Name: Sondowanie mechaniki komórkowej za pomocą pęsety optycznej bez koralików w zarodku Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Poznaj metodę pęsety optycznej bez koralików do sondowania mechaniki komórkowej w zarodku Drosophila. Technika ta umożliwia bezinwazyjne pomiary sił i właściwości reologicznych kontaktów międzykomórkowych podczas morfogenezy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez FRM Equipe Grant FRM DEQ20130326509, Agence Nationale de la Recherche ANR-Blanc Grant, Morfor ANR-11-BSV5-0008 (do P.-F.L.). Wyrażamy uznanie dla infrastruktury France-BioImaging wspieranej przez Francuską Narodową Agencję Badawczą (ANR-10-INBS-04-01, «Inwestycje w przyszłość»). Dziękujemy Brice'owi Detailleurowi i Claude'owi Morettiemu z infrastruktury PICSL-FBI za pomoc techniczną.

<ol><li>Lecuit, T., Lenne, P. -F., Munro, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+generation%2C+transmission%2C+and+integration+during+cell+and+tissue+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+cell+and+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Force generation, transmission, and integration during cell and tissue morphogenesis.</a> Annual review of cell and developmental biology. 27 (1), 157-184 (2011).</li>
<li>Heisenberg, C. -P., Bellaïche, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forces+in+tissue+morphogenesis+and+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Forces in tissue morphogenesis and patterning.</a> Cell. 153 (5), 948-962 (2013).</li>
<li>Sugimura, K., Lenne, P. -F., Graner, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+forces+and+stresses+in+situ+in+living+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Measuring forces and stresses in situ in living tissues.</a> Development. 143 (2), Cambridge, England. 186-196 (2016).</li>
<li>Campàs, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+toolbox+to+explore+the+mechanics+of+living+embryonic+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+cell+%26+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">A toolbox to explore the mechanics of living embryonic tissues.</a> Seminars in cell & developmental biology. 55, 119-130 (2016).</li>
<li>Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+forces+contribute+to+cell+sheet+morphogenesis+for+dorsal+closure+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila.</a> Journal of Cell Biology. 149 (2), 471-490 (2000).</li>
<li>Farhadifar, R., Roper, J. C., Aigouy, B., Eaton, S., Julicher, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+cell+mechanics%2C+cell-cell+interactions%2C+and+proliferation+on+epithelial+packing%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The influence of cell mechanics, cell-cell interactions, and proliferation on epithelial packing.</a> Current Biology. 17 (24), 2095-2104 (2007).</li>
<li>Rauzi, M., Verant, P., Lecuit, T., Lenne, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nature+and+anisotropy+of+cortical+forces+orienting+Drosophila+tissue+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+biology%22%5BJournal%5D)">Nature and anisotropy of cortical forces orienting Drosophila tissue morphogenesis.</a> Nature Cell biology. 10 (12), 1401-1410 (2008).</li>
<li>Ma, X., Lynch, H. E., Scully, P. C., Hutson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+embryonic+tissue+mechanics+with+laser+hole+drilling%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Biology%22%5BJournal%5D)">Probing embryonic tissue mechanics with laser hole drilling.</a> Physical Biology. 6 (3), 036004(2009).</li>
<li>Hutson, M. S., Tokutake, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forces+for+morphogenesis+investigated+with+laser+microsurgery+and+quantitative+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Forces for morphogenesis investigated with laser microsurgery and quantitative modeling.</a> Science. 300 (5616), 145-149 (2003).</li>
<li>Bonnet, I., Marcq, P., Bosveld, F., Fetler, L., Bellaïche, Y., Graner, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+state%2C+material+properties+and+continuous+description+of+an+epithelial+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society%2C+Interface+%2F+the+Royal+Society%22%5BJournal%5D)">Mechanical state, material properties and continuous description of an epithelial tissue.</a> Journal of the Royal Society, Interface / the Royal Society. 9 (75), 2614-2623 (2012).</li>
<li>Etournay, R., Popović, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+of+cell+dynamics+and+epithelial+tension+during+morphogenesis+of+the+Drosophila+pupal+wing%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Interplay of cell dynamics and epithelial tension during morphogenesis of the Drosophila pupal wing.</a> eLife. 4, e07090(2015).</li>
<li>Rauzi, M., Lenne, P. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+forces+in+cell+shape+changes+and+tissue+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+topics+in+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Cortical forces in cell shape changes and tissue morphogenesis.</a> Current topics in developmental biology. 95, 93-144 (2011).</li>
<li>Saha, A., Nishikawa, M., Behrndt, M., Heisenberg, C. -P., Jülicher, F., Grill, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+Physical+Properties+of+the+Cell+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Determining Physical Properties of the Cell Cortex.</a> Biophysical journal. 110 (6), 1421-1429 (2016).</li>
<li>Desprat, N., Supatto, W., Pouille, P. A., Beaurepaire, E., Farge, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+deformation+modulates+twist+expression+to+determine+anterior+midgut+differentiation+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+cell%22%5BJournal%5D)">Tissue deformation modulates twist expression to determine anterior midgut differentiation in Drosophila embryos.</a> Developmental cell. 15 (3), 470-477 (2008).</li>
<li>Mitrossilis, D., Röper, J. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransductive+cascade+of+Myo-II-dependent+mesoderm+and+endoderm+invaginations+in+embryo+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Mechanotransductive cascade of Myo-II-dependent mesoderm and endoderm invaginations in embryo gastrulation.</a> Nature Communications. 8, 13883(2017).</li>
<li>Campàs, O., Mammoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+cell-generated+mechanical+forces+within+living+embryonic+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantifying cell-generated mechanical forces within living embryonic tissues.</a> Nature Methods. 11 (2), 183-189 (2013).</li>
<li>Serwane, F., Mongera, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+quantification+of+spatially+varying+mechanical+properties+in+developing+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo quantification of spatially varying mechanical properties in developing tissues.</a> Nature Methods. 14 (2), 181-186 (2017).</li>
<li>Chiou, K. K., Hufnagel, L., Shraiman, B. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stress+inference+for+two+dimensional+cell+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+computational+biology%22%5BJournal%5D)">Mechanical stress inference for two dimensional cell arrays.</a> PLoS computational biology. 8 (5), e1002512(2012).</li>
<li>Ishihara, S., Sugimura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bayesian+inference+of+force+dynamics+during+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+theoretical+biology%22%5BJournal%5D)">Bayesian inference of force dynamics during morphogenesis.</a> Journal of theoretical biology. 313, 201-211 (2012).</li>
<li>Brodland, G. W., Veldhuis, J. H., Kim, S., Perrone, M., Mashburn, D., Hutson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellFIT%3A+a+cellular+force-inference+toolkit+using+curvilinear+cell+boundaries%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">CellFIT: a cellular force-inference toolkit using curvilinear cell boundaries.</a> PLoS ONE. 9 (6), e99116(2014).</li>
<li>Svoboda, K., Block, S. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7919782">Biological applications of optical forces.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 23, 247-285 (1994).</li>
<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li>
<li>Bambardekar, K., Clément, R., Blanc, O., Chardès, C., Lenne, P. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+laser+manipulation+reveals+the+mechanics+of+cell+contacts+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Direct laser manipulation reveals the mechanics of cell contacts in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2015).</li>
<li>Clément, R., Dehapiot, B., Collinet, C., Lecuit, T., Lenne, P. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscoelastic+Dissipation+Stabilizes+Cell+Shape+Changes+during+Tissue+Morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Viscoelastic Dissipation Stabilizes Cell Shape Changes during Tissue Morphogenesis.</a> Current biology: CB. 27 (20), (2017).</li>
<li>Chardès, C., Ménélec, P., Bertrand, V., Lenne, P. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Setting-up+a+simple+light+sheet+microscope+for+in+toto+imaging+of+C.+elegans+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%22%5BJournal%5D)">Setting-up a simple light sheet microscope for in toto imaging of C. elegans development.</a> Journal of visualized experiments. 87, e51342(2014).</li>
<li>Serge, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+multiple-target+tracing+to+probe+spatiotemporal+cartography+of+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes.</a> Nature Methods. 5 (8), 687-694 (2008).</li>
<li>Cavey, M., Lecuit, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Cellular+and+Molecular+Dynamics+in+Live+Embryos+Using+Fluorescent+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Drosophila%22%5BJournal%5D)">Imaging Cellular and Molecular Dynamics in Live Embryos Using Fluorescent Proteins.</a> Drosophila. 420, 219-238 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Pęseta optyczna pozwala w sposób nieinwazyjny na wykonywanie bezwzględnych pomiarów mechanicznych bezpośrednio w rozwijającym się nabłonku zarodkowym. W tym sensie ma przewagę nad innymi metodami, takimi jak ablacja laserowa, która jest inwazyjna i zapewnia względne pomiary, siły magnetyczne, które wymagają wstrzyknięć, lub wnioskowanie o sile, które opiera się na silnych założeniach, a także zapewnia względne pomiary.
Protokół obejmuje kilka krytycznych kroków. Po pierwsze, ponieważ soczewka ...

Rozwój embrionalny to wysoce powtarzalny proces, podczas którego komórki i tkanki deformują się, aby ukształtować przyszłe zwierzę. Wykazano, że takie deformacje wymagają aktywnego generowania sił na poziomie komórki1,2. Aby zrozumieć procesy morfogenetyczne, podczas których komórki i tkanki zmieniają swój kształt, kluczowa jest zatem ocena właściwości mechanicznych zaangażowanych komórek oraz zmierzenie sił w tkance podczas tego procesu3,4. Warstwy nabłonkowe, zwłaszcza u Drosophila, były szeroko badane ze względu na ich geometrię quasi-2D i łatwą manipulację.
W związku z tym wiele technik zostało opracowanych przez nas i innych do oceny mechaniki nabłonka in vivo podczas rozwoju. Przedstawimy krótki przegląd trzech głównych technik stosowanych w tkankach nabłonkowych. Ablacja laserowa, szeroko stosowana metoda, pozwala na ujawnienie miejscowego naprężenia mechanicznego na połączeniach komórkowych5,6,7,8 lub na większą skalę9,10,11 wykonując lokalne cięcia, które zaburzają integralność mechaniczną celu. Dynamika otworu po cięciu dostarcza informacji zarówno o naprężeniu poprzedzającym ablację, jak i o reologii tkanki12,13. Wadą ablacji laserowej jest to, że jest inwazyjna, ponieważ wymaga lokalnego przerwania kory komórkowej. W związku z tym można wykonać tylko ograniczoną liczbę ablacji, jeśli chce się zachować integralność tkanki. Inną wadą jest to, że ablacje dostarczają tylko względnych szacunków napięcia na styku komórek, ponieważ prędkość otwierania zależy od tarcia lepkiego, które na ogół nie jest znane. Manipulacja magnetyczna została również opracowana i stosowana u Drosophila, obejmując użycie ferrofluidów14 lub liposomów ultramagnetycznych15. Mogą one zapewniać pomiary bezwzględne16,17, ale są również inwazyjne w tym sensie, że wymagają wstrzyknięcia sond w żądane miejsce. Może to być bardzo trudne w zależności od systemu, który nie zawsze jest podatny na precyzyjne wstrzyknięcia. Trzecią techniką, w pełni nieinwazyjną, jest wnioskowanie siłowe18,19,20. Wnioskowanie o sile opiera się na założeniu równowagi mechanicznej w punktach potrójnych (połączeniach trójkomórkowych lub wierzchołkach) i pozwala wywnioskować napięcia na wszystkich stykach komórka-komórka (i ewentualnie ciśnienia we wszystkich komórkach) poprzez rozwiązanie problemu odwrotnego. W przypadku naprężeń każdy wierzchołek zawiera dwa równania (X i Y). W ten sposób powstaje duży układ równań liniowych, które w pewnych warunkach można odwrócić, aby ocenić napięcie we wszystkich kontaktach komórek. Chociaż ta metoda jest bardzo atrakcyjna, ponieważ wymaga jedynie obrazu podzielonego na segmenty i nie wymaga dodatkowego eksperymentu ani konfiguracji, jej dokładność nie została jeszcze określona i ponownie zapewnia tylko wartości względne, chyba że zostanie wykonany bezwzględny pomiar kalibracyjny.
Aby przezwyciężyć niektóre z tych ograniczeń, wprowadzamy w tym artykule zestaw pęsety optycznej połączonej z mikroskopem z arkuszem świetlnym, aby przyłożyć kontrolowane siły na skali komórkowej w nabłonku embrionalnym Drosophila melanogaster. Pęseta optyczna była używana do wielu zastosowań biologicznych, w tym do pomiarów pojedynczych białek oraz manipulacji organellami i komórkami21. Podajemy tu przyłożone siły w zakresie kilkudziesięciu pN, co jest niewielkie, ale wystarczające do wywołania lokalnych deformacji kontaktów komórkowych i wykonania pomiarów mechanicznych in vivo. Zazwyczaj używamy prostopadłego odchylenia styków komórek, monitorowanego za pomocą analizy kymogramów, aby powiązać siłę z odkształceniem. Co ważne, nasz zestaw nie wymaga wstrzykiwania kulek w pożądane miejsce w tkance, ponieważ pęseta optyczna jest w stanie bezpośrednio wywierać siły na kontakty komórka-komórka. Sprzężenie pęsety optycznej z mikroskopem arkuszowym światła pozwala na szybkie obrazowanie (kilka klatek na sekundę), co jest bardzo przydatne w przypadku analizy mechanicznej w krótkich skalach czasowych i przy zmniejszonej fototoksyczności, ponieważ oświetlenie próbki jest ograniczone do płaszczyzny obrazowania22.
Ogólnie rzecz biorąc, pęsety optyczne są nieinwazyjnym sposobem na przyłożenie kontrolowanych sił do kontaktów komórkowych in vivo w zarodku Drosophila oraz na wydobycie informacji mechanicznych, takich jak sztywność i napięcie na styku komórki23, właściwości reologiczne24, oraz gradient lub anizotropia napięcia23.

<table><tbody><tr><td>Laser światłowodowy iterbowy LP, 10 W, CW</td><td>IPG Laser</td><td>YLM-10-LP-SC</td><td>wraz z kolimatorem LP: wiązka D = 1,6 mm i czerwony laser prowadzący</td></tr> <tr><td>& Oslash; Migawka wiązki optycznej 1/2 "</td><td>Thorlabs</td><td>SH05</td><td></td></tr><tr><td>Systemy galwanometryczne o małej średnicy wiązki</td><td>Thorlabs</td><td>GVS001</td><td>1 dla przemieszczenia X, 1 dla przemieszczenia Y</td></tr><tr><td>Zasilacz liniowy 1D lub 2D Galvo System Galwanometry</td><td>Thorlabs</td><td>GPS011</td><td>zasilanie</td></tr><tr><td>2 soczewki f = 30 mm</td> Teleskop przekaźnikowy <td>Thorlabs</td><td>LB1757-B</td><td>między 2 galwami</td></tr><tr><td>Soczewka f = 200 mm</td><td>Teleskop Thorlabs</td><td>LB1945-B</td><td>2.5X</td></tr><tr><td>Obiektyw f = 500 mm</td><td>Teleskop Thorlabs</td><td>LB1869-B</td><td>2.5X</td></tr><tr><td>Kątowe kinematyczne zwierciadło eliptyczne z gwintowanymi otworami na pręty klatkowe</td><td>Peryskopowe</td>okulary ochronne <td>Thorlabs</td><td>KCB1E</td></tr><tr><td>, jasnozielone soczewki, przepuszczalność światła widzialnego 59%, uniwersalny styl</td><td>Thorlabs</td><td>LG1</td><td></td></tr><tr><td>45&deg; AOI, średnica 50.0 mm, gorące lustro</td><td>Edmund Optics</td><td>#64-470</td><td></td></tr><tr><td>Emiter wielofotonowy HC 750/S</td><td>AHF</td><td>HC 750/SP</td><td></td></tr><tr><td>Obudowa CompactDAQ</td><td>National Instruments</td><td>cDAQ-9178</td><td></td></tr><tr><td>Moduł wyjściowy napięcia serii C</td><td>National Instruments</td><td>NI-9263</td><td>Moduł wyjść analogowych</td></tr><tr><td>Moduł wejściowy napięcia serii C</td><td>National Instruments</td><td>NI-9215</td><td>Moduł wejść analogowych</td></tr><tr><td>FluoSpheres Mikrosfery modyfikowane karboksylanem, 0,5 i mikro; m, czerwona fluorescencyjna (580/605), 2% ciał stałych</td><td>Koraliki kalibracyjne</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F8812</td></tr><tr><td>C++ (Qt) domowe oprogramowanie</td><td></td><td></td> pęsety optycznej <td>opracowane przez Oliviera Blanca i Claire Chard&egrave;s. Alternatywne rozwiązanie: labview</td></tr></tbody></table>

sondowanie mechaniki komórkowej za pomocą pęsety optycznej bez koralików w zarodku drosophila

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Morfogeneza wymaga koordynacji między wzorcami genetycznymi a siłami mechanicznymi, aby solidnie kształtować komórki i tkanki. W związku z tym wyzwaniem dla zrozumienia procesów morfogenetycznych jest bezpośredni pomiar sił komórkowych i właściwości mechanicznych in vivo podczas embriogenezy. Prezentujemy tutaj zestaw pęsety optycznej sprzężonej z mikroskopem arkuszowym, który pozwala na bezpośrednie przyłożenie sił do kontaktów komórka-komórka wczesnego zarodka Drosophila, podczas obrazowania z prędkością kilku klatek na sekundę. Technika ta ma tę zaletę, że nie wymaga wstrzykiwania do zarodka koralików, zwykle stosowanych jako sondy pośrednie, na które wywierane są siły optyczne. Szczegółowo opisujemy krok po kroku implementację konfiguracji i proponujemy narzędzia do wydobywania informacji mechanicznych z eksperymentów. Monitorując przemieszczenia kontaktów komórka-komórka w czasie rzeczywistym, można wykonywać pomiary naprężeń i badać reologię kontaktów komórkowych.

Rysunek 5 przedstawia dane eksperymentalne uzyskane poprzez nadanie pułapce ruchu sinusoidalnego. Pułapka powoduje odchylenie interfejsu, co zilustrowano na 3 migawkach pokazujących 3 kolejne pozycje interfejsu (Rysunek 5A)23. Nagrane filmy służą do wygenerowania kymografu (Rysunek 5B>) i są następnie analizowane w celu wyznaczenia pozycji interfejsu z rozdzielczością subpikse...

Prezentujemy zestaw pęsety optycznej sprzężonej z mikroskopem z arkuszem świetlnym oraz jej implementację do badania mechaniki komórkowej bez koralików w zarodku Drosophila.

Sondowanie mechaniki komórkowej za pomocą pęsety optycznej bez koralików w zarodku Drosophila

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące mechaniki tkankowej, takie jak to, jak zmieniają się właściwości kontaktów komórkowych w czasie i przestrzeni podczas morfogenezy tkanek. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest słabo inwazyjna i jest kompatybilna z obrazowaniem na żywo, takim jak mikroskopia arkuszowa. Ta technika nie wymaga wstrzykiwania kulek w tkankę.Zwykle używane jako sondy demiare, na których można uzyskać zamrożenie, jestem podekscytowany. Proces ten zademonstrują Chardes, inżynier, i Raphael Clement, naukowiec z mojego poziomu terenu. Aby rozpocząć, ustaw pionowy mikroskop do mikroskopii świetlnej w poziomej równinie, a następnie przygotuj laser i optykę, aby działały jako pęseta optyczna.Następnie wlej jeden mikrolitr 500-nanometrowych kulek fluorescencyjnych do szklanej kuwety i dodaj 10 mililitrów wody destylowanej. Umieść kuwetę w uchwycie kuwety pod obiektywem i ustaw ostrość obiektywu tak, aby obiektyw dotykał powierzchni wody. Teraz otwórz Kreator Zintegrowanego Środowiska Programistycznego QT, który służy do sterowania oprogramowaniem do akwizycji.Otwórz oprogramowanie do akwizycji, otwierając profil microRheo., a następnie włącz t

probing-cell-mechanics-with-bead-free-optical-tweezers-drosophila

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Niniejszy protokół opisuje zastosowanie mikroiniekcji i obrazowania o wysokiej rozdzielczości w zarodku syncytialnym Drosophila melanogaster w celu badania mitozy.

Techniki mikroiniekcji do badania mitozy w embrionie syncytialnym Drosophila melanogaster

Kinetochor jest miejscem, w którym SAC inicjuje swój sygnał monitorujący segregację mitotyczną siostrzanych chromatyd. Opisano metodę wizualizacji rekrutacji i wymiany jednego z białek kinetochoru oraz jej koordynacji z ruchem chromosomów w embrionach Drosophila przy użyciu laserowego skanującego systemu konfokalnego Leica.

Badanie punktu kontrolnego mitozy poprzez obrazowanie dynamicznego zachowania białek kinetochorowych i ruchu chromosomów w żywych zarodkach syncytialnych Drosophila

Prezentujemy technikę oznaczania pojedynczych neuronów w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) zarodków Drosophila, która pozwala na analizę morfologii neuronów za pomocą światła przechodzącego lub mikroskopii konfokalnej.

Znakowanie pojedynczych komórek w ośrodkowym układzie nerwowym Drosophila melanogaster

Brak narzędzi do pomiaru właściwości materiału i parametrów rozciągania in vivo uniemożliwia walidację ich ról podczas rozwoju. Zastosowaliśmy mikroskopię sił atomowych (AFM) i śledzenie nanocząstek, aby określić ilościowo cechy mechaniczne nienaruszonej komórki żółtka zarodka danio pręgowanego podczas epibolii. Metody te są niezawodne i mają szerokie zastosowanie, unikając inwazyjnych interwencji.

AFM i mikroreologia w komórkach żółtka zarodka danio pręgowanego

Siły mechaniczne są ważne dla kontrolowania migracji komórek. Protokół ten demonstruje użycie elastycznych hydrożeli, które można odkształcić za pomocą szklanej mikropipety i mikromanipulatora w celu stymulacji komórek za pomocą lokalnego gradientu sztywności w celu wywołania zmian w strukturze komórki i migracji.

Test durotaksji pojedynczej komórki do oceny mechanicznej kontroli ruchu komórkowego i powiązanych zdarzeń sygnalizacyjnych

Prezentowany tutaj jest protokół mikroiniekcji i jednoczesnego obrazowania wielu zarodków Drosophila podczas rozwoju embrionalnego za pomocą obrazowania o wysokiej zawartości na płytce.

Przygotowanie zarodków Drosophila i mikroiniekcja do mikroskopii żywych komórek wykonana przy użyciu automatycznego analizatora o wysokiej zawartości

Celem tego protokołu jest pokazanie, jak przeprowadzić ulepszony test mechanicznej nocycepcji u larw Drosophila. Używamy tutaj testu, aby wykazać, że nadwrażliwość mechaniczna (allodynia i hiperalgezja) występuje u larw Drosophila.

Ulepszony test i narzędzia do pomiaru mechanicznej nocycepcji u larw Drosophila

Tutaj prezentujemy protokół do badania wewnątrzkomórkowych właściwości mechanicznych izolowanych embrionalnych komórek zebrytanicznego danio pręgowanego w trójwymiarowym zamknięciu z bezpośrednim pomiarem siły przez pułapkę optyczną.

Bezpośrednie pomiary siły mechaniki subkomórkowej w zamknięciu za pomocą pęsety optycznej

We wczesnym zarodku Drosophila wiele organelli jest ruchliwych. Zasadniczo można je obrazować na żywo za pomocą specjalnych sond fluorescencyjnych, ale skorupka jaja uniemożliwia bezpośrednie zastosowanie do zarodka. Protokół ten opisuje, w jaki sposób wprowadzić takie sondy za pomocą mikroiniekcji, a następnie analizować ruch organelli masowych za pomocą prędkości obrazu cząstek.

Wizualizacja zależnego od cytoszkieletu transportu organelli zawierających lipidy w zarodkach Drosophila

Kurczliwość aktomyozyny odgrywa ważną rolę w morfogenezie komórek i tkanek. Jednak trudno jest dokładnie manipulować kurczliwością aktomiozyny in vivo. Protokół ten opisuje system optogenetyczny, który szybko hamuje kurczliwość aktomiozyny za pośrednictwem Rho1 w zarodkach Drosophila, ujawniając natychmiastową utratę napięcia nabłonka po inaktywacji aktomiozyny in vivo.

Optogenetyczne hamowanie kurczliwości aktomyozyny za pośrednictwem Rho1 w połączeniu z pomiarem napięcia nabłonka w zarodkach Drosophila

Protokoły te określają, jak scharakteryzować organizację i funkcję zakrywającą złączeń przegrody plisowanej u nabłonka embrionalnego kontrolnego oraz mutacyjnego nabłonka embrionalnego Drosophila.

Eksperymenty immunobarwienia i penetracji barwnika w celu określenia białek styku przegrody w nabłonku embrionalnym Drosophila

Poznaj metodę pęsety optycznej bez koralików do sondowania mechaniki komórkowej w zarodku Drosophila. Technika ta umożliwia bezinwazyjne pomiary sił i właściwości reologicznych kontaktów międzykomórkowych podczas morfogenezy.

Sondowanie mechaniki komórkowej za pomocą pęsety optycznej bez koralików w zarodku Drosophila

Przeglądaj więcej filmów