczane na naczyniach ze szklanym dnem i hodowane przez kilka dni. Świeże posiewy, podobnie jak te długotrwale zróżnicowane, mogą być wykorzystywane do badań obrazowania konfokalnego o wysokiej rozdzielczości. Hodowla zawiera różne typy komórek, z prążkowanymi miocytami i neuronami widocznymi na powłoce poli-L-lizyny. Aby specyficznie oznaczyć struktury subkomórkowe za pomocą fluorescencyjnych białek markerowych, opracowaliśmy również protokół elektroporacji, który umożliwia transfekcję plazmidowego DNA do różnych typów komórek, w tym neuronów. W ten sposób, w obecności bodźców zdefiniowanych przez operatora, złożone zachowanie komórek i dynamika wewnątrzkomórkowa pierwotnych komórek danio pręgowanego mogą być oceniane z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową. Ponadto, wykorzystując mózg dorosłego danio pręgowanego, wykazujemy, że opisana technika dysocjacji, a także podstawowe warunki hodowli, działają również w przypadku tkanki dorosłego danio pręgowanego.

Rycina 1G przedstawia obraz w świetle przechodzącym typowej hodowli pochodzącej z embrionów typu dzikiego, w której najliczniej występują prążkowane miocyty oraz skupiska komórek neuronopodobnych. W celu łatwiejszej identyfikacji określonych typów komórek można zastosować linię transgeniczną z ekspresją białka fluorescencyjnego specyficzną dla danego typu komórek (Rycina 1H).
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-pa...

Przedstawiamy skuteczny i łatwy w użyciu protokół do przygotowania pierwotnych hodowli komórkowych zarodków danio pręgowanego do transfekcji i obrazowania żywych komórek, a także protokół do przygotowania pierwotnych komórek z mózgu dorosłego danio pręgowanego.

Hodowla i transfekcja komórek pierwotnych danio pręgowanego

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in ...

Metoda ta dostarcza zbiorowisku danio pręgowanego narzędzia do analizy dynamiki międzykomórkowej z rozdzielczością nieosiągalną in vivo. A także pozwala zrekompensować brak linii komórkowych danio pręgowanego. Główną zaletą tej techniki jest to, że wyizolowałeś i przetransfekowałeś te pierwotne komórki bezpośrednio z oryginalnej tkanki, więc nie musisz utrzymywać linii komórkowych.Aby rozpocząć protokół, przygotuj zarodki danio pręgowanego dwa dni po zapłodnieniu, czyli dpf. Pierwszego dnia zorganizowano kilka krzyżówek wybranego szczepu danio pręgowanego. Drugiego dnia łączą się w pary z rybami i zbierają jaja bezpośrednio po tarle na plastikowej 10-centymetrowej szalce Petriego.Usuń martwe i zanieczyszczone jaja za pomocą plastikowej pipety Pasteura. Umyj jajka raz za pomocą błękitu metylenowego Danieau 30% o masie 0,0001%. Następnie zastąp pożywkę świeżym Danieau 30% bez błękitu metylenowego i wysiaduj jaja przez noc w temperaturze 28 stopni Celsjusza.Trzeciego dnia usuń martwe i zanieczyszczone zarodki i zamień pożywkę na Danieau 30%Następnie inkubuj zarodki przez noc w temperaturze 28 stopni Celsjusza. Czwartego dnia usuń kosmówkę, usuwając pożywkę, aż w naczyniu pozostanie ok

culture-and-transfection-of-zebrafish-primary-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Film demonstruje metodę hodowli pierwotnych komórek zwojowych siatkówki z zarodków danio pręgowanego. Zarodki we wczesnym stadium są poddawane sekcji w celu wyizolowania oczu, które są następnie mechanicznie dysocjowane w zawiesinę komórek zwojowych siatkówki. Ta zawiesina komórkowa jest hodowana na szkiełkach nakrywkowych pokrytych białkami adhezyjnymi, aby ułatwić rozwój aksonów.

Wytwarzanie pierwotnych kultur komórek zwojowych siatkówki z zarodków danio pręgowanego

Tutaj oferujemy powtarzalną metodę badania neurogenezy u dorosłych za pomocą testu neurosfery pochodzącego z całego mózgu lub z obszaru kresomózgowia, tektalu lub móżdżku mózgu dorosłego danio pręgowanego. Dodatkowo opisujemy procedurę manipulowania ekspresją genów w neurosferach danio pręgowanego.

Izolacja i hodowla neurosfer mózgowych dorosłych danio pręgowanego

Ten protokół opisuje metodę izolowania pojedynczych komórek z zarodków danio pręgowanego, wzbogacania o interesujące komórki, przechwytywania komórek danio pręgowanego w mikroprzepływowych systemach multipleksów jednokomórkowych i oceny ekspresji genów z pojedynczych komórek.

Izolacja i charakterystyka pojedynczych komórek z zarodków danio pręgowanego

Regeneracja siatkówki danio pręgowanego była głównie badana przy użyciu stałych siatek oka. Jednak dynamiczne procesy, takie jak interkinetyczna migracja jądrowa, zachodzą podczas odpowiedzi regeneracyjnej i wymagają obrazowania żywych komórek w celu zbadania mechanizmów leżących u ich podstaw. W tym miejscu opisujemy warunki hodowli i obrazowania w celu monitorowania międzykinetycznej migracji jądrowej (INM) w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopii wielofotonowej.

Hodowla dorosłych transgenicznych eksplantatów siatkówki danio pręgowanego do obrazowania żywych komórek za pomocą mikroskopii wielofotonowej

Tutaj opisujemy modele ksenoprzeszczepu danio pręgowanego za pomocą dwóch różnych miejsc iniekcji, tj. przestrzeni perivitelinowej i kanału Cuviera, aby zbadać inwazyjne zachowanie i ocenić potencjał wewnątrznaczyniowy i wynaczynieniowy ludzkich komórek raka piersi, odpowiednio.

Inwazyjne zachowanie ludzkich komórek raka piersi u embrionalnego danio pręgowanego

Tutaj pokazujemy proces tworzenia linii reportera napięcia elektrycznego komórkowego do wizualizacji rozwoju embrionalnego, ruchu i komórek nowotworowych ryb in vivo.

Wizualizacja komórkowej aktywności elektrycznej we wczesnych zarodkach i nowotworach danio pręgowanego

Manipulacje embriologiczne, takie jak eksterminacja i przeszczepianie komórek, są ważnymi narzędziami do badania wczesnego rozwoju. Protokół ten opisuje proste i skuteczne urządzenie do przeszczepiania do wykonywania tych manipulacji w zarodkach danio pręgowanego.

Proste i skuteczne urządzenie do przeszczepiania zarodków danio pręgowanego

Ta praca opisuje protokół dla modułowego systemu transgenezy Tol2, metody klonowania opartej na bramie, służącej do tworzenia i wstrzykiwania transgenicznych konstruktów do embrionów zebranego.

System Danio pręgowanego Tol2: modułowe i elastyczne podejście do transgenezy oparte na bramce

Tutaj prezentujemy skuteczny, łatwy i szybki protokół hodowli 3D do tworzenia sferoid dwóch linii komórkowych danio pręgowanego (Danio rerio): ZEM2S (zarodek) i ZFL (normalny hepatocyt).

Metoda hodowli 3D sferoid embrionalnych i wątrobowych linii komórkowych danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy protokół przeszczepiania komórek o wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej w zarodkach i larwach danio pręgowanego na każdym etapie, między co najmniej 1 a 7 dniem po zapłodnieniu.

Przeszczep komórek w wysokiej rozdzielczości u embrionów i larw danio pręgowanego

Naucz się hodowli i transfekcji komórek pierwotnych danio pręgowanego z zarodków i mózgu dorosłych osobników. Ta metoda umożliwia obrazowanie żywych komórek z wysoką rozdzielczością.

Hodowla i transfekcja komórek pierwotnych danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów