Platforma mikrofizjologiczna dla ludzkiego tłuszczu: warstwowa biała tkanka tłuszczowa

Ta przełomowa metoda pozwala nam po raz pierwszy utrzymać tłuszcz przy życiu i w zdrowiu ex vivo przez kilka kolejnych tygodni w celu zbadania biologii tkanki tłuszczowej. Główną zaletą tej techniki jest to, że tkanka pozostaje stabilna przez osiem tygodni w hodowli, jednocześnie rekapitulując mikrośrodowisko tłuszczowe, w tym otaczające natywne komórki podporowe zrębu tłuszczowego. Zacznij od wysiewu ASC przy około 80% zbiegu na płytkach do kultur tkankowych.

Dla każdej pożądanej studzienki SWAT należy wysiać jedną konwencjonalną studzienkę do hodowli tkankowej i jedną studzienkę o odpowiedniej wielkości na plastikowej płytce do hodowli tkankowej pokrytej PNIPAAm. Utrzymuj ASC w kompletnej pożywce w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 przez sześć do ośmiu dni, zmieniając pożywkę co dwa dni. Dwadzieścia cztery godziny przed wysiewem SWAT, owiń krawędź krążka tłoka każdego tłoka do aparatu wysiewającego SWAT co najmniej dwa razy taśmą laboratoryjną, aby zapobiec wyciekowi roztworu żelatyny.

W zdezynfekowanej etanolem komorze bezpieczeństwa biologicznego spryskaj 15-mililitrowy stożkowy stojak na probówki zawierające puste, niezakorkowane 15-mililitrowe stożkowe tubki, a także każdy tłok owinięty taśmą z 70% etanolem, umieszczając każdy tłok w pustej probówce podczas dezynfekcji. Spryskaj metalowe podkładki o wadze około 6,3 grama i umieść je na stojaku wraz z parą haczykowatych kleszczy. Następnie zamknij skrzydło szafki i włącz światło UV, aby ułatwić nocne suszenie i sterylizację materiałów aparatu do wysiewu.

Gdy komórki osiągną 100% zbieżność i wykażą prążkowany wzór, dodaj 0,75 grama żelatyny w proszku do 10 mililitrów HBSS. I zrównoważyć pH roztworu za pomocą 100 mikrolitrów wodorotlenku sodu. Dodaj żelatynę do łaźni wodnej o temperaturze 75 stopni Celsjusza i energicznie potrząsaj probówką co pięć minut, aż proszek rozpuści się w roztworze.

Przecedzić jednorodny roztwór żelatyny przez filtr strzykawkowy i nanieść żelatynę na tłoki. Zaklejone taśmą krawędzie tłoków będą służyć jako forma, podczas gdy żelatyna zestala się. Gdy żelatyna stwardnieje, odwiń taśmę i użyj haczykowatych kleszczyków, aby usunąć żelatynę z zewnętrznej krawędzi tłoka, uważając, aby pozostała żelatyna w środku tłoka była całkowicie wypoziomowana, aby zmaksymalizować kontakt z arkuszem ASC.

Po usunięciu żelatyny ze wszystkich tłoków, delikatnie nałożyć każdy tłok na płytkę ASC pokrytą PNIPAAm, używając metalowych podkładek do dociążenia tłoków. Po 1,5-godzinnej inkubacji w temperaturze pokojowej przenieś płytki do łaźni lodowo-wodnej na kolejne 1,5 godziny, aby zakończyć dysocjację arkusza komórkowego od powierzchni płytki pokrytej PNIPAAm. Następnie należy oczyścić spód płytek pokrytych PNIPAAm, aby usunąć niesterylną wodę.

Po otrzymaniu ludzkiej tkanki tłuszczowej dodaj pożywkę do hodowli zimnych komórek do jednej 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówkowej na kulturę, która ma być wysiana. I umyj duże segmenty tkanki tłuszczowej trzy razy w sterylnym PBS, usuwając jak najwięcej PBS między praniami. Po ostatnim umyciu za pomocą kleszczy i sterylnej maszynki do golenia grubo rozdrobnić tkankę, usuwając jak najwięcej układu naczyniowego i powięziowego, aż roztwór nabierze gęstej płynnej konsystencji z jak najmniejszą liczbą widocznych pojedynczych segmentów białej tkanki tłuszczowej.

Po osiągnięciu odpowiedniej konsystencji tkanki za pomocą zmodyfikowanej końcówki mikropipety P1000 przenieś odpowiednią objętość zmielonej tkanki do każdej wcześniej przygotowanej probówki o pojemności 1,5 mililitra i krótko wymieszaj zmieloną tkankę z podłożem znajdującym się w probówkach. Następnie zastąp pożywkę w każdej kulturze ASC jedną objętością roztworu białej tkanki tłuszczowej i delikatnie przenieś tłoki żelatyny do mieszaniny białej tkanki tłuszczowej na podstawowych płytkach ASC. Zbadaj monowarstwy na płytkach powlekanych PNIPAAm pod mikroskopem, aby potwierdzić oderwanie komórek i przenieś płytki na powierzchnię bloku grzewczego o temperaturze od 37 do 40 stopni Celsjusza w komorze bezpieczeństwa biologicznego.

Następnie dodaj dwa do trzech mililitrów podgrzanej pożywki hodowlanej, aby inkubować komórki i ułatwić topienie żelatyny. Po 30 minutach delikatnie usunąć tłoki z powierzchni płytki, przykryć kultury odpowiednimi pokrywkami płytki i umieścić płytki w inkubatorze do hodowli komórkowych. Gdy żelatyna całkowicie się upłynni, odessać i zastąpić pożywkę do hodowli komórkowej odpowiednią objętością pożywki M199 wolnej od czerwieni fenolowej uzupełnionej insuliną, deksametazonem i antybiotykami.

Przez 7,5 tygodnia hodowli klastry SWAT pozostają zabezpieczone na miejscu na monowarstwie, a w poszczególnych adipocytach obserwuje się tylko niewielkie zmiany morfologiczne. Wyraźne zabarwienie czerwienią nilową jednopunktowych klastrów adipocytów po dwóch tygodniach hodowli pokazuje, że komórki są rzeczywiście adipocytami z nienaruszonymi błonami, a nie artefaktami, torbielami lub martwymi adipocytami. Barwienie jodkiem propidyny 53-dniowego SWAT i barwienie czerwienią olejową O 51-dniowych kultur SWAT potwierdzają, że adipocyty zachowują żywotność nawet w zaawansowanych punktach czasowych.

Immunocytochemia wykazuje odpowiednią oczekiwaną ekspresję białka i lokalizację markerów dojrzałych adipocytów w SWAT, a ilościowy PCR wskazuje na ekspresję kluczowych genów adipocytów na poziomie transkrypcji. Ocena funkcji endokrynnej bazylii wskazuje, że wydzielanie leptyny bazylii z kultur SWAT wykryte przez test ELISA i uwalnianie glicerolu może być również indukowane w odpowiedzi na stymulację chemiczną. Ksenotransplantacja adipocytów hodowanych przez SWAT ujawnia wyraźnie widoczne i łatwo odzyskane złogi tłuszczu 10 dni po przeszczepie, które plamią się na obecność ludzkich, ale nie mysich markerów adipocytów.

Po opanowaniu tej techniki można ją ukończyć w około pięć godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Ważne jest, aby pamiętać o szybkim przetworzeniu tkanki pierwotnej, aby zminimalizować śmierć komórki. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak ilościowy PCR w czasie rzeczywistym, barwienie immunologiczne lub testy funkcjonalne, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące tego, jak adipocyty reagują na różne leki lub toksyny.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić hodowlę SWAT jako stabilną i niezawodną platformę do badań nad tkanką tłuszczową. Nie zapominaj, że praca z pierwotną tkanką ludzką może być niebezpieczna i że podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie odpowiednich środków ochrony osobistej i obchodzenie się z tkanką pod szafkami bezpieczeństwa biologicznego.