Name: In Situ Pomiar i korelacja gęstości komórek i emisji światła bakterii bioluminescencyjnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: Poznaj metodę pomiaru bioluminescencji bakterii in situ przy użyciu szczepu E. coli z operonem lux. Technika umożliwia badanie mechanizmów regulacji światła i charakterystyki operonów w organizmach modelowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Pragniemy podziękować Wladislaw Maier (BMG Labtech GmbH) za wsparcie w stworzeniu samodzielnie napisanego skryptu dla czytnika płytek. Prace te były wspierane przez austriacki "Fonds zur Förderung der wissenschaftlichen Forschung" (FWF) dla PM (P24189) oraz program doktorancki "DK Molecular Enzymology" (W901) dla PM.

1. Projektowanie, przygotowanie i ekspresja operonu luksowego u Escherichia coli
Uwaga: Zobacz Spis materiałów, aby uzyskać informacje na temat zestawów komercyjnych używanych w tej sekcji.
<ol>
	<li>Do przeniesienia operonu luksowego do E. coli należy wybrać standardowy wektor pET z odpowiednimi miejscami restrykcyjnymi i interesującym genem oporności na antybiotyki (np. pET28a; NcoI, XhoI, kanamycyna).</li>
	<li>Zaprojektuj fragmenty i nakładające się startery do montażu Gibsona w oparciu o sekwencję DNA Photobacterium mandapamensis 27561 (GenBank: DQ988878.2).</li>
	<li>Przygotuj standardową reakcję PCR z zaprojektowanymi starterami i wyizolowanym genomowym DNA Photobacterium mandapamensis 27561 jako matrycą (patrz Materiał uzupełniający dla starterów i warunków). 
	UWAGA: Izolacja genomowego DNA odpowiedniego szczepu bakteryjnego zwiększa skuteczność PCR.</li>
	<li>Oczyścić produkt PCR poprzez oczyszczanie za pomocą kolumny wirowej.</li>
	<li>Przeprowadzić trawienie restrykcyjne izolowanego wektora pET28a za pomocą NcoI i XhoI w temperaturze 37 °C przez 45 minut.</li>
	<li>Oczyść zlinearyzowany wektor i fragmenty PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, a następnie oczyszczenia w kolumnie wirowej.</li>
	<li>Określ stężenie DNA w każdym fragmencie i wektorze zlinearyzowanym i oblicz optymalne ilości do złożenia zgodnie z protokołem20,21. 
	UWAGA: Skuteczność montażu zależy od wielkości i liczby fragmentów i musi być dostosowana zgodnie z protokołem producenta20,21.</li>
	<li>Po połączeniu wszystkich fragmentów i buforu w probówce do PCR, inkubować mieszaninę montażową w maszynie do PCR w temperaturze 50 °C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Przekształć zmontowany produkt wektorowy zgodnie ze standardowymi protokołami transformacji plazmidu bakteryjnego E. coli w odpowiedni system E. coli do replikacji plazmidu o wysokiej wydajności (np. E. coli TOP10 lub XL-1).</li>
	<li>Wybierz kolonie z płytki transformacyjnej i umieść smugi na nowych płytkach w celu izolacji DNA.</li>
	<li>Wyizoluj plazmidowe DNA zgodnie ze standardowymi protokołami.</li>
	<li>Aby zweryfikować prawidłowe złożenie plazmidu, w tym wszystkich fragmentów, najpierw wykonaj PCR kolonii zgodnie ze standardowymi protokołami przy użyciu starterów specyficznych dla każdego zmontowanego fragmentu.</li>
	<li>Oprócz PCR kolonii i późniejszej elektroforezy w żelu agarozowym, należy przygotować wszystkie izolowane wektory montażowe do sekwencjonowania DNA, aby zweryfikować prawidłowe złożenie i prawidłowe sekwencje DNA.</li>
	<li>Przekształć zweryfikowany plazmid zgodnie ze standardowymi protokołami transformacji plazmidu bakteryjnego E. coli w odpowiedni system E. coli do produkcji białek o wysokiej wydajności (np. E. coli BL21). 
	UWAGA: Kontynuuj bezpośrednio z poniższym protokołem odciągania. W przypadku dłuższego przechowywania zaleca się przygotowanie bulionu glicerolowego.</li>
</ol>
2. Ekspresja zmodyfikowanych szczepów E. coli 
<ol>
	<li>Przygotować hodowlę całonocną (ONC) do ekspresji przez inokulację odpowiedniej objętości pożywki LB (np. 100 ml) uprzednio przygotowanym zapasem glicerolu komórek E. coli BL21 przekształconych za pomocą połączonego plazmidu lub bezpośrednio z płytki transformacyjnej. Dodać 100 μl kanamycyny (50 mg/ml; gen oporności na antybiotyki pET28a) i inkubować ONC w temperaturze 37 °C i 120 obr./min w wytrząsarce inkubatora przez noc.</li>
	<li>Zaszczepić główną kulturę ekspresyjną (np. 800 ml pożywki LB) 8 ml ONC i dodać 800 μl kanamycyny (50 mg/ml).</li>
	<li>Inkubować główną kulturę w temperaturze 37 °C i prędkości 120 obr./min w wytrząsarce inkubatora, aż gęstość komórek osiągnie OD600 0,6 - 0,8 (około 2,5 godziny).</li>
	<li>Zmniejszyć temperaturę inkubacji do 28 °C.</li>
	<li>Indukuj ekspresję białka poprzez dodanie IPTG do końcowego stężenia 0,1 mM. 
	UWAGA: Badania empiryczne wykazały, że obniżenie temperatury do 28 °C dawało największe natężenie światła.</li>
	<li>Obserwuj komórki, aż zaczną świecić (około 1 godziny). 
	UWAGA: W zależności od celu ekspresji, komórki są hodowane do następnego dnia, a następnie zbierane lub komórki mogą być potrząsane tak długo, jak długo świecą (maksymalnie 48 godzin). Pobieranie komórek i oczyszczanie wszelkich białek można przeprowadzić zgodnie ze standardowymi procedurami.</li>
</ol>
3. Ekspresja szczepów bioluminescencyjnych bakterii
UWAGA: Szczepy bioluminescencyjne bakterii wymagają specjalnego podłoża wzrostowego/sztucznego podłoża wodnego do wzrostu i produkcji światła.
<ol>
	<li>Przygotować sztuczną pożywkę z wodą morską, składającą się z dwóch oddzielnie przygotowanych składników pożywki. 
	UWAGA: Przygotowanie sztucznego podłoża z wodą morską zostało zaadaptowane z oryginalnego protokołu22. Poniższe ilości dotyczą 1 l płynnego podłoża lub 1 l podłoża agarowego.
	<ol>
		<li>W przypadku pożywki ze sztuczną wodą morską należy odważyć następujące sole: 28,13 g NaCl, 0,77 g KCl, 1,60 g CaCl2 · 2H2O, 4,80 g MgCl2 · 6H2O, 0,11 gNaHCO3 i 3,50 gMgSO4 ·7H2O.</li>
		<li>Dodać 1 l wody destylowanej i rozpuścić wszystkie składniki.</li>
		<li>W przypadku podłoża LB należy zważyć następujące składniki: 10 g ekstraktu drożdżowego, 10 g peptonu, a w przypadku płytek agarowych dodatkowe 20 g agaru.</li>
		<li>Dodaj 250 ml wody z kranu i rozpuść składniki.</li>
		<li>Oba przygotowane podłoża należy sterylizować w autoklawie oddzielnie w temperaturze 121 °C przez 20 minut.</li>
		<li>W przypadku płytek agarowych należy połączyć 250 ml pożywki LB z 750 ml pożywki ze sztucznej wody morskiej bezpośrednio po autoklawowaniu i przygotować płytki.</li>
		<li>W przypadku pożywki płynnej należy połączyć 250 ml pożywki LB z 750 ml pożywki ze sztucznej wody morskiej bezpośrednio po autoklawowaniu lub po schłodzeniu. 
		UWAGA: Sztuczne podłoże wody morskiej może stać się mętne w wyniku wytrącania się soli.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Szczepy bioluminescencyjne bakterii należy rozprowadzić na płytkach agarowych ze sztucznej wody morskiej i inkubować przez noc w temperaturze 24 - 30 °C. 
	UWAGA: Długie przechowywanie szczepów bakteryjnych odbywa się zwykle poprzez zamrażanie zapasów glicerolu w kulturze bakteryjnej. Szczepy powinny być zawsze najpierw rozrzucone na płytkach agarowych, aby zapewnić jednolite warunki początkowe dla wszystkich szczepów, przed użyciem do kultur płynnych, ze względu na opóźnioną fazę wzrostu po rozmrożeniu.</li>
	<li>Przygotować ONC, zaszczepiając 100 ml sztucznej pożywki z wodą morską pojedynczą kolonią z płytki. Inkubować ONC w temperaturze 24 - 30 °C i 120 obr./min w wytrząsarce inkubatora przez noc.</li>
	<li>Zaszczepić 800 ml sztucznej pożywki wodnej 8 ml ONC.</li>
	<li>Inkubować komórki bakteryjne w temperaturze 24 - 30 °C i prędkości 120 obr./min w wytrząsarce inkubatora. 
	UWAGA: Profil natężenia światła bakterii bioluminescencyjnych silnie zmienia się w zależności od temperatury. W zależności od mechanizmów regulacyjnych produkcji światła przez dany szczep bakterii, emisja światła może rozpocząć się po około 1 - 6 godzinach.</li>
	<li>Obserwuj hodowlę komórek bakteryjnych, aż zaczną świecić (około 1 - 6 godzin). 
	UWAGA: W zależności od celu ekspresji, komórki są hodowane do następnego dnia, a następnie zbierane lub komórki mogą być potrząsane tak długo, jak długo świecą. Pobieranie komórek i oczyszczanie wszelkich białek można przeprowadzić zgodnie ze standardowymi procedurami.</li>
</ol>
4. Test aktywności in vivo dla bioluminescencyjnych szczepów bakteryjnych i zmodyfikowanych szczepów E. coli
UWAGA: Długie przechowywanie szczepów jest zwykle możliwe dzięki zamrożeniu zapasów glicerolu w kulturze bakteryjnej. Szczepy powinny być zawsze najpierw rozrzucone na płytkach agarowych, aby zapewnić jednolite warunki początkowe dla wszystkich szczepów, przed użyciem do kultur płynnych, ze względu na opóźnioną fazę wzrostu po rozmrożeniu.
<ol>
	<li>Umieścić pożądany bioluminescencyjny szczep bakterii lub zmodyfikowany szczep E. coli na płytce agarowej i inkubować w temperaturze 28 °C przez noc. 
	UWAGA: Temperatura inkubacji może się różnić w zależności od szczepu i musi być oceniona empirycznie. Aby móc porównać bioluminescencyjne szczepy bakterii i zmodyfikowane szczepy E. coli, warunki wzrostu muszą być identyczne.</li>
	<li>Zaszczepić 3 ml pożywki odpowiednim szczepem pojedynczą kolonią z płytki agarowej i inkubować komórki w temperaturze 28 °C i 180 obr./min w wytrząsarce inkubatora przez około 1-2 godziny.</li>
	<li>Zmierzyć gęstość komórek w rozcieńczeniu płynnej kultury w stosunku 1:10 przy długości fali 650 nm. Obliczyć stosunek i objętość dla 1 ml kultury o OD650 wynoszącym 0,05, 
	UWAGA: Kolejny test czytnika płytek określi gęstość komórek przy 650 nm, aby uniknąć zakłóceń spowodowanych emisją światła przez szczepy.</li>
	<li>Odpipetować obliczoną objętość kultury i pożywki do 24-dołkowej płytki o czarnych ściankach ze szklanym dnem. W przypadku zmodyfikowanego szczepu E. coli do próbek dodać 1 μl kanamycyny (antybiotykooporność wektora pET28a) i 1 μl IPTG (indukcja ekspresji genu). Umieść pokrywkę na talerzu, aby uniknąć parowania podczas pomiarów. 
	UWAGA: Aby zapewnić, że wektor pET28a zawierający cały operon luksa nie zostanie utracony przez hodowlę E. coli, kanamycyna musi być dodana do każdej próbki E. coli w dołkach płytkowych i aby zapewnić możliwość pomiaru produkcji światła w komórkach E. coli, ekspresja genu musi być indukowana przez IPTG. Aby uniknąć przesłuchów i zakłóceń pomiaru, najlepsze wyniki wykazały płytki studzienne o czarnych ściankach ze szklanym dnem i przezroczystą pokrywą. Niemniej jednak można zaobserwować przesłuchy i dobrze dobrać pozycje.</li>
	<li>Rozpocznij pomiar w czytniku płytek. 
	UWAGA: Protokół czytnika płytek jest oparty na skrypcie opracowanym specjalnie dla tego testu (patrz Materiał uzupełniający), który łączy dwa pomiary, absorbancję i bioluminescencję. Punkty danych są zbierane co 10 minut z ciągłym wstrząsaniem między pomiarami i stałą temperaturą 28 °C.</li>
</ol>

<ol><li>Widder, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+in+the+Ocean%3A+Origins+of+Biological+Chemical%2C+and+Ecological+Diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence in the Ocean: Origins of Biological Chemical, and Ecological Diversity.</a> Science. 328 (5979), 704-708 (2010).</li>
<li>Dunlap, P. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/topics/biochemistry-genetics-and-molecular-biology/bioluminescent-bacteria">Bioluminescence, Microbial.</a> Encycl Microbiol. , 45-61 (2009).</li>
<li>Ulitzur, S., Hastings, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+tetradecanal+as+the+natural+aldehyde+in+bacterial+bioluminescence%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Evidence for tetradecanal as the natural aldehyde in bacterial bioluminescence.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 76 (1), 265-267 (1979).</li>
<li>Kurfürst, M., Ghisla, S., Hastings, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+postulated+structure+of+the+primary+emitter+in+the+bacterial+luciferase+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Characterization and postulated structure of the primary emitter in the bacterial luciferase reaction.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 81, 2990-2994 (1984).</li>
<li>Dunlap, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemistry+and+genetics+of+bacterial+bioluminescence%5BTitle%5D)+AND+%22Biolumin+Fundam+Appl+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Biochemistry and genetics of bacterial bioluminescence.</a> Biolumin Fundam Appl Biotechnol. 1, 37-64 (2014).</li>
<li>Meighen, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Bioluminescence%3A+Organization%2C+regulation%2C+and+application+of+the+lux+genes%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Bacterial Bioluminescence: Organization, regulation, and application of the lux genes.</a> FASEB J. 7, 1016-1022 (1993).</li>
<li>Moore, S. A., James, M. N. G., O'Kane, D. J., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+of+Photobacterium+leiognathi+non-fluorescent+flavoprotein+with+limited+sequence+identity+to+bacterial+luciferase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Crystallization of Photobacterium leiognathi non-fluorescent flavoprotein with limited sequence identity to bacterial luciferase.</a> J Mol Biol. 224, 523-526 (1992).</li>
<li>Moore, S. A., James, M. N. G., O'Kane, D. J., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+flavoprotein+related+to+the+subunits+of+bacterial+luciferase%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a flavoprotein related to the subunits of bacterial luciferase.</a> EMBO J. 12 (5), 1767-1774 (1993).</li>
<li>Moore, S. A., James, M. N. G. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/pro.5560031103">Common structural features of the luxF protein and the subunits of bacterial luciferase: Evidence for a (βα)8 fold in luciferase.</a> Protein Sci. 3, 1914-1926 (1994).</li>
<li>Moore, S. A., James, M. N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+refinement+of+the+non-fluorescent+flavoprotein+from+Photobacterium+leiognathi+at+1.60+%C3%85+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural refinement of the non-fluorescent flavoprotein from Photobacterium leiognathi at 1.60 Å resolution.</a> J Mol Biol. 249, 195-214 (1995).</li>
<li>Kita, A., Kasai, S., Miyata, M., Miki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+flavoprotein+FP390+from+a+luminescent+bacterium+Photobacterium+phosphoreum+refined+at+2.7+%C3%85+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+Sect+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Structure of flavoprotein FP390 from a luminescent bacterium Photobacterium phosphoreum refined at 2.7 Å resolution.</a> Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 52 (1), 77-86 (1996).</li>
<li>Bergner, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+biochemical+properties+of+LuxF+from+Photobacterium+leiognathi%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+-+Proteins+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Structural and biochemical properties of LuxF from Photobacterium leiognathi.</a> Biochim Biophys Acta - Proteins Proteomics. 1854 (10), 1466-1475 (2015).</li>
<li>Defoirdt, T., Boon, N., Sorgeloos, P., Verstraete, W., Bossier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quorum+sensing+and+quorum+quenching+in+Vibrio+harveyi%3A+Lessons+learned+from+in+vivo+work%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Quorum sensing and quorum quenching in Vibrio harveyi: Lessons learned from in vivo work.</a> ISME J. 2 (1), 19-26 (2008).</li>
<li>Meighen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+bacterial+bioluminescence%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetics of bacterial bioluminescence.</a> Annu Rev Genet. 28, 117-139 (1994).</li>
<li>Kelkar, M., De, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+based+in+vivo+screening+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence based in vivo screening technologies.</a> Curr Opin Pharmacol. 12 (5), 592-600 (2012).</li>
<li>Waidmann, M. S., Bleichrodt, F. S., Laslo, T., Riedel, C. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+luciferase+reporters%3A+The+Swiss+army+knife+of+molecular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Bioeng+Bugs%22%5BJournal%5D)">Bacterial luciferase reporters: The Swiss army knife of molecular biology.</a> Bioeng Bugs. 2 (1), 8-16 (2011).</li>
<li>Wilson, T., Hastings, J. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWilson%2C+T+%22Bioluminescence+living+lights%2C+lights+for+living%22">Bioluminescence living lights, lights for living</a>. , Harvard University Press. (2013).</li>
<li>Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+synthesis+of+the+mouse+mitochondrial+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome.</a> Nat Methods. 7 (11), 901-903 (2010).</li>
<li>Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+overlapping+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments.</a> Methods Enzymol. 498, 349-361 (2011).</li>
<li><a target="_blank" href="https://www.neb.com/applications/cloning-and-synthetic-biology/dna-assembly-and-cloning/nebuilder-hifi-dna-assembly?gclid=EAIaIQobChMI4-3PmdWy2gIViONkCh3FbAh5EAAYASAAEgIHjPD_BwE">NEB NEBuilder HiFi DNA Assembly Reaction</a>. , (2015).</li>
<li>Atlas, R. M. <a target="_blank" href="https://books.google.com/books/about/Handbook_of_Microbiological_Media_Third.html?id=aWsF-e8tPzIC">Handbook of Microbiological Media, Third Edition</a>. , CRC Press. (2004).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Konstrukcję plazmidu ekspresyjnego zawierającego cztery fragmenty składające się na cały operon lux-rib P. mandapamensis 27561 osiągnięto za pomocą klonowania Gibsona. Ta ekspresja genu luksa oparta na E. coli umożliwia komórkom E. coli emitowanie światła. Unikanie regulacji quorum sensing i niestandardowych warunków wzrostu to istotne zalety tego systemu.
Zaletą stosowania strategii klonowania Gibsona jest łatwe składanie wielu liniowych fragmentów DNA, wysoka elastyczność i brak potrzeby stosowania określonych miejsc restrykcyjnych 18,19,20. Metoda ta pozwala w łatwy sposób zmienić operon luksa, wykluczając pojedyncze geny lub klastry genów lub wprowadzając nowe geny lub wymieniając geny z jednego szczepu na drugi. Warunkiem koniecznym do zastosowania tej metody jest dostępność odpowiedniej sekwencji genu operonu luksowego. Tylko w przypadku niewielkiej liczby bakterii bioluminescencyjnych znana i/lub dostępna jest pełna sekwencja DNA danego operonu luksowego. Wiele z tych sekwencji jest pofragmentowanych, ponieważ zostały wygenerowane przy użyciu sekwencjonowania ze strzelbą. W przypadku badanego P. mandapamensis 27561 pełna sekwencja DNA operonu luksa jest znana i dostępna w bazie danych genów NCBI (GenBank: DQ988878.2).
Jednym z krytycznych kroków w protokole montażu Gibsona jest obliczenie stężenia DNA w pojedynczych fragmentach. W protokole montażu producenta zalecono stosowanie 0,2 - 0,5 pmols i łącznej objętości 20 μL na 4 - 6 fragmentów20,21. W naszym przypadku, w którym luxCDABFEG-ribEBH składa się z 4 fragmentów, stężenia i objętości całkowite wynosiły odpowiednio 0,1 pmol i 45 μL, w zależności od wydajności produktów PCR. Z jednej strony trzeba było zmniejszyć stężenie, a z drugiej zwiększyć objętość. Mimo to montaż przebiegł bardzo dobrze, a sekwencjonowanie DNA potwierdziło prawidłową insercję przy pierwszej próbie. To odkrycie potwierdziło, że montaż Gibsona jest solidną i odpowiednią metodą dla naszych badań, która może być łatwo modyfikowana 18,19,20.
Nowo opracowany test czytnika płytek jest łatwą w obsłudze metodą. Umożliwia prostą analizę pierwotną nowych lub (nie)znanych bioluminescencyjnych szczepów bakterii i daje już pierwsze wskazówki na temat mechanizmu regulacyjnego produkcji światła (np . opóźnienie w luminescencji przy niskiej gęstości komórek). Dodatkowo, warunki wzrostu w połączeniu z produkcją światła można łatwo ocenić, po prostu zmieniając podłoże lub temperaturę.
Pomiary za pomocą czytnika płytek wykonano w temperaturze 28 °C. Powodem tego nietypowego ustawienia jest wrażliwość na temperaturę bioluminescencyjnych szczepów bakterii, w których temperatury powyżej 30 °C prowadzą do mniejszego lub nawet zerowego wzrostu i/lub emisji światła. Należy pamiętać, że czytnik płytek jest w stanie utrzymać określoną temperaturę w czasie, z ograniczeniem do braku aktywnego układu chłodzenia. W związku z tym temperatura otoczenia musi być niższa od temperatury pomiaru.
Jako dowód słuszności koncepcji, porównano konstrukt E. coli z bioluminescencyjnym szczepem P. mandapamensis (Rysunek 5) z jednej strony i pomiary referencyjne (Rysunek 4) z drugiej strony, które potwierdziły niezawodność tego nowo powstałego systemu. Dodatkowo, długoterminowy pomiar zapewnił długowieczność emisji światła (rysunek 6). Należy jednak wziąć pod uwagę, że wartości OD nie są wiarygodne powyżej pewnej gęstości optycznej, w zależności od charakterystyki zastosowanego urządzenia pomiarowego (w tym przypadku około 15 godzin), gdzie do pomiaru w zakresie liniowym detektora potrzebne byłoby odpowiednie rozcieńczenie. Te duże odchylenia w wartościach OD sprawiają, że te długie pomiary nie są wiarygodne. Dlatego zaleca się krótsze pomiary, takie jak 10 godzin, przy użyciu opisanej tutaj konfiguracji eksperymentalnej.
Ograniczenia ustalonego testu czytnika płytek można zobaczyć na rysunku 7. Trudność polega na znalezieniu odpowiedniego ustawienia pomiaru. "Wartość wzmocnienia" dostosowuje czułość lampy powielacza fotograficznego (PMT). Wzmocnienie to wzmocnienie sygnału w PMT, co oznacza, że wyższy współczynnik wzmocnienia zwiększy sygnał. Jeśli wzmocnienie jest ustawione zbyt nisko, stosunek sygnału do szumu staje się większy, a natężenie światła "niskich" świecących bakterii bioluminescencyjnych nie może być już mierzone (sygnały bliskie zeru, dane nie są wyświetlane). Wyzwaniem w teście bioluminescencyjnym jest ustawienie wzmocnienia tak, aby wyniki pomiarów dla wszystkich szczepów bakterii mieściły się w zakresie urządzenia. Dodatkowo zakres pomiarowy dla luminescencji zależy od czasu interwału pomiaru (np. maksymalnie 2 000 000 przez 1 s).
Wzmocnienie zostało ustawione na 2800, które zostało empirycznie przetestowane i wybrane dla konkretnego czytnika płytek użytego do ustalenia tej metody. Zastosowane ustawienie wzmocnienia pozwala na rejestrację maksymalnego emitowanego światła przez bioluminescencyjny system E. coli , P. mandapamensis 27561 i P. mandapamensis S1 bez przepełnienia, ale dla szczepów P. mandapamensis TH1 i V. harveyi 14126 wzmocnienie było zbyt wysokie. W związku z tym te ostatnie szczepy przekraczają granicę wykrywalności i nie można zmierzyć rzeczywistego maksymalnego natężenia światła. To ograniczenie techniczne może uniemożliwić porównanie bakterii bioluminescencyjnych, które wykazują duże wahania w maksymalnej emisji światła, chociaż warunki wzrostu i gęstość komórek mogą być porównywalne.
Umiejscowienie analizowanych szczepów bakteryjnych w obrębie zastosowanych płytek studzienkowych musi być ocenione empirycznie. Chociaż użyto czarnych płytek studzienkowych ze szklanym dnem, zaobserwowano przesłuchy między próbkami. Natężenie światła określonych szczepów jest tak wysokie, że wszystkie sąsiednie studnie będą wykazywać fałszywie dodatnie emisje światła (np. ślepe). Dlatego ważne jest, aby mierzyć dwa różne szczepy oddzielnie lub z pewną separacją przestrzenną od siebie.
Znanych jest już wiele zmodyfikowanych szczepów E. coli, które zawierają części operonu luksowego i są głównie zorientowane na zastosowanie 15,16,17. Opisane tu metody, mają na celu prowadzenie badań podstawowych, na przykład możliwość analizy każdego genu luksa z osobna. Chociaż badania nad bioluminescencją mają długą historię, wciąż istnieje wiele otwartych pytań. Poprzez wykluczenie lub wprowadzenie genów z operonu luksowego, wymianę genów luxAB na geny z innego szczepu lub analizę kompleksów białkowych, osadzonych w łatwym w obsłudze systemie E. coli i dalsze zastosowanie testu czytnika płytek, możliwe jest uzyskanie większej ilości informacji na temat procesów regulacyjnych i funkcji genów luksów.

Emisja światła przez organizmy żywe (bioluminescencja) to fascynujący proces występujący u bakterii, grzybów, owadów, nicieni, ryb i kałamarnic1. Bioluminescencyjna emisja światła wynika z reakcji chemiluminescencyjnej, w której energia chemiczna jest (częściowo) przekształcana w energię świetlną („zimne światło”). W bakteriach bioluminescencyjnych heterodimeryczny enzym lucyferaza katalizuje monooxygenację długołańcuchowych aldehydów alifatycznych, takich jak tetradekanal, do odpowiadających im kwasów, czemu towarzyszy emisja światła z maksimum przy 490 nm2,3.
<img alt="Wzór reakcji bioluminescencji; emisja katalizowana przez lucyferazę; schemat chemiczny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57881/57881fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rycina 1Ogólny schemat reakcji lucyferazy bakteryjnej. Bakteryjna lucyferaza (LuxAB) katalizuje monooxygenację długołańcuchowych aldehydów (CH3(CH2)nCHO) poprzez wykorzystanie zredukowanego mononukleotydu flawinowego (FMNH2)2) i tlenu cząsteczkowego (O2), w wyniku czego powstają produkty w postaci długołańcuchowych kwasów (CH3(CH2)nCOOH), mononukleotyd flawinowy (FMN), woda (H2O) oraz emisję światła o maksimum przy 490 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57881/57881fig1v2large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Energia uwalniana podczas tego utleniania powoduje powstanie wzbudzonego stanu wodorotlenku FMN-4a, który pełni rolę emitującej światło lucyferyny4. Białka uczestniczące w bakteryjnej bioluminescencji, mianowicie LuxCDABEG, są kodowane przez operon lux i są wysoce konserwatywne w różnych szczepach bakteryjnych2,5. Geny luxA i luxB kodują heterodimeryczną lucyferazę; produkty genów luxC, luxD i luxE są składnikami kompleksu reduktazy kwasów tłuszczowych, a luxG koduje reduktazę flawinową6. Liczne bioluminescencyjne Photobacteria (np. Photobacterium mandapamensis 27561) posiadają dodatkowy gen luxF. Wykazano, że LuxF jest białkiem homodimerycznym, które wiąże nietypową pochodną flawiny 6-(3'-(R)-myristyl)-FMN (myrFMN)7,8,9,10,1,12. Zidentyfikowano dodatkowe geny odpowiedzialne za syntezę ryboflawiny (np. ribEBH), a ponadto opisano geny regulacyjne, które odgrywają rolę w regulacji bioluminescencji poprzez mechanizm quorum sensing, szczególnie w przypadku Vibrio fischeri i Vibrio harveyi6,13. Mimo wysoce konserwatywnego uporządkowania genów, bakterie bioluminescencyjne wykazują duże zróżnicowanie w takich cechach jak dynamika wzrostu, intensywność emisji światła czy regulacja bioluminescencji2,5,14.
Znanych jest wiele zmodyfikowanych szczepów lub plazmidów zawierających fragmenty lub całe operony lux, które wykorzystują bioluminescencję jako systemy reporterowe. Opracowano różnorodne zastosowania, takie jak określanie aktywności promotora, monitorowanie zanieczyszczeń bakteryjnych w środowisku lub próbkach żywności, przeniesienie energii rezonansowej bioluminescencji (BRET), obrazowanie infekcji in vivo w organizmach eukariotycznych, pirosekwencjonowanie i inne15,16,17. Co ciekawe, trzy najczęściej stosowane bioluminescencyjne systemy reporterowe pochodzą z północnoamerykańskiego świetlika (Photinus pyralis), patogena jelitowego nicieni (Photorhabdus luminescens) oraz z meduzy Renilla reniformis. Żaden z tych systemów nie ma pochodzenia bakteryjnego, jednak wykorzystanie genów i operonów lux pochodzenia bakteryjnego budzi coraz większe zainteresowanie w badaniach stosowanych16. Rzadsze zastosowanie białek bioluminescencyjnych ze źródeł bakteryjnych wynika głównie z niższej stabilności i krótszego czasu trwania świecenia białek luminescencyjnych pochodzenia bakteryjnego, co może być związane z ich morskim środowiskiem naturalnym. Bakterie bioluminescencyjne z siedlisk morskich nie nadają się do hodowli w standardowych warunkach laboratoryjnych. Bakterie te wymagają specyficznych pożywek i warunków wzrostu, takich jak sztuczna woda morska oraz niższe temperatury wzrostu/inkubacji (np. 28 °C).
Aby uprościć porównanie charakterystyk operonu lux lub pojedynczych genów lux w różnych szczepach bakterii bioluminescencyjnych, niezbędna jest metoda standaryzacji ekspresji i analizy operonu lux. W związku z tym pojawił się pomysł zintegrowania całego operonu lux-rib z modelową bakterią badawczą Escherichia coli (E. coli). W tym celu montaż Gibsona okazał się użytecznym narzędziem do integracji wielu liniowych, nakładających się fragmentów w jednym wektorze ekspresyjnym bez konieczności stosowania specyficznych miejsc restrykcyjnych. Metoda ta jest również odpowiednia, gdy wstawki DNA są zbyt duże (np. P. mandapamensis 27561 luxCDABFEG-ribEBH; rozmiar operonu ~ 9 kb), aby można było je namnożyć za pomocą PCR. Operon lux można podzielić na wiele nakładających się fragmentów, a następnie złożyć w jeden plazmid ekspresyjny, po czym zweryfikowany sekwencyjnie produkt montażu można bezpośrednio przekształcić do odpowiedniego systemu E. coli w celu uzyskania wysokiej wydajności ekspresji białka18,19,20. Oprócz łatwej w obsłudze ekspresji genu lux w oparciu o E. coli, należało opracować prostą metodę łączącą rejestrację wzrostu komórek z emisją światła bioluminescencyjnego. Opisana tutaj metoda pozwala na pomiar in situ oraz korelację gęstości komórek i emisji światła bakterii bioluminescencyjnych.
Analiza genów lux, kolejności operonu lux oraz regulacji u różnych bakterii bioluminescencyjnych, z wykorzystaniem z jednej strony sztucznego bioluminescencyjnego układu E. coli zawierającego cały operon lux-rib szczepu P. mandapamensis 27561, a z drugiej strony nowo opracowanego testu z użyciem czytnika płytek, łączącego pomiar gęstości komórek i emisji światła in situ, pozwala na uzyskanie szerszej wiedzy na temat różnorodnych bakteryjnych układów lux. Ta fundamentalna charakterystyka i porównanie lucyferaz oraz enzymów powiązanych mogą doprowadzić do opracowania alternatyw dla istniejących systemów reporterowych o zwiększonej stabilności i aktywności.

<table><tbody><tr><td>NEBuilder Zestaw do klonowania DNA o wysokiej wierności New</td><td>England Biolabs Inc.</td><td>E2621S</td><td>dla 10 rxn dx.doi.org/10.17504/protocols.io.cwaxad</td></tr><tr><td>polimerazy fluzyjnej&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>F530S</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Polimeraza DNA o wysokiej wierności</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>GeneJet Genomic DNA Purififcation Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0721</td><td>do 50 enzymów</td></tr><tr><td>restrykcyjnych i buforu rxn (NcoI, XhoI)</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>R3193S/R0146S</td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV Żel i zestaw do czyszczenia PCR&nbsp;</td><td>Promega</td><td>A9282</td> do zestawu do ekstrakcji żelu DNA Monarch <td>250 rxn</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>#T1020S</td><td>dla 50 rxn</td></tr><tr><td>GeneJet Plasmid Miniprep Kit&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0503</td><td>do 250 rxn</td></tr><tr><td>GoTaq G2 DNA Polymerase</td><td>Promega</td><td>M7841</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka sensoblaska ze szklanym dnem</td> Czytnik płytek <td>Greiner Bio One</td><td>662892</td><td></td></tr><tr><td>FLUOStar Omega&nbsp;</td>Oprogramowanie <td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OPTIMA/Mars Analysis</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td>Wersja 2.20</td></tr><tr><td>Microsoft Excel 2010</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Multitron Standard Incubator</td><td>Shaker Infors AG</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in situ pomiar i korelacja gęstości komórek i emisji światła bakterii bioluminescencyjnych

In Situ Measurement and Correlation of Cell Density and Light Emission of Bioluminescent Bacteria

Istnieje znaczna liczba gatunków bakterii zdolnych do emitowania światła. Wszystkie mają ten sam klaster genów, a mianowicie operon luksa. Pomimo tego podobieństwa, bakterie te wykazują ekstremalne różnice w cechach, takich jak zachowanie wzrostu, intensywność emisji światła lub regulacja bioluminescencji. Przedstawiona tutaj metoda to nowo opracowany test, który łączy rejestrację wzrostu komórek i intensywności emisji światła bioluminescencyjnego w czasie przy użyciu czytnika płytek. Uzyskane w ten sposób charakterystyki wzrostu i emisji światła można powiązać z ważnymi cechami danego szczepu bakteryjnego, takimi jak regulacja quorum sensing. Hodowla różnych bakterii bioluminescencyjnych wymaga specjalnego podłoża (np. sztucznego podłoża z wodą morską) i określonych temperatur. Z drugiej strony, łatwa w obsłudze, niebioluminescencyjna bakteria Escherichia coli (E. coli) może być hodowana niedrogo w dużych ilościach na skalę laboratoryjną. Wykorzystanie E. coli poprzez wprowadzenie plazmidu zawierającego cały operon luksowy może uprościć warunki eksperymentalne, a dodatkowo otworzyć wiele możliwości dla przyszłych zastosowań. Ekspresję wszystkich genów lux wykorzystujących szczep ekspresyjny E. coli osiągnięto poprzez budowę plazmidu ekspresyjnego poprzez klonowanie Gibsona i wstawienie czterech fragmentów zawierających siedem genów lux i trzy geny żeber operonu lux-rib do wektora pET28a. Ekspresja genu lux oparta na E. coli może być indukowana i kontrolowana poprzez dodanie izopropylo-β-D-tiogalaktopiranozydu (IPTG), w wyniku czego powstają bioluminescencyjne komórki E. coli. Zaletą tego systemu jest unikanie ograniczeń regulacji quorum sensing i złożonych składów pożywek wraz z niestandardowymi warunkami wzrostu, takimi jak określone temperatury. System ten umożliwia analizę genów lux i ich wzajemnych oddziaływań, poprzez wykluczenie odpowiedniego genu z operonu luksowego, a nawet dodanie nowych genów, wymianę genów luxAB z jednego szczepu bakteryjnego na inny lub analizę kompleksów białkowych, takich jak luxCDE.

Kolejność genów w operonie lux - luxCDABFEG - jest wysoce konserwatywna w różnych szczepach2,5,14. Do projektu plazmidu wykorzystano informacje o sekwencji bioluminescencyjnego szczepu bakteryjnego Photobacterium mandapamensis 27561, zachowując tę samą kolejność genów oraz uwzględniając niekodujące sekwencje między poszczególnymi genami. Schematyczny przegląd zastosowanej strategii klonowania Gibsona przedstawiono na Rysunku 2. Wygenerowano łącznie cztery fragmenty: luxCDAB, luxF, luxEG oraz ribEBH, z nakładającymi się sekwencjami o długości 20 - 40 par zasad. Po wykonaniu wszystkich etapów montażu Gibsona20, sekwencjonowanie DNA potwierdziło prawidłowy montaż plazmidu, zawierający wszystkie fragmenty. Mapa wektora końcowego produktu montażu pET28a zawierającego operon lux-rib przedstawiona jest na Rysunku 3. Istotną zaletą tego zmodyfikowanego wektora pET28a jest możliwość wykorzystania zstandaryzowanych warunków hodowli E. coli oraz kontrolowanej indukcji za pomocą IPTG.
W celu pomiaru emisji światła bakterii bioluminescencyjnych oraz odpowiadającej im gęstości komórek opracowano metodę opartą na czytniku płytek. Metoda dla czytnika płytek została stworzona poprzez połączenie pojedynczych skryptów pomiarowych dla natężenia światła i gęstości komórek. Ten nowy skrypt umożliwił pomiar OD650 oraz natężenia światła co 10 min w określonym przez użytkownika przedziale czasowym, który musi zostać dostosowany do czasu generacji bakterii wykorzystywanych w danej analizie (np. 10 h). Pomiar gęstości optycznej przeprowadzono przy 650 nm, aby uniknąć interferencji z emisją światła. Jako dowód koncepcji oraz w celu zapewnienia żywotności i prawidłowego wzrostu komórek E. coli, wykonano pomiary referencyjne. Na Rysunku 4 przedstawiono porównanie komórek E. coli BL21, komórek E. coli BL21 zawierających pusty wektor pET28a oraz komórek E. coli BL21 zawierających wektor pET28a z insertem operonu lux-rib. W przypadku tego ostatniego szczepu nie dodawano IPTG, aby przeanalizować emisję światła wynikającą z nieszczelności promotora T7. Wszystkie trzy pomiary referencyjne wykazują sigmoidalną krzywą wzrostu z trzema fazami wzrostu (fazą adaptacyjną, wykładniczą i stacjonarną). Tylko komórki E. coli BL21 zawierające wektor pET28a z insertem operonu lux-rib zaczynają emitować światło, jednak w przeciwieństwie do pomiarów, w których ekspresja jest indukowana dodaniem IPTG i światło jest emitowane po 30 min, komórki nieindukowane zaczynają świecić dopiero po około 5 h i wykazują znacznie niższą emisję światła (ok. 4-krotnie) w porównaniu z systemem indukowanym.
Rysunek 5 przedstawia porównanie krzywych wzrostu i intensywności światła operonu lux wykazującego ekspresję w E. coli oraz bioluminescencyjnego szczepu bakteryjnego P. mandapamensis 27561, zarówno w podłożu LB, jak i w sztucznym podłożu wody morskiej, z zastosowaniem nowej, opracowanej metody in situ. Aby porównać te bakterie, pomiary przeprowadzono w temperaturze inkubacji 28 °C. Temperatura ta obniża tempo wzrostu zmodyfikowanego szczepu E. coli w podłożu LB, jak i w sztucznym podłożu wody morskiej, natomiast dla bioluminescencyjnych szczepów bakteryjnych niższe temperatury są kluczowe. Zależność ta od temperatury jest widoczna na Rysunku 5A, ponieważ P. mandapamensis 27561 wykazuje znacznie wyższą gęstość komórek niż E. coli. Ponadto, podczas gdy w przypadku szczepów E. coli podłoże LB pozwala na uzyskanie wyższych gęstości komórek, dla naturalnych bioluminescencyjnych szczepów bakteryjnych preferowane i niezbędne dla bioluminescencji jest sztuczne podłoże wody morskiej. Odnotowane gęstości komórek korelują z odpowiednimi intensywnościami światła, co pokazano na Rysunku 5B>. Warto zauważyć, że bioluminescencyjne komórki E. coli osiągają podobne maksima emisji światła zarówno w podłożu LB, jak i w sztucznym podłożu wody morskiej, choć najwyższe intensywności odnotowano w różnych punktach czasowych. W przeciwieństwie do tej obserwacji, P. mandapamensis 27561 przeżywa w podłożu LB przy znacznie zredukowanym tempie wzrostu, jednak komórki bakteryjne nie emitowały w ogóle światła (Rysunek 5B>). W sztucznym podłożu wody morskiej P. mandapamensis 27561 wykazuje maksimum emisji światła na poziomie około 1 x 104 zliczeń na sekundę, co jest niemal 20-krotnie niższą wartością niż w przypadku E. coli. Rysunek 5C przedstawia względne jednostki światła, w których bioluminescencja została znormalizowana względem OD. Wyniki te potwierdzają, że nie tylko wprowadzenie plazmidu zawierającego operon lux do E. coli przebiegło pomyślnie i było funkcjonalne, ale także, że ten zmodyfikowany szczep E. coli stanowi właściwą alternatywę z jeszcze wyższymi wydajnościami emisji światła i bez ograniczeń charakterystycznych dla bioluminescencji bakterii morskich, takich jak konieczność stosowania złożonego podłoża wody morskiej i niskich temperatur.
Dodatkowo, przeprowadzono długoterminowy pomiar ekspresji genu lux-rib w oparciu o E. coli w ciągu 24 h, aby przeanalizować trwałość emisji światła (Rysunek 6). Emisja światła trwała przez 19,5 h, znacznie dłużej niż w przypadku szczepów bakteryjnych (np. P. mandapamensis 27561), w których zaobserwowano stopniowy spadek, skutkujący bardzo niską emisją światła po 10 h.
Aby zilustrować ograniczenia opracowanego testu, Rysunek 7 przedstawia wyniki pomiarów trzech bioluminescencyjnych szczepów bakterii, mianowicie Photobacterium mandapamensis S1, Photobacterium mandapamensis TH1 oraz Vibrio harveyi 14126. W przypadku pierwszego szczepu (S1) metoda działa bardzo dobrze i wykazuje maksymalną intensywność bioluminescencji wynoszącą niemal 2 x 106. Dla pozostałych dwóch szczepów (TH1 i 14126) maksymalna intensywność światła nie mogła zostać określona, ponieważ generowana przez oba intensywność światła przekroczyła granicę detekcji dla zastosowanych ustawień urządzenia. Wartość wzmocnienia zdefiniowana dla opracowanej metody (skryptu) dla tych dwóch szczepów została ustawiona zbyt wysoko. Niemniej jednak, moment rozpoczęcia aktywności bioluminescencyjnej można ze sobą porównać. P. mandapamensis TH1 i P. mandapamensis S1 zaczynają świecić odpowiednio po około 1 h i przy wartości OD650 wynoszącej 0,1 – 0,2. W przeciwieństwie do nich, V. harveyi 14126 zaczyna emitować światło po około 5,5 h przy wartości OD650 wynoszącej 1,0. Obserwowany początek emisji światła towarzyszy wykładniczy wzrost OD, jak i bioluminescencji. Znane jest, że bioluminescencja V. harveyi 14126 podlega regulacji poprzez quorum sensing, a zatem wymaga specyficznej gęstości komórek umożliwiającej aktywację operonu lux, co można wyraźnie zaobserwować na Rysunku 713. Wynik ten wykazuje, że dzięki temu nowemu testowi z użyciem czytnika płytek in situ możliwe jest łatwe porównanie bakterii bioluminescencyjnych, a także wstępne określenie mechanizmu regulacyjnego tych szczepów poprzez ustalenie, czy można zaobserwować regulację typu quorum sensing.
Rysunek 8 przedstawia przykład kultury ekspresyjnej komórek E. coli BL21 zawierających zmontowany plazmid pET28a z operonem lux po indukcji IPTG. Około godziny po indukcji komórki E. coli zaczynają świecić na kolor niebiesko-zielony. Rysunek 8A przedstawia kulturę ekspresyjną E. coli sfotografowaną w świetle, a Rysunek 8B ukazuje tę samą kulturę w ciemności. Rysunek 8C przedstawia płytkę z agarem z pożywką z syntetycznej wody morskiej z P. mandapamensis S1 świecącymi w ciemności na ten sam niebiesko-zielony kolor charakterystyczny dla bakteryjnej bioluminescencji.
<img alt="Schemat edycji genów: etapy projektowania starterów, PCR, montażu Gibsona, transformacji plazmidowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57881/57881fig2v3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2Schematyczna reprezentacja zastosowanej strategii klonowania Gibsona. Krok (I): Projektuje się primery nakładające się (kolorowe strzałki; nakładanie się ok. 20–40 par zasad). Primery nakładające się zawierają sekwencje przyłączania składające się z odpowiednio regionu 5' i 3' jednego fragmentu oraz odpowiednio regionu 3' i 5' segmentu sąsiedniego. Krok (II): Projektowane fragmenty do składania są generowane za pomocą standardowych reakcji PCR. Krok (III): Wektor docelowy jest linearyzowany poprzez trawienie restrykcyjne (np. NcoI, XhoI). Krok (IV): Należy oznaczyć stężenia DNA wszystkich fragmentów oraz zlinearyzowanego wektora, aby dostosować ich stężenie zgodnie z wymogami metody Gibson assembly (zgodnie z protokołem producenta). Krok (V): Wszystkie fragmenty oraz zlinearyzowany wektor o zoptymalizowanych stężeniach DNA łączy się z mieszaniną reakcyjną do Gibson assembly (egzonukleaza T5, polimeraza DNA i ligaza DNA), a następnie inkubuje w temperaturze 50 °C przez 1 h. Krok (VI): Produkt zmontowany poddawano transformacji zgodnie ze standardowymi protokołami do odpowiedniej *E. coli* szczep do wysokowydajnej replikacji plazmidów (np. E. coli TOP10 lub XL-1). Krok (VII): Aby zweryfikować poprawność składania plazmidu, należy przeprowadzić sekwencjonowanie DNA złożonego plazmidu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57881/57881fig2v3large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat kolisty operonu lux w plazmidzie pET28a przedstawiający geny i promotory odpowiedzialne za ekspresję genów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57881/57881fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rycina 3Mapa wektora pET28a zawierająca lux-rib operon Ten lux-rib operon P. mandapamensis 27561 zostaje wprowadzony do wielokrotnego miejsca klonowania wektora pET28a w oryginalnej kolejności genów (luxCDABFEG-ribEBH). Do klonowania wykorzystano miejsca restrykcyjne NcoI i XhoI. Fragmenty wykorzystane do montażu operonu metodą Gibsona to luxCDAB na pomarańczowo, luxF na zielono, luxEG na niebiesko i ribEBH w kolorze lawendowym; geny w obrębie fragmentu przedstawiono jako oddzielne ramki. Sekwencje niekodujące pomiędzy poszczególnymi genami operonu zostały uwzględnione w zastosowanej strategii klonowania. Końcowy rozmiar plazmidu pET28a zawierającego cały lux-rib operon składa się z 14 625 par zasad. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57881/57881fig3v2large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Krzywe wzrostu mierzone gęstością optyczną i bioluminescencją; komórki BL21; analiza ekspresji białek; wykres." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57881/57881fig4v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rysunek 4: Porównanie krzywych wzrostu i intensywności światła szczepów referencyjnych. Wartość OD przy 650 nm oraz intensywność bioluminescencji w zliczeniach na sekundę mierzono co 10 min przez 10 h w 28 °CWszystkie pomiary stanowią wartości średnie z trzech powtórzeń biologicznych, z czterema powtórzeniami technicznymi dla każdego z nich. Słupki błędów reprezentują odchylenia standardowe. E. coli komórki BL21 (szare kwadraty), E. coli komórki BL21 zawierające pusty wektor pET28a (szare kółka), oraz E. coli komórki BL21 zawierające wektor pET28a z lux-rib analizowano wstawkę operonu (czarny romb), aby upewnić się, że wzrost naszych E. coli komórki <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57881/57881fig4v2large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykresy wzrostu i luminescencji bakterii; pomiary OD; LB i sztuczna woda morska; analiza optyczna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57881/57881fig5v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rycina 5Porównanie krzywych wzrostu i intensywności światła dla luks operon wykazujący ekspresję w E. coli (kwadraty) i *P. mandapamensis* 27561 (kółka) w pożywce LB (symbole otwarte) lub w sztucznej pożywce morskiej (symbole wypełnione). Wszystkie pomiary stanowią wartości średnie z trzech powtórzeń biologicznych, z czterema powtórzeniami technicznymi dla każdego z nich. Słupki błędów przedstawiają odchylenia standardowe. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono w temperaturze inkubacji wynoszącej 28 °C. (A) Pomiary gęstości optycznej (OD) przy 650 nm wykonywano co 10 min przez 10 h. lux E. coli ekspresję operonu (panel lewy) porównuje się z P. mandapamensis 27561 (prawy panel) w pożywce LB i sztucznej pożywce morskiej. Gęstość komórek wyznaczono przy 650 nm, aby uniknąć interferencji spowodowanej bioluminescencją. (B) Pomiar intensywności światła (bioluminescencja [impulsy/s]) przeprowadzano co 10 min przez 10 h. lux E. coli ekspresja operonu (panel lewy) jest porównana do P. mandapamensis 27561 (prawy panel) w pożywce LB i sztucznej pożywce morskiej. (C) Względne intensywności światła (RLU/OD) dla luks operon wyrażany w E. coli (panel lewy) oraz *P. mandapamensis* 27561 (prawy panel) wyznacza się poprzez normalizację bioluminescencji do gęstości komórek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57881/57881fig5v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykresy OD650, bioluminescencji oraz RLU/OD w funkcji czasu. Analiza bioluminescencji w czasie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57881/57881fig6v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6Porównanie krzywych wzrostu i natężeń światła dla E. coli na podstawie luks ekspresja genów przez 24 h. Wartość OD przy 650 nm oraz intensywność bioluminescencji w zliczeniach na sekundę mierzono co 10 min przez 24 h w 28 °CWszystkie pomiary stanowią wartości średnie z trzech powtórzeń biologicznych, z których każde obejmowało cztery powtórzenia techniczne. Słupki błędów przedstawiają odchylenia standardowe. Dodatkowo przedstawiono względne natężenia światła (RLU/OD), w których bioluminescencję znormalizowano względem gęstości komórek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57881/57881fig6v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza wzrostu bakterii i bioluminescencji, przedstawiająca OD, bioluminescencję oraz RLU/OD w czasie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57881/57881fig7v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7Porównanie bakterii bioluminescencyjnych w celu oceny potencjalnej regulacji poprzez quorum sensing. Emisję światła i gęstość komórek pomiarzono co 10 min przez 10 h; przedstawione dane stanowią wartości średnie z trzech powtórzeń biologicznych, z czterema powtórzeniami technicznymi dla każdego z nich. Słupki błędu reprezentują odchylenia standardowe. Pomiary *Photobacterium mandapamensis* TH1 (czarne kwadraty), Vibrio harveyi 14126 (szare kółka) i Photobacterium mandapamensis S1 (szare romby) porównano ze sobą; (A) przedstawia gęstość optyczną (OD) przy 650 nm, (B) natężenie światła (bioluminescencja [impulsy/s]) oraz (C) względne natężenie światła (RLU/OD). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57881/57881fig7v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Świecąca hodowla bakteryjna, eksperyment z fluorescencją, demonstracja bioluminescencji, kolba Erlenmeyera." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57881/57881fig8.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 8"> 
Rycina 8Bioluminescencja w podłożach płynnych i na płytkach z agarem. (A) kolba o pojemności 5 L z 2 L pożywki LB zaszczepiona E. coli komórki BL21 wykazujące ekspresję pET28a luks plazmid operonu sfotografowany w świetle. (B) Ta sama hodowla co w (A) sfotografowana w ciemności. Zdjęcia A i B wykonano około 2 h po indukcji ekspresji. (C) Szalka z agarem z pożywki sztucznej wody morskiej z posiewem kreśkowym *P. mandapamensis* S1 sfotografowano w ciemności. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57881/57881fig8large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>

Bakterie bioluminescencyjne regulują produkcję światła za pomocą różnych mechanizmów, takich jak quorum sensing. Ta nowatorska metoda pozwala na badanie in situ bioluminescencji i korelacji emisji światła z gęstością komórek. Sztuczny bioluminescencyjny system Escherichia coli pozwala na scharakteryzowanie operonów luksów, białek Lux i ich wzajemnych oddziaływań.

In Situ Pomiar i korelacja gęstości komórek i emisji światła bakterii bioluminescencyjnych

There is a considerable number of bacterial species capable of emitting light. All of them share the same gene cluster, namely the lux operon. Despite ...

Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie bioluminescencji. Takich jak znalezienie optymalnych warunków wzrostu dla maksymalnego natężenia światła bakterii bioluminescencyjnych i określenie mechanizmu regulacyjnego. Główną zaletą tej techniki jest łatwa konfiguracja, która może być stosowana do różnych szczepów i organizmów, a także proste i szybkie możliwości regulacji.Podążanie za tą metodą może zapewnić wgląd w charakterystykę operonu luksowego. Może być również stosowany w innych systemach, takich jak systemy bakteryjne, środowiskowe, raportowe lub czujniki. Na początek przygotuj hodowlę przez noc, zaszczepiając 100 mililitrów pożywki LB kanamycyną, komórkami E.coli BL21 przekształconymi w operon luksów z glicerolu lub bezpośrednio z płytki transformacyjnej.Inkubuj kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 120 obr./min przez noc. Następnego dnia zaszczepij 800 mililitrów pożywki kanamycyny LB 8 mililitrami nocnej kultury. Inkubuj kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 120 obr./min w wytrząsarce inkubatora, aż gęstość komórek osiągnie OD600 od 0,6 do 0,8.Zmniejsz temperaturę inkubacji do 28 stopni Celsjusza i indukuj ekspresję białka, dodając 0,1 milimolowego IPTG. Następnie obserwuj komórki, aż zaczną świecić. Po przygotowaniu pożywki zgodnie z protokołem tekstowym, szczepy bioluminescencyjne bakterii należy rozprowadzić na płytkach agarowych ze sztucznej wody morskiej i inkubować je w temperaturze od 24 do 30 stopni Celsjusza przez noc.Przygotuj kulturę na noc, zaszczepiając 100 mililitrów sztucznej pożywki z wodą morską pojedynczą kolonią z płytki. Następnie inkubuj kulturę w temperaturze od 24 do 30 stopni Celsjusza i 120 obr./min przez noc. Następnego dnia zaszczepij 800 mililitrów sztucznej pożywki z wodą morską za pomocą 8 mililitrów kultury przez noc.Inkubuj komórki bakteryjne w temperaturze od 24 do 30 stopni Celsjusza i 120 obr./min i obserwuj komórki, aż zaczną świecić. Umieść pożądany bioluminescencyjny szczep bakterii lub zmodyfikowany szczep E. coli na płytce agarowej i inkubuj kulturę w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez noc. Zaszczepić 3 mililitry pożywki pojedynczą kolonią z płytki nocnej i inkubować komórki w temperaturze 28 stopni Celsjusza i 180 obr./min przez około jedną do dwóch godzin.Zmierzyć gęstość komórek w rozcieńczeniu płynnej kultury w proporcji od 1 do 10 przy 650 nanometrach. Następnie oblicz stosunek i objętość na jeden mililitr kultury przy OD650 0,05. Odpipetować obliczoną objętość kultury i pożywki do 24-dołkowej płytki o czarnych ściankach ze szklanym dnem.Aby upewnić się, że wektor pET28a zawierający cały operon luksa nie zostanie utracony i który jest wyrażony w zmodyfikowanym szczepie E. coli, dodaj do próbek jeden mikrolitr kanamycyny i jeden mikrolitr IPTG. Następnie umieść pokrywkę na talerzu, aby uniknąć parowania podczas pomiarów. Na koniec użyj czytnika płytek ustawionego na 28 stopni Celsjusza i skryptu znajdującego się w protokole tekstowym, aby wykonywać pomiary absorbancji i bioluminescencji co 10 minut, z potrząsaniem między punktami danych.Rysunek ten porównuje pomiary OD650 komórek BL21 E. coli, komórek BL21 zawierających pusty wektor pET28a i komórek BL21 zawierających wektor pET28a z wkładką operonową lux-rib, ale bez indukcji. Wszystkie trzy pomiary referencyjne emisji światła pokazują sigmoidalną krzywą wzrostu z fazami wzrostu, wykładniczymi i stacjonarnymi, ale nie mają emisji światła, z wyjątkiem tej ostatniej próbki, która wykazuje emisję światła po 300 minutach, z powodu nieszczelności promotora T7. W tym przypadku porównano krzywe wzrostu i natężenie światła operonu luksa wyrażonego w E. coli i bioluminescencyjnym szczepie bakteryjnym, Photobacterium mandapamensis 27561, w temperaturze 28 stopni Celsjusza w LB, czyli sztucznym podłożu morskim.Zmodyfikowany szczep E.coli i P.mandapamensis rosną w sztucznym podłożu wody morskiej, a także w podłożu LB i oba wykazują emisję światła. Ale w pożywce LB P.Mandapamensis w ogóle nie emituje światła. Co ciekawe, zmodyfikowany szczep E. coli wykazuje wyższe maksymalne natężenie światła niż bakterie bioluminescencyjne.W tym eksperymencie ekspresję genów operonu lux-rib opartego na E.coli mierzono przez 24 godziny, aby przeanalizować jego długowieczność. Emisja światła trwała 19 i pół godziny, znacznie dłużej niż w przypadku szczepów bakteryjnych, gdzie obserwowano stopniowy spadek, co skutkowało bardzo niską emisją światła po 10 godzinach. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się bioluminescencją do badania operonów luksowych w organizmach modelowych, takich jak E. Coli.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak pracować z bakteriami bioluminescencyjnymi.

in-situ-measurement-correlation-cell-density-light-emission

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opisano metody obrazowania bioluminescencyjnego infekcji bakteryjnych u żywych zwierząt. Patogeny są modyfikowane w celu ekspresji lucyferazy, co umożliwia optyczne obrazowanie całego ciała w celu wykrycia infekcji u żywych zwierząt. Modele zwierzęce mogą zostać zainfekowane patogenami wykazującymi ekspresję lucyferazy, a wynikający z tego przebieg choroby może być wizualizowany w czasie rzeczywistym za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego.

Wykorzystanie lucyferazy do obrazowania infekcji bakteryjnych u myszy

Niniejszy artykuł opisuje podawanie myszom bakterii z markerem lux oraz późniejszą analizę in vivo z wykorzystaniem obrazowania bioluminescencyjnego IVIS.

Obrazowanie bakterii bioluminescencyjnych In vivo

Źródło: Brodl, E., et al. Pomiar in situ i korelacja gęstości komórek i emisji światła bakterii bioluminescencyjnych. J. Vis. Exp. (2018).Ten film pokazuje pomiar i korelację bioluminescencji z gęstością komórek w transformowanych bakteriach. Pojedyncza kolonia bakteryjna jest używana do zainicjowania płynnej kultury. Kulturę umieszcza się w studzience o pożądanym stężeniu komórek. Antybiotyk i induktor są dodawane w celu ekspresji genu wymaganego do bioluminescencji bakterii. Odczyty...

Test in vivo w celu skorelowania bioluminescencji bakteryjnej z gęstością komórek

Źródło: Brodl, E., et al. In Situ Pomiar i korelacja gęstości komórek i emisji światła bakterii bioluminescencyjnych. J. Vis. Exp. 1 (2018)Ten film demonstruje hodowlę morskich bakterii bioluminescencyjnych w celu obserwacji aktywacji operonu luminescencji za pośrednictwem quorum-sensing, umożliwiając monitorowanie w czasie rzeczywistym ekspresji genów i emisji światła na potrzeby badań nad komunikacją mikrobiologiczną i regulacją genów.

Ekspresja operonu luminescencyjnego w morskich bakteriach bioluminescencyjnych

Źródło: de Vries, C. R. i in., A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection. J. Vis. Exp. (2020).Ten film demonstruje bioluminescencyjną technikę obrazowania monitorującego postęp infekcji bakteryjnej na żywym modelu myszy. Bakterie patogenne opracowane z systemem raportu luxABCDE emitują światło w miejscu zakażenia, umożliwiając wizualizację bakterii aktywnych przemianownie. Obrazując mysz w czasie, naukowcy mogą nieinwazyjnie śledzić dynamikę infekcji i...

Bioluminescencja zakażeń bakteryjnych u myszy

Ten film prezentuje pomiar obciążenia bakteryjnego in vivo za pomocą Bacillus Calmette-Guérin, BCG, larw owadów zakażonych luksem. Proces obejmuje homogenizację larw, traktowanie substratem lucyferazy i pomiar bioluminescencji w celu określenia względnych jednostek światła, które korelują z obciążeniem bakteryjnym.

Pomiar obciążenia in vivo bakteriami eksprymującymi lucyferazy w larwie owada

Komórki ssaków wyrażające kasetę genu bioluminescencji bakteryjnej (luksy) wytwarzają światło autonomicznie. Wykazano, że uzyskana dynamika bioluminescencyjna po ekspozycji chemicznej odzwierciedla wpływ leczenia na wzrost i metabolizm komórek, dzięki czemu komórki te są niedrogim, ciągłym narzędziem do badań przesiewowych toksyczności w czasie rzeczywistym, które można łatwo dostosować do automatyzacji o wysokiej przepustowości.

Autonomicznie bioluminescencyjne komórki ssaków do ciągłego monitorowania cytotoksyczności w czasie rzeczywistym

Infekcje wywołane przez wielolekooporne (MDR) szczepy bakteryjne stały się poważnym zagrożeniem dla zdrowia publicznego, co spowodowało konieczność opracowania alternatywnych metod leczenia. Przedstawiamy protokół oceny skuteczności terapii przeciwdrobnoustrojowym światłem niebieskim (aBL) w zakażeniach MDR Acinetobacter baumannii w oparzeniach myszy za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego.

In vivo (in vivo) Badanie przeciwdrobnoustrojowej terapii światłem niebieskim w wielolekoopornych zakażeniach oparzeniami Acinetobacter baumannii przy użyciu obrazowania bioluminescencyjnego

Przedstawiono test bioluminescencji in vitro w celu określenia komórkowego rytmu dobowego w komórkach nabłonka sutka. Metoda ta wykorzystuje plazmidy reporterowe komórek ssaków eksprymujące zdestabilizowaną lucyferazy pod kontrolą promotora genu PERIOD 2. Można go dostosować do innych typów komórek w celu oceny specyficznego dla narządu wpływu na rytm okołodobowy.

In vitro Test bioluminescencji w celu scharakteryzowania rytmu okołodobowego w komórkach nabłonka sutka

Przedstawiono szczegółowy protokół mysiego modelu kolonizacji enterokwotocznej E. coli (EHEC) przy użyciu bakterii znakowanych bioluminescencyjnie. Wykrycie tych bioluminescencyjnych bakterii za pomocą nieinwazyjnego systemu obrazowania in vivo u żywych zwierząt może poszerzyć naszą obecną wiedzę na temat kolonizacji EHEC.

Wykrywanie enterokrwotocznej kolonizacji Escherichia coli u mysiego gospodarza za pomocą nieinwazyjnego systemu bioluminescencji in vivo

Genetycznie kodowana lucyferazy jest popularnym nieinwazyjnym raportem ekspresji genów. Zastosowanie zautomatyzowanego rejestratora ALLIGATOR do obrazowania podłużnego lucyferazy pod kątem gazu i temperatury umożliwia rejestrację podłużną komórek bioluminescencyjnych w szerokim zakresie warunków. Tutaj pokazujemy, w jaki sposób ALLIGATOR może być stosowany w kontekście badań nad rytmami okołodobowymi.

Elastyczny pomiar reporterów bioluminescencyjnych za pomocą zautomatyzowanego podłużnego obrazowania lucyferazy zoptymalizowanego pod kątem gazu i temperatury rejestratora (ALLIGATOR)

Poznaj metodę pomiaru bioluminescencji bakterii in situ przy użyciu szczepu E. coli z operonem lux. Technika umożliwia badanie mechanizmów regulacji światła i charakterystyki operonów w organizmach modelowych.

In Situ Pomiar i korelacja gęstości komórek i emisji światła bakterii bioluminescencyjnych

Przeglądaj więcej filmów