Name: Platforma mikrofizjologiczna dla ludzkiego tłuszczu: warstwowa biała tkanka tłuszczowa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Poznaj metodę utrzymywania ludzkiej białej tkanki tłuszczowej w kulturze przez osiem tygodni. Ta technika umożliwia badanie biologii tkanki tłuszczowej w kontrolowanych warunkach in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy pragną podziękować za wsparcie instytucjonalne udzielone przez Centrum Nauk o Zdrowiu LSU, które sfinansowało projekt.

Wszystkie zadania zostały wykonane zgodnie z protokołami #8759 i #9189, zatwierdzonymi przez Biuro IRB LSUHSC-NO. Wszystkie prace na zwierzętach zostały wykonane zgodnie z protokołem #3285 zatwierdzonym przez Biuro IACUC w LSUHSC-NO.
1. Wysiewanie arkuszy komórek warstwowych
UWAGA: Zobacz Rysunek 1.
<ol>
	<li>Wysiewaj ADSC przy około 80% zbiegu na płytkach do hodowli tkankowych (płytki 6 cm lub 6-dołkowe). Dla każdej wymaganej studzienki SWAT należy wysiać 1 konwencjonalną studzienkę do hodowli tkankowej i 1 studzienkę o odpowiedniej wielkości na plastikowej płytce do hodowli tkankowej pokrytej poli(N-izopropyloakrylamidem (pNIPAAm). 
	UWAGA: W związku z tym 6-dołkowa płytka SWAT będzie wymagała wysiewu komórek na jednej 6-dołkowej standardowej płytce do hodowli tkankowej (warstwa podstawowa) i jednej 6-dołkowej płytce do hodowli tkankowej pokrytej pNIPAAm (górna warstwa). Płyty powlekane pNIPAAm można kupić komercyjnie lub wyprodukować w laboratorium12,13,14.</li>
	<li>Utrzymuj ADSC w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w zmodyfikowanym pożywce Eagle (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 10% FBS i 1x penicyliną/streptomycyną. Zmieniaj nośniki co 2 dni.</li>
	<li>Pozwól komórkom połączyć się, aż staną się w 100% zlewające się i przyjmą prążkowany wzór (około 6-8 dni). 
	UWAGA: Komórki te będą musiały funkcjonować jako pojedynczy nienaruszony arkusz komórek, aby ustabilizować wyporną tkankę tłuszczową. Niewystarczająco zlewające się komórki ulegną fragmentacji po wysiewie za pomocą WAT.</li>
</ol>
2. Przygotowanie zaopatrzenia SWAT
<ol>
	<li>Przygotuj kilka 10 ml porcji 1x Zbilansowanego Roztworu Soli Hanka (HBSS); Przygotuj tyle, aby uzyskać żądaną liczbę płytek z zapasem objętości.</li>
	<li>Przygotuj aparat nurnikowy do wysiewu SWAT. Zbuduj tłok z prostych akrylowych tworzyw sztucznych, składających się z trzpienia przymocowanego do okrągłego dysku. Upewnij się, że mieści się w obwodzie dołka do hodowli tkankowej (średnica: <6 cm dla płytki 6 cm, <3,5 cm dla płytki 6-dołkowej; przybliżona masa: 6,7 g dla płytki 6 cm, 5,1 g dla płytki 6-dołkowej).
	<ol>
		<li>Przygotuj dodatkowe tłoki, aby zapewnić płynny przebieg procedury w przypadku wystąpienia problemu z którymkolwiek z pojedynczych tłoków.</li>
		<li>Owinąć taśmę laboratoryjną wokół krawędzi tłoka, co najmniej 2 razy, aby zapobiec wyciekowi roztworu żelatyny.</li>
		<li>Spryskaj komorę bezpieczeństwa biologicznego (BSC) 70% EtOH. Spryskaj stożkowy stojak na probówki o pojemności 15 ml wewnątrz BSC pustymi, niezakorkowanymi stożkowymi probówkami o pojemności 15 ml; Rurki pomogą zabezpieczyć umieszczenie tłoków żelatynowych.</li>
		<li>Spryskaj dokładnie każdy tłok owinięty taśmą 70% EtOH i umieść w stożkowej tubie o pojemności 15 ml na stojaku. Spryskaj metalowe podkładki (przybliżona masa 6,3 g) i umieść je na stojaku wraz z parą haczykowatych kleszczy; podkładki dociążą tłoki podczas wysiewu SWAT.</li>
		<li>Zamknij skrzydło BSC i włącz światło UV, aby ułatwić suszenie i sterylizację. 
		UWAGA: Najlepiej przeprowadzić ten krok 24 godziny przed siewem SWAT. Alternatywnie, przeprowadź proces w dniu pobrania tkanki/wysiewu SWAT; jednak w takim przypadku należy odczekać 15–45 minut na suszenie/sterylizację UV.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie tłoków żelatynowych — zastosowanie do górnych arkuszy komórkowych
<ol>
	<li>Podgrzać łaźnię wodną do temperatury 75 °C.</li>
	<li>Przygotuj roztwór żelatyny, dodając 0,75 g żelatyny w proszku do 10 ml bulionu 1x HBSS. Pod wyciągiem dodać 100 μl 1 M NaOH w celu zrównoważenia pH roztworu.
	<ol>
		<li>Dodaj 10 ml bulionu do łaźni wodnej i energicznie wstrząsaj co 5 minut, aż proszek rozpuści się w roztworze. Staraj się rozpuścić sproszkowaną żelatynę wkrótce po dodaniu do podgrzanej łaźni wodnej.</li>
		<li>Włącz dmuchawę BSC, wyłącz światło UV i podnieś skrzydło. Spryskaj powierzchnię BSC i przygotuj zapasy filtrów (strzykawki luer-lock 5 ml i filtry strzykawkowe 0,2 μm). Przygotuj wiele filtrów, aby skutecznie przecedzić wystarczającą ilość żelatyny do nałożenia na tłoki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Gdy roztwór żelatyny osiągnie jednorodną konsystencję, przefiltrować roztwór i nałożyć go na tłoki. Naładować strzykawkę żelatyną. Nanieść żelatynę na plastikowe tłoki przez filtr strzykawkowy (~2,5 ml dla płytki 6-dołkowej, ~4,5 ml dla naczynia 6 cm) i pozostawić do zestalenia (~20 min).</li>
	<li>Gdy żelatyna stwardnieje, odwiń taśmę od krawędzi tłoków. Za pomocą haczykowatych kleszczy usunąć żelatynę z zewnętrznej krawędzi tłoka (tj. z podniesionych krawędzi menisku). Upewnij się, że pozostała żelatyna w środku tłoka jest całkowicie wypoziomowana, aby zmaksymalizować kontakt z arkuszem ADSC.</li>
	<li>Po usunięciu nadmiaru żelatyny delikatnie nałóż tłoki żelatyny na płytki ADSC pokryte pNIPAAm. Użyj metalowych podkładek, aby obciążyć tłok. Nie ścinać arkuszy komórek podczas nakładania tłoków.</li>
	<li>Pozostawić tłoki na arkuszach komórek na 1,5 godziny w temperaturze pokojowej. Inkubować płytki/tłoki w lodowatej kąpieli wodnej przez 1,5 godziny, aby całkowicie oddzielić arkusz komórek od powierzchni płytki pokrytej pNIPAAm.
	<ol>
		<li>Zachowaj ostrożność podczas inkubacji w łaźni lodowej; nie pozwól, aby kąpiel lodowa zanieczyściła pożywkę komórkową podczas inkubacji.</li>
		<li>Po zakończeniu inkubacji należy oczyścić spód płytek pokrytych pNIPAAm, aby usunąć niesterylną wodę.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Przetwarzanie białej tkanki tłuszczowej
<ol>
	<li>Podczas pobierania ludzkiej tkanki tłuszczowej z sali operacyjnej należy przechowywać wszystkie próbki w sterylnym pojemniku, który znajduje się na lodzie, do czasu zasiania SWAT. Dodaj sterylne pożywki konserwacyjne, takie jak sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), do pojemnika na tkankę tłuszczową, aby zapewnić stabilność tkanek.</li>
	<li>Dodać pożywkę do hodowli zimnokomórkowych do 1,5 ml probówek mikrowirówkowych dla każdego dołka/naczynia do wysiewu (100 μl dla płytki 6-dołkowej, 200 μl dla płytki 6 cm).</li>
	<li>Zmiel tkankę tłuszczową.
	<ol>
		<li>W przypadku stałych segmentów tkanki tłuszczowej wykonaj następujące czynności.
		<ol>
			<li>Umyj duże segmenty tkanki tłuszczowej 3x w sterylnym PBS i usuń jak najwięcej PBS.</li>
			<li>Grubo zmiel tkankę za pomocą kleszczy i sterylnej maszynki do golenia i usuń jak najwięcej układu naczyniowego i powięzi (więcej szczegółów w Dyskusji).</li>
			<li>Drobno zmielić tłuszcz brzytwą, aż zmielona tkanka nabierze gęstej, płynnej konsystencji. 
			UWAGA: Idealnie byłoby, gdyby tkanka wydawała się jednorodna, bez widocznych pojedynczych segmentów WAT, chociaż nie zawsze jest to możliwe.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przetwarzaj lipoaspirat w następujący sposób.
		<ol>
			<li>Pod BSC przyklej sterylną gazę na wierzchu zlewki i umieść tę zlewkę w większej zlewce, aby zebrać nadmiar płynu.</li>
			<li>Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 25 ml pobrać tyle lipoaspiratu, ile potrzeba i nałożyć go na powierzchnię sterylnej gazy. Nałóż PBS bezpośrednio na tę powierzchnię, aby zmyć tłuszcz lipopaspirowany i usunąć nadmiar krwi i pozostałości lipidów.</li>
			<li>Użyj kleszczy, aby odzyskać odsączoną tkankę, przenieś ją na sterylną powierzchnię do mielenia mięsa i zmiel lipoaaspirat.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj sterylnej maszynki do golenia, aby odciąć dystalny koniec końcówek pipet p1000, aby przenieść zmieloną tkankę; zminimalizuje to naprężenia ścinające, które mogą prowadzić do lizy adipocytów. Po osiągnięciu odpowiedniej konsystencji tkanki przenieś żądaną objętość zmielonej tkanki do każdej probówki o pojemności 1,5 ml (300–400 μl dla płytki 6-dołkowej, 500–600 μl dla płytki 6 cm). Krótko wymieszaj zmielony WAT i podłoże w probówkach.</li>
	<li>Weź podstawowe płytki ADSC i zdekantuj/zassaj pożywkę. Zastąp pożywkę mieszaniną WAT/pożywka z każdej probówki o pojemności 1.5 ml.
	<ol>
		<li>Delikatnie usunąć tłoki żelatynowe z płytek pokrytych pNIPAAm i nałożyć je na mieszaninę WAT na płytkach ADSC na podstawie. Zbadaj monowarstwę płytek pokrytych pNIPAAm pod mikroskopem, aby potwierdzić oderwanie komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustaw blok grzewczy na około 37–40 °C pod BSC. Trzymając tłoki nadal na miejscu, przesuń płytki na powierzchnię bloku grzewczego. Dodaj 2-3 ml podgrzanej pożywki hodowlanej, aby inkubować komórki i ułatwić topienie żelatyny.</li>
	<li>Po ~30 min delikatnie usuń tłoki z powierzchni płytki. Załóż pokrywki płytek do hodowli tkankowych i przenieś do inkubatora do hodowli komórkowych. Gdy żelatyna całkowicie upłynni się w temperaturze 37 °C, należy odessać i wymienić pożywkę do hodowli komórkowych.</li>
	<li>Utrzymuj SWAT w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w pożywce M199 wolnej od czerwieni fenolowej z 7 μM insuliny, 30 μM deksametazonem, 1x penicyliną/streptomycyną. Przechowywać w około 2 ml pożywki dla płytek 6-dołkowych i 3 ml dla szalek 6 cm. Zmieniaj nośniki co 2 dni.</li>
</ol>
5. Żniwa SWAT
<ol>
	<li>Przygotować podwielokrotności kolagenazy (0,5 mg/ml kolagenazy, 500 nM adenozyny, w PBS) w 15 ml stożkowych probówkach (przybliżona objętość 10 ml). Zamrozić probówki i przechowywać je w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Odessać dowolną pożywkę hodowlaną z komórek, przemyć 1x PBS, a następnie odessać PBS. Przygotuj porcje kolagenazy, rozmrażając je w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: Idealnie, roztwór kolagenazy osiągnie 37 °C; Natychmiast po tym dodaj tkankę.</li>
	<li>Dodać całą tkankę z płytki SWAT do poszczególnych porcji. Zbierz SWAT za pomocą sterylnego skrobaka komórkowego i przenieś go do podwielokrotności kolagenazy za pomocą odciętej końcówki pipety p1000. Dodać tkankę bezpośrednio do stożkowych probówek o pojemności 15 ml zawierających roztwór kolagenazy.
	<ol>
		<li>Alternatywnie, inkubować mieszaninę tkanka/kolagenaza w stożkowej probówce o pojemności 50 ml; zwiększona powierzchnia dodatkowo ułatwi trawienie enzymatyczne.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieścić probówki z próbkami w inkubowanej wytrząsarce orbitalnej pod kątem 45°. Inkubować przy 200 obr./min, w temperaturze 37 °C przez 30–60 min.</li>
	<li>Umieść filtr siatkowy 250 μm w nowej stożkowej probówce o pojemności 15 ml w celu zebrania. Przelej strawiony roztwór adipocytów przez filtr. 
	UWAGA: Umożliwi to przejście wszystkich komórek podczas filtrowania tkanki włóknistej.</li>
	<li>Pozostawić przepływ na 5 minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić separację faz. 
	UWAGA: Adipocyty będą unosić się na górze roztworu, podczas gdy komórki zrębu tłuszczowego (ASC) osiądą w niższych fazach. Wirowanie przez 5 minut przy 500 x g może również zmaksymalizować separację komórek lub zbiór otaczających ADSC w granulkach.</li>
	<li>Za pomocą odciętej końcówki pipety p1000 przenieś adipocyty (pływającą warstwę na wierzchu roztworu kolagenazy) do probówki zbiorczej mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Biorąc jednorazowo ~250 μL, powoli pipetuj wzdłuż krawędzi probówki, aby zebrać adipocyty.
	<ol>
		<li>Powoli obracaj rurkę podczas zbierania adipocytów, aby zmaksymalizować odzyskiwanie komórek przylegających do wnętrza. Kontynuuj pobieranie kolejnych komórek, aż probówka mikrowirówki o pojemności 1,5 ml będzie pełna.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usunąć nadmiar płynu z wyizolowanych adipocytów za pomocą strzykawki dołączonej do igły (~21 G). Zanurz igłę pod pływającą warstwą adipocytów. Krótko potrząsnąć igłą, aby usunąć wszelkie komórki przylegające do trzonu igły, a następnie poczekać, aż usunięte adipocyty wypłyną na górę.</li>
	<li>Powoli wciągaj nadmiar płynu, uważając, aby uniknąć niezamierzonego usunięcia adipocytów. Użyj podziałki probówek do mikrowirówek, aby konsekwentnie izolować objętości próbek (np. .0,1 ml dla każdej próbki).</li>
	<li>Użyj izolowanych komórek do ekstrakcji DNA/RNA, testu wychwytu glukozy, testu lipolizy itp.</li>
</ol>

<ol><li>Cawley, J., Meyerhoefer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+medical+costs+of+obesity%3A+An+instrumental+variables+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Health+Economics%22%5BJournal%5D)">The medical costs of obesity: An instrumental variables approach.</a> Journal of Health Economics. 31 (1), 219-230 (2012).</li>
<li>Pi-Sunyer, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Medical+Risks+of+Obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Postgraduate+Medicine%22%5BJournal%5D)">The Medical Risks of Obesity.</a> Postgraduate Medicine. 121 (6), 21-33 (2009).</li>
<li>Smith, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphologic+studies+of+human+subcutaneous+adipose+tissue+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Morphologic studies of human subcutaneous adipose tissue in vitro.</a> Anatomical Record. 169 (1), 97-104 (1971).</li>
<li>Sugihara, H., Yonemitsu, N., Miyabara, S., Yun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cultures+of+unilocular+fat+cells%3A+characteristics+of+growth+in+vitro+and+changes+in+differentiation+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Primary cultures of unilocular fat cells: characteristics of growth in vitro and changes in differentiation properties.</a> Differentiation. 31 (1), 42-49 (1986).</li>
<li>Sugihara, H., Yonemitsu, N., Toda, S., Miyabara, S., Funatsumaru, S., Matsumoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unilocular+fat+cells+in+three-dimensional+collagen+gel+matrix+culture%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Unilocular fat cells in three-dimensional collagen gel matrix culture.</a> The Journal of Lipid Research. 29, 691-697 (1988).</li>
<li>Hazen, S. A., Rowe, W. A., Lynch, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolayer+cell+culture+of+freshly+isolated+adipocytes+using+extracellular+basement+membrane+components%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Monolayer cell culture of freshly isolated adipocytes using extracellular basement membrane components.</a> The Journal of Lipid Research. 36, 868-875 (1995).</li>
<li>Fried, S. K., Kral, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+differences+in+regional+distribution+of+fat+cell+size+and+lipoprotein+lipase+activity+in+morbidly+obese+patients%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Obesity%22%5BJournal%5D)">Sex differences in regional distribution of fat cell size and lipoprotein lipase activity in morbidly obese patients.</a> International Journal of Obesity. 11 (2), 129-140 (1987).</li>
<li>Sutherland, M. L., Fabre, K. M., Tagle, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+National+Institutes+of+Health.+Microphysiological+Systems+Program+focuses+on+a+critical+challenge+in+the+drug+discovery+pipeline%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">The National Institutes of Health. Microphysiological Systems Program focuses on a critical challenge in the drug discovery pipeline.</a> Stem Cell Research and Therapy. 4, (2013).</li>
<li>Wikswo, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relevance+and+potential+roles+of+microphysiological+systems+in+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">The relevance and potential roles of microphysiological systems in biology and medicine.</a> Experimental Biology and Medicine. 239 (9), 1061-1072 (2014).</li>
<li>National Institutes of Health. NIH-CASIS Coordinated Microphysiological Systems Program for Translational Research in Space (#RFA-TR-18-001). , Available from:
 <a target="_blank" href="https://grants.nih.gov/grants/guide/rfa-files/RFA-TR-18-001.html">https://grants.nih.gov/grants/guide/rfa-files/RFA-TR-18-001.html</a> (2017).</li>
<li>Lau, F. H., Vogel, K., Luckett, J. P., Hunt, M., Meyer, A., Rogers, C. L., Tessler, O., Dupin, C. L., St Hilaire, H., Islam, K. N., Frazier, T., Gimble, J. M., Scahill, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sandwiched+White+Adipose+Tissue%3A+A+Microphysiological+System+of+Primary+Human+Adipose+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">Sandwiched White Adipose Tissue: A Microphysiological System of Primary Human Adipose Tissue.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 24 (3), (2018).</li>
<li>Ebara, M., Hoffman, J. M., Stayton, P. S., Hoffman, A. S. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0969806X07000795">Surface modification of microfluidic channels by UV-mediated graft polymerization of non-fouling and 'smart' polymers.</a> Radiation Physics and Chemistry. 76, 1409-1413 (2007).</li>
<li>Lin, J. B., Isenberg, B. C., Shen, Y., Schorsch, K., Sazonova, O. V., Wong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermo-responsive+poly%28N-isopropylacrylamide%29+grafted+onto+microtextured+poly%28dimethylsiloxane%29+for+aligned+cell+sheet+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces+B%3A+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Thermo-responsive poly(N-isopropylacrylamide) grafted onto microtextured poly(dimethylsiloxane) for aligned cell sheet engineering.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 99, 108-115 (2012).</li>
<li>Turner, W. S., Sandhu, N., McCloskey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Engineering%3A+Construction+of+a+Multicellular+3D+Scaffold+for+the+Delivery+of+Layered+Cell+Sheets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets.</a> Journal of Visualized Experiments. (92), e51044(2014).</li>
<li>Bunnell, B., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cells%3A+Isolation%2C+expansion+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cells: Isolation, expansion and differentiation.</a> Methods. 45 (2), 115-120 (2008).</li>
<li>Akiyama, Y., Kikuchi, A., Yamato, M., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrathin+poly%28N-isopropylacrylamide%29+grafted+layer+on+polystyrene+surfaces+for+cell+adhesion%2Fdetachment+control%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Ultrathin poly(N-isopropylacrylamide) grafted layer on polystyrene surfaces for cell adhesion/detachment control.</a> Langmuir. 20 (13), 5506-5511 (2004).</li>
<li>Fried, S. K., Russell, C. D., Grauso, N. L., Brolin, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipoprotein+lipase+regulation+by+insulin+and+glucocorticoid+in+subcutaneous+and+omental+adipose+tissues+of+obese+women+and+men%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Lipoprotein lipase regulation by insulin and glucocorticoid in subcutaneous and omental adipose tissues of obese women and men.</a> Journal of Clinical Investigation. 92 (5), 2191-2198 (1993).</li>
<li>Keipert, S., Jastroch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brite%2Fbeige+fat+and+UCP1+-+is+it+thermogenesis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Brite/beige fat and UCP1 - is it thermogenesis?</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (7), 1075-1082 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten szczegółowo opisuje zastosowanie ADSC do nakładania ludzkiej białej tkanki tłuszczowej; ludzkie linie komórkowe ADSC można izolować za pomocą dobrze ugruntowanych protokołów15. Jednak system można dostosować do zindywidualizowanych wymagań badawczych (takich jak użycie komórek 3T3L-1 do kanapkowania WAT myszy). Proces ten polega na obchodzeniu się z pierwotną tkanką ludzką. Należy stosować standardowe środki ostrożności; obchodzić się z tkankami ludzkimi jako patogenami BSL-2 (np....

Tkanka tłuszczowa jest głównym organem otyłości, który ponosi bezpośrednie roczne koszty medyczne od 147 miliardów do 210 miliardów dolarów w Stanach Zjednoczonych. <klasa sup="xref">1. Nagromadzenie tkanki tłuszczowej przyczynia się również do innych głównych przyczyn zgonów, takich jak choroby serca, cukrzyca typu II i niektóre rodzaje raka2. Modele hodowli in vitro są niezbędne w badaniach metabolicznych i opracowywaniu leków, ale obecne modele badawcze tkanki tłuszczowej mają poważne braki. Adipocyty to delikatne, pływające i kończnie zróżnicowane komórki, które nie przylegają do tworzyw sztucznych hodowli komórkowych i dlatego nie mogą być hodowane przy użyciu konwencjonalnych metod hodowli komórkowych. Od lat siedemdziesiątych XX wieku w próbach pokonania tych barier zastosowano kilka metod, w tym użycie szkiełek nakrywkowych, hodowli sufitowych, hodowli zawiesinowych i matryc zewnątrzkomórkowych3,4,5,6,7. Jednak metody te charakteryzowały się śmiercią komórki i odróżnicowaniem i są zwykle stosowane przez nie dłuższy niż dwutygodniowy okres badania. Co więcej, modele te nie próbują podsumować natywnego mikrośrodowiska tłuszczowego, ponieważ nie utrzymują nienaruszonego ECM, interakcji między adipocytami a komórkami podporowymi zrębu, ani sił skurczowych, jakie komórki wywierają na siebie nawzajem w WAT in vivo.
Wobec braku metody hodowli pierwotnej tkanki tłuszczowej o złotym standardzie, badania nad tkanką tłuszczową opierały się głównie na zróżnicowanych preadipocytach (diffAds). DiffAds są wielomiejscowe, przylegające i aktywne metabolicznie. Natomiast pierwotne białe adipocyty są jednopunktowe, nieprzylegające i wykazują stosunkowo niski metabolizm. Niepowodzenie obecnych modeli hodowli tkanki tłuszczowej w podsumowaniu fizjologii zdrowej, dojrzałej tkanki tłuszczowej jest prawdopodobnie głównym czynnikiem braku leków zatwierdzonych przez FDA, które bezpośrednio celują w adipocyty. W rzeczywistości brak fizjologicznych modeli narządów in vitro jest poważnym problemem w przypadku większości narządów i chorób.
W swoim stanowisku ogłaszającym utworzenie programu Systemów Mikrofizjologicznych (MPS), National Institutes of Health (NIH) poinformował, że wskaźnik sukcesu w 2013 roku we wszystkich badaniach klinicznych na ludziach wynosił tylko 18% dla badań klinicznych fazy II i 50% dla badań klinicznych fazy III<klasa sup="xref">8. Program MPS ma na celu bezpośrednie rozwiązanie problemu niezdolności monokultury in vitro do modelowania fizjologii człowieka. NIH definiuje MPS jako systemy hodowli składające się z ludzkich komórek pierwotnych lub macierzystych w wielokomórkowych konstruktach 3D, które podsumowują funkcjonowanie narządów. W przeciwieństwie do redukcjonistycznych modeli jednorodnych, unieśmiertelnionych kultur komórkowych, MPS powinny dokładnie modelować interakcje komórka-komórka, lek-komórka, lek-lek i narząd-lek9. W przeciwieństwie do krótkoterminowych metod hodowli pierwotnej, standardy NIH dyktują trwałość MPS przez 4 tygodnie w culture8. Więcej szczegółów na temat programu MPS można znaleźć na stronie RFA NIH (#RFA-TR-18-001)10.
Opracowaliśmy prosty, nowatorski, elastyczny i niedrogi MPS o nazwie "kanapkowana biała tkanka tłuszczowa" (SWAT)11. Pokonujemy naturalną wyporność adipocytów poprzez "kanapkowanie" zmielonej pierwotnej tkanki tłuszczowej między arkuszami komórek zrębu pochodzących z tkanki tłuszczowej (ADSC) (ryc. 1). Powstały w ten sposób konstrukt 3D podsumowuje kontakt komórka-komórka i natywne mikrośrodowisko tłuszczowe poprzez otoczenie dojrzałych adipocytów naturalną populacją komórek wspierających adipocyty. SWAT został zwalidowany poprzez wykazanie 8-tygodniowej żywotności, odpowiedzi na sygnalizację egzogenną, wydzielania adipokiny i wszczepienia do modelu zwierzęcego.

<table><tbody><tr><td>10x HBSS</td><td>Thermofisher</td><td>14185052</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna</td><td>Sigma-aldrich</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza</td><td>Sigma-aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>Adenozyna</td><td>Sigma-aldrich</td><td>A9251</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermofisher</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>M199 Media</td><td>Thermofisher</td><td>11043023</td><td>Bez czerwieni fenolu&nbsp;</td></tr><tr><td>250 i mikro; m Filtr siatkowy</td><td>Pierce</td><td>87791</td><td></td></tr><tr><td>0,2 & mikro; m Filtr strzykawkowy</td><td>Celltreat</td><td>229747</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki Luer-Lok 5 mL&nbsp;</td><td>Podkładki</td><td></td> metalowe BD 309646 <td></td></tr><tr><td></td> Są to proste podkładki metalowe, które można kupić w każdym sklepie z narzędziami.<td></td><td></td><td> Po prostu dodają ciężaru z tyłu zatyczek, aby zapewnić równomierny kontakt między komórkami a żelatyną, a jednocześnie są łatwe do przechowywania i sterylizacji. Przybliżona masa: 6,3 g&nbsp;</td></tr><tr><td><silny>Nazwa</silny><</td><td>silny>Firma</silny></td><td><silny>Numer katalogowy</silny></td><td><silny>Komentarze</td></tr><tr><td><silny>Podgrzewany sprzęt</silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubowana wytrząsarka orbitalna</td><td>VWR</td><td>10020-988</td><td>Próbki należy nachylić pod kątem 45&stopni, aby ułatwić trawienie kolagenazy</td></tr><tr><td>Blok ciepła</td><td></td><td></td><td>Ustaw na 37-40 &deg; C i umieszczony pod Szafka bezpieczeństwa biologicznego</td></tr><tr><td>Zestaw do kąpieli</td><td></td><td></td> wodnej <td>na ~75 &deg; C</td></tr><tr><td>Nazwa</strong</td><td>>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Specialized Plastics</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Upcell Naczynia 6 cm z 6 multiwell</td><td>Nunc</td><td>174902&nbsp; lub 174901</td><td>Są to dostępne na rynku naczynia pokryte pNIPAAm, które można wykorzystać do uprawy górnego arkusza ADSC. Alternatywnie, płytki z powłoką pNIPAAm mogą być produkowane w laboratorium. Średnica: < 6 cm dla naczynia 6 cm, < 3,5 cm dla płytki 6-dołkowej; Przybliżona masa: 6,7 g dla szalki 6 cm, 5,1 g dla płytki 6-dołkowej</td></tr><tr><td>Plastikowy aparat</td><td></td><td></td> tłokowy <td>Można je dopasować tak, aby pasowały do pożądanych tworzyw sztucznych pokrytych pNIPAAm (płytki wielodołkowe, szalki Petriego). Składają się z prostej łodygi przymocowanej do okrągłego dysku. Mogą być produkowane w laboratorium lub przez dowolny zakład, który może wytwarzać tworzywa akrylowe</td></tr></tbody></table>

platforma mikrofizjologiczna dla ludzkiego tłuszczu: warstwowa biała tkanka tłuszczowa

A Microphysiologic Platform for Human Fat: Sandwiched White Adipose Tissue

Biała tkanka tłuszczowa (WAT) odgrywa kluczową rolę w regulacji wagi i codziennym zdrowiu. Mimo to istnieją znaczne ograniczenia w dostępnych modelach hodowli pierwotnej, z których żaden nie zdołał wiernie odtworzyć mikrośrodowiska tłuszczowego ani przedłużyć żywotności WAT poza dwa tygodnie. Brak wiarygodnego modelu hodowli pierwotnej poważnie utrudnia badania nad metabolizmem WAT i opracowywaniem leków. W tym celu wykorzystaliśmy standardy NIH dotyczące systemu mikrofizjologicznego, aby opracować nowatorską platformę dla pierwotnej kultury WAT o nazwie "SWAT" (sandwiched white tłuszcze). Pokonujemy naturalną wyporność adipocytów, umieszczając zmielone klastry WAT między arkuszami komórek zrębu pochodzących z tkanki tłuszczowej. W tym konstrukcie próbki WAT są żywotne przez osiem tygodni w hodowli. SWAT utrzymuje nienaruszony ECM, kontakty międzykomórkowe i naciski fizyczne w warunkach WAT in vivo; dodatkowo SWAT utrzymuje solidny profil transkrypcyjny, wrażliwość na egzogenną sygnalizację chemiczną i funkcję całych tkanek. SWAT reprezentuje prostą, powtarzalną i skuteczną metodę pierwotnej hodowli tkanki tłuszczowej. Potencjalnie jest to platforma o szerokim zastosowaniu do badań w zakresie fizjologii WAT, patofizjologii, metabolizmu i rozwoju farmaceutycznego.

Żywotność SWAT oceniano początkowo poprzez sekwencyjne obrazowanie jasnopolowe pojedynczych skupisk WAT (n = 12) przez okres około 7,6 tygodnia. Skupiska pozostawały utrwalone w miejscu na monowarstwie przez cały ten czas. Zaobserwowano niewielkie zmiany morfologiczne, polegające na lekkim deformowaniu się pojedynczych adipocytów lub zmianie ich położenia. Jednakże adipocyty nie stawały się wielopęcherzykowe wraz z upływem czasu, co wskazuje na brak dedifferencjacji, ani nie wykazywały ża...

Biała tkanka tłuszczowa (WAT) ma krytyczne braki w swoich obecnych pierwotnych modelach hodowli, co utrudnia rozwój farmakologiczny i badania metaboliczne. W tym miejscu przedstawiamy protokół wytwarzania układu mikrofizjologicznego tkanki tłuszczowej poprzez umieszczanie WAT między arkuszami komórek zrębu. Ta konstrukcja zapewnia stabilną i adaptowalną platformę dla podstawowej kultury WAT.

Platforma mikrofizjologiczna dla ludzkiego tłuszczu: warstwowa biała tkanka tłuszczowa

White adipose tissue (WAT) plays a crucial role in regulating weight and everyday health.  Still, there are significant limitations to available primary ...

Ta przełomowa metoda pozwala nam po raz pierwszy utrzymać tłuszcz przy życiu i w zdrowiu ex vivo przez kilka kolejnych tygodni w celu zbadania biologii tkanki tłuszczowej. Główną zaletą tej techniki jest to, że tkanka pozostaje stabilna przez osiem tygodni w hodowli, jednocześnie rekapitulując mikrośrodowisko tłuszczowe, w tym otaczające natywne komórki podporowe zrębu tłuszczowego. Zacznij od wysiewu ASC przy około 80% zbiegu na płytkach do kultur tkankowych.Dla każdej pożądanej studzienki SWAT należy wysiać jedną konwencjonalną studzienkę do hodowli tkankowej i jedną studzienkę o odpowiedniej wielkości na plastikowej płytce do hodowli tkankowej pokrytej PNIPAAm. Utrzymuj ASC w kompletnej pożywce w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 przez sześć do ośmiu dni, zmieniając pożywkę co dwa dni. Dwadzieścia cztery godziny przed wysiewem SWAT, owiń krawędź krążka tłoka każdego tłoka do aparatu wysiewającego SWAT co najmniej dwa razy taśmą laboratoryjną, aby zapobiec wyciekowi roztworu żelatyny.W zdezynfekowanej etanolem komorze bezpieczeństwa biologicznego spryskaj 15-mililitrowy stożkowy stojak na probówki zawierające puste, niezakorkowane 15-mililitrowe stożkowe tubki, a także ka

a-microphysiologic-platform-for-human-fat-sandwiched-white-adipose

Research

JoVE Journal

Behavior

Zachowanie

Ze względu na drastyczny i negatywny związek między otyłością a innymi chorobami współistniejącymi, uzasadnione są badania nad rolą tłuszczu w chorobach i ogólnym zdrowiu. Przedstawiamy protokół izolacji i wycinania magazynów tłuszczowych pozwalający na badanie tkanki tłuszczowej metodami in situ i in vitro.

Lokalizacja, identyfikacja i wycięcie mysich magazynów tłuszczu

Przedstawiona tutaj metoda wykorzystuje 18pozytonowej tomografii emisyjnej/tomografii komputerowej (PET-CT) F-Fluorodeoxyglucose (18F-FDG) oraz rezonansu magnetycznego (MRI) oddzielonego tłuszczem i wodą, z których każdy jest skanowany po 2 godzinach ekspozycji na warunki termoneutralne (24 °C) i zimne (17 °C) w celu zmapowania brązowej tkanki tłuszczowej (BAT) u dorosłych ludzi.

Ludzkie brązowe magazyny tkanki tłuszczowej automatycznie segmentowane za pomocą pozytonowej tomografii emisyjnej/tomografii komputerowej i zarejestrowanych obrazów rezonansu magnetycznego

Ze względu na wysoką zawartość lipidów, tkanka tłuszczowa była trudna do wizualizacji przy użyciu tradycyjnych metod histologicznych. Adipo-Clear to technika oczyszczania tkanek, która umożliwia solidne znakowanie i wolumetryczne obrazowanie fluorescencyjne tkanki tłuszczowej w wysokiej rozdzielczości. W tym miejscu opisano metody przygotowania próbki, obróbki wstępnej, barwienia, czyszczenia i montażu do obrazowania.

Adipo-Clear: metoda oczyszczania tkanek do trójwymiarowego obrazowania tkanki tłuszczowej

Tutaj prezentujemy mikrofragmentację ludzkiej tkanki tłuszczowej bez enzymów przy użyciu urządzenia systemu zamkniętego. Ta nowa metoda pozwala na uzyskanie submilimetrowych skupisk tkanki tłuszczowej nadających się do przeszczepu in vivo, hodowli in vitro oraz dalszej izolacji i charakterystyki komórek.

Mikrofragmentacja ludzkiej tkanki tłuszczowej do fenotypowania komórek i charakterystyki sekretomu

Ten protokół opisuje techniczne podejście do izolowania subpopulacji komórek zrębu adipogennych i włóknisto-zapalnych z mysich magazynów białej tkanki tłuszczowej (WAT) w jamie brzusznej poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją lub separację kulek immunomagnetycznych.

Izolacja adipogennych i włóknisto-zapalnych subpopulacji komórek zrębu z mysich wewnątrzbrzusznych magazynów tłuszczu

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół opisujący wykorzystanie fragmentów mikronaczyniowych wyizolowanych z gryzoni lub ludzkiej tkanki tłuszczowej jako prostego podejścia do inżynierii funkcjonalnej, unaczynionej beżowej tkanki tłuszczowej.

Trójwymiarowa hodowla unaczynionej termogenicznej tkanki tłuszczowej z fragmentów mikronaczyniowych

Ten protokół opisuje półautomatyczną izolację frakcji zrębu naczyniowego (SVF) z mysiej tkanki tłuszczowej w celu uzyskania preadipocytów i osiągnięcia różnicowania adipocytów in vitro. Użycie dysocjatora tkankowego do trawienia kolagenazy zmniejsza zmienność eksperymentalną i zwiększa odtwarzalność.

Półautomatyczna izolacja zrębu frakcji naczyniowej z mysiej białej tkanki tłuszczowej za pomocą dysocjatora tkankowego

Tutaj opisujemy protokół izolacji, hodowli i fenotypowania mikronaczyniowych komórek śródbłonka z ludzkiej podskórnej tkanki tłuszczowej (hSATMVECs). Dodatkowo opisujemy eksperymentalny model wzajemnego przenikania się hSATMVEC-adipocytów.

Badanie wzajemnych oddziaływań komórek śródbłonka tkanki tłuszczowej i adipocytów w ludzkiej podskórnej tkance tłuszczowej

Tutaj prezentujemy protokół, który może przekształcić autologiczną tkankę tłuszczową w różne substancje składowe tkanki tłuszczowej o różnych właściwościach i funkcjach fizykochemicznych.

Innowacyjne frakcjonowanie tkanki tłuszczowej do przekształcania tłuszczu w specjalistyczne składniki

Za pomocą modelu eksplantacji ex vivo, małe fragmenty części rostralnej tkanki tłuszczowej białej trzewnej od szczupłych myszy są hodowane przez 7–10 dni, co umożliwia indukcję i badanie zapalenia tkanki tłuszczowej, jak to ma miejsce podczas karmienia dietą wysokotłuszczową.

Ex vivo model myszy na zapaleniu tkanki tłuszczowej podobnym do diety wysoko tłuszczowej

Poznaj metodę utrzymywania ludzkiej białej tkanki tłuszczowej w kulturze przez osiem tygodni. Ta technika umożliwia badanie biologii tkanki tłuszczowej w kontrolowanych warunkach in vitro.

Platforma mikrofizjologiczna dla ludzkiego tłuszczu: warstwowa biała tkanka tłuszczowa

Przeglądaj więcej filmów