Analiza ilościowa alternatywnego splicingu pre-mRNA w skrawkach mózgu myszy przy użyciu testu hybrydyzacji RNA in situ
August 26th, 2018
Opisano protokół hybrydyzacji in situ (ISH), który wykorzystuje krótkie oligonukleotydy antysensowne do wykrywania alternatywnych wzorców splicingu pre-mRNA w sekcjach mózgu myszy.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie alternatywnego splicingu pre-mRNA. W szczególności zapewnia solidny, czuły system testowy do badania alternatywnych wzorców łączenia in situ w wycinkach tkanki. Dzięki tej metodzie alternatywny splicing może być analizowany jednocześnie w wielu podtypach, które są zawarte w złożonych strukturach biologicznych, takich jak mózg myszy.
Główną zaletą tej techniki jest to, że wykorzystuje ona antystatyczne sondy złączowe eksonów w hybrydyzacji mRNA in situ w celu wytworzenia sygnałów hybrydyzacji specyficznych dla izoformy. Technologia wzmacniania sygnału budowlanego zwiększa czułość detekcji, aby zapewnić solidne sygnały hybrydyzacji. Wykryte sygnały polegały na włączeniu eksonów uciekającym przed określonymi sondami, które są używane do obliczania procentowego splicingu w parametrach życiowych w różnych anatomicznych obszarach mózgu myszy.
W tym badaniu ekson 23a NF1 jest używany jako przykład ilustrujący zastosowanie systemu testowego. System można jednak dostosować do analizy wzorców ekspresji wielu alternatywnych eksonów. Aby rozpocząć parafinowanie sekcji D mózgu myszy, napełnij dwie naczynia do mycia 250 mililitrami ksylenu.
I kolejne dwa z 250 mililitrami 100% etanolu w dygestorium. Włóż szkiełka chusteczek do stojaka do mycia. Następnie umieść ruszt do mycia w naczyniu zawierającym ksylen i inkubuj przez pięć minut, przesuwając ruszt w górę iw dół co najmniej trzy razy, a następnie powtórz z drugim naczyniem z ksylenem.
Następnie umieść ruszt w naczyniu zawierającym etanol i inkubuj przez dwie minuty, wykonując te same ruchy w górę iw dół, a następnie powtórz z drugim naczyniem na etanolu. Aby wysuszyć szkiełka, przesuń ruszt z drugiego naczynia na etanol i umieść go w inkubatorze w temperaturze 60 stopni Celsjusza na pięć minut. Użyj hydrofobowego pisaka barierowego, aby narysować barierę o wymiarach 0,75 cala na 0,75 cala wokół sekcji tkanki i suszyć na powietrzu przez trzy minuty w temperaturze pokojowej.
Włącz piekarnik do hybrydyzacji i ustaw temperaturę na 40 stopni Celsjusza. Po całkowitym zwilżeniu papieru nawilżającego wodą destylowaną umieść go na tacy kontrolującej wilgotność. Następnie włóż tackę kontrolującą wilgotność do pieca do hybrydyzacji.
Po umieszczeniu wysuszonych szkiełek na ławce, całkowicie przykryj skrawki tkanki na każdym szkiełku pięcioma do ośmiu kroplami roztworu nadtlenku wodoru. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Postukaj szkiełkami w chłonny papier, pojedynczo, aby usunąć roztwór nadtlenku wodoru i włóż szkiełka do stojaka do mycia.
Zanurz ruszt w naczyniu do mycia zawierającym wodę, przesuwając go w górę i w dół trzy do pięciu razy, aby umyć szkiełka. Napełnij litrową szklaną zlewkę umieszczoną na gorącej płycie 700 mililitrami 1X zabiegu usuwania celu i przykryj folią. Włóż termometr przez foliową pokrywę i włącz płytę grzejną, ustaw wysoką temperaturę na 10 do 15 minut.
Gdy temperatura odczynnika do pobierania osiągnie 98 stopni Celsjusza, ustaw płytę grzejną na niską temperaturę, aby utrzymać łagodny stan wrzenia. Następnie ostrożnie zdejmij folię i umieść ruszt w zlewce. Przykryj zlewkę folią i inkubuj przez 15 minut.
Za pomocą kleszczy przenieś ruszt ze zlewki do naczynia do mycia zawierającego 200 mililitrów wody destylowanej i inkubuj przez 15 sekund. Po 15 sekundach umieść ruszt w naczyniu myjącym zawierającym 100% etanolu i inkubuj przez trzy minuty. Zdejmij ruszt z naczynia i susz w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 10 minut.
Po umieszczeniu szkiełek na stojaku na plamy, przykryj skrawki tkanki pięcioma kroplami proteazy 3 na szkiełko. Ostrożnie umieść ruszt na tacy kontrolującej wilgotność i włóż tacę do pieca do hybrydyzacji i inkubuj w temperaturze 40 stopni Celsjusza przez 30 minut. Po wyjęciu kosza z tacki postukaj w szkiełka, aby usunąć nadmiar płynu i włóż je do kosza do mycia.
Umieść ruszt w naczyniu do mycia zawierającym wodę destylowaną i przesuń ruszt w górę iw dół trzy do pięciu razy, aby umyć szkiełka. Aby przygotować się do hybrydyzacji in situ, inkubuj sondy i odczynniki AMP w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Włóż tackę kontrolującą wilgotność do piekarnika do hybrydyzacji i ustaw na 40 stopni Celsjusza.
W celu hybrydyzacji sondy wyjmij szkiełka z rusztu do mycia i postukaj w nie, aby usunąć nadmiar płynu. Umieść szkiełka na stojaku na plamy. Użyj ołówka, aby oznaczyć slajdy nazwą sondy.
Umieść trzy przylegające do siebie szkiełka tkanki mózgowej, które mają zostać zhybrydyzowane z trzema różnymi sondami mitozy włókien nerwowych typu pierwszego. Ponieważ istnieją bardzo różne sondy specyficzne dla izoformy, używam przylegających do siebie ciętych odcinków tkanki. Bardzo ważne jest, aby te sekcje były traktowane dokładnie tak samo na etapach hybrydyzacji, amplifikacji i wykrywania sygnału, aby zapewnić dokładność procentowego splotu w obliczeniach.
Przykryj skrawki tkanki czterema kroplami sondy na sekcję, po jednym szkiełku na raz, aby zapobiec wysuszeniu skrawków. Następnie umieść stojak na plamy na tacy kontrolującej wilgotność i włóż go do piekarnika o temperaturze 40 stopni Celsjusza na dwie godziny. Następnie umieść ruszt do mycia w naczyniu do mycia wypełnionym 200 mililitrami bufora do mycia 1X.
Następnie stuknij każdy slajd, pojedynczo w ręcznik papierowy, aby usunąć nadmiar płynu. I natychmiast włóż każdy szkiełko do kosza do prania. Inkubować w temperaturze pokojowej przez dwie minuty w naczyniu wypełnionym świeżym buforem do mycia, przesuwając ruszt w górę iw dół trzy do pięciu razy, a następnie powtórzyć mycie w nowym naczyniu.
Aby wzmocnić sygnał, dotknij każdego slajdu, aby usunąć nadmiar bufora do prania i umieść je na stojaku na plamy. Pokryj sekcję tkanki na każdym szkiełku czterema kroplami odczynnika AMP zero. Następnie umieść ruszt na tacy kontrolującej wilgotność, włóż blachę do piekarnika i inkubuj w temperaturze 40 stopni Celsjusza przez 30 minut.
Umyj szkiełko dwukrotnie buforem do mycia, tak jak poprzednio w tym eksperymencie. Powtórz krok wzmacniania sygnału za pomocą odczynników AMP od jednego do sześciu, zgodnie z opisem w protokole tekstowym, a po każdym kroku umyj szkiełka. W celu wykrycia sygnału usuń nadmiar bufora myjącego ze szkiełek, stukając i umieszczając je na stojaku na plamy.
Następnie wymieszaj dwa mikrolitry szybkiej czerwieni B ze 120 mikrolitrami szybkiej czerwieni A w mikroprobówce wirówkowej. Dodaj roztwór do odcinków tkanek na każdym szkiełku, aby całkowicie je pokryć. Umieść stojak na plamy na tacy do kontroli wilgotności, przykryj tackę i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
Następnie usuń roztwór i włóż szkiełka do stojaka do mycia. Umieść ruszt w naczyniu do mycia zawierającym wodę z kranu, aby umyć szkiełka i powtórz pranie. Po drugim praniu postukaj w chłonny papier, aby usunąć nadmiar wody.
Następnie umieść ruszt w naczyniu zawierającym 50% roztwór barwiący hematoksylinę. Przesuń stojak kilka razy w górę iw dół. I inkubować przez dwie minuty w temperaturze pokojowej.
Przenieś ruszt do naczynia do mycia zawierającego wodę z kranu. Przesuń ruszt pięć razy w górę i w dół i powtarzaj pranie, aż szkiełka staną się przezroczyste, a skrawki chusteczki pozostaną fioletowe. Następnie przenieś ruszt do naczynia zawierającego 0,02% wody amoniakalnej.
Przesuń stojak w górę i w dół dwa do czterech razy, aż sekcje zmienią kolor na niebieski. Umyj szkiełka wodą z kranu trzy do pięciu razy w naczyniu do barwienia. Następnie umieść stojak w inkubatorze i inkubuj przez 15 minut w temperaturze 60 stopni Celsjusza, aby wysuszyć szkiełka.
Po całkowitym wyschnięciu dodaj jedną kroplę podłoża montażowego na każde szkiełko, aby przykryć plasterek. Następnie ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe o wymiarach 24 na 50 milimetrów na odcinkach tkanki na każdym szkiełku. Po wysuszeniu szkiełek na powietrzu przez 30 minut w temperaturze pokojowej przystąp do zbierania danych.
Aby obliczyć procent splicingu lub wartość PSI dla eksonu 23a, zlicza się liczbę komórek i kropek w trzech podregionach kory i hipokampa CA3. Test hybrydyzacji RNA in situ przeprowadza się w sekcjach mózgu myszy typu dzikiego CD1 przy użyciu trzech różnych sond specyficznych dla NF1. Czerwone kropki punktowe obserwowane w sekcjach kory mózgowej i hipokampa wskazują na pozytywne sygnały przez sondy całkowite NF1, specyficzne dla włączenia i pomijające specyficzne sondy.
Sygnały ISH z trzech sond są następnie zliczane i wykorzystywane do obliczenia PSI. Test hybrydyzacji RNA in situ przeprowadza się w korze myszy C57 z czarnym 6J typu dzikiego i czarnych myszy z mutacją C57 6J, w których ekson 23a jest zawarty we wszystkich typach komórek. Czerwone kropki punktowe obserwowane w korze czarnych myszy typu dzikiego C57 6J wskazują na pozytywne sygnały przez całkowitą liczbę NF1, specyficzne dla inkluzji i pomijanie specyficznych sond.
U myszy z mutacją C57 Black 6J podobne sygnały uzyskuje się za pomocą sond całkowitych NF1 i specyficznych dla inkluzji. Jednak żaden sygnał nie jest wykrywany, gdy używana jest pominięcie określonej sondy, co wskazuje, że dwie sondy ukierunkowane na włączenie lub pominięcie eksonów są wysoce specyficzne. Ponieważ wielokolorowe etykietowanie na tych samych szkiełkach tkankowych nie jest jeszcze dostępne dla tej procedury, na różnych szkiełkach tkankowych stosuje się różne sondy.
Aby uzyskać dokładne wartości procentowe łączenia, ważne jest, aby używać przylegających do siebie suwaków i traktować suwaki w dokładnie taki sam sposób podczas całej tej procedury. Uzupełnieniem tej procedury są pomiary, takie jak immunohistochemia, które można wykonać, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące lokalizacji i funkcji izoform splicingu o zróżnicowanej ekspresji.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł opisuje protokół hybrydyzacji in situ (ISH) wykorzystujący krótkie oligonukleotydy antysensowe do wykrywania alternatywnych wzorców splajsowania pre-mRNA w sekcjach mózgu myszy. Ta metoda pozwala na jednoczesną analizę wzorców splajsowania w różnych podtypach w złożonych strukturach biologicznych.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Genetyka
- Biologia molekularna
Tło
- Alternatywne splajsowanie pre-mRNA jest kluczowe dla generowania różnorodności białek.
- Zrozumienie wzorców splajsowania może dostarczyć wglądu w funkcjonowanie i zaburzenia mózgu.
- Techniki hybrydyzacji in situ są niezbędne do badania splajsowania w kontekście tkankowym.
- To badanie koncentruje się na sekcjach mózgu myszy, aby zbadać wariacje splajsowania.
Cel badania
- Opracowanie wrażliwego testu na wykrywanie alternatywnego splajsowania in situ.
- Analiza wzorców splajsowania w różnych regionach mózgu.
- Zgłębienie zrozumienia mechanizmów splajsowania w mózgu.
Stosowane metody
- Hybrydyzacja in situ z użyciem krótkich oligonukleotydów antysensowych.
- Sondy antystatyczne przeciwko złączom ekonowym dla sygnałów specyficznych dla izoform.
- Technologia wzmacniania sygnału w celu zwiększenia czułości wykrywania.
- Analiza zawartości eksonów i procentów splajsowania w różnych obszarach anatomicznych.
Główne wyniki
- Silne sygnały hybrydyzacji zostały osiągnięte za pomocą opracowanej metody.
- Alternatywne wzorce splajsowania zostały pomyślnie wykryte w sekcjach mózgu myszy.
- Technika pozwala na jednoczesną analizę wielu zdarzeń splajsowania.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia złożoności splajsowania w tkankach nerwowych.
Wnioski
- Protokół ISH zapewnia cenне narzędzie do badania alternatywnego splajsowania.
- Wyniki zwiększają wiedzę na temat mechanizmów splajsowania w mózgu.
- Ta metoda może ułatwić dalsze badania nad splajsowaniem związanymi z warunkami neurologicznymi.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This method enables spatially resolved quantification of alternative splicing events in complex tissues, addressing a critical gap in target validation where bulk RNA approaches mask cellular heterogeneity. By providing isoform-specific signals at single-cell resolution in anatomically defined brain regions, it supports mechanistic de-risking of splicing-dependent targets in neuroscience drug discovery. The ability to calculate percent spliced in (PSI) values from exon inclusion and skipping signals offers a quantitative, reproducible metric for assessing target engagement and pathway modulation in preclinical models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking specific splice isoforms to cell-type-specific expression patterns in disease-relevant brain regions.
- Operational Value: Provides a robust, sensitive assay system for examining alternative splicing patterns in situ within tissue slices, reducing reliance on dissociated cell models that lose spatial context.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Uses shock anti-static exon junction probes to generate isoform-specific hybridization signals, enabling simultaneous analysis of multiple subtypes within complex biological structures.
- Operational Value: Signal amplification technology increases detection sensitivity, producing robust signals suitable for quantitative imaging and automated analysis workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates disease-relevant system analysis by mapping splicing patterns across anatomical areas such as cortex and hippocampus, supporting biomarker discovery for neuropsychiatric indications.
- Operational Value: Enables parallel processing of adjacently cut tissue sections under identical conditions, ensuring data accuracy for cross-sectional comparisons in preclinical studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery biology phase, where spatially resolved splicing data informs target selection and mechanistic understanding before assay development for high-throughput screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by revealing cell-type-specific alternative splicing patterns that may be obscured in bulk tissue analyses.
- Screening: Generates quantitative, spatially resolved readouts (e.g., PSI values) that can inform assay design for splicing-modulating compounds.
- Analytics: Enables calculation of percent spliced in from exon inclusion and skipping signal counts, providing a normalized metric for comparing conditions across brain regions.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity by validating splicing changes in anatomically defined regions relevant to disease models.
- Enterprise Reuse: The probe-based approach is adaptable to multiple alternative exons, positioning it as a reusable platform for splicing analysis across diverse targets and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking specific splice isoforms to defined anatomical locations, increasing confidence in target-disease relationships.
- Operational Value: Standardized protocol with built-in controls (e.g., adjacently cut slides, identical processing) enhances reproducibility across sites and users.
- Strategic Value: Supports better go/no-go decisions by providing spatially resolved efficacy and mechanism data early in the discovery pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated splicing expression in disease-relevant neural circuits.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA in situ hybridization, tissue sectioning, and quantitative image analysis for punctate dot counting.
- Dependent on hybridization ovens, humidity control trays, and reagent systems for probe hybridization, signal amplification, and detection (e.g., Fast Red).
- Necessitates standardization across teams for slide preparation, probe incubation, and washing steps to ensure comparability of PSI calculations.
- Adaptation to new exons requires design and validation of exon junction-specific probes, with sensitivity to target sequence accessibility.
- Practical limitation: Multi-color labeling is not currently available, requiring sequential analysis on separate slides, which increases tissue sectioning and processing demands.
