In Situ Pomiar i korelacja gęstości komórek i emisji światła bakterii bioluminescencyjnych
28 czerwca 2018
Bakterie bioluminescencyjne regulują produkcję światła za pomocą różnych mechanizmów, takich jak quorum sensing. Ta nowatorska metoda pozwala na badanie in situ bioluminescencji i korelacji emisji światła z gęstością komórek. Sztuczny bioluminescencyjny system Escherichia coli pozwala na scharakteryzowanie operonów luksów, białek Lux i ich wzajemnych oddziaływań.
Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie bioluminescencji. Takich jak znalezienie optymalnych warunków wzrostu dla maksymalnego natężenia światła bakterii bioluminescencyjnych i określenie mechanizmu regulacyjnego. Główną zaletą tej techniki jest łatwa konfiguracja, która może być stosowana do różnych szczepów i organizmów, a także proste i szybkie możliwości regulacji.
Podążanie za tą metodą może zapewnić wgląd w charakterystykę operonu luksowego. Może być również stosowany w innych systemach, takich jak systemy bakteryjne, środowiskowe, raportowe lub czujniki. Na początek przygotuj hodowlę przez noc, zaszczepiając 100 mililitrów pożywki LB kanamycyną, komórkami E.coli BL21 przekształconymi w operon luksów z glicerolu lub bezpośrednio z płytki transformacyjnej.
Inkubuj kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 120 obr./min przez noc. Następnego dnia zaszczepij 800 mililitrów pożywki kanamycyny LB 8 mililitrami nocnej kultury. Inkubuj kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 120 obr./min w wytrząsarce inkubatora, aż gęstość komórek osiągnie OD600 od 0,6 do 0,8.
Zmniejsz temperaturę inkubacji do 28 stopni Celsjusza i indukuj ekspresję białka, dodając 0,1 milimolowego IPTG. Następnie obserwuj komórki, aż zaczną świecić. Po przygotowaniu pożywki zgodnie z protokołem tekstowym, szczepy bioluminescencyjne bakterii należy rozprowadzić na płytkach agarowych ze sztucznej wody morskiej i inkubować je w temperaturze od 24 do 30 stopni Celsjusza przez noc.
Przygotuj kulturę na noc, zaszczepiając 100 mililitrów sztucznej pożywki z wodą morską pojedynczą kolonią z płytki. Następnie inkubuj kulturę w temperaturze od 24 do 30 stopni Celsjusza i 120 obr./min przez noc. Następnego dnia zaszczepij 800 mililitrów sztucznej pożywki z wodą morską za pomocą 8 mililitrów kultury przez noc.
Inkubuj komórki bakteryjne w temperaturze od 24 do 30 stopni Celsjusza i 120 obr./min i obserwuj komórki, aż zaczną świecić. Umieść pożądany bioluminescencyjny szczep bakterii lub zmodyfikowany szczep E. coli na płytce agarowej i inkubuj kulturę w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez noc. Zaszczepić 3 mililitry pożywki pojedynczą kolonią z płytki nocnej i inkubować komórki w temperaturze 28 stopni Celsjusza i 180 obr./min przez około jedną do dwóch godzin.
Zmierzyć gęstość komórek w rozcieńczeniu płynnej kultury w proporcji od 1 do 10 przy 650 nanometrach. Następnie oblicz stosunek i objętość na jeden mililitr kultury przy OD650 0,05. Odpipetować obliczoną objętość kultury i pożywki do 24-dołkowej płytki o czarnych ściankach ze szklanym dnem.
Aby upewnić się, że wektor pET28a zawierający cały operon luksa nie zostanie utracony i który jest wyrażony w zmodyfikowanym szczepie E. coli, dodaj do próbek jeden mikrolitr kanamycyny i jeden mikrolitr IPTG. Następnie umieść pokrywkę na talerzu, aby uniknąć parowania podczas pomiarów. Na koniec użyj czytnika płytek ustawionego na 28 stopni Celsjusza i skryptu znajdującego się w protokole tekstowym, aby wykonywać pomiary absorbancji i bioluminescencji co 10 minut, z potrząsaniem między punktami danych.
Rysunek ten porównuje pomiary OD650 komórek BL21 E. coli, komórek BL21 zawierających pusty wektor pET28a i komórek BL21 zawierających wektor pET28a z wkładką operonową lux-rib, ale bez indukcji. Wszystkie trzy pomiary referencyjne emisji światła pokazują sigmoidalną krzywą wzrostu z fazami wzrostu, wykładniczymi i stacjonarnymi, ale nie mają emisji światła, z wyjątkiem tej ostatniej próbki, która wykazuje emisję światła po 300 minutach, z powodu nieszczelności promotora T7. W tym przypadku porównano krzywe wzrostu i natężenie światła operonu luksa wyrażonego w E. coli i bioluminescencyjnym szczepie bakteryjnym, Photobacterium mandapamensis 27561, w temperaturze 28 stopni Celsjusza w LB, czyli sztucznym podłożu morskim.
Zmodyfikowany szczep E.coli i P.mandapamensis rosną w sztucznym podłożu wody morskiej, a także w podłożu LB i oba wykazują emisję światła. Ale w pożywce LB P.Mandapamensis w ogóle nie emituje światła. Co ciekawe, zmodyfikowany szczep E. coli wykazuje wyższe maksymalne natężenie światła niż bakterie bioluminescencyjne.
W tym eksperymencie ekspresję genów operonu lux-rib opartego na E.coli mierzono przez 24 godziny, aby przeanalizować jego długowieczność. Emisja światła trwała 19 i pół godziny, znacznie dłużej niż w przypadku szczepów bakteryjnych, gdzie obserwowano stopniowy spadek, co skutkowało bardzo niską emisją światła po 10 godzinach. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się bioluminescencją do badania operonów luksowych w organizmach modelowych, takich jak E. Coli.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak pracować z bakteriami bioluminescencyjnymi.
Przegląd
W niniejszym artykule omówiono metodę badania bakterii bioluminescencyjnych, koncentrując się na regulacji produkcji światła poprzez quorum sensing oraz na charakterystyce operonów lux w sztucznym systemie E. coli.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Bioluminescencja
- Genetyka drobnoustrojów
- Sygnalizacja komórkowa
Wstęp
- Bakterie bioluminescencyjne mogą emitować światło, które jest regulowane przez różne mechanizmy.
- Quorum sensing odgrywa kluczową rolę w produkcji światła.
- Zrozumienie operonów lux jest niezbędne do manipulowania bioluminescencją.
- Niniejsze badania można zastosować do różnych szczepów i organizmów.
Cel badania
- Ustalenie optymalnych warunków wzrostu dla bakterii bioluminescencyjnych.
- Określenie mechanizmów regulacyjnych produkcji światła.
- Przedstawienie informacji na temat charakterystyki operonu lux.
Zastosowane metody
- Przygotowanie nocnych kultur E. coli z operonami lux.
- Indukcja ekspresji białek przy użyciu IPTG.
- Pomiar emisji światła i gęstości komórek za pomocą czytnika płytek.
- Porównanie krzywych wzrostu i natężeń światła między zmodyfikowanymi szczepami E. coli a szczepami bioluminescencyjnymi.
Główne wyniki
- Zmodyfikowany szczep E. coli wykazywał wyższą intensywność światła niż naturalne bakterie bioluminescencyjne.
- Emisja światła z operonu lux trwała znacznie dłużej niż w przypadku szczepów bakteryjnych.
- Krzywe wzrostu wykazały wyraźne fazy z różną emisją światła.
- Metoda ta pozwala na łatwą konfigurację i dostosowanie do różnych organizmów.
Wnioski
- Technika ta pogłębia zrozumienie bioluminescencji w organizmach modelowych.
- Stanowi ona platformę do dalszych badań nad operonami lux.
- Przyszłe badania mogą wykorzystać tę metodę w różnych zastosowaniach w badaniach mikrobiologicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Metoda ta umożliwia ustandaryzowaną, ilościową ocenę funkcji operonu lux w zmodyfikowanych systemach mikrobiologicznych, wspierając walidację celów w biologii syntetycznej oraz opracowywanie biosensorów. Poprzez oddzielenie pomiaru bioluminescencji od natywnej regulacji quorum sensing, zapewnia ona kontrolowaną platformę do mechanistycznej minimalizacji ryzyka w przypadku konstruktów genetycznych. Podejście to pozwala na uzyskanie wiarygodnych prognoz dotyczących dynamiki ekspresji genów oraz funkcjonalności kompleksów białkowych, co dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania wczesnych decyzji go/no-go w procesach badawczych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie komponentów operonu lux oraz ich wzajemnych oddziaływań poprzez systematyczną delecję lub substytucję genów.
- Wartość operacyjna: Wspiera walidację funkcjonalną konstruktów genetycznych poprzez korelację emisji światła z gęstością komórek w warunkach kontrolowanej indukcji.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia ocenę tworzenia się kompleksów białkowych (np. LuxCDE) poprzez wykorzystanie stałej emisji światła jako odczytu funkcjonalnego.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Gotowość testu: Generuje powtarzalne dane luminescencji i OD650 rozdzielone w czasie, odpowiednie do adaptacji w badaniach wysokoprzepustowych.
- Wynik ilościowy: Dostarcza pomiarów ratiometrycznych (światło na komórkę), co umożliwia normalizację pomiędzy szczepami i warunkami.
- Ponowne wykorzystanie platformy: Tworzy modułowy system do testowania wariantów operonu lux lub ekspresji białek heterologicznych w E. coli.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Zapewnia system relewantny dla danej choroby do badania bakteryjnych szlaków sygnalizacyjnych w przypadku wykorzystania lux jako reportera w modelach infekcji.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Pozwala na wyizolowanie funkcji genu lux z natywnych sieci regulacyjnych, co zmniejsza niejednoznaczność w powiązaniach między fenotypem a genotypem.
- Pewność prognostyczna: Umożliwia podłużną ocenę stabilności ekspresji genów, co jest krytyczne dla oceny trwałości biosensorów.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum odkryć – od walidacji konstruktów genetycznych po opracowanie testów – umożliwiając iteracyjne cykle projektowania, budowy i testowania w celu optymalizacji biosensorów.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących funkcji genu lux oraz wpływu elementów regulacyjnych poprzez ekspresję indukowalną i monitorowanie w czasie rzeczywistym.
- Przesiewanie: Zapewnia ustandaryzowane, powtarzalne odczyty luminescencji kompatybilne z formatami płytek wielodołkowych do porównawczej oceny szczepów lub wariantów.
- Analityka: Dostarcza wyniki dwuparametrowe (OD650 i luminescencja), co pozwala na obliczenie specyficznych wskaźników emisji światła w celu ilościowego porównania.
- Badania translacyjne: Odnosi się do zastosowań przedklinicznych, gdy lux jest wykorzystywany jako reporter w obrazowaniu żywych komórek lub w modelach infekcji wymagających stabilnej emisji sygnału.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy skalowalną, indukowalną platformę opartą na E. coli, którą można zastosować w wielu projektach obejmujących charakterystykę obwodów genetycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną, umożliwiając bezpośrednią korelację modyfikacji genetycznej z ilościową emisją światła.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację testu poprzez zdefiniowane protokoły indukcji, kontrolę temperatury oraz normalizację ratiometryczną.
- Wartość strategiczna: Zwiększa pewność decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go), dostarczając wczesnych, ilościowych informacji na temat wydajności konstrukcji genetycznej.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację wariantów genetycznych skorygowaną o ryzyko, w oparciu o funkcjonalne profile emisji światła.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej w zakresie klonowania molekularnego, hodowli bakterii oraz obsługi czytnika płytek do jednoczesnego pomiaru absorbancji i luminescencji.
- Zależy od instrumentacji umożliwiającej zsynchronizowane wstrząsanie oraz cykle pomiaru absorbancji/bioluminescencji w kontrolowanej temperaturze.
- Wymaga standaryzacji poziomów indukcji IPTG oraz protokołów rozcieńczania OD650 pomiędzy użytkownikami i laboratoriami.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania metody przy rozszerzeniu jej na gospodarzy innych niż E. coli lub alternatywne systemy reporterowe.
- Ograniczony przez wymogi stabilności plazmidu, co necessitate stosowania selekcji antybiotykowej podczas pomiarów w celu zapobiegania utracie konstruktu.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Title
0:43
Expression of Modified E. coli Strains
1:41
Expression of Bacterial Bioluminescent Strain
2:27
In Vivo Activity Assay for Bacterial Bioluminescent Strains and Modified E. coli Strains
3:49
Results: Cell Density and Light Emission of lux Operon in E. coli
5:27
Conclusion
