Name: In vitro Hodowla pszczół samotnic: narzędzie do oceny czynników ryzyka larw (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Poznaj metodę in vitro hodowli larw pszczół samotnic w celu oceny wpływu fungicydów na ich rozwój i mikrobiom. Technika ta umożliwia badanie czynników ryzyka dla zdrowia zapylaczy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Kimballowi Clarkowi i Timowi Kroghowi za dostarczenie trzciny gniazdującej Osmii, Meredith Nesbitt i Molly Bidwell za pomoc w laboratorium, doktorom Cameronowi Currie, Christelle Guédot, Terry'emu Griswoldowi, Michaelowi Branstetterowi i trzem anonimowym recenzentom za ich użyteczne komentarze, które poprawiły rękopis. Praca ta była wspierana przez fundusze przyznane przez USDA-Agricultural Research Service (Current Research Information System #3655-21220-001), Wisconsin Department of Agriculture, Trade, and Consumer Protection (#197199), National Science Foundation (w ramach grantu nr. DEB-1442148), Centrum Badań Bioenergetycznych Wielkich Jezior Departamentu Energii (DOE Biuro Nauki BER DE-FC02-07ER64494).

1. Przygotowanie roztworów propikonazolu do eksperymentów z ekspozycją na fungicyd
<ol>
	<li>Przygotuj 0,1x roztwór fungicydu, rozpuszczając odpowiednie objętości zakupionego komercyjnie propikonazolu 14,3% w sterylnej wodzie w dniu przeprowadzenia eksperymentu. Upewnij się, że do wszystkich zabiegów używany jest wyłącznie świeżo przygotowany roztwór fungicydu.</li>
	<li>Dodaj 23 µL 0,1x roztworu fungicydu na gram dostarczonego pyłku, aby uzyskać maksymalne stężenie propikonazolu wcześniej raportowane dla pyłku zbieranego przez pszczoły24 (0,361 PPM lub µg substancji czynnej g-1 pyłku).</li>
</ol>
2. Pobieranie jaj i zapasów pyłku gospodarza z trzcin Osmia
<ol>
	<li>Za pomocą wysterylizowanego skalpela przeprowadzić sekcję świeżo zamkniętych trzcin gniazdowych Osmia, rozdzielając trzcinę wzdłuż na dwie części w celu odsłonięcia poszczególnych komór. 
	UWAGA: Każde gniazdo może zawierać od 8 do 14 komór, a w każdej komorze znajduje się jedno jajo.</li>
	<li>Dokonać wizualnej inspekcji trzcin w celu zidentyfikowania komór zawierających jaja samców, opierając się na wcześniej opublikowanych wytycznych77. Za pomocą wysterylizowanej zakrzywionej igły usunąć z trzciny gniazdowej każdą porcję zapasu pyłku wraz z przypisanym do niej jajem i umieścić je w czystej łódce wagowej.</li>
	<li>Delikatnie oddzielić jajo od zapasu za pomocą czystego, cienkiego pędzla malarskiego i zmierzyć masę świeżą zapasu pyłku oraz jaja przy użyciu standardowej wagi laboratoryjnej. Obliczyć średnią masę zapasów pyłku dla samców.</li>
	<li>Kolejne kroki należy wykonać z minimalną zwłoką, aby zmniejszyć ryzyko uszkodzenia jaja wskutek ekspozycji na nadmierną temperaturę i odwodnienia.</li>
</ol>
3. Przygotowanie zapasów pyłku rośliny żywicielskiej
<ol>
	<li>Wizualnie sprawdź zebrany przez matkę pyłek rośliny żywicielskiej wydobyty z komór lęgowych, aby upewnić się, że nie ma w nim pasożytów78. Aby zminimalizować ewentualne różnice wynikające z indywidualnego doboru matki, połącz zapasy pyłku w jedną masę w sterylnym szalce Petriego i dokładnie wymieszaj za pomocą wysterylizowanej igły.</li>
	<li>Podziel połączoną masę na nowe porcje zapasów pyłku, dbając o to, aby waga każdej zrekonstytuowanej porcji była w przybliżeniu równa średniej wadze naturalnie przydzielonego zapasu dla samca (Średnia ± SE, 0.35 ± 0.01 g, N = 42). 
	UWAGA: Ponieważ Osmia sp. przydziela mniejsze zapasy pyłku potomstwu męskiemu, skutkuje to niższą masą ciała larw samców w porównaniu do samic77. Aby uniknąć takich różnic wynikających z dymorfizmu płciowego, w eksperymentach należy wykorzystywać wyłącznie jaja samców.</li>
</ol>
4. Przygotowanie zapasu pyłku rośliny niebędącej żywicielem
<ol>
	<li>Zmiel komercyjnie zakupiony pyłek zebrany przez pszczoły miodowe na drobny proszek, używając standardowej laboratoryjnej młynarki kulowej.</li>
	<li>Biorąc pod uwagę zawartość wilgoci w zapasach pyłku gospodarza zbieranych przez matki (~20%), nawodnij proszek pyłkowy odpowiednią ilością 40% wysterylizowanego roztworu cukru79 i wymieszaj dokładnie, aby uzyskać konsystencję ciasta.</li>
	<li>Podziel masę na poszczególne porcje pyłku, z których każda powinna ważyć mniej więcej tyle, co średnia waga naturalnie przydzielonych zapasów dla samca. 
	UWAGA: Zawartość wilgoci w zapasach pyłku gospodarza zbieranych przez matki można wcześniej ustandaryzować, porównując masę świeżą i suchą zapasów pyłku z 30 losowo wybranych komór samców80. W celu uzyskania masy suchej zapasy pyłku należy poddać liofilizacji w liofilizatorze (1,5 Pa przez 72 h).</li>
</ol>
5. Przygotowanie wielodołkowych płytek do hodowli komórek
<ol>
	<li>Wyłożyć poszczególne dołki sterylnej 48-dołkowej płytki hodowlanej autoklawowanymi cynowymi kubeczkami (5 × 9 cm). Za pomocą sterylnej pęsety delikatnie rozszerzyć górną krawędź kapsułki, aby pomieściła ona porcję pyłku.</li>
	<li>Umieścić pojedynczą masę porcji pyłku gospodarza lub nie-gospodarza wewnątrz cynowego kubeczka, używając sterylnych narzędzi zgodnie z grupą badawczą. 
	UWAGA: Aby uniknąć kontaminacji krzyżowej, należy używać oddzielnych płytek dla grup badawczej i kontrolnej.</li>
</ol>
6. Dodawanie fungicydów
<ol>
	<li>Za pomocą sterylnego drewnianego patyczka wykonaj w centralnej części masy pyłkowej wgłębienie. Do każdej porcji pyłku używaj nowego patyczka.</li>
	<li>Do wgłębienia dodaj odpowiednią objętość roztworu fungicydu (dla grupy badawczej) lub sterylnej wody (dla grupy kontrolnej). Używając sterylnej pęsety, zaciśnij otwór wgłębienia, aby zminimalizować kontakt powierzchniowy fungicydu lub sterylnej wody z jajem.</li>
	<li>Upewnij się, że factorialny układ projektu eksperymentalnego jest zgodny z tym przedstawionym na schemacie (Rysunek 4).</li>
</ol>
<img alt="Schemat eksperymentu z pyłkiem porównującego pszczoły z rodzaju Osmia oraz pszczoły miodne pod kątem wpływu fungicydu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57876/57876fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Schematyczna reprezentacja układu eksperymentalnego. Eksperyment opiera się na pełnym przekrojowym układzie factorialnym 2 × 2. Czynnik 1 reprezentuje ekspozycję na fungicyd i składa się z 2 poziomów: (i) brak fungicydu (N = 10) oraz (ii) fungicyd (N = 10). Czynnik 2 reprezentuje źródło pyłku i składa się z 2 poziomów: (i) pyłek rośliny żywicielskiej (N = 8) oraz (ii) pyłek rośliny niebędącej żywicielem (N = 8). <a href="/files/ftp_upload/57876/57876fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
7. Hodowla i obserwacja larw
<ol>
	<li>Za pomocą czystego, cienkiego pędzla umieść losowo wybrane jajo samca na górnej powierzchni zapasu pyłku. Po rozmieszczeniu jaj we wszystkich zapasach zamknij pokrywę płytki hodowlanej, zabezpieczając jej rogi taśmą etykietującą.</li>
	<li>Umieść płytki wielodołkowe na czystej tacy i przykryj je ciemnym materiałem, aby zablokować dostęp bezpośredniego światła. Do tacy włóż płytkę 6-dołkową zawierającą 30 mL sterylnej wody, aby zapobiec wysychaniu. Pozostaw tace inkubacyjne w inkubatorze w temperaturze pokojowej, nie zakłócając procesu.</li>
	<li>Codziennie obserwuj płytki wielodołkowe pod mikroskopem stereotypowym, nie zdejmując pokryw. Sprawdź, czy larwy żyją, obserwując ich ruchy. Jeśli nie stwierdzono ruchu, usuń kubeczek z martwymi larwami i pozostałym zapasem pyłku. Pozwól wszystkim przeżyjącym larwom rozwijać się niezakłóconym w płytkach aż do osiągnięcia stadium przepoczwarnego.</li>
	<li>Wyjmij larwę z kubeczka, gdy osiągnie stadium przepoczwarcze41. Użyj pędzla, aby oczyścić kokon jedwabny z odchodów. Ostrożnie przetnij kokon jedwabny pod mikroskopem stereotypowym i wyjmij przepoczwarkę za pomocą pęsety gumowej.</li>
	<li>Postępuj z przepoczwarką delikatnie, aby narzędzia nie przebiły jej miękkiego ciała. Zapisz masę świeżą przepoczwarki (biomasa przepoczwarkowa) oraz czas rozwoju od jaja do stadium przepoczwarczego (czas rozwoju larwy). 
	UWAGA: Każda martwa larwa powinna zostać natychmiast usunięta, aby zapobiec niepożądanemu wzrostowi drobnoustrojów na zwłokach i pozostałym zapasach pyłku. Zmniejsza to ryzyko infekcji pozostałych zdrowych larw.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Hodowla pszczół poza ich naturalnymi trzcinami lęgowymi, w warunkach laboratoryjnych, pozwala na przetestowanie wielu hipotez dotyczących przydatności larwalnej. W zakresie, w jakim niezidentyfikowane czynniki nadal powodują śmiertelność pszczół, badania oceny ryzyka z wykorzystaniem doświadczeń in vitro mogą pomóc w identyfikacji potencjalnych zagrożeń i informowaniu o praktykach zarządzania dla tej bogatej gatunkowo grupy dzikich zapylaczy 12,38,49,76,81,82....

Biorąc pod uwagę ich rolę jako dominującej grupy owadów zapylających1, globalny spadek populacji pszczół stanowi zagrożenie dla bezpieczeństwa żywnościowego i stabilności ekosystemów2,3,4,5,6,7. Tendencje spadkowe w populacjach pszczół hodowlanych i dzikich przypisuje się kilku wspólnym czynnikom ryzyka, w tym fragmentacji siedlisk, pojawianiu się nowych pasożytów i patogenów, utracie różnorodności genetycznej oraz wprowadzeniu gatunków inwazyjnych3,4,7,8,9,10,11,12. W szczególności gwałtowny wzrost stosowania pestycydów (np. neonikotynoidów) został bezpośrednio powiązany ze szkodliwymi skutkami dla pszczół13,14,15. Liczne badania wykazały, że synergizm między neonikotynoidami a fungicydami hamującymi biosyntezę ergosterolu (EBI) może prowadzić do wysokiej śmiertelności wielu gatunków pszczół16,17,18,19,20,21,22. Niemniej jednak fungicydy, długo uznawane za „bezpieczne dla pszczół”, są nadal opryskiwane na kwitnące uprawy bez większej kontroli23. Udokumentowano, że pszczoły zbieraczki rutynowo przynoszą ładunki pyłku zanieczyszczone pozostałościami fungicydów24,25,26. Spożycie takiego pyłku obciążonego fungicydami może powodować wysoką śmiertelność larw pszczół27,28,29,30 oraz szereg efektów subletalnych u dorosłych osobników16,31,32,33,34. Niedawne badanie sugeruje, że fungicydy mogą powodować straty w populacjach pszczół poprzez zmianę składu społeczności drobnoustrojów w pyłku przechowywanym w ulu, zakłócając tym samym krytyczne symbiozy między pszczołami a mikrobami przenoszonymi przez pyłek35.
Choć pszczoły samotnice są kluczowe dla zapylania wielu roślin dziko rosnących i uprawnych36,37,38, ta zróżnicowana grupa zapylaczy otrzymywała znacznie mniejszą uwagę w badaniach dotyczących monitorowania pestycydów. Gniazdo dorosłej samotnej samicy zawiera od 5 do 10 zamkniętych komórek lęgowych, z których każda jest wyposażona w określoną masę zebranego przez matkę pyłku i nektaru oraz jedno jajo39. Po wykluciu się larwy polegają na przydzielonych zapasach pyłku oraz towarzyszącej im mikrobiocie przenoszonej przez pyłek, aby uzyskać odpowiednie odżywienie40,41. Ze względu na brak korzyści wynikających z trybu życia społecznego, pszczoły samotnice mogą być bardziej podatne na ekspozycję na pestycydy42. Na przykład, podczas gdy straty w pszczołach społecznych po oprysku mogą być w pewnym stopniu zrekompensowane przez robotnice i nowo wykluwający się lęg, śmierć pojedynczej dorosłej samotnej samicy kończy całą aktywność rozrodczą43. Takie różnice w podatności podkreślają potrzebę włączenia zróżnicowanych taksonów pszczół do badań ekotoksykologicznych, aby zapewnić odpowiednią ochronę zarówno pszczołom hodowlanym, jak i dzikim. Jednakże, poza nielicznymi badaniami, analizy wpływu ekspozycji na fungicydy koncentrowały się głównie na pszczołach społecznych18,23,32,44,45,46,47,48,49.
Pszczoły samotnice z rodzaju Osmia (Rysunek 1) są wykorzystywane na całym świecie jako wydajne zapylacze wielu ważnych upraw owoców i orzechów39,50,51,53,53. Podobnie jak inne zarządzane grupy zapylaczy24,54,55,56,57,58, dorosłe pszczoły z rodzaju Osmia są rutynowo narażone na fungicydy rozpylane na kwitnących uprawach44. Dorosłe samice żerujące na niedawno opryskanych uprawach mogą zbierać i gromadzić w komórkach lęgowych pyłek zanieczyszczony fungicydami, który później stanowi jedyny pokarm dla rozwijających się larw. Spożywanie skażonych zapasów pyłku może w konsekwencji narazić larwy na działanie pozostałości fungicydów42. Ryzyko ekspozycji może być wyższe u gatunków oligolektycznych, które żerują tylko na kilku blisko spokrewnionych roślinach żywicielskich59,60,61. Niektóre pszczoły z rodziny Megachilidae zdają się na przykład preferencyjnie żerować na niskiej jakości pyłku roślin z rodziny Asteraceae, aby ograniczyć pasożytnictwo62. Jednak stopień, w jakim fungicydy wpływają na kondycję larw u oligolektycznych pszczół samotnic, nie został empirycznie określony. Celem niniejszego badania jest opracowanie protokołu do testowania głównych i interakcyjnych efektów ekspozycji na fungicydy oraz źródła pyłku na kondycję pszczół samotnic hodowanych in vitro. W celu przeprowadzenia badań można komercyjnie pozyskać jaja O. ribifloris sensu lato (s.l.) (Tabela materiałów). Populacja ta jest idealna ze względu na jej znaczenie jako rodzimego zapylacza oraz silną predylekcję do bogatej w nektar rośliny Mahonia aquifolium (mahonia liściasta) występującej w regionie53,63,64 (Rysunek 2).
<img alt="Pszczoła zapylająca gałązkę, badanie interakcji ekologicznych, badania nad relacjami owad-roślina." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57876/57876fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Zdjęcie o wysokiej rozdzielczości dorosłego osobnika Osmia ribifloris. Kredyt fotograficzny: Dr Jim Cane, entomolog badawczy, USDA-ARS <a href="/files/ftp_upload/57876/Figure_1.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rurki gniazdowe pszczół z obecnym metalicznie zielonym chrząszczem, podkreślające siedlisko pszczół w badaniach przyrodniczych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57876/57876fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Trzciny gniazdowe Osmia ribifloris (s.l.) z gniazdującą samicą na pierwszym planie. Przegrody komór i korki końcowe trzcin są zbudowane z przeżutych liści. Zdjęcie: Mr. Kimball Clark, NativeBees.com <a href="/files/ftp_upload/57876/57876fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Pierwszym celem niniejszego badania jest ocena wpływu spożywania pyłku traktowanego fungicydem na kondycję larw (mierzoną czasem rozwoju i biomasą przepoczwarki). Choć ekspozycja na powszechnie stosowany fungicyd propikonazol została powiązana ze zwiększoną śmiertelnością dorosłych pszczół u kilku gatunków 23,24,32,44,45,54,55,56,57,58,65,66,67, jego wpływ na larwy pszczół jest słabiej poznany. Drugim celem badania jest ocena skutków spożywania pyłku roślin niebędących żywicielami na kondycję larw. Poprzednie badania wskazują, że larwy pszczół oligoletycznych nie rozwijają się, gdy są zmuszone do spożywania pyłku roślin niebędących ich żywicielami68. Takie wyniki można przypisać różnicom w fizjologii pszczół69, biochemii pyłku70 oraz korzystnemu mikrobiomowi związanemu z naturalnymi zapasami pyłku71. Trzecim celem niniejszego badania jest ocena interakcyjnych efektów traktowania fungicydem i składu pyłku w diecie na kondycję larw.
Znane jest, że liczne cechy biologiczne, w tym wielkość ciała matki, tempo zaopatrywania, strategia żerowania oraz ilość pyłku72,73,74,75, wpływają na kondycję larw u pszczół samotnic. Czynniki te mogą wprowadzać znaczną zmienność między trzcinami, co stanowi wyzwanie przy opracowywaniu rzetelnych planów doświadczalnych podczas oceny stanu zdrowia larw. Ponadto, ze względu na to, że rozwój larwalny zachodzi wewnątrz zamkniętych trzcin gniazdowych, efekty takiej zmienności u potomstwa są trudne do wizualizacji i ilościowego określenia bez zastosowania technik nieletalnych (Rysunek 3). Aby przezwyciężyć to wyzwanie, wszystkie hipotezy w niniejszym badaniu są testowane przy użyciu larw hodowanych poza trzcinami gniazdowymi. Plan doświadczalny stanowi w pełni skrzyżowany układ factorialny 2 × 2, w którym każdy czynnik składa się z 2 poziomów; Czynnik 1: ekspozycja na fungicyd (Fungicyd; Brak fungicydu); Czynnik 2: źródło pyłku (Pyłek rośliny żywicielskiej, Pyłek rośliny nieżywicielskiej). Pszczoły są hodowane od stadium jaja do stadium przedpoczwalkowego w sterylnych wielodołkowych płytkach do hodowli komórkowych w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych. Każdy dołek jest indywidualnie zaopatrzony w zestandaryzowaną ilość zapasu pyłku oraz jedno jajo. Po wykluciu larwa żywi się przydzielonym pyłkiem w dołku, kończy rozwój larwalny i rozpoczyna przepoczwalkowanie. Dotychczasowe badania wykazały, że niewyjaśniona śmiertelność jest niższa u pszczół hodowanych w tym sztucznym środowisku niż u osobników występujących w naturze49,76. Wykorzystanie pszczół hodowanych in vitro ma kilka zalet w porównaniu z badaniami terenowymi: 1) minimalizuje ono zakłócający wpływ naturalnej zmienności i niekontrolowanych czynników typowych dla badań terenowych; 2) pozwala na jednoczesne testowanie wielu poziomów manipulacji dla każdego z interesujących czynników w grupach traktowanych; 3) liczba powtórzeń może być określona z góry, a czynniki doświadczalne dla każdego powtórzenia mogą być manipulowane indywidualnie; 4) zmienne odpowiedzi larwalnych można łatwo wizualizować i rejestrować niezależnie, nie niepokojąc sąsiednich larw; 5) protokół może zostać zmodyfikowany w celu dostosowania do bardziej złożonych planów doświadczalnych obejmujących wiele czynników i zmiennych odpowiedzi.
<img alt="Układ do ekstrakcji larw na potrzeby badania rozwoju owadów; jaja w wyżłobieniu w drewnie i larwy na kawałkach pianki." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57876/57876fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Zawartość naturalnej trzciny gniazdowej Osmia ribifloris (s.l.). Zbliżenie na (A) rozciętą trzcinę ukazującą poszczególne komory, zapasy pyłku i przegrody oraz (B) świeżo zebrane zapasy pyłku i powiązane z nimi jaja (zaznaczone czarnym okręgiem). <a href="/files/ftp_upload/57876/57876fig3large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>

<table><tbody><tr><td>jaja O. ribifloris sensu lato (s.l.)</td><td></td><td></td><td>Kaysville, Hrabstwo Davis, Utah, USA</td></tr><tr><td>Trzcina osmia</td><td>Nativebees.com</td><td>NA</td><td>Świeżo zatkane trzciny</td></tr><tr><td>Zestaw preparacyjny</td><td>VWR</td><td>89259-964</td><td>Sterylizuj przed użyciem</td></tr><tr><td>Szczypce długie</td><td>Husky</td><td>1006</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowe płytki hodowlane</td><td>VWR</td><td>10062-892</td><td>Sterylnie zamknięte</td></tr><tr><td>48-dołkowe płytki hodowlane</td><td>VWR</td><td>10062-898</td><td>Sterylnie uszczelnione</td></tr><tr><td>szalki Petriego</td><td>VWR</td><td>25373100</td><td>Sterylnie uszczelnione</td></tr><tr><td>kwadratowe łodzie wagowe</td><td>VWR</td><td>10770-448</td><td></td></tr><tr><td>Szczotka do włosów wielbłąda</td><td>Bioquip</td><td>1153A Kapsułki</td><td></td></tr><tr><td>cynowe</td><td>EA</td><td>D1021</td><td>Sterylizuj przed użyciem</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>VWR</td><td>470302-808</td><td></td></tr><tr><td>Propikonazol 14.3</td><td>Quali-Ppro</td><td>60207-90-1</td><td>Propikonazol 14,3%</td></tr><tr><td>Pyłek</td><td>pszczeli Pszczeli energetyzujący</td><td>897098001244</td><td>Nieprzetworzony, naturalny, surowy pyłek</td></tr><tr><td>Mikrowaga</td><td>VWR</td><td>10204-990</td><td></td></tr><tr><td>Pulverisette</td><td>LAB SYNERGY INC.</td><td></td><td></td>30334913</tr><tr><td>Patyczki drewniane</td><td>VWR</td><td>470146908</td><td>Sterylizuj przed użyciem</td></tr><tr><td>Taśma uszczelniająca</td><td>VWR</td><td>89097-912</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>VWR</td><td>89403-384</td><td></td></tr><tr><td>Taca do sadzenia</td><td>VWR</td><td>470150-632</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR</td><td>BDH1158-4LP</td><td></td></tr><tr><td>Probówka wirówkowa</td><td>VWR</td><td>21008936</td><td></td></tr><tr><td>Mikrostrzykawka</td><td>Cole-Palmer</td><td>UX-07940-07</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta gumowa</td><td>Amazon</td><td>B0135HWPN4</td><td></td></tr><tr><td>Igły do strzykawek</td><td>VWR</td><td>89219-334</td><td></td></tr><tr><td>Liofilizator</td><td>Labcono</td><td>LFZ-1L</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie statystyczne</td><td>SPSS</td><td>Wersja 21.0</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro hodowla pszczół samotnic: narzędzie do oceny czynników ryzyka larw

In Vitro Rearing of Solitary Bees: A Tool for Assessing Larval Risk Factors

Chociaż pszczoły samotnice świadczą kluczowe usługi zapylania dla dzikich i zarządzanych upraw, ta bogata gatunkowo grupa została w dużej mierze pominięta w badaniach nad regulacją pestycydów. Ryzyko narażenia na pozostałości fungicydów może być szczególnie wysokie, jeśli oprysk występuje na roślinach żywicielskich lub w ich pobliżu, podczas gdy pszczoły zbierają pyłek, aby zaopatrzyć swoje gniazda. W przypadku gatunków Osmia, które spożywają pyłek z wybranej grupy roślin (oligolekty), niemożność wykorzystania pyłku z roślin niebędących żywicielami może zwiększyć ich czynnik ryzyka toksyczności związanej z fungicydami. Manuskrypt ten opisuje protokoły stosowane do pomyślnego chowu oligolektycznych pszczół murarek, Osmia ribifloris sensu lato, od stadium jaja do stadium przedsłupkowego na płytkach hodowli komórkowych w znormalizowanych warunkach laboratoryjnych. Pszczoły hodowane in vitro są następnie wykorzystywane do badania wpływu ekspozycji na fungicydy i źródła pyłku na kondycję pszczół. Opierając się na w pełni skrzyżowanym modelu czynnikowym 2 × 2, eksperyment bada główne i interaktywne skutki ekspozycji na fungicydy i źródło pyłku na sprawność larw, określaną ilościowo za pomocą biomasy przepoczwarkowej, czasu rozwoju larw i przeżywalności. Główną zaletą tej techniki jest to, że wykorzystanie pszczół hodowanych in vitro zmniejsza naturalną zmienność tła i umożliwia jednoczesną manipulację wieloma parametrami eksperymentalnymi. Opisany protokół stanowi wszechstronne narzędzie do badania hipotez obejmujących zestaw czynników wpływających na zdrowie pszczół. Aby działania na rzecz ochrony pszczół przyniosły znaczący, trwały sukces, kluczowe okażą się takie spostrzeżenia na temat złożonej interakcji czynników fizjologicznych i środowiskowych powodujących spadek liczebności pszczół.

Kondycję larw określono za pomocą trzech wskaźników: (i) czasu rozwoju larw, (ii) biomasy przepoczwarkowej oraz (iii) procentu przeżywalności. Przeprowadzono dwuczynnikową analizę wariancji (ANOVA), przyjmując ekspozycję na fungicyd (dwa poziomy: brak fungicydu, fungicyd) oraz źródło pyłku (dwa poziomy: pyłek rośliny żywicielskiej, pyłek rośliny niebędącej żywicielem) jako zmienne niezależne, a czas rozwoju larw jako zmienną zależną. Główny efekt ekspozycji na fungicyd (F1,2...

Spraye fungicydowe na kwitnące rośliny mogą narażać samotne pszczoły na wysokie stężenia pozostałości fungicydów przenoszonych przez pyłki. Wykorzystując eksperymenty laboratoryjne z udziałem larw pszczół hodowanych in vitro, badanie to bada interaktywne efekty spożywania pyłku poddanego działaniu fungicydów pochodzącego z roślin żywicielskich i niebędących żywicielami.

In vitro Hodowla pszczół samotnic: narzędzie do oceny czynników ryzyka larw

Although solitary bees provide crucial pollination services for wild and managed crops, this species-rich group has been largely overlooked in pesticide ...

Samotne gatunki pszczół reprezentują najbardziej zróżnicowaną grupę pszczół na świecie, ale skuteczna hodowla larw w ściśle kontrolowanych warunkach może być dość trudna. Stworzyliśmy metodę hodowli in vitro gatunków pszczół samotnic, co pozwala nam wyizolować i zmierzyć czynniki ryzyka związane z ich symbiontami mikrobiologicznymi. Wśród niektórych gatunków pszczół samotnic gniazdujących w łodygach bardzo ważne jest, aby techniki hodowli zaspokajały potrzeby młodych larw, a także ich symbiontów mikrobiologicznych urodzonych przez pyłek.W tym miejscu naświetliliśmy główne i interaktywne skutki wielu stresorów, co pozwala nam stwierdzić, czy stresory działają w dużej mierze samodzielnie, czy wspólnie. Procedurę zademonstrują Molly Bidwell i Prarthana Dharampal, obie z mojego laboratorium. Za pomocą wysterylizowanego skalpela rozetnij świeżo zatkane trzciny gniazdujące Osmię.Podziel stroiki wzdłuż na dwie części, aby odsłonić poszczególne komory. Gniazda zazwyczaj zawierają od ośmiu do 14 komór po jednym jaju w każdej komorze. Zidentyfikuj jaja samców przy użyciu metody standardowej.W tym eksperymencie wykorzystano tylko męskie jaja ze względu na uprzedzenia płciowe w wielkości pyłku. Zaopatrzenie męskie jest zazwyczaj mniejsze niż zaopatrzenie żeńskie. Następnie za pomocą wysterylizowanego narzędzia usuń każdy zapas pyłku wraz z powiązanym jajem i umieść je w czystej łodzi do ważenia.W łódce do ważenia delikatnie oddziel jajko od prowiantu. Następnie oddzielnie zważyć zapas pyłku i jajo. Pracuj szybko z jajami Osmii, aby zminimalizować czas ich przerwy w pyleniu.W celu przygotowania do dostarczania pyłku żywiciela, najpierw należy dokonać oględzin pyłku roślin żywicielskich zebranego przez matkę wydobytego z komór lęgowych pod kątem pasożytów. Następnie, aby zmniejszyć potencjalne uprzedzenia matki, połącz zapasy pyłku w jedną masę i wymieszaj je za pomocą wysterylizowanej igły. Następnie podzielić pyłek żywiciela na nowe składniki o standardowej masie.Aby przygotować pyłek roślin niebędących żywicielami, należy sproszkować zakupiony w handlu pyłek zebrany przez pszczoły miodne na drobny proszek za pomocą standardowego laboratoryjnego młyna do kości. Następnie, w oparciu o zawartość wilgoci w zapasach pyłku gospodarza, uwodnić pyłek w proszku za pomocą wysterylizowanego 40% roztworu cukru. Wymieszaj to do konsystencji przypominającej ciasto.Następnie należy zaopatrzyć się w pyłek niebędący żywicielem o tej samej wadze, co pyłek zebrany przez matkę. W przypadku płytki zabiegowej należy wyłożyć poszczególne dołki 48-dołkowej płytki hodowlanej autoklawowanymi cynowymi kubkami. Przygotuj osobne płytki dla grupy badanej i kontrolnej.Następnie za pomocą sterylnych kleszczyków delikatnie rozszerz górną krawędź miseczek, aby mogły pomieścić zapas pyłku. Następnie załaduj pojedyncze zapasy pyłku do blaszanych kubków. Teraz w każdej masie pyłku wykonaj centralnie umieszczone wgłębienie za pomocą sterylnego drewnianego patyczka.Użyj nowego patyczka do każdego zapasu pyłku. Do zagłębienia dodaj odpowiednie objętości roztworu zabiegowego, takiego jak fungicyd i sterylna woda do kontroli. Po każdym dodaniu ściśnij wgłębienie za pomocą czystych sterylnych kleszczy.Na początek dobrze załaduj każdą płytkę zabiegową losowo wybranym męskim jajem. Umieść go na wierzchu zapasu pyłku za pomocą czystego, cienkiego pędzla. Po umieszczeniu jajek przymocuj pokrywkę do talerza za pomocą taśmy na rogach.Następnie każdą przygotowaną płytkę należy umieścić w inkubatorze utrzymywanym w temperaturze pokojowej. Dołącz jedną sześciodołkową płytkę wypełnioną sterylną wodą, aby zapobiec wysuszeniu. Pozostawić płytki w inkubatorze w spokoju.Sprawdzaj płytkę codziennie pod mikroskopem preparacyjnym bez zdejmowania pokrywy. Jeśli larwy są żywe, będą się poruszać. W przypadku wykrycia żadnego ruchu należy wyrzucić blaszany kubek zawierający martwe larwy i pozostały zapas pyłku.Kiedy larwa osiągnie stadium przedplepiskowe, wyjmij ją z blaszanego kubka i użyj szczotki, aby usunąć wiórki z jedwabnego kokonu. Następnie za pomocą mikroskopu preparacyjnego ostrożnie przetnij jedwabny kokon i usuń poczwarkę za pomocą szczypiec do piórka. Z przedplestem należy obchodzić się delikatnie, aby zapobiec uszkodzeniu jego ciała.Teraz zapisz masę poczwarki i czas rozwoju od jaja do stadium poczwarki. Przydatność larw określono ilościowo za pomocą czasu rozwoju larw i biomasy przedmieść. Stwierdzono istotną ujemną korelację między czasem rozwoju larw a biomasą przepoczwarkową w grupach leczonych fungicydami i nieleczonych.Chociaż stwierdzono istotną ujemną korelację w przypadku larw wychowanych na pyłku innym niż domowy, nie zaobserwowano takiej zależności w przypadku larw wyhodowanych na pyłku gospodarza. Źródło pyłku miało znaczący wpływ na kondycję pszczół. W przypadku hodowli na pyłku niebędącym żywicielem czas rozwoju larw znacznie się wydłużył, podczas gdy biomasa przedsłupkowa znacznie się zmniejszyła zarówno w grupach leczonych fungicydami, jak i nieleczonych w porównaniu z larwami wyhodowanymi na pyłku gospodarza.Ekspozycja na fungicydy nie miała istotnego głównego wpływu na kondycję. Nie stwierdzono statystycznie istotnej różnicy w czasie rozwoju i biomasie przedpoczwarkowej dla zabiegów wyhodowanych na pyłku gospodarza i nieżywiciela w grupach leczonych fungicydami i nieleczonych. Nie stwierdzono istotnego wpływu interakcji ekspozycji na fungicydy i źródło pyłku na czas rozwoju larw i biomasę przedplep.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skutecznie hodować larwy samotnych pszczół w warunkach in vitro. Po opanowaniu technika ta może być stosowana do hodowli pszczół w warunkach in vitro od stadium jaja do poczwarki, powodując przy tym minimalną śmiertelność z powodu stresu związanego z obchodzeniem się ze stresem. Podczas stosowania tej procedury należy pamiętać o użyciu jaj lub bardzo młodych larw.Gwarantuje to, że larwy są hodowane prawie wyłącznie zgodnie z zamierzoną manipulacją zabiegami dietetycznymi. Protokół ten można rozszerzyć na kilka innych gatunków samotnych pszczół i os i można go łatwo modyfikować w celu przetestowania głównych i interaktywnych skutków wielu czynników ryzyka wpływających na zdrowie zapylaczy. Zapewniając środki do hodowli in vitro larw pszczół samotnych, technika ta może pomóc w identyfikacji nieznanych wcześniej czynników ryzyka wśród wrażliwych populacji pszczół.Na przykład niektóre z ich eksperymentów opartych na tym protokole mogą pomóc w ustaleniu roli mikrobiomu pyłku w nadawaniu różnych stopni odporności na stresory ksenobiotyczne. Jako dostępna i niedroga technika, protokół ten stanowi wszechstronne narzędzie do testowania hipotez, które może być łatwo modyfikowane przez badaczy w celu osiągnięcia własnych celów badawczych.

in-vitro-rearing-solitary-bees-tool-for-assessing-larval-risk

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Protokół warunkowania Proboscis Extension Response (PER), opracowany dla pszczół miodnych (Apis mellifera), dostarcza ekologicznie istotnych i łatwo mierzalnych środków do badania kilku różnych mechanizmów uczenia się u wielu gatunków owadów.

Protokół odpowiedzi na wydłużenie trąby do badania plastyczności behawioralnej u owadów: zastosowanie do badań podstawowych, biomedycznych i rolniczych

Celem tej prezentacji jest zademonstrowanie in vivo i in vitro technik hodowli nicieni entomopatogenicznych. Metody in vivo uwzględniają hodowlę tych nicieni z owadem żywicielem, podczas gdy metody in vitro wykorzystują bogate podłoża agarowe.

Hodowla in vivo i in vitro nicieni entomopatogenicznych (Steinernematidae i Heterorhabditidae)

Niniejszym przedstawiamy metodę karmienia skażoną pestycydami żywnością zarówno pojedynczej pszczoły miodnej, jak i kolonii ula. Procedura ocenia wpływ pestycydów na poszczególne pszczoły miodne poprzez dokarmianie in vivo podstawową dietą larw, a także na naturalny stan rodziny pszczelej.

Ocena wpływu chemikaliów środowiskowych na rozwój pszczół miodnych od poziomu osobnika do poziomu kolonii

W tym protokole, metody przeprowadzania krzyżówek wsobnych i oceny sukcesu tych krzyżówek, są opisane dla mrówki Vollenhovia emeryi. Protokoły te są ważne dla eksperymentów mających na celu zrozumienie genetycznych podstaw systemów determinacji płci u błonkoskrzydłych.

Indukcja i ocena krzyżówek wsobnych z wykorzystaniem mrówki, Vollenhovia emeryi

Tutaj prezentujemy protokoły dotyczące 1) laboratoryjnego rozmnażania zagrożonego wyginięciem motyla niebieskiego motyla z Miami (Cyclargus thomasi bethunebakeri) oraz 2) oceny podstawowych informacji o historii życia, takich jak czas niedojrzałego rozwoju i liczba stadiów larwalnych. Obie metody mogą być dostosowane do stosowania z innymi programami ochrony ex situ.

Programy rozmnażania zagrożonych motyli w niewoli w celu poszerzenia wiedzy na temat historii życia i skutecznych technik ochrony ex situ

Tutaj opisujemy dwa protokoły: pierwszy do rozmnażania, ekstrakcji, oczyszczania i ilościowego oznaczania dużych ilości bezotoczkowych cząsteczek wirusa pszczoły miodnej, w tym metoda usuwania poczwarek pszczół miodnych, a drugi do testowania skutków infekcji wirusowej za pomocą wysoce powtarzalnego, wysokoprzepustowego testu biologicznego w klatce.

Przygotowanie inokulum wzbogaconego wirusem do doustnego zakażenia pszczół miodnych (Apis mellifera)

Ten protokół został opracowany w celu lepszego zrozumienia, jak agrochemikalia wpływają na reprodukcję pszczół miodnych (Apis mellifera), poprzez ustanowienie metod wystawiania królowych pszczół miodnych i ich opiekunów na działanie agrochemikaliów w kontrolowanych, laboratoryjnych warunkach i uważne monitorowanie ich odpowiednich reakcji.

Ocena ryzyka agrochemicznego dla krytych matek pszczół miodnych

Obecny protokół wyjaśnia metodę karmienia larwami samotnicy, pszczoły samotnicy, Osmia excavata, skażonymi pestycydami. W ramach procedury bada się ekotoksyczność pestycydu dla larw pszczół samotnic.

Ocena wpływu pestycydów na larwy pszczół samotnic

Tutaj szczegółowo opisano dwa protokoły oceny preferencji dotyczących źródła pożywienia i składania jaj u larw i samic plujek. Składają się one z czterech opcji, w których na siebie oddziałują dwa czynniki: rodzaj podłoża i temperatura. Testy umożliwiają określenie preferencji larw dotyczących źródła pożywienia oraz preferencji miejsca składania jaj przez samice.

Badanie wyborów dotyczących historii życia: wykorzystanie temperatury i rodzaju podłoża jako czynników oddziałujących na larwy plujki i preferencje samic

Pokazujemy sprawdzoną metodę bezpiecznego obchodzenia się z pszczołami zebranymi na polu. Metoda ta umożliwia szybką manipulację, identyfikację, pobieranie próbek genetycznych i potwierdzanie interakcji między roślinami a owadami za pomocą pyłku pobranego podczas pobierania próbek. Podejście to, łatwe do adaptacji, oferuje opłacalny, nieśmiercionośny sposób badania rzadkich grup owadów.

Szybka metoda ograniczania i bezpiecznego obchodzenia się z pszczołami w terenie

Poznaj metodę in vitro hodowli larw pszczół samotnic w celu oceny wpływu fungicydów na ich rozwój i mikrobiom. Technika ta umożliwia badanie czynników ryzyka dla zdrowia zapylaczy.

In vitro Hodowla pszczół samotnic: narzędzie do oceny czynników ryzyka larw

Przeglądaj więcej filmów