Name: Analiza ilościowa alternatywnego splicingu pre-mRNA w skrawkach mózgu myszy przy użyciu testu hybrydyzacji RNA in situ (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Poznaj metodę hybrydyzacji RNA in situ do analizy alternatywnego splicingu pre-mRNA w tkankach mózgu myszy. Technika wykorzystuje krótkie sondy antysensowne i wzmacnianie sygnału do wykrywania wzorców splicingu w różnych regionach anatomicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez American Heart Association [Grant-in-Aid 0365274B to H.L.], National Cancer Institute [GI SPORE P50CA150964 to Z.W.], National Institutes of Health [Office of Research Infrastructure Shared Instrumentation Grant S10RR031845 dla Light Microscopy Imaging Facility na Case Western Reserve University] oraz China Scholarship Council [dla X.G.]. 
Autorzy dziękują Richardowi Lee z Light Microscopy Imaging Core za jego pomoc w skanowaniu preparatów.

Wszystkie opisane tutaj eksperymenty z udziałem myszy zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Case Western Reserve. Tytuł protokołu 2016-0068 (PI: Hua Lou) brzmi "Rola alternatywnego splicingu pre-mRNA w rozwoju kręgowców".
UWAGA: Informacje o wszystkich urządzeniach, odczynnikach i materiałach użytych w tym protokole są zawarte w Tabeli Materiałów.
1. Przygotuj sekcje z zatopioną parafiną (FFPE) z formaliną
<ol>
	<li>Poddaj eutanazji 1 mysz CD1 i 1 mysz C57BL/6J przez zwichnięcie szyjki macicy. Ostrożnie rozetnij czaszkę nożyczkami chirurgicznymi i kleszczami. Usuń mózg za pomocą miarki. 
	UWAGA: Użyto 5-miesięcznych samców myszy CD1 i 3-miesięcznych samców myszy C57BL / 6J i wykazano podobne wyniki.
	<ol>
		<li>Umyj mózg PBS. Utrwal cały mózg roztworem zawierającym 10% formaliny w temperaturze pokojowej (RT) przez 30 godzin, umieszczając cały mózg w 50 ml roztworu formaliny.</li>
		<li>Zmień roztwór utrwalający na PBS i inkubuj mózg w PBS przez noc w temperaturze 4 °C. Odwodnić i zanurzyć mózg w ksylenie i parafinie przy użyciu standardowych procedur18.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Za pomocą mikrotomu pociąć osadzoną tkankę na odcinki o wielkości 5 μm. Umieść wstęgę parafinową najpierw w łaźni wodnej RT, a następnie w łaźni wodnej o temperaturze 45 °C, aby rozprowadzić wstążkę.
	<ol>
		<li>Gdy zmarszczki i fałdy wstążki znikną, natychmiast zamontuj sekcje na szkiełkach szkiełkowych. Szkiełka suszyć na powietrzu przez noc w temperaturze pokojowej w temperaturze pokojowej. Przed użyciem piec szkiełka przez 1 godzinę w temperaturze 60 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Wstępna obróbka próbki
<ol>
	<li>Odparafinować skrawki tkanek. Wykonaj te czynności w dygestorium.
	<ol>
		<li>Napełnij dwie naczynia do mycia (<klasa silna="xfig">Rysunek 1A) 250 ml świeżego ksylenu i dwie 250 ml 100% etanolu. Włóż szkiełka do mycia tkanek do stojaka do mycia (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A) i umieść ruszt do mycia naczyń zgodnie z kolejnością i czasem inkubacji wskazanym w Tabeli 1.</li>
		<li>Podczas każdej inkubacji podnoś ruszt do mycia w górę i w dół więcej niż 3 razy w naczyniu do mycia. Po każdej inkubacji szybko przenieś ruszt do mycia do następnego naczynia do mycia, aby zapobiec wysychaniu skrawków tkanki.</li>
		<li>Po wykonaniu etapów inkubacji wyjmij z naczynia do mycia ruszt ze szkiełkami. Umieść ruszt w inkubatorze o temperaturze 60 °C na 5 minut lub do momentu, gdy szkiełka całkowicie wyschną.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Narysuj barierę o wymiarach 0,75 x 0,75 cala otaczającą wycinek tkanki za pomocą hydrofobowego pisaka barierowego. Suszyć barierę na powietrzu przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wstępne traktowanie plasterków
	<ol>
		<li>Przygotowanie odczynników i sprzętu
		<ol>
			<li>Włącz piec do hybrydyzacji (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1B) i ustaw temperaturę na 40 °C na 30 minut przed użyciem.</li>
			<li>Całkowicie zwilż papier nawilżający (<silna klasa="xfig">Rysunek 1E) wodą destylowaną i umieść go na tacy kontroli wilgotności (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D, po lewej). Trzymaj tackę kontrolną wilgotności w piecu do hybrydyzacji.</li>
			<li>Przygotuj 700 ml świeżych 1x odczynników do odzyskiwania celu, dodając 630 ml dH2O do 70 ml 10 odczynników do odzyskiwania celu.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zastosuj nadtlenek wodoru.
		<ol>
			<li>Połóż odparafinowane szkiełka na ławce. Dodaj 5-8 kropli nadtlenku wodoru do sekcji, aby całkowicie pokryć tkankę. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
			<li>Postukaj w szkiełka na kawałku chłonnego papieru, aby usunąć roztwór nadtlenku wodoru, po jednym szkiełku na raz. Natychmiast włóż szkiełko do kosza do mycia i przenieś kosz do naczynia do mycia wypełnionego dH2O.</li>
			<li>Umyj szkiełka, przesuwając ruszt w górę iw dół w wodzie destylowanej 3–5 razy. Przenieś kosz do mycia do naczynia do mycia wypełnionego świeżą wodą destylowaną i jeszcze raz umyj szkiełka.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wykonywanie pobierania celu
		<ol>
			<li>Umieść szklaną zlewkę o pojemności 1 000 ml na płycie grzejnej. Dodaj 700 ml świeżych 1x odczynników do odzyskiwania celu do zlewki i przykryj folią. Włóż termometr do zlewki przez foliową pokrywę (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C). Włącz płytę grzejną i ustaw na wysokich obrotach na 10–15 minut.</li>
			<li>Gdy temperatura pobieranych odczynników osiągnie 98 °C, przełącz regulator temperatury płyty grzejnej z wysokiej na niską, aby utrzymać łagodne wrzenie. Nie gotować dłużej niż 15 minut.</li>
			<li>W międzyczasie ostrożnie otwórz folię i włóż stojak do mycia z plastrami do środka regenta. Ponownie przykryj zlewkę i inkubuj przez 15 minut.</li>
			<li>Za pomocą kleszczyków wyjmij ruszt ze zlewki do naczynia do mycia wypełnionego 200 mldH2Oi płucz przez 15 sekund.</li>
			<li>Przenieś ruszt do naczynia myjącego zawierającego 100% świeżego etanolu i odstaw na 3 minuty. Wyjmij szkiełka i susz je w inkubatorze o temperaturze 60 °C przez 10 minut.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zastosuj proteazę III
		<ol>
			<li>Umieść szkiełka na stojaku na plamy (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 1D, po prawej). Dodaj 5 kropli proteazy III, aby pokryć tkankę. Ostrożnie umieść ruszt na tacy do kontroli wilgotności (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D, po lewej) i włóż tacę do pieca hybrydyzacyjnego o temperaturze 40 °C. Inkubować przez 30 minut.</li>
			<li>Wyjmij ruszt przesuwny i włóż blachę z powrotem do piekarnika. Stukaj w szkiełka, aby usunąć nadmiar płynu, po jednym slajdzie na raz. Włóż szkiełko do kosza do mycia i umieść kosz w naczyniu do mycia wypełnionym dH2O. Przesuwaj ruszt w górę i w dół, aby umyć szkiełka 3-5 razy.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Test ISH
<ol>
	<li>Przygotowanie materiałów
	<ol>
		<li>Wstępnie podgrzej 50-krotny bufor do płukania w inkubatorze o temperaturze 40 °C przez 20 minut. Wymieszaj 2,94 l dH2O i 60 ml 50 razy buforu do płukania, aby uzyskać 1 x bufor do płukania.</li>
		<li>Przygotować 50% roztwór do barwienia hematoksyliny, dodając 100 ml hematoksyliny Gilla I do 100 mldH2O. Przygotować 0,02% (w/v) wody amoniakalnej, dodając 1,43 ml 1 N wodorotlenku amonu do 250 ml dH2O. Dobrze wymieszać w pojemniku.</li>
		<li>Umieść sondy i odczynniki AMP 0–6 w temperaturze RT 30 minut przed użyciem. Tackę do kontroli wilgotności należy przechowywać w piecu do hybrydyzacji o temperaturze 40 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Procedura ISH 
	UWAGA: Aby zbadać ekspresję izoform splicingu Nf1 i obliczyć wartość procentu splicingu (PSI) dla eksonu 23a, stosuje się trzy różne sondy ISH, które celują w izoformę zawartą w eksonie 23a, izoformę wykluczoną z eksonu 23a lub obie izoformy (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2). Sondy stosuje się na przylegających do siebie wycinkach tkanek. Aby zapewnić dokładność obliczeń, bardzo ważne jest, aby trzy sekcje tkanki były traktowane dokładnie tak samo na etapach hybrydyzacji, amplifikacji i wykrywania sygnału.
	<ol>
		<li>Hybrydyzacja sondy.
		<ol>
			<li>Wyjmij szkiełka z rusztu do mycia i strzepnij nadmiar płynu ze szkiełek. Umieść szkiełka w stojaku na plamy.</li>
			<li>Użyj ołówka, aby oznaczyć slajdy nazwą sondy. Umieść trzy przylegające do siebie szkiełka tkanki mózgowej, które mają być hybrydyzowane z trzema różnymi sondami Nf1 (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2) razem. Wykonaj kolejne kroki w tej samej kolejności slajdów.</li>
			<li>Dodaj 4 krople sondy, aby pokryć tkankę. Rób to po jednym slajdzie na raz, aby zapobiec wysychaniu sekcji. Umieść stojak na plamy na tacy kontroli wilgotności i wstaw go do piekarnika o temperaturze 40 °C na 2 godziny.</li>
			<li>Umyj szkiełka dwukrotnie buforem myjącym. Przy każdym praniu napełnij naczynie do barwienia 200 ml 1x bufora do mycia i umieść w nim ruszt do mycia. Postukaj nadmiarem płynu w ręcznik papierowy po jednym szkiełku na raz i szybko włóż go do kosza do prania. Przesuwaj ruszt przesuwny w górę iw dół w naczyniu 3–5 razy przez 2 minuty przy temperaturze pokojowej.</li>
			<li>Do drugiego prania użyj świeżego bufora do mycia.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wzmocnienie sygnału.
		<ol>
			<li>Postukaj w nadmiar bufora do mycia ze szkiełek i umieść je w stojaku na plamy. Dodaj 4 krople AMP 0, aby pokryć tkankę. Umieść stojak na plamy na tacce kontroli wilgotności i wstaw go do piekarnika na 30 minut w temperaturze 40 °C.</li>
			<li>Umyj szkiełka dwukrotnie buforem myjącym, jak opisano powyżej.</li>
			<li>Powtórz ten krok z AMP 1–6, postępując zgodnie z kolejnością i warunkiem podanym w tabeli 2. Umyj szkiełka dwukrotnie po każdym etapie hybrydyzacji.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Detekcja sygnału
		<ol>
			<li>Postukaj w nadmiar bufora do mycia ze szkiełek i umieść je w stojaku na plamy. Dodać 2 μl Fast Red B do 120 μl Fast Red A (w stosunku 1:60) w probówce do mikrowirówki. Dobrze wymieszaj i dodaj, aby całkowicie pokryć część tkanki. 
			UWAGA: Całkowita objętość czerwonej mieszanki A/B zależy od liczby i wielkości skrawków tkanki. W przypadku obszaru o wymiarach 0,75'' x 0,75'' na jedną sekcję wystarczy 120 μl. Użyj mieszanki w ciągu 5 minut i unikaj wystawiania mieszanki na bezpośrednie działanie promieni słonecznych lub promieniowania UV.</li>
			<li>Zamknąć tackę i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć roztwór do pojemnika na odpady i natychmiast włożyć szkiełka do stojaka do mycia i umieścić ruszt w naczyniu do mycia wypełnionym wodą z kranu. Ponownie spłucz świeżą wodą z kranu.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeciwbarwienie szkiełek
	<ol>
		<li>Wyjmij ruszt do mycia z wody z kranu i szybko postukaj w chłonny papier, aby usunąć nadmiar wody. Włóż stojak do 50% roztworu barwiącego hematoksyliną i natychmiast przesuń stojak kilka razy w górę iw dół. Inkubować przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przenieś ruszt na suwak z powrotem do naczynia na wodę z kranu. Umyj 3-5 razy, przesuwając ruszt w górę iw dół i zmieniając świeżą wodę z kranu, aż szkiełka staną się przezroczyste, podczas gdy tkanki mózgowe pozostaną fioletowe.</li>
		<li>Przenieś ruszt do naczynia zawierającego 0,02% wody amoniakalnej. Przesuń stojak w górę i w dół 2-3 razy, aż chusteczki zmienią kolor na niebieski. Umyj szkiełka 3–5 razy świeżą wodą z kranu w naczyniu do barwienia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Montaż próbek
	<ol>
		<li>Przenieść ruszt do szkiełek z naczynia do barwienia do inkubatora o temperaturze 60 °C i inkubować przez co najmniej 15 minut, aż szkiełka całkowicie wyschną.</li>
		<li>Umieścić 40 μl podłoża mocującego na szkiełku podstawowym i ostrożnie nałożyć szkiełko nakrywkowe o wymiarach 24 mm x 50 mm na wycinek tkanki. Suche zjeżdżalnie na powietrzu przez 30 minut w RT.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Gromadzenie i analiza danych
UWAGA: Użyj skanera slajdów, aby zeskanować obrazy w 40-krotnym powiększeniu.
<ol>
	<li>Kontrole dodatnie i ujemne
	<ol>
		<li>Dla każdego eksperymentu uwzględnij kontrole pozytywne i negatywne (<silna klasa="xfig">Rysunek 3). Jako dobra kontrola pozytywna, sygnał powinien być widoczny jako punktowe kropki w powiększeniu 20-40X.</li>
		<li>Użyj myszy (mm)-PPIB-1ZZ jako kontroli pozytywnej. Ta sonda jest ukierunkowana na powszechny gen porządkowy PPIB. W przypadku kontroli ujemnej dopuszczalna jest jedna kropka na każde 20 komórek wykazujących barwienie tła na 20-krotne pole mikroskopu.</li>
		<li>Użyj sondy DapB-1ZZ jako kontroli negatywnej. Ta sonda celuje w bakteryjny gen dapB. Te sondy kontrolne były używane w wielu testach ISH19.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Detekcja i analiza sygnałów wzorców ekspresji AS eksonu 23a Nf1
	<ol>
		<li>Ponieważ sygnały hybrydyzacji są oznaczone jako kropki punktowe, policz kropki ręcznie. Liczba kropek jest skorelowana z poziomem transkryptów, który jest wykrywany przez określoną sondę. Należy pamiętać, że liczba punktów może być również analizowana przez oprogramowanie ImageJ lub SpotStudio.</li>
		<li>Użyj trzech sond, aby zhybrydyzować się z izoformami zawierającymi ekson 23a, eksonem 23a lub całkowitymi transkryptami Nf1 (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2). Ponieważ trzy sondy nie mogą być używane jednocześnie, użyj trzech sąsiednich odcinków tkanki mózgowej do hybrydyzacji z każdą sondą.
		<ol>
			<li>Aby obliczyć procent splicingu (PSI) dla eksonu 23a, policz liczbę komórek i kropek w kilku regionach mózgu. Dla każdego obszaru zainteresowania policz ponad 400 komórek z kilku podregionów, jak wskazano na Rysunek 4.</li>
			<li>Zbierz dane z tych samych podregionów dla każdej z trzech sond. Obliczać PSI jako liczbę kropek na komórkę za pomocą sondy inkluzji eksonu 23a/(liczba kropek na komórkę z sondą inkluzyjną eksonu 23a + liczba kropek na komórkę z sondą pomijającą ekson23a) x 100%.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Wang, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+isoform+regulation+in+human+tissue+transcriptomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes.</a> Nature. 456, 470-476 (2008).</li>
<li>Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+surveying+of+alternative+splicing+complexity+in+the+human+transcriptome+by+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing.</a> Nature Genetics. 40, 1413-1415 (2008).</li>
<li>Cieply, B., Carstens, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+roles+of+alternative+splicing+factors+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+RNA%22%5BJournal%5D)">Functional roles of alternative splicing factors in human disease.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 6, 311-326 (2015).</li>
<li>Xiong, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+splicing.+The+human+splicing+code+reveals+new+insights+into+the+genetic+determinants+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA splicing. The human splicing code reveals new insights into the genetic determinants of disease.</a> Science. 347, 1254806(2015).</li>
<li>Shirai, Y., Watanabe, M., Sakagami, H., Suzuki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+splice+variants+in+the+5%27UTR+of+Gtf2i+expressed+in+the+rat+brain%3A+alternative+5%27UTRs+and+differential+expression+in+the+neuronal+dendrites%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Novel splice variants in the 5'UTR of Gtf2i expressed in the rat brain: alternative 5'UTRs and differential expression in the neuronal dendrites.</a> Journal of Neurochemistry. 134, 578-589 (2015).</li>
<li>Cui, Y., Liu, J., Irudayaraj, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+quantification%3A+in+situ+analysis+of+transcriptome+and+pre-mRNA+alternative+splicing+at+the+nanoscale%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+Nanomedicine+and+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Beyond quantification: in situ analysis of transcriptome and pre-mRNA alternative splicing at the nanoscale.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9, (2017).</li>
<li>Trifonov, S., Yamashita, Y., Kase, M., Maruyama, M., Sugimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamic+acid+decarboxylase+1+alternative+splicing+isoforms%3A+characterization%2C+expression+and+quantification+in+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Glutamic acid decarboxylase 1 alternative splicing isoforms: characterization, expression and quantification in the mouse brain.</a> BMC Neuroscience. 15, 114(2014).</li>
<li>Hollander, D., Naftelberg, S., Lev-Maor, G., Kornblihtt, A. R., Ast, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+Are+Short+Exons+Flanked+by+Long+Introns+Defined+and+Committed+to+Splicing%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">How Are Short Exons Flanked by Long Introns Defined and Committed to Splicing?</a> Trends in Genetics. 32, 596-606 (2016).</li>
<li>Cassidy, A., Jones, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developments+in+in+situ+hybridisation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Developments in in situ hybridisation.</a> Methods. 70, 39-45 (2014).</li>
<li>Meshorer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+and+neuritic+mRNA+translocation+under+long-term+neuronal+hypersensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing and neuritic mRNA translocation under long-term neuronal hypersensitivity.</a> Science. 295, 508-512 (2002).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope%3A+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope+for+in+situ+detection+of+transcriptionally+active+human+papillomavirus+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">RNAscope for in situ detection of transcriptionally active human papillomavirus in head and neck squamous cell carcinoma.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2014).</li>
<li>Zhu, H., Hinman, M. N., Hasman, R. A., Mehta, P., Lou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+neuron-specific+alternative+splicing+of+neurofibromatosis+type+1+pre-mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of neuron-specific alternative splicing of neurofibromatosis type 1 pre-mRNA.</a> Molecular and Cellular Biology. 28, 1240-1251 (2008).</li>
<li>Hinman, M. N., Sharma, A., Luo, G., Lou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurofibromatosis+type+1+alternative+splicing+is+a+key+regulator+of+Ras+signaling+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Neurofibromatosis type 1 alternative splicing is a key regulator of Ras signaling in neurons.</a> Molecular and Cellular Biology. 34, 2188-2197 (2014).</li>
<li>Nguyen, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurofibromatosis+type+1+alternative+splicing+is+a+key+regulator+of+Ras%2FERK+signaling+and+learning+behaviors+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Neurofibromatosis type 1 alternative splicing is a key regulator of Ras/ERK signaling and learning behaviors in mice.</a> Human Molecular Genetics. 26, 3797-3807 (2017).</li>
<li>Zhou, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hu+proteins+regulate+alternative+splicing+by+inducing+localized+histone+hyperacetylation+in+an+RNA-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Hu proteins regulate alternative splicing by inducing localized histone hyperacetylation in an RNA-dependent manner.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, E627-E635 (2011).</li>
<li>Sharma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-mediated+histone+modifications+regulate+alternative+splicing+in+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Calcium-mediated histone modifications regulate alternative splicing in cardiomyocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, E4920-E4928 (2014).</li>
<li>Adzemovic, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+Analysis+in+the+Rat+Central+Nervous+System+and+Peripheral+Lymph+Node+Tissue+Sections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2016).</li>
<li>Shokry, I. M., Callanan, J. J., Sousa, J., Tao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+In+Situ+Hybridization+using+Oligonucleotide+Probes+on+Paraformaldehyde-prefixed+Brain+of+Rats+with+Serotonin+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2015).</li>
<li>Erben, L., He, M. X., Laeremans, A., Park, E., Buonanno, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Ultrasensitive+In+Situ+Hybridization+Approach+to+Detect+Short+Sequences+and+Splice+Variants+with+Cellular+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">A Novel Ultrasensitive In Situ Hybridization Approach to Detect Short Sequences and Splice Variants with Cellular Resolution.</a> Molecular Neurobiology. , (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Niniejszy komunikat informuje o użyciu BaseScope RNA ISH do badania wzorców ekspresji AS w sekcjach mózgu myszy. Wykazano, że antysensowne sondy złączowe egzon-ekson krótszy niż 50 nukleotydów mogą celować w inkluzję eksonu i pomijanie izoform w sposób solidny i specyficzny. Co więcej, uzyskane sygnały można wykorzystać do obliczenia PSI alternatywnego eksonu.
W procedurze przetestowano kilka wariantów. Na przykład przetestowano zamrożone skrawki tkanek wygenerowane przez cięcie kriostatu i wy...

Alternatywny splicing (AS) to powszechny proces, który zachodzi podczas dojrzewania pre-mRNA. W tym procesie ekson może być w różny sposób włączony do dojrzałego mRNA. W ten sposób, poprzez AS, jeden gen może generować wiele mRNA, które kodują różne produkty białkowe. Szacuje się, że 92–94% ludzkich genów ulega alternatywnemu splicingowi1,2. Nieprawidłowe alternatywne wzorce splicingu wynikające z mutacji genetycznych zostały powiązane z wieloma chorobami, w tym stwardnieniem zanikowym bocznym, dystrofią miotoniczną i rakiem3,4. W związku z tym kluczowe znaczenie ma zbadanie i lepsze zrozumienie alternatywnych mechanizmów regulacyjnych splicingu w celu znalezienia nowych metod leczenia chorób u ludzi.
AS jest często regulowany w sposób specyficzny dla typu komórki. Ważne jest określenie wzorca ekspresji AS określonego genu w danym systemie biologicznym. Staje się to jednak skomplikowane, gdy bada się złożony narząd, który zawiera wiele różnych typów komórek, taki jak mózg lub serce. W tym przypadku idealnym wyborem systemu testowego jest hybrydyzacja RNA in situ (ISH) przy użyciu skrawków tkanki, dzięki czemu wzorzec ekspresji AS określonego genu może być wykryty w wielu typach komórek jednocześnie. Rzeczywiście, sondy specyficzne dla eksonu zostały użyte do oceny poziomów ekspresji alternatywnego exon5,6,7. Jednak to podejście nie nadaje się do analizy wzorców AS z następujących powodów. Po pierwsze, konwencjonalne metody ISH zwykle używają sond dłuższych niż 300 pz, podczas gdy średnia wielkość wewnętrznych eksonów kręgowców (nie pierwszego lub ostatniego eksonu) wynosi 170 nukleotydów8,9. Po drugie, gdy sonda specyficzna dla eksonu jest używana do zbadania wzoru splicingu wewnętrznego alternatywnego eksonu, jedyną izoformą mRNA wykrytą przez sondę jest ta, która zawiera ekson, podczas gdy izoforma mRNA bez eksonu nie może zostać wykryta. W związku z tym obliczenie wartości procentu splicingu (PSI) dla alternatywnego eksonu jest skomplikowane. Co więcej, konwencjonalne fluorescencyjne ISH często łączą ISH z barwieniem immunologicznym, co zmniejsza skuteczność i odporność wykrywania. Na przykład w badaniu, w którym badano indukowane stresem przełączanie izoform splicingu mRNA acetylocholinoesterazy (AChE), digoksygenina została włączona do sondy ISH i wykryta za pomocą przeciwciała anty-digoksygeninowego. Alternatywnie, sonda znakowana biotyną została wykryta przez koniugat fosfatazy alkalicznej/streptawidyny i substrat dla fosfatazy alkalicznej10. Żadna z metod nie wykorzystuje żadnej strategii amplifikacji w celu zwiększenia czułości wykrywania. W rezultacie trudno jest wykryć transkrypty mRNA, które ulegają ekspresji na niskich poziomach. W związku z tym potrzebny jest prostszy i bardziej niezawodny system oznaczania ISH do analizy wzorców ekspresji AS in situ.
BaseScope został niedawno opracowany w oparciu o platformę RNAscope, dobrze znanego i szeroko stosowanego systemu testowego ISH. Oba systemy testowe wykorzystują technologię amplifikacji specyficzną dla celu, która zwiększa czułość detekcji11,12. To, co odróżnia jeden od drugiego, to długość sekwencji docelowej, która wynosi zaledwie 50 nukleotydów w przypadku BaseScope i 300–1000 nukleotydów w przypadku RNAscope. W ten sposób możliwe jest zaprojektowanie sond, które celują w złącza ekson-ekson w celu wykrycia określonych alternatywnych izoform mRNA. W obecnym badaniu ustalono procedurę w celu zbadania wzorców ekspresji AS eksonu 23a neurofibromatozy typu 1 (Nf1), alternatywnego eksonu szeroko badanego w tym samym laboratorium13,14,15,16,17, w sekcjach mózgu myszy. Wyniki pokazują, że BaseScope jest idealnym systemem do badania wzorców ekspresji eksonu 23a Nf1 in situ. Ponieważ ten system testowy można dostosować do analizy wzorców ekspresji AS wielu alternatywnych eksonów, stanowi on potężne nowe narzędzie w badaniach AS.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hybrid Oven</td><td>Zaawansowana diagnostyka komórek</td><td>241000ACD</td><td></td></tr><tr><td>Taca do kontroli wilgotności (z pokrywką)</td><td>Zaawansowana diagnostyka komórek</td><td>310012</td> Stain Rack Zaawansowana diagnostyka komórek 310017 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płyta grzejna</td><td>Fisher Scientific</td><td>1160049SH</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator ogólnego przeznaczenia Imperial III</td><td>Lab-Line</td><td>302</td><td></td></tr><tr><td>Skaner slajdów</td><td>Leica</td><td>SCN400</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Odczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do leczenia wstępnego</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>322381</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen</td><td>Peroxide Cell Diagnostics</td><td>2000899</td><td></td></tr><tr><td>Protease III*</td><td>Zaawansowana diagnostyka komórkowa</td><td>2000901</td><td></td></tr><tr><td>10x Target Retrieval</td><td>Zaawansowana diagnostyka komórek</td><td>2002555</td><td></td></tr><tr><td>BaseScope Detection RelingKit</td><td>Zaawansowana diagnostyka komórek</td><td>332910</td><td></td></tr><tr><td>AMP 0</td><td>Zaawansowana diagnostyka komórek</td><td>2001814</td><td></td></tr><tr><td>AMP 1</td><td>Zaawansowana diagnostyka komórek</td><td>2001815</td><td></td></tr><tr><td>AMP 2</td><td>Zaawansowana diagnostyka komórek</td><td>2001816</td><td></td></tr><tr><td>AMP 3</td><td>Zaawansowana diagnostyka komórek</td><td>2001817</td><td></td></tr><tr><td>AMP 4</td><td>Zaawansowana diagnostyka komórek</td><td>16229B</td><td></td></tr><tr><td>AMP 5-CZERWONY</td><td>Zaawansowana diagnostyka komórkowa</td><td>16229C</td><td></td></tr><tr><td>AMP 6-RED</td><td>Zaawansowana diagnostyka komórek</td><td>2001820</td><td></td></tr><tr>Szybka <td>zaawansowana diagnostyka komórek</td><td>RED-A</td><td>2001821</td><td></td></tr><tr>Szybka <td>zaawansowana diagnostyka komórek</td><td>RED-B</td><td>16230F</td><td></td></tr><tr><td>50x Bufor do płukania</td><td>Zaawansowana diagnostyka komórek</td><td>310091</td><td></td></tr><tr><td>Sonda kontroli ujemnej - mysz DapB-1ZZ</td><td>Zaawansowana diagnostyka komórkowa</td><td>701021</td><td></td></tr><tr><td>Sonda kontroli pozytywnej - Mysz (mm)-PPIB-1ZZ</td><td>Zaawansowana diagnostyka komórkowa</td><td>701081</td><td></td></tr><tr><td>kontrola myszy ślizgowej Granulka komórek 3T3</td><td>Zaawansowana diagnostyka komórek</td><td>310045</td><td></td></tr><tr><td><silna>Nazwa</td><td>Company</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Inne materiały</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Papier nawilżający</td><td>Zaawansowana diagnostyka komórek</td><td>310015</td><td></td></tr><tr><td>Stojak do mycia</td> American <td>Master Tech Scientific</td><td>9837976</td><td></td></tr><tr><td>Mycie naczyń</td><td>American Master Tech Scientific</td><td>LWS20WH</td><td></td></tr><tr><td>Hydrofobowy długopis barierowy</td><td>Vector Laboratory</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka szklane</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Szkło nakrywkowe, 24 mm x 50 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12--545-F</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek amonu</td><td>Fisher Scientific</td><td>002689</td><td></td></tr><tr><td>100% etanol (EtOH)</td><td>Decon Labs</td><td>2805</td><td></td></tr><tr><td>roztwór formalde</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF94-4</td><td></td></tr><tr><td>Hematoksylina I</td><td>American Master Tech Scientific</td><td>17012359</td><td></td></tr><tr><td>Medium montażowe</td><td>Vector Labs</td><td>H-5000</td><td></td></tr><tr><td>Ksylen</td><td>Fisher Scientific</td><td>173942</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza ilościowa alternatywnego splicingu pre-mrna w skrawkach mózgu myszy przy użyciu testu hybrydyzacji rna in situ

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Alternatywny splicing (AS) występuje w ponad 90% ludzkich genów. Wzorzec ekspresji alternatywnie splicywanego eksonu jest często regulowany w sposób specyficzny dla typu komórki. Wzorce ekspresji AS są zwykle analizowane za pomocą RT-PCR i RNA-seq przy użyciu próbek RNA wyizolowanych z populacji komórek. Badanie in situ wzorców ekspresji AS dla określonej struktury biologicznej można przeprowadzić za pomocą hybrydyzacji RNA in situ (ISH) przy użyciu sond specyficznych dla eksonów. Jednak to konkretne zastosowanie ISH zostało ograniczone, ponieważ alternatywne eksony są na ogół zbyt krótkie, aby zaprojektować sondy specyficzne dla eksonów. W niniejszym raporcie opisano zastosowanie BaseScope, niedawno opracowanej technologii, która wykorzystuje krótkie oligonukleotydy antysensowne w RNA ISH, do analizy wzorców ekspresji AS w sekcjach mózgu myszy. Ekson 23a nerwiakowłókniakowatości typu 1 (Nf1) jest używany jako przykład ilustrujący, że krótkie sondy ze złączem ekson-ekson wykazują silne sygnały hybrydyzacji o wysokiej swoistości w analizie RNA ISH na odcinkach mózgu myszy. Co ważniejsze, sygnały wykryte za pomocą sond specyficznych dla inkluzji i przeskakiwania eksonów można wykorzystać do wiarygodnego obliczenia procentu splecionych wartości ekspresji eksonu Nf1 23a w różnych obszarach anatomicznych mózgu myszy. Przedstawiono protokół doświadczalny i metodę obliczeniową dla analizy AS. Wyniki wskazują, że BaseScope stanowi nowe, potężne narzędzie do oceny wzorców ekspresji AS in situ.

Metodę BaseScope ISH przeprowadzono z wykorzystaniem trzech szczepów myszy: myszy CD1 typu dzikiego, myszy C57BL/6J typu dzikiego oraz myszy mutantów Nf123aIN/23aIN na tle C57BL/6J, w których ekson 23a jest włączany we wszystkich typach komórek w wyniku wprowadzonych mutacji miejsc splicingowych14,15.
W pierwszym kroku system testowy ISH sprawdzono pr...

Opisano protokół hybrydyzacji in situ (ISH), który wykorzystuje krótkie oligonukleotydy antysensowne do wykrywania alternatywnych wzorców splicingu pre-mRNA w sekcjach mózgu myszy.

Analiza ilościowa alternatywnego splicingu pre-mRNA w skrawkach mózgu myszy przy użyciu testu hybrydyzacji RNA in situ

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie alternatywnego splicingu pre-mRNA. W szczególności zapewnia solidny, czuły system testowy do badania alternatywnych wzorców łączenia in situ w wycinkach tkanki. Dzięki tej metodzie alternatywny splicing może być analizowany jednocześnie w wielu podtypach, które są zawarte w złożonych strukturach biologicznych, takich jak mózg myszy.Główną zaletą tej techniki jest to, że wykorzystuje ona antystatyczne sondy złączowe eksonów w hybrydyzacji mRNA in situ w celu wytworzenia sygnałów hybrydyzacji specyficznych dla izoformy. Technologia wzmacniania sygnału budowlanego zwiększa czułość detekcji, aby zapewnić solidne sygnały hybrydyzacji. Wykryte sygnały polegały na włączeniu eksonów uciekającym przed określonymi sondami, które są używane do obliczania procentowego splicingu w parametrach życiowych w różnych anatomicznych obszarach mózgu myszy.W tym badaniu ekson 23a NF1 jest używany jako przykład ilustrujący zastosowanie systemu testowego. System można jednak dostosować do analizy wzorców ekspresji wielu alternatywnych eksonów. Aby rozpocząć parafinowanie sekcji D mózgu myszy, napełnij dwie naczynia do mycia 250 mililitrami ksylenu.I kolejne dwa z 250 mililitrami 100% etanolu w dygestorium. Włóż szkiełka chusteczek do stojaka do mycia. Następnie umieść ruszt do mycia w naczyniu zawierającym ksylen i inkubuj przez pięć minut, przesuwając ruszt w górę iw dół co najmniej trzy razy, a następnie powtórz z drugim naczyniem z ksylenem.Następnie umieść ruszt w naczyniu zawierającym etanol i inkubuj przez dwie minuty, wykonując te same ruchy w górę iw dół, a następnie powtórz z drugim naczyniem na etanolu. Aby wysuszyć szkiełka, przesuń ruszt z drugiego naczynia na etanol i umieść go w inkubatorze w temperaturze 60 stopni Celsjusza na pięć minut. Użyj hydrofobowego pisaka barierowego, aby narysować barierę o wymiarach 0,75 cala na 0,75 cala wokół sekcji tkanki i suszyć na powietrzu przez trzy minuty w temperaturze pokojowej.Włącz piekarnik do hybrydyzacji i ustaw temperaturę na 40 stopni Celsjusza. Po całkowitym zwilżeniu papieru nawilżającego wodą destylowaną umieść go na tacy kontrolującej wilgotność. Następnie włóż tackę kontrolującą wilgotność do pieca do hybrydyzacji.Po umieszczeniu wysuszonych szkiełek na ławce, całkowicie przykryj skrawki tkanki na każdym szkiełku pięcioma do ośmiu kroplami roztworu nadtlenku wodoru. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Postukaj szkiełkami w chłonny papier, pojedynczo, aby usunąć roztwór nadtlenku wodoru i włóż szkiełka do stojaka do mycia.Zanurz ruszt w naczyniu do mycia zawierającym wodę, przesuwając go w górę i w dół trzy do pięciu razy, aby umyć szkiełka. Napełnij litrową szklaną zlewkę umieszczoną na gorącej płycie 700 mililitrami 1X zabiegu usuwania celu i przykryj folią. Włóż termometr przez foliową pokrywę i włącz płytę grzejną, ustaw wysoką temperaturę na 10 do 15 minut.Gdy temperatura odczynnika do pobierania osiągnie 98 stopni Celsjusza, ustaw płytę grzejną na niską temperaturę, aby utrzymać łagodny stan wrzenia. Następnie ostrożnie zdejmij folię i umieść ruszt w zlewce. Przykryj zlewkę folią i inkubuj przez 15 minut.Za pomocą kleszczy przenieś ruszt ze zlewki do naczynia do mycia zawierającego 200 mililitrów wody destylowanej i inkubuj przez 15 sekund. Po 15 sekundach umieść ruszt w naczyniu myjącym zawierającym 100% etanolu i inkubuj przez trzy minuty. Zdejmij ruszt z naczynia i susz w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 10 minut.Po umieszczeniu szkiełek na stojaku na plamy, przykryj skrawki tkanki pięcioma kroplami proteazy 3 na szkiełko. Ostrożnie umieść ruszt na tacy kontrolującej wilgotność i włóż tacę do pieca do hybrydyzacji i inkubuj w temperaturze 40 stopni Celsjusza przez 30 minut. Po wyjęciu kosza z tacki postukaj w szkiełka, aby usunąć nadmiar płynu i włóż je do kosza do mycia.Umieść ruszt w naczyniu do mycia zawierającym wodę destylowaną i przesuń ruszt w górę iw dół trzy do pięciu razy, aby umyć szkiełka. Aby przygotować się do hybrydyzacji in situ, inkubuj sondy i odczynniki AMP w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Włóż tackę kontrolującą wilgotność do piekarnika do hybrydyzacji i ustaw na 40 stopni Celsjusza.W celu hybrydyzacji sondy wyjmij szkiełka z rusztu do mycia i postukaj w nie, aby usunąć nadmiar płynu. Umieść szkiełka na stojaku na plamy. Użyj ołówka, aby oznaczyć slajdy nazwą sondy.Umieść trzy przylegające do siebie szkiełka tkanki mózgowej, które mają zostać zhybrydyzowane z trzema różnymi sondami mitozy włókien nerwowych typu pierwszego. Ponieważ istnieją bardzo różne sondy specyficzne dla izoformy, używam przylegających do siebie ciętych odcinków tkanki. Bardzo ważne jest, aby te sekcje były traktowane dokładnie tak samo na etapach hybrydyzacji, amplifikacji i wykrywania sygnału, aby zapewnić dokładność procentowego splotu w obliczeniach.Przykryj skrawki tkanki czterema kroplami sondy na sekcję, po jednym szkiełku na raz, aby zapobiec wysuszeniu skrawków. Następnie umieść stojak na plamy na tacy kontrolującej wilgotność i włóż go do piekarnika o temperaturze 40 stopni Celsjusza na dwie godziny. Następnie umieść ruszt do mycia w naczyniu do mycia wypełnionym 200 mililitrami bufora do mycia 1X.Następnie stuknij każdy slajd, pojedynczo w ręcznik papierowy, aby usunąć nadmiar płynu. I natychmiast włóż każdy szkiełko do kosza do prania. Inkubować w temperaturze pokojowej przez dwie minuty w naczyniu wypełnionym świeżym buforem do mycia, przesuwając ruszt w górę iw dół trzy do pięciu razy, a następnie powtórzyć mycie w nowym naczyniu.Aby wzmocnić sygnał, dotknij każdego slajdu, aby usunąć nadmiar bufora do prania i umieść je na stojaku na plamy. Pokryj sekcję tkanki na każdym szkiełku czterema kroplami odczynnika AMP zero. Następnie umieść ruszt na tacy kontrolującej wilgotność, włóż blachę do piekarnika i inkubuj w temperaturze 40 stopni Celsjusza przez 30 minut.Umyj szkiełko dwukrotnie buforem do mycia, tak jak poprzednio w tym eksperymencie. Powtórz krok wzmacniania sygnału za pomocą odczynników AMP od jednego do sześciu, zgodnie z opisem w protokole tekstowym, a po każdym kroku umyj szkiełka. W celu wykrycia sygnału usuń nadmiar bufora myjącego ze szkiełek, stukając i umieszczając je na stojaku na plamy.Następnie wymieszaj dwa mikrolitry szybkiej czerwieni B ze 120 mikrolitrami szybkiej czerwieni A w mikroprobówce wirówkowej. Dodaj roztwór do odcinków tkanek na każdym szkiełku, aby całkowicie je pokryć. Umieść stojak na plamy na tacy do kontroli wilgotności, przykryj tackę i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej.Następnie usuń roztwór i włóż szkiełka do stojaka do mycia. Umieść ruszt w naczyniu do mycia zawierającym wodę z kranu, aby umyć szkiełka i powtórz pranie. Po drugim praniu postukaj w chłonny papier, aby usunąć nadmiar wody.Następnie umieść ruszt w naczyniu zawierającym 50% roztwór barwiący hematoksylinę. Przesuń stojak kilka razy w górę iw dół. I inkubować przez dwie minuty w temperaturze pokojowej.Przenieś ruszt do naczynia do mycia zawierającego wodę z kranu. Przesuń ruszt pięć razy w górę i w dół i powtarzaj pranie, aż szkiełka staną się przezroczyste, a skrawki chusteczki pozostaną fioletowe. Następnie przenieś ruszt do naczynia zawierającego 0,02% wody amoniakalnej.Przesuń stojak w górę i w dół dwa do czterech razy, aż sekcje zmienią kolor na niebieski. Umyj szkiełka wodą z kranu trzy do pięciu razy w naczyniu do barwienia. Następnie umieść stojak w inkubatorze i inkubuj przez 15 minut w temperaturze 60 stopni Celsjusza, aby wysuszyć szkiełka.Po całkowitym wyschnięciu dodaj jedną kroplę podłoża montażowego na każde szkiełko, aby przykryć plasterek. Następnie ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe o wymiarach 24 na 50 milimetrów na odcinkach tkanki na każdym szkiełku. Po wysuszeniu szkiełek na powietrzu przez 30 minut w temperaturze pokojowej przystąp do zbierania danych.Aby obliczyć procent splicingu lub wartość PSI dla eksonu 23a, zlicza się liczbę komórek i kropek w trzech podregionach kory i hipokampa CA3. Test hybrydyzacji RNA in situ przeprowadza się w sekcjach mózgu myszy typu dzikiego CD1 przy użyciu trzech różnych sond specyficznych dla NF1. Czerwone kropki punktowe obserwowane w sekcjach kory mózgowej i hipokampa wskazują na pozytywne sygnały przez sondy całkowite NF1, specyficzne dla włączenia i pomijające specyficzne sondy.Sygnały ISH z trzech sond są następnie zliczane i wykorzystywane do obliczenia PSI. Test hybrydyzacji RNA in situ przeprowadza się w korze myszy C57 z czarnym 6J typu dzikiego i czarnych myszy z mutacją C57 6J, w których ekson 23a jest zawarty we wszystkich typach komórek. Czerwone kropki punktowe obserwowane w korze czarnych myszy typu dzikiego C57 6J wskazują na pozytywne sygnały przez całkowitą liczbę NF1, specyficzne dla inkluzji i pomijanie specyficznych sond.U myszy z mutacją C57 Black 6J podobne sygnały uzyskuje się za pomocą sond całkowitych NF1 i specyficznych dla inkluzji. Jednak żaden sygnał nie jest wykrywany, gdy używana jest pominięcie określonej sondy, co wskazuje, że dwie sondy ukierunkowane na włączenie lub pominięcie eksonów są wysoce specyficzne. Ponieważ wielokolorowe etykietowanie na tych samych szkiełkach tkankowych nie jest jeszcze dostępne dla tej procedury, na różnych szkiełkach tkankowych stosuje się różne sondy.Aby uzyskać dokładne wartości procentowe łączenia, ważne jest, aby używać przylegających do siebie suwaków i traktować suwaki w dokładnie taki sam sposób podczas całej tej procedury. Uzupełnieniem tej procedury są pomiary, takie jak immunohistochemia, które można wykonać, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące lokalizacji i funkcji izoform splicingu o zróżnicowanej ekspresji.

quantitative-analysis-alternative-pre-mrna-splicing-mouse-brain

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Ze względu na przejściowy charakter pre-mRNA, jego izolacja i badanie in vivo mogą być trudne. Przedstawiamy tutaj nowatorskie podejście in vitro do badania oddziaływań RNA-białko z wykorzystaniem syntetycznej puli oligonukleotydów, która pokrywa wybrane regiony pre-mRNA.

Szybka metoda wysokoprzepustowa mapowania rybonukleoprotein (RNP) na ludzkim pre-mRNA

Ten film demonstruje wykrywanie syntezy RNA receptora serotoninowego za pomocą sond oligonukleotydowych w tkance mózgowej szczura dotkniętej zespołem serotoninowym. Protokół obejmuje wstępną obróbkę tkanek, hybrydyzację sondy i detekcję enzymatyczną w celu wizualizacji i ilościowego określenia ekspresji RNA receptora serotoninowego pod mikroskopem.

Hybrydyzacja in situ przy użyciu sond oligonukleotydowych do badania ekspresji RNA w skrawkach mózgu szczura

Źródło: Jolly, S., et.al. Połączenie podwójnej fluorescencji  hybrydyzacji in situ z immunoznakowaniem w celu wykrycia ekspresji trzech genów w sekcjach mózgu myszy. J. Vis. Exp. (2016). Ten film demonstruje zastosowanie hybrydyzacji in situ z podwójną fluorescencją do wizualizacji ekspresji dwóch celów RNA w sekcjach mózgu myszy. Protokół obejmuje sekwencyjne wykrywanie RNA za pomocą sond znakowanych izotiocyjanianem fluoresceiny i digoksygeniną, a następnie enzymatyczne wzmacnianie sygnału w...

 Wykonywanie podwójnej fluorescencji hybrydyzacji in situ w celu wykrycia ekspresji genów w skrawkach mózgu myszy

Wykazano, że Wykazano, że alternatywna regulacja splicingu przyczynia się do przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego (EMT), niezbędnego programu komórkowego w różnych procesach fizjologicznych i patologicznych. W tym miejscu opisujemy metodę wykorzystującą indukowalny model EMT do wykrywania alternatywnego splicingu podczas EMT.

Wykrywanie alternatywnego splicingu podczas przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego

Hybrydyzacja in situ (ISH) RNA umożliwia wizualizację RNA w komórkach i tkankach. Tutaj pokazujemy, jak połączenie RNAscope ISH z immunohistochemią lub barwnikami histologicznymi może być z powodzeniem wykorzystane do wykrywania mRNA zlokalizowanych na aksonach w odcinkach mózgu myszy i człowieka.

Wykrywanie aksonalnie zlokalizowanych mRNA w skrawkach mózgu za pomocą hybrydyzacji in situ o wysokiej rozdzielczości

Lokalizacja ekspresji genów w określonych typach komórek może być trudna ze względu na brak specyficznych przeciwciał. W tym miejscu opisujemy protokół jednoczesnego potrójnego wykrywania ekspresji genów poprzez połączenie hybrydyzacji in situ RNA z podwójną fluorescencją z barwieniem immunologicznym.

Połączenie podwójnej fluorescencji hybrydyzacji in situ z immunoznakowaniem w celu wykrycia ekspresji trzech genów w wycinkach mózgu myszy

Tutaj opisujemy protokół mający na celu zbadanie wpływu nieprawidłowego splicingu na lekooporność w guzach litych i nowotworach hematologicznych. W tym celu przeanalizowaliśmy profile transkryptomiczne rodzicielskich i opornych modeli in vitro za pomocą sekwencjonowania RNA i ustaliliśmy metodę opartą na qRT-PCR w celu walidacji genów kandydujących.

Wykorzystanie sekwencjonowania RNA do wykrywania nowych wariantów splicingu związanych z opornością na leki w modelach nowotworów in vitro

Tutaj zaprezentowaliśmy metodę sekwencjonowania mRNA z multipleksowaną pojedynczą komórką do profilowania ekspresji genów w tkankach embrionalnych myszy. Metoda sekwencjonowania mRNA pojedynczej komórki oparta na kropelkach (scRNA-Seq) w połączeniu ze strategiami multipleksowania może profilować pojedyncze komórki z wielu próbek jednocześnie, co znacznie obniża koszty odczynników i minimalizuje eksperymentalne efekty wsadowe.

Multipleksowana analiza sekwencjonowania mRNA pojedynczej komórki komórek embrionalnych myszy

Alternatywny splicing (AS) i alternatywna poliadenylacja (APA) rozszerzają różnorodność izoform transkryptu i ich produktów. W tym miejscu opisujemy protokoły bioinformatyczne do analizy masowych testów sekwencjonowania RNA i sekwencjonowania końca 3' w celu wykrycia i wizualizacji AS i APA różniących się w różnych warunkach eksperymentalnych.

Identyfikacja alternatywnego splicingu i poliadenylacji w danych sekwencyjnych RNA

Opracowaliśmy test hybrydyzacji Duplex in situ do mapowania izoform receptora insuliny IR-A i IR-B w mysim splocie naczyniówkowym, pokonując ograniczenia tradycyjnych metod. To podejście o wysokiej rozdzielczości ujawnia ekspresję specyficzną dla izoformy, oferując nowe informacje na temat sygnalizacji insuliny w mózgu i potencjalnych terapii ukierunkowanych na izoformy w zaburzeniach neurologicznych.

Precyzyjna wizualizacja receptorów insuliny A i B w mózgu myszy za pomocą testu hybrydyzacji RNA in situ

Protokół ten zapewnia uproszczony proces obliczeniowy do ilościowej identyfikacji początkujących transkrypcji wzmacniaczy. Integrując dostępność chromatyny, cechy chromatyny oraz dane transkrypcyjne, umożliwia dokładne wykrywanie i analizę aktywności wzmacniacza specyficzną dla nici w złożonych regionach intragenowych, pozostając jednocześnie dostępnym dla badaczy bez rozległego szkolenia bioinformatycznego.

Tok obliczeniowy do ilościowej identyfikacji RNA intergenowego/wewnątrzgenowego w embrionalnych komórkach macierzystych myszy

Poznaj metodę hybrydyzacji RNA in situ do analizy alternatywnego splicingu pre-mRNA w tkankach mózgu myszy. Technika wykorzystuje krótkie sondy antysensowne i wzmacnianie sygnału do wykrywania wzorców splicingu w różnych regionach anatomicznych.

Analiza ilościowa alternatywnego splicingu pre-mRNA w skrawkach mózgu myszy przy użyciu testu hybrydyzacji RNA in situ

Przeglądaj więcej filmów