Name: Ilościowy pomiar reaktywnych form tlenu i fenotypu wydzielniczego związanego ze starzeniem się w normalnych ludzkich fibroblastach podczas starzenia się wywołanego onkogenem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 59 s
Description: Poznaj metody ilościowego pomiaru reaktywnych form tlenu i fenotypu SASP w ludzkich fibroblastach WI-38 podczas starzenia się wywołanego onkogenem H-Ras. Protokoły te umożliwiają precyzyjną analizę mechanizmów starzenia się komórkowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta grantem z Narodowej Fundacji Badawczej Korei (2015R1D1A1A01060839) (dla Young Yeon Kim) oraz grantem Narodowej Fundacji Badawczej Korei (NRF) finansowanym przez rząd Korei (MSIT) (nr 2016R1A2B2008887, nr 2016R1A5A2007009) (dla Jeanho Yuna).

<ol><li>Hayflick, L., Moorhead, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+serial+cultivation+of+human+diploid+cell+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">The serial cultivation of human diploid cell strains.</a> Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).</li>
<li>Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging%2C+cellular+senescence%2C+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Aging, cellular senescence, and cancer.</a> Annual Review of Physiology. 75, 685-705 (2013).</li>
<li>Braig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogene-induced+senescence+as+an+initial+barrier+in+lymphoma+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Oncogene-induced senescence as an initial barrier in lymphoma development.</a> Nature. 436 (7051), 660-665 (2005).</li>
<li>Michaloglou, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRAFE600-associated+senescence-like+cell+cycle+arrest+of+human+naevi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">BRAFE600-associated senescence-like cell cycle arrest of human naevi.</a> Nature. 436 (7051), 720-724 (2005).</li>
<li>Collado, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+biology%3A+senescence+in+premalignant+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumour biology: senescence in premalignant tumours.</a> Nature. 436 (7051), 642(2005).</li>
<li>Malaquin, N., Martinez, A., Rodier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keeping+the+senescence+secretome+under+control%3A+Molecular+reins+on+the+senescence-associated+secretory+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Keeping the senescence secretome under control: Molecular reins on the senescence-associated secretory phenotype.</a> Experimental Gerontology. 82, 39-49 (2016).</li>
<li>Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+essence+of+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The essence of senescence.</a> Genes & Development. 24 (22), 2463-2479 (2010).</li>
<li>Lu, T., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+radicals+and+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Free radicals and senescence.</a> Experimental Cell Research. 314 (9), 1918-1922 (2008).</li>
<li>Furumoto, K., Inoue, E., Nagao, N., Hiyama, E., Miwa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+telomere+shortening+is+slowed+down+by+enrichment+of+intracellular+vitamin+C+via+suppression+of+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Age-dependent telomere shortening is slowed down by enrichment of intracellular vitamin C via suppression of oxidative stress.</a> Life Sciences. 63 (11), 935-948 (1998).</li>
<li>Lee, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ras+proteins+induce+senescence+by+altering+the+intracellular+levels+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ras proteins induce senescence by altering the intracellular levels of reactive oxygen species.</a> The Journal of Biological Chemistry. 274 (12), 7936-7940 (1999).</li>
<li>Chen, Q., Ames, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-like+growth+arrest+induced+by+hydrogen+peroxide+in+human+diploid+fibroblast+F65+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Senescence-like growth arrest induced by hydrogen peroxide in human diploid fibroblast F65 cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (10), 4130-4134 (1994).</li>
<li>Dumont, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+replicative+senescence+biomarkers+by+sublethal+oxidative+stresses+in+normal+human+fibroblast%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Induction of replicative senescence biomarkers by sublethal oxidative stresses in normal human fibroblast.</a> Free Radical Biology & Medicine. 28 (3), 361-373 (2000).</li>
<li>Blander, G., de Oliveira, R. M., Conboy, C. M., Haigis, M., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+dismutase+1+knock-down+induces+senescence+in+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Superoxide dismutase 1 knock-down induces senescence in human fibroblasts.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (40), 38966-38969 (2003).</li>
<li>Packer, L., Fuehr, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+oxygen+concentration+extends+the+lifespan+of+cultured+human+diploid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells.</a> Nature. 267 (5610), 423-425 (1977).</li>
<li>Serra, V., von Zglinicki, T., Lorenz, M., Saretzki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+superoxide+dismutase+is+a+major+antioxidant+in+human+fibroblasts+and+slows+telomere+shortening%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Extracellular superoxide dismutase is a major antioxidant in human fibroblasts and slows telomere shortening.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (9), 6824-6830 (2003).</li>
<li>Rodier, F., Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four+faces+of+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Four faces of cellular senescence.</a> The Journal of Cell Biology. 192 (4), 547-556 (2011).</li>
<li>Munoz-Espin, D., Serrano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence%3A+from+physiology+to+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence: from physiology to pathology.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15 (7), 482-496 (2014).</li>
<li>Tchkonia, T., Zhu, Y., van Deursen, J., Campisi, J., Kirkland, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence+and+the+senescent+secretory+phenotype%3A+therapeutic+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence and the senescent secretory phenotype: therapeutic opportunities.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 966-972 (2013).</li>
<li>van Deursen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+senescent+cells+in+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The role of senescent cells in ageing.</a> Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Kim, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperation+between+p21+and+Akt+is+required+for+p53-dependent+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Cooperation between p21 and Akt is required for p53-dependent cellular senescence.</a> Aging Cell. 16 (5), 1094-1103 (2017).</li>
<li>Serrano, M., Lin, A. W., McCurrach, M. E., Beach, D., Lowe, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+ras+provokes+premature+cell+senescence+associated+with+accumulation+of+p53+and+p16INK4a%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Oncogenic ras provokes premature cell senescence associated with accumulation of p53 and p16INK4a.</a> Cell. 88 (5), 593-602 (1997).</li>
<li>Wu, D., Yotnda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+detection+of+reactive+oxygen+species+%28ROS%29+in+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Production and detection of reactive oxygen species (ROS) in cancers.</a> Journal of Visualized Experiments. (57), (2011).</li>
<li>Wojtala, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+monitor+ROS+production+by+fluorescence+microscopy+and+fluorometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Methods to monitor ROS production by fluorescence microscopy and fluorometry.</a> Methods in Enzymology. 542, 243-262 (2014).</li>
<li>Duncan, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-associated+dysregulation+of+protein+metabolism+in+the+mammalian+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Age-associated dysregulation of protein metabolism in the mammalian oocyte.</a> Aging Cell. 16 (6), 1381-1393 (2017).</li>
<li>Yang, L., Song, T., Chen, L., Soliman, H., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleolar+repression+facilitates+initiation+and+maintenance+of+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Nucleolar repression facilitates initiation and maintenance of senescence.</a> Cell Cycle. 14 (22), 3613-3623 (2015).</li>
<li>Coppe, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+secretory+phenotypes+reveal+cell-nonautonomous+functions+of+oncogenic+RAS+and+the+p53+tumor+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor.</a> PLoS Biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).</li>
<li>Kosar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+heterochromatin+foci+are+dispensable+for+cellular+senescence%2C+occur+in+a+cell+type-+and+insult-dependent+manner+and+follow+expression+of+p16%28ink4a%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated heterochromatin foci are dispensable for cellular senescence, occur in a cell type- and insult-dependent manner and follow expression of p16(ink4a).</a> Cell Cycle. 10 (3), 457-468 (2011).</li>
<li>Sharpless, N. E., Sherr, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forging+a+signature+of+in+vivo+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Forging a signature of in vivo senescence.</a> Nature Reviews. Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).</li>
<li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposing+roles+for+p16Ink4a+and+p19Arf+in+senescence+and+ageing+caused+by+BubR1+insufficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Opposing roles for p16Ink4a and p19Arf in senescence and ageing caused by BubR1 insufficiency.</a> Nature Cell Biology. 10 (7), 825-836 (2008).</li>
<li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+p16Ink4a-positive+senescent+cells+delays+ageing-associated+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders.</a> Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).</li>
<li>Baar, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Apoptosis+of+Senescent+Cells+Restores+Tissue+Homeostasis+in+Response+to+Chemotoxicity+and+Aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Targeted Apoptosis of Senescent Cells Restores Tissue Homeostasis in Response to Chemotoxicity and Aging.</a> Cell. 169 (1), 132-147 (2017).</li>
<li>Farr, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+cellular+senescence+prevents+age-related+bone+loss+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Targeting cellular senescence prevents age-related bone loss in mice.</a> Nature Medicine. 23 (9), 1072-1079 (2017).</li>
<li>Chang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+senescent+cells+by+ABT263+rejuvenates+aged+hematopoietic+stem+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Clearance of senescent cells by ABT263 rejuvenates aged hematopoietic stem cells in mice.</a> Nature Medicine. 22 (1), 78-83 (2016).</li>
<li>Yosef, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+elimination+of+senescent+cells+by+inhibition+of+BCL-W+and+BCL-XL%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Directed elimination of senescent cells by inhibition of BCL-W and BCL-XL.</a> Nature Communications. 7, 11190(2016).</li>
<li>Jeon, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+clearance+of+senescent+cells+attenuates+the+development+of+post-traumatic+osteoarthritis+and+creates+a+pro-regenerative+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Local clearance of senescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritis and creates a pro-regenerative environment.</a> Nature Medicine. 23 (6), 775-781 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu przedstawiliśmy metody monitorowania wewnątrzkomórkowych poziomów ROS podczas starzenia się wywołanego przez H-Ras w normalnych ludzkich fibroblastach WI-38. Wewnątrzkomórkowe poziomy ROS w żywych komórkach można mierzyć ilościowo za pomocą przepuszczalnego dla komórek odczynnika DCF-DA i cytometrii przepływowej. Po wychwycie komórkowym DCF-DA jest deacetylowany przez esterazy wewnątrzkomórkowe, a następnie utleniany przez ROS, tworząc wysoce fluorescencyjną 2',7'-dichlorofluoresceinę (DCF). Fluorescencję D...

Ponad 50 lat temu, Hayflick i Moorhead ujawnili, że normalne komórki wchodzą w nieodwracalne zatrzymanie wzrostu po wyczerpaniu ich potencjału proliferacyjnego po pewnej liczbie podziałów komórkowych1. Zjawisko to jest obecnie znane jako starzenie replikacyjne i uważa się, że silnie koreluje ze starzeniem się organizmów2. Chociaż postępująca erozja telomerów jest uważana za główną przyczynę starzenia replikacyjnego, doniesiono, że różne stresy komórkowe, takie jak uszkodzenie DNA, aktywacja onkogenna i stres oksydacyjny, wywołują inny rodzaj starzenia się komórek zwany "przedwczesnym starzeniem" lub "starzeniem się wywołanym stresem". Co ciekawe, przedwczesne starzenie się odgrywa silną rolę hamującą rozwój nowotworu po aktywacji onkogenów, takich jak H-Ras i BRAF. Badania na modelach mysich i tkankach ludzkich dostarczyły mocnych dowodów na to, że biomarkery starzenia się komórek były głównie obecne w zmianach przednowotworowych, w których aktywowane są onkogenne Ras i BRAF, ale były zmniejszone w nowotworach złośliwych, które rozwinęły się z tych zmian3,4,5. W poprzednich badaniach wykazano, że poza rolą w starzeniu się i supresji nowotworów, starzenie się komórek odgrywa rolę w różnych procesach fizjologicznych, w tym w gojeniu się ran, naprawie tkanek, nadzorze immunologicznym i rozwoju embrionalnym6.
Chociaż zatrzymanie wzrostu było szeroko badane jako cecha charakterystyczna starzenia się komórek7, znaczna ilość dowodów sugeruje, że wewnątrzkomórkowe reaktywne formy tlenu (ROS) również przyczyniają się do starzenia się komórek8. Podwyższenie poziomów ROS podczas różnych typów starzenia się komórek, w tym starzenia replikacyjnego i starzenia się wywołanego onkogenami (OIS), zostało pierwotnie zgłoszone kilkadziesiąt lat temu9,10. Bardziej bezpośrednie, egzogenne leczenie subletalną dawkąH2O2 indukuje starzenie się11,12. Hamowanie enzymów wymiatających ROS, takich jak SOD1, również powoduje przedwczesne starzenie się13. W przeciwieństwie do tego, niskie warunki tlenowe w otoczeniu i rosnące wymiatanie ROS opóźniają początek starzenia się10,14,15. Wyniki te niewątpliwie wskazują, że ROS są ważnymi mediatorami lub determinantami indukcji starzenia się komórek. Jednak to, w jaki sposób ROS przyczyniają się do indukcji starzenia się komórek i jak poziomy ROS są podwyższone podczas starzenia się komórek, wymaga dalszych badań.
Ostatnie badania wykazały, że komórki starcze mają silne działanie parakrynne na sąsiednich komórkach i tkankach za pośrednictwem SASP16,17. W starzejącej się tkance komórki starcze sprzyjają dysfunkcjom tkanek związanym z wiekiem poprzez wiele ścieżek poprzez SASP, oprócz autonomicznego zubożenia komórek proliferacyjnych. Różne czynniki prozapalne, takie jak IL-6, IL-8, TGFβ i metaloproteinazy macierzy (MMP), wydzielane przez komórki starcze, powodują związane z wiekiem dysfunkcje tkanek poprzez upośledzenie homeostazy tkanek, zniszczenie architektury tkanki, starzenie się sąsiednich komórek i sterylne zapalenie18,19. Jednak SASP mogą mieć korzystne działanie w zależności od kontekstu biologicznego. Ponadto heterogenetyczny charakter SASP zależy od typu komórki starczej i stadium komórki, co podkreśla potrzebę dalszych badań19.
Tutaj opisujemy szybkie i czułe techniki oparte na cytometrii do oceny wewnątrzkomórkowych poziomów ROS podczas OIS. Ponadto przedstawiono metody analizy czynników SASP z wykorzystaniem ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (qPCR) i ELISA.

<table><tbody><tr><td>ODCZYNNIKI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>poly-L-lizyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>BOSC 23</td><td>ATCC</td><td>CRL-11269</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>penicylina/streptomycyna</td><td>wellgene</td><td>LS202-02</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyclon</td><td>SH30013.02</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO</td><td>12800-082</td><td></td></tr><tr><td>OPTI-MEM&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>pBabe puro-H-RasV12&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>1768</td><td></td></tr><tr><td>pGAG/pol</td><td>Addgene</td><td>14887</td><td></td></tr><tr><td>pVSVG</td><td>Addgene</td><td>1733</td><td></td></tr><tr><td>Turbofect</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0531</td><td></td></tr><tr><td>polibren</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268</td><td>8 mg/mL</td></tr><tr><td>puromycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td><td>2 mg/mL&nbsp;</td></tr><tr><td>formaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>5-bromo-4-chloro-3-indolyl &beta; D-galaktopiranozyd (X-gal)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4252</td><td></td></tr><tr><td>żelazocyjanek potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4252</td><td></td></tr><tr><td>żelazocyjanek potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9387</td><td></td></tr><tr><td>trypsyna-EDTA</td><td>wellgene</td><td>LS015-01</td><td></td></tr><tr><td>DCF-DA</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>D6883</td><td>10 mM&nbsp;</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>MMLV Odwrotna transkryptaza</td><td>Promega</td><td>M1701</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green PCR master 2x mix</td><td>Takara</td><td>PR820A</td><td></td></tr><tr><td>Random Primer</td><td>Promega</td><td>C118A</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Ultraczysta woda destylowana</td><td>Invitrogen</td><td>10977015</td><td></td></tr> Test <tr><td>ELISA u człowieka IL-6</td><td>PeproTech</td><td>#900-TM16</td><td></td></tr><tr><td>Test ELISA u człowieka IL-8</td><td>PeproTech</td><td>#900_TM18</td><td></td></tr><tr><td>EQUIPMENTS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,45 &mu; m filtr strzykawkowy</td><td>sartorius</td><td>16555</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>BEMIS&nbsp;</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>NIKON</td><td>TS100</td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy</td><td>BD Bioscience</td><td>LSR Fortessa</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4ml</td><td>Merk Millipore</td><td>UFC800324</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr NanoDrop</td><td>BioDrop</td><td>80-3006-61</td><td></td></tr><tr><td>System PCR w czasie rzeczywistym</td><td>Applied Biosystems</td><td>ABI Prism 7500</td><td></td></tr><tr><td>ELISA Czytnik</td><td>Molecular Devices</td><td>Czytnik</td><td></td> mikropłytek EMax</tr></tbody></table>

ilościowy pomiar reaktywnych form tlenu i fenotypu wydzielniczego związanego ze starzeniem się w normalnych ludzkich fibroblastach podczas starzenia się wywołanego onkogenem

A Quantitative Measurement of Reactive Oxygen Species and Senescence-associated Secretory Phenotype in Normal Human Fibroblasts During Oncogene-induced Senescence

Starzenie się komórek było uważane za stan nieodwracalnego zatrzymania wzrostu po wyczerpaniu zdolności proliferacyjnych lub wystawieniu na różne stresy. Ostatnie badania rozszerzyły rolę starzenia się komórek na różne procesy fizjologiczne, w tym rozwój, gojenie się ran, nadzór immunologiczny i dysfunkcję tkanek związaną z wiekiem. Chociaż zatrzymanie cyklu komórkowego jest krytyczną cechą charakterystyczną starzenia się komórek, wykazano również, że zwiększona produkcja wewnątrzkomórkowych reaktywnych form tlenu (ROS) odgrywa ważną rolę w indukcji starzenia się komórek. Ponadto ostatnie badania wykazały, że komórki starcze wykazują silne działanie parakrynne na sąsiednie komórki i tkanki poprzez fenotyp wydzielniczy związany ze starzeniem się (SASP). Gwałtowny wzrost zainteresowania strategiami terapeutycznymi przeciwko starzeniu się komórek podkreśla potrzebę precyzyjnego zrozumienia mechanizmów starzenia, w tym wewnątrzkomórkowych ROS i SASP. W tym miejscu opisujemy protokoły ilościowej oceny wewnątrzkomórkowych poziomów ROS podczas starzenia się komórek wywołanego H-Ras przy użyciu barwnika fluorescencyjnego wrażliwego na ROS i cytometrii przepływowej. Ponadto wprowadzamy czułe techniki analizy indukcji ekspresji mRNA i wydzielania czynników SASP. Protokoły te można zastosować do różnych modeli starzenia się komórek.

Przykład starzenia indukowanego przez H-Ras przedstawiono na Rysunku 1. Zakażenie prawidłowych ludzkich fibroblastów WI-38 retrowirusem H-RasV12 wywołało gwałtowne zmiany morfologiczne (Rysunek 1B). Ponadto, jak pokazano na Rysunku 1C, aktywność barwienia SA β-gal znacząco wzrosła po ekspresji H-RasV12. Ponad 70% komórek wykazywało aktywność barwienia SA β-gal 6 d po zakażeniu retrowirusem H-RasV12, ...

Wykazano, że wewnątrzkomórkowy ROS odgrywa ważną rolę w indukcji starzenia się komórek. W tym miejscu opisujemy czuły test do ilościowego określania poziomów ROS podczas starzenia się komórek. Udostępniamy również protokoły oceny fenotypu wydzielniczego związanego ze starzeniem się, który podobno przyczynia się do różnych dysfunkcji związanych z wiekiem.

Ilościowy pomiar reaktywnych form tlenu i fenotypu wydzielniczego związanego ze starzeniem się w normalnych ludzkich fibroblastach podczas starzenia się wywołanego onkogenem

Cellular senescence has been considered a state of irreversible growth arrest upon exhaustion of proliferative capacity or exposure to various stresses. ...

Ogólnym celem tej procedury jest zapewnienie czułych technik monitorowania wewnątrzkomórkowych poziomów ROS i fenotypu wydzielniczego związanego ze starzeniem się lub SASP podczas starzenia się komórek. Tutaj pokazujemy, że metody te z powodzeniem ujawniają wzrost poziomów wewnątrzkomórkowych ROS i czynników SASP IL-6 i IL-8 podczas starzenia się wywołanego przez H-Ras w normalnych ludzkich fibroblastach WI-38. Techniki te umożliwiają monitorowanie zmian wewnątrzkomórkowych poziomów ROS podczas starzenia się komórek oraz analizę ekspresji czynników SASP.Główną zaletą tej metody jest to, że można je zastosować do wielu różnych modeli starzenia się komórek. Dlatego ta metoda może ostatecznie pomóc nam zrozumieć rolę ROS i SASP w starzeniu się komórek oraz zbadać leżące u ich podstaw mechanizmy regulacyjne. Procedurę zademonstrują Young Yeon Kim i Jee-Hyun Um z mojego laboratorium.Rozpocznij tę procedurę od przygotowania retrowirusa H-Ras. Najpierw wysiewaj ekotropowe komórki BOSC w naczyniu hodowlanym pokrytym poli-L-lizyną i hoduj w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze do hodowli tkankowych przez jeden dzień. Następnego dnia należy przetransfekować komórki BOSC retrowirusowym DNA H-Ras i upakować DNA za pomocą odczynnika do transfekcji zgodnie z instrukcjami producenta.Po ośmiu godzinach transfekcji usuń pożywkę transfekcyjną i dodaj osiem mililitrów świeżej pożywki. Zbierz pożywkę zawierającą cząsteczki wirusa 48 godzin później i usuń resztki komórkowe przez odwirowanie. Następnie przefiltruj pożywkę zawierającą wirusa za pomocą filtra strzykawkowego o średnicy 0,45 mikrometra.Umieść komórki WI-38 w 60-milimetrowym naczyniu hodowlanym na dzień przed zbiorem retrowirusa H-Ras i hoduj przez jeden dzień w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze. Następnego dnia usuń pożywkę wzrostową i dodaj jeden mililitr pożywki z wirusem H-Ras. Dodać dodatkowy mililitr pożywki wzrostowej zawierającej dwa mikrolitry roztworu podstawowego polibrenu i inkubować przez jeden dzień w inkubatorze CO2.Po 24 godzinach od zakażenia usuń pożywkę z wirusem, dwukrotnie przemyj komórki PBS i dodaj pożywkę wzrostową. Aby usunąć niezakażone komórki, należy traktować je przez dwa dni dwoma mikrogramami na mililitr puromycyny. Przygotować świeży roztwór barwiący SA beta-gal, rozcieńczając roztwór podstawowy.Usuń pożywkę hodowlaną i przemyj komórki raz PBS. Dodać roztwór utrwalający zawierający formaldehyd i inkubować przez pięć minut. Usunąć roztwór utrwalający z komórek i przemyć PBS.Dodaj świeżo przygotowany roztwór barwiący SA beta-gal, aby przykryć naczynie. Uszczelnij naczynie Parafilmem, aby uniknąć wysuszenia próbki, i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze bez CO2. Następnego dnia sprawdź stan zabarwienia komórek pod mikroskopem.Komórki beta-gal-dodatnie SA będą niebieskie w obszarze okołojądrowym. Uzyskaj obraz barwienia SA beta-gal za pomocą kamery CCD i oblicz procent komórek barwionych SA beta-gal, licząc liczbę komórek SA beta-gal-dodatnich wśród co najmniej 200 wszystkich komórek. Umieść dwa razy 10 do piątego komórki WI-38 na 60-milimetrowej szalce hodowlanej i wywołaj starzenie się poprzez zakażenie komórek retrowirusem H-Ras, jak opisano wcześniej.W żądanym punkcie czasowym pomiaru ROS usuń pożywkę wzrostową i przemyj raz PBS. Odłącz komórki przez traktowanie roztworem trypsyny/EDTA i określ liczbę komórek. Przenieś jedną komórkę razy 10 do piątej do 15-mililitrowej stożkowej probówki i zbierz komórki przez odwirowanie.Ostrożnie usuń pożywkę wzrostową i dodaj jeden mililitr świeżo przygotowanego podłoża barwiącego DCF-DA. Ostrożnie ponownie zawiesić osad komórkowy i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut w ciemności. Zebrać komórki przez odwirowanie i przemyć raz PBS.Ponownie zawiesić komórki jednym mililitrem PBS i przenieść próbki do probówki FACS. Sygnał fluorescencji DCF-DA można zmierzyć za pomocą cytometru przepływowego wyposażonego w niebieski laser o długości 488 nanometrów. Najpierw uruchom niebarwioną próbkę komórki kontrolnej.Na wykresie punktowym rozproszenia do przodu w porównaniu z rozproszeniem bocznym wybierz żywe komórki i wyeliminuj martwe komórki i szczątki komórek za pomocą narzędzia do bramkowania. Następnie na histogramie wyświetlającym sygnał fluorescencji DCF-DA dostosuj napięcie niebieskiego lasera, aby umieścić pik z komórek kontrolnych przy lewej krawędzi. Teraz uruchom każdą próbkę zabarwioną DCF-DA i zarejestruj co najmniej 10 000 zdarzeń.Indukuj starzenie się poprzez zakażenie komórek retrowirusem H-Ras, jak opisano wcześniej. Na jeden dzień przed zbiorem przemyj komórki dwukrotnie PBS. Dodaj trzy mililitry DMEM bez FBS i hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze do hodowli tkankowych przez jeden dzień.Po 24 godzinach zbierz kondycjonowaną pożywkę i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do kolejnego testu ELISA. Trypsynizuj komórki i zbierz je w 1,5-mililitrowej probówce mikrowirówkowej przez odwirowanie. Przygotuj całkowite RNA przy użyciu konwencjonalnej metody ekstrakcji RNA i wygeneruj cDNA z dwóch mikrogramów całkowitego RNA w reakcji odwrotnej transkrypcji.Do PCR w czasie rzeczywistym należy przygotować SYBR Green PCR Master Mix dla wszystkich reakcji zawierających startery do przodu i do tyłu dla IL-6 lub IL-8. Przygotować mieszaninę reakcyjną dla każdej próbki zawierającej startery aktynowe jako kontrolę wewnętrzną. Dodaj 48 mikrolitrów Master Mix i dwa mikrolitry produktów cDNA rozcieńczonych od jednego do trzech do każdego dołka w 96-dołkowej płytce optycznej qPCR.Każdą reakcję należy wykonać w trzech egzemplarzach. Skonfiguruj program reakcji PCR w czasie rzeczywistym na termocyklerze i wykonaj PCR w czasie rzeczywistym. Po zakończeniu cyklu zbierz wartości progowe cyklu lub wartości CT i oblicz poziomy mRNA IL-6 lub IL-8 po normalizacji do poziomów aktyny.Rozmrażanie kondycjonowanych pożywek zebranych wcześniej ze starzejących się komórek WI-38. Usunąć resztki komórek przez odwirowanie przy 500 g przez pięć minut. Zagęścić kondycjonowaną pożywkę 10-krotnie za pomocą filtra odśrodkowego o wielkości porów 3 000 daltonów.Wykonaj test ELISA za pomocą odpowiedniego zestawu do testu ELISA IL-6 lub IL-8. Najpierw dobrze pokryj płytkę ELISA rozcieńczonym przeciwciałem IL-6 lub IL-8, inkubując płytkę przez noc w temperaturze pokojowej. Po czterokrotnym umyciu każdej studzienki dodaj bufor blokujący do każdej studzienki i inkubuj przez godzinę.Umyj talerz cztery razy. Dodać seryjnie rozcieńczone wzorce ELISA lub skoncentrowane kondycjonowane próbki pożywki i inkubować przez dwie godziny. Po umyciu płytki należy inkubować próbki z przeciwciałem drugorzędowym i sekwencyjnie koniugować streptawidynę-HRP.Dodaj 100 mikrolitrów roztworu substratu TMB do każdej studzienki i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 20 minut, aby umożliwić uzyskanie koloru. Zatrzymaj reakcję, dodając roztwór zatrzymujący. Odczytaj absorbancję każdego dołka za pomocą czytnika ELISA przy 450 nanometrach.Wykreśl krzywą standardową dla wygenerowanych standardów. Obliczyć stężenia IL-6 i IL-8 w kondycjonowanym podłożu zgodnie z krzywymi wzorcowymi. Wykreśl wyniki po normalizacji do liczby komórek.Zakażenie normalnych ludzkich fibroblastów WI-38 retrowirusem H-Ras wywołało dramatyczne zmiany w morfologii komórek. Aktywność barwienia beta-galu SA zaobserwowano w ponad 70% komórek, co wskazuje, że ekspresja H-Ras indukuje starzenie się komórek w komórkach WI-38 w ciągu sześciu dni. Analiza barwienia DCF-DA ujawnia, że ekspresja H-Ras indukuje również znaczny wzrost wewnątrzkomórkowych poziomów ROS.Wzrost wewnątrzkomórkowych poziomów ROS obserwuje się już dwa dni po ekspresji H-Ras i utrzymuje się do sześciodniowego punktu czasowego. Analiza PCR w czasie rzeczywistym reprezentatywnych czynników wydzielniczych związanych ze starzeniem IL-6 i IL-8 ujawnia, że ekspresja mRNA IL-6 i IL-8 jest znacznie zwiększona w starzejących się komórkach WI-38. Testy ELISA kondycjonowanej pożywki potwierdziły, że wydzielanie IL-6 i IL-8 jest również zwiększone w komórkach starczych indukowanych przez H-Ras.Wywołanie starzenia się komórek poprzez ekspresję onkogenu, uszkodzenie DNA lub stres oksydacyjny trwa zwykle od sześciu do ośmiu dni. Gdy ogniwa są gotowe, pomiar ROS można przeprowadzić w ciągu dwóch godzin, jeśli zostanie wykonany prawidłowo. Po opanowaniu tych technik analiza poziomów mRNA i białek czynników SASP może zostać zakończona w ciągu jednego dnia.Podczas analizy poziomów ROS i indukcji SASP ważne jest, aby potwierdzić starzenie się komórek poprzez barwienie SA beta-gal i w razie potrzeby dodatkową metodę. Ponadto należy pamiętać, że wzrost ROS następuje we wczesnej fazie starzenia, podczas gdy rozwój SASP jest wykrywalny dopiero po pełnym ustaleniu starzenia. Techniki te można zastosować do szerokiej gamy modeli starzenia się komórek.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak analizować poziomy ROS i indukcję SASP podczas starzenia się komórek.

a-quantitative-measurement-reactive-oxygen-species-senescence

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Ten film ilustruje test oparty na cytometrii przepływowej do ilościowego oznaczania komórek raka starczego wywołanego terapią za pomocą podwójnych markerów starzenia. Wykrywanie i kwantyfikacja komórek starczych wymaga użycia substratu β-galaktozydazy. Substrat jest rozszczepiany przez aktywną lizosomalną β-galaktozydazę w komórkach starczych, wytwarzając produkt fluorescencyjny, który w połączeniu z granulkami autofluorescencyjnej lipofuscyny oznacza starcze komórki rakowe.

Kwantyfikacja starzejących się komórek nowotworowych wywołanych terapią za pomocą cytometrii przepływowej

Czy starzenie się zapobiega lub sprzyja nowotworzenia, pozostaje kwestią sporną. Ponieważ leki chemoterapeutyczne mogą indukować starzenie się komórek rakowych, badanie starzenia się jest niezbędne do zaproponowania nowych terapii. Jednak standardowy i szeroko stosowany test β-galaktozydazy ma poważne wady. Proponujemy tutaj szybki i czuły test oparty na cytometrii przepływowej w celu ilościowego określenia starzenia.

Właściwa metoda ilościowego oznaczania starzejących się komórek rakowych

Starzenie się komórek, nieodwracalny stan zatrzymania cyklu komórkowego, może być wywołane przez różne stresy komórkowe. W tym miejscu opisujemy protokoły indukowania starzenia się komórek oraz metody oceny markerów starzenia.

Techniki indukcji i ilościowego oznaczania starzenia się komórek

Tutaj omawiamy szereg protokołów do indukcji i walidacji starzenia się komórek w hodowanych komórkach. Skupiamy się na różnych bodźcach wywołujących starzenie i opisujemy kwantyfikację powszechnych markerów związanych ze starzeniem się. Przedstawiamy szczegóły techniczne na przykładzie fibroblastów, ale protokoły można dostosować do różnych modeli komórkowych.

Indukcja i walidacja starzenia się komórek w pierwotnych komórkach ludzkich

Starzenie się komórek jest kluczowym czynnikiem w rozwoju przewlekłych patologii związanych z wiekiem. Identyfikacja środków terapeutycznych ukierunkowanych na komórki starcze daje nadzieję na wydłużenie procesu starzenia się w dobrym zdrowiu. W tym miejscu przedstawiamy nowatorski test do badań przesiewowych w celu identyfikacji senoterapeutyków na podstawie pomiaru aktywności związanej ze starzeniem β-galaktozydazy w pojedynczych komórkach.

Test przesiewowy oparty na SA-β-galaktozydazie do identyfikacji leków senoterapeutycznych

Ten protokół opisuje proces metabolicznego znakowania starzejących się i niedzielących się komórek za pomocą pulsacyjnego SILAC, nieukierunkowaną analizę spektrometrii mas i uproszczone obliczanie okresów półtrwania białek.

Pomiar szybkości obrotu białek w starzejących się i niedzielących się hodowanych komórkach z etykietowaniem metabolicznym i spektrometrią mas

Tutaj prezentujemy metodę opartą na cytometrii przepływowej do wizualizacji i kwantyfikacji wielu markerów związanych ze starzeniem się w pojedynczych komórkach.

Jednoczesne obrazowanie i wykrywanie za pomocą cytometrii przepływowej wielu fluorescencyjnych markerów starzenia w starczych komórkach nowotworowych wywołanych terapią

Przedstawiono protokół fluorescencyjnej, cytometrycznej cytometrii przepływowej starzejących się komórek nowotworowych indukowanych przez chemioterapię w hodowli komórkowej lub w mysich modelach nowotworów. Opcjonalne procedury obejmują współbarwienie immunologiczne, utrwalanie próbki w celu ułatwienia analizy dużych partii lub punktów czasowych oraz wzbogacanie żywotnych komórek starczych przez sortowanie metodą cytometrii przepływowej.

Sonda β-galaktozydazy związana ze starzeniem się w kolorze dalekiej czerwieni do identyfikacji i wzbogacania starzejących się komórek nowotworowych za pomocą cytometrii przepływowej

Ten protokół przedstawia mikroskopie konfokalną światła odbitego do obiektywnej, pojedynczej komórkowej detekcji aktywności senescencji związanej z beta-galaktozydazą (SA-β-gal) w frakcji naczyniowej stromy izolowanych z ludzkiego tkanki tłuszczowej. Metoda jest kompatybilna z immunocytochemią, zawiera kontrole pH do oceny ilościowej i dodatkowo zapewnia bardziej wrażliwą i mniej subiektywną alternatywę dla konwencjonalnego barwienia SA-β-gal.

Wykrywanie starzenia się przy użyciu odbitego światła w frakcji naczyniowej tkanki tłuszczowej

Ten artykuł przedstawia protokół LysoTracker dla żywych komórek w celu zmierzenia remodelacji lizosomalnej podczas starzenia się w  fibroblastach ludzkich IMR-90.

Analiza lizosomalna z użyciem LysoTracker do ilościowej oceny starzenia komórkowego w fibroblastach ludzkich

Ta metoda bada, jak senny fibroblast skóry wpływa na zdrowe. Starzenie jest indukowane poprzez ekspozycję na UVB, a uodparniony medium jest stosowany na normalne fibroblasty. Pomaga to ocenić aktywne biologicznie związki, które mają na celu zmienioną komunikację między komórkami w starzeniu się skóry.

Nowela połączenia przeciwutleniaczy do przywrócenia zdrowej komunikacji międzykomórkowej w modelu in vitro przy użyciu pożywki warunkowej z komórek starzejących się

Poznaj metody ilościowego pomiaru reaktywnych form tlenu i fenotypu SASP w ludzkich fibroblastach WI-38 podczas starzenia się wywołanego onkogenem H-Ras. Protokoły te umożliwiają precyzyjną analizę mechanizmów starzenia się komórkowego.

Ilościowy pomiar reaktywnych form tlenu i fenotypu wydzielniczego związanego ze starzeniem się w normalnych ludzkich fibroblastach podczas starzenia się wywołanego onkogenem (Wideo) | JoVE Journal

Ilościowy pomiar reaktywnych form tlenu i fenotypu wydzielniczego związanego ze starzeniem się w normalnych ludzkich fibroblastach podczas starzenia się wywołanego onkogenem

Przeglądaj więcej filmów