Name: Wykrywanie lokalizacji subkomórkowej białka poprzez znakowanie białek zielonej fluorescencji i barwienie 4,6-diamidino-2-fenyloindolem w Caenorhabditis elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Poznaj metodę szybkiej lokalizacji subkomórkowej białka z użyciem GFP i DAPI w Caenorhabditis elegans. Technika umożliwia jednoczesną obserwację translokacji jądrowej pod wpływem stresu cieplnego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Szczepy C. elegans użyte w tym badaniu zostały uzyskane z Centrum Genetyki Caenorhabditis, które jest wspierane przez National Institutes of Health - Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Praca ta była wspierana przez NIH: 1R03AG048578-01 do Jun Liang, CUNY-CCRG 1501 do Jun Liang oraz PSC-CUNY 66184-00 44 i 67248-00 45 do Jun Liang. Dziękujemy Cathy Savage-Dunn za uprzejme podzielenie się swoją przestrzenią laboratoryjną. Wszystkie obrazy fluorescencyjne zostały wykonane w Queens College Core Facility. Dziękujemy Williamowi J. Rice'owi za jego komentarze do manuskryptu.

1. Rozwiązania
<ol>
	<li>Płyty NGM
	<ol>
		<li>Do kolby Erlenmeyera o pojemności 2 l dodać 3 g NaCl, 17 g agaru, 2,5 g peptonu i 975 mldH2O. Przykryć ujście kolby folią aluminiową. Kolbę należy sterylizować w autoklawie przez 50 minut. Schładzamy przez 20–30 minut.</li>
		<li>Następnie dodaj wysterylizowane roztwory: 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 5 mg/ml cholesterolu w etanolu, 1 ml 1 MMgSO4 i 25 ml 1 M buforu KPO4 (pH 6,0). Mieszaj roztwory, aby dobrze je wymieszać.</li>
		<li>Za pomocą dozownika płynu dozować roztwór NGM na płytki Petriego o średnicy 60 mm. Napełnij talerze w 2/3 agarem. Przechowuj je w hermetycznym pojemniku w temperaturze 4 °C do wykorzystania w przyszłości.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>1 M bufor KPO4 (pH 6,0)
	<ol>
		<li>Rozpuścić 10,83 g KH2PO4 i 3,56 g K2HPO4 w dH2O, a następnie dostosować całkowitą objętość do 100 ml. Roztwór należy sterylizować w autoklawie przez 15 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zobacz materiał M9
	<ol>
		<li>Rozpuścić 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4 i 5 g NaCl w dH2O, dodać 1 ml 1 MMgSO4 i dostosować całkowitą objętość do 1 l.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>10 μg/ml DAPI
	<ol>
		<li>Dodać 1 μl 10 mg/ml DAPI do 999 μl dH2O.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>95% alkoholu (v/v)
	<ol>
		<li>Odmierz 95 ml 100% alkoholu i dodaj wodę destylowaną, aby dostosować objętość do 100 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>30% aceton (v/v)
	<ol>
		<li>Dodać 30 ml acetonu do dH2O i dostosować całkowitą objętość do 100 ml.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Stres cieplny
<ol>
	<li>Wygeneruj linię tablicy pozachromosomalnej z translacyjnym konstruktem docelowych genów9,10. Alternatywnie, uzyskaj takie linie z Caenorhabditis Genetics Center (CGC), które jest publicznym zasobem dla badań nad C. elegans, lub z wcześniej opublikowanego laboratorium badawczego.</li>
	<li>Zintegruj linie pozachromosomalne z genomem, wystawiając robaki na promieniowanie 3,800 Rad γ-radiation9. Następnie wybierz stabilnie wyrażone linie, tak aby każde zwierzę wyrażało białko markerowe, takie jak GFP lub wałek.</li>
	<li>Aby usunąć mutacje powstałe podczas promieniowania, należy przeciąć linie co najmniej 2 razy. Użyj tej transgenicznej linii, aby wykryć zmiany wzorca ekspresji białek pod wpływem stresu.</li>
	<li>Przygotuj płytki ślimakowe NGM zgodnie z opisem w kroku 1.1. Smuguj klon OP50 i hoduj bakterie w płynnym bulionie LB przez noc. Wysiewaj płytki NGM płynną kulturą OP50 i inkubuj płytki w inkubatorze o temperaturze 37 °C przez noc, aby wyhodować trawnik bakteryjny jako źródło pożywienia dla robaków. Ostudzić płytki w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 minut przed użyciem.</li>
	<li>Hodować linię transgeniczną w temperaturze 20 °C bez głodu przez co najmniej 2 pokolenia przed testem stresu cieplnego.</li>
	<li>Wybierz 8-10 młodych, grawitych dorosłych (macica wypełniona jajami) na nową płytkę robaka, a następnie pozwól im złożyć jaja przez około 3-5 godzin i usuń wszystkie dorosłe osobniki z płytek.</li>
	<li>Aby zsynchronizować robaki, pozwól jajom się wykluć i hoduj larwy przez około 48 godzin do czwartego stadium larwalnego (L4). Zbadaj ich strukturę sromu (strukturę półksiężyca), aby zidentyfikować stadium L4 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1, strzałka)11.</li>
	<li>Umieść płytki ślimakowe z larwami L4 w inkubatorze o temperaturze 35 °C na 2–5 godzin, aby uzyskać stres cieplny. Umieść termometr w inkubatorze, aby dokładnie zmierzyć temperaturę.</li>
</ol>
3. Barwienie DAPI
<ol>
	<li>Utrwalanie etanolu
	<ol>
		<li>Dodać 10 μl buforu M9 na środku szkiełka podstawowego.</li>
		<li>Wybierz robaki poddane szokowi cieplnemu z kroku 2.8 i umieść je w buforze M9 na szklanym szkiełku.
		<ol>
			<li>Alternatywnie, zmyć płytkę M9, odwirować ją przy 1 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej i wyrzucić supernatant. Dodaj robaki do szklanego szkiełka.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Użyj miękkiej chusteczki, aby odsączyć nadmiar płynu. Obejrzyj ten krok pod mikroskopem preparacyjnym.</li>
		<li>Dodaj 10 μl 95% alkoholu na robaki i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Obserwuj proces pod mikroskopem preparacyjnym i nie pozwól, aby zwierzęta zbytnio wyschły. Natychmiast po odparowaniu etanolu ze zwierząt przejdź do następnego kroku. 
		Uwaga: Etanol bardzo szybko odparowuje.</li>
		<li>Powtórz krok 3.1.4 dwa razy, aby robaki zostały naprawione. 
		Uwaga: To normalne, że zwierzęta wyglądają na ciemniejsze i zniekształcone.</li>
		<li>Dodaj 10 μl DAPI (10 μg/ml) do robaków. Natychmiast przykryj je szkiełkiem nakrywkowym i uszczelnij szkiełko przezroczystym żelem do paznokci</li>.
		<li>Obejrzyj zwierzęta po około 10 minutach pod mikroskopem fluorescencyjnym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utrwalanie acetonu (podejście alternatywne)
	<ol>
		<li>Zmyć płytkę poddaną szokowi termicznemu z kroku 2.8 za pomocą M9, odwirować ją przy 1 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej i wyrzucić supernatant. Przemyć osad 1 mldH2O, zebrać osad i wyrzucić supernatant.</li>
		<li>Dodać 400 μl 30% acetonu przez 15 minut. Wirować przy 1 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej i wyrzucić supernatant. Użyj 500 μL dH2O do umycia zwierząt 2x. Odrzucić supernatant.</li>
		<li>Dodaj 200 μl DAPI (10 μg/ml), czyli 4 razy więcej niż całkowita objętość robaków, do probówki na 15 minut.</li>
		<li>Odwirować przy 1 000 g przez 1 minutę i odrzucić supernatant. Przemyć osad 2x 500 μLdH2O. Umieścić robaki na szkiełkach podstawowych, przykryć je szkiełkami nakrywkowymi, uszczelnić szkiełko przezroczystym żelem do lakieru do paznokci i obserwować zwierzęta pod mikroskopem fluorescencyjnym.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Obrazowanie mikroskopowe
<ol>
	<li>Włącz źródło światła UV i mikroskop fluorescencyjny. Włącz komputer podłączony do mikroskopu.</li>
	<li>Załaduj szkiełko do mikroskopu fluorescencyjnego. Użyj soczewki obiektywowej o małej mocy (10X), aby zlokalizować robaki, zwiększ powiększenie do 400X i skup się na próbce.</li>
	<li>Otwórz oprogramowanie dostarczone z mikroskopem. Kliknij "Akwizycja" w menu; kliknij "Kamera" i wybierz kamerę podłączoną do mikroskopu; Dzięki temu wybrana kamera może komunikować się z oprogramowaniem. 
	Uwaga: Różne mikroskopy mogą różnić się działaniem.</li>
	<li>W tym samym "Akwizycie" kliknij "Akwizycja wielowymiarowa". Spowoduje to otwarcie nowego okna nawigacyjnego "Akwizycja wielowymiarowa". Kliknij przycisk "Wielokanałowy", a pojawią się wszystkie dostępne kanały.</li>
	<li>Wybierz kolor niebieski, zielony i DIC (różnicowy kontrast interferencyjny), aby obserwować próbkę. W oknie nawigacji "Akwizycja wielowymiarowa" pozostaw włączone kanały "Blue-DAPI", "Green-GFP" i "Grey-DIC", "Nomarski"; Kliknij prawym przyciskiem myszy inne kanały, takie jak "Czerwona rodamina" i "Białe jasne pole", aby je zamknąć.</li>
	<li>Najpierw zmierz czas ekspozycji dla każdego kanału:
	<ol>
		<li>Kliknij lewym przyciskiem myszy kanał "Blue-DAPI", aby go wybrać, a następnie kliknij "Zmierz", aby zrobić obraz na żywo pod kanałem DAPI z automatycznym czasem naświetlania. Pojawi się nowe okno z obrazem na żywo.</li>
		<li>Po lewej stronie okna obrazu na żywo ręcznie dostosuj czas naświetlania, jeśli to konieczne, aby obraz był zgodny z oczekiwaniami.</li>
		<li>Na koniec kliknij "OK" w oknie obrazu na żywo. Ustawia to czas ekspozycji w kanale DAPI.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powtórz krok 4.6 dla pozostałych kanałów, "Green-GFP" i "Grey-DIC", "Nomarski", aby ustawić czasy ekspozycji dla tych kanałów.</li>
	<li>W oknie nawigacyjnym "Akwizycja wielowymiarowa" kliknij "Start", aby automatycznie zebrać 3 obrazy w 3 różnych kanałach w kolejności (patrz wyżej) z określonymi czasami naświetlania zgodnie z ustawieniem.</li>
	<li>Aby zapisać plik, przejdź do menu głównego, kliknij "Plik", a następnie "Zapisz jako". Wprowadź nazwę pliku i nazwę folderu. Zapisz plik jako domyślny format pliku, aby zachować szczegółowe informacje o obrazowaniu do wykorzystania w przyszłości.</li>
	<li>Aby wyeksportować plik w innych formatach:
	<ol>
		<li>Przejdź do "Plik" i kliknij "Eksportuj". Spowoduje to otwarcie okna ustawień eksportu.</li>
		<li>Ustaw nazwę pliku i folder. Zaznacz "Utwórz folder projektu", aby lepiej uporządkować dane. Oprogramowanie pozwala również użytkownikowi określić 4 inne opcje: "Generuj scalone obrazy", "Użyj koloru dla obrazów kanałów", "Użyj nazw kanałów" i "Tylko scalony obraz".</li>
		<li>Wybierz żądany typ pliku z menu rozwijanego, taki jak "TIF", "BMP", "PSD" lub "JPG" i inne typy. Następnie kliknij "Start", aby wyeksportować.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Essers, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FOXO+transcription+factor+activation+by+oxidative+stress+mediated+by+the+small+GTPase+Ral+and+JNK%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">FOXO transcription factor activation by oxidative stress mediated by the small GTPase Ral and JNK.</a> The EMBO Journal. 23 (24), 4802-4812 (2004).</li>
<li>Oh, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JNK+regulates+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans+by+modulating+nuclear+translocation+of+forkhead+transcription+factor%2FDAF-16%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">JNK regulates lifespan in Caenorhabditis elegans by modulating nuclear translocation of forkhead transcription factor/DAF-16.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (12), 4494-4499 (2005).</li>
<li>Gross, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+cleaved+BID+targets+mitochondria+and+is+required+for+cytochrome+c+release%2C+while+BCL-XL+prevents+this+release+but+not+tumor+necrosis+factor-R1%2FFas+death%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Caspase cleaved BID targets mitochondria and is required for cytochrome c release, while BCL-XL prevents this release but not tumor necrosis factor-R1/Fas death.</a> The Journal of Biological Chemistry. 274 (2), 1156-1163 (1999).</li>
<li>Doerflinger, M., Glab, J. A., Puthalakath, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BH3-only+proteins%3A+a+20-year+stock-take%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">BH3-only proteins: a 20-year stock-take.</a> The FEBS Journal. 282 (6), 1006-1016 (2015).</li>
<li>Mayorova, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+containing+aragonite+crystals+mediate+responses+to+gravity+in+Trichoplax+adhaerens+%28Placozoa%29%2C+an+animal+lacking+neurons+and+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cells containing aragonite crystals mediate responses to gravity in Trichoplax adhaerens (Placozoa), an animal lacking neurons and synapses.</a> PLoS One. 13 (1), e0190905(2018).</li>
<li>Terron-Camero, L. C., Molina-Moya, E., Sanz-Fernandez, M., Sandalio, L. M., Romero-Puertas, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+%28ROS%2FRNS%29+during+hypersensitive+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Detection of reactive oxygen and nitrogen species (ROS/RNS) during hypersensitive cell death.</a> Methods in Molecular Biology. , 97-105 (2018).</li>
<li>Pedrazzini, E., Vitale, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29043678">Protein biosynthesis and maturation in the ER.</a> Methods in Molecular Biology. , 179-189 (2018).</li>
<li>Liang, J., Shaulov, Y., Savage-Dunn, C., Boissinot, S., Hoque, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloride+intracellular+channel+proteins+respond+to+heat+stress+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Chloride intracellular channel proteins respond to heat stress in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 12 (9), e0184308(2017).</li>
<li>Evans, T. C. Transformation and microinjection. <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org">Wormbook</a>. , edited by The C. elegans Research Community (2006).</li>
<li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA transformation.</a> Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).</li>
<li>Yochem, J. Nomarski images for learning the anatomy, with tips for mosaic analysis. <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org">Wormbook</a>. , edited by The C. elegans Research Community (2006).</li>
<li>Dulhunty, A., Gage, P., Curtis, S., Chelvanayagam, G., Board, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glutathione+transferase+structural+family+includes+a+nuclear+chloride+channel+and+a+ryanodine+receptor+calcium+release+channel+modulator%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The glutathione transferase structural family includes a nuclear chloride channel and a ryanodine receptor calcium release channel modulator.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (5), 3319-3323 (2001).</li>
<li>Suh, K. S., Malik, M., Shukla, A., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLIC4%2C+skin+homeostasis+and+cutaneous+cancer%3A+surprising+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">CLIC4, skin homeostasis and cutaneous cancer: surprising connections.</a> Molecular Carcinogenesis. 46 (8), 599-604 (2007).</li>
<li>Yao, Q., Qu, X., Yang, Q., Wei, M., Kong, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLIC4+mediates+TGF-beta1-induced+fibroblast-to-myofibroblast+transdifferentiation+in+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Reports%22%5BJournal%5D)">CLIC4 mediates TGF-beta1-induced fibroblast-to-myofibroblast transdifferentiation in ovarian cancer.</a> Oncology Reports. 22 (3), 541-548 (2009).</li>
<li>Ronnov-Jessen, L., Villadsen, R., Edwards, J. C., Petersen, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+a+chloride+intracellular+channel+gene%2C+CLIC4%2C+in+transforming+growth+factor-beta1-mediated+conversion+of+fibroblasts+to+myofibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Differential expression of a chloride intracellular channel gene, CLIC4, in transforming growth factor-beta1-mediated conversion of fibroblasts to myofibroblasts.</a> The American Journal of Pathology. 161 (2), 471-480 (2002).</li>
<li>He, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+CLIC4+in+the+host+innate+responses+to+bacterial+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Role of CLIC4 in the host innate responses to bacterial lipopolysaccharide.</a> European Journal of Immunology. 41 (5), 1221-1230 (2011).</li>
<li>Zhong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+CLIC4+enhances+autophagy+and+triggers+mitochondrial+and+ER+stress-induced+apoptosis+in+human+glioma+U251+cells+under+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Inhibition of CLIC4 enhances autophagy and triggers mitochondrial and ER stress-induced apoptosis in human glioma U251 cells under starvation.</a> PLoS One. 7 (6), e39378(2012).</li>
<li>Liang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+schnurri+homolog+sma-9+mediates+stage-+and+cell+type-specific+responses+to+DBL-1+BMP-related+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans schnurri homolog sma-9 mediates stage- and cell type-specific responses to DBL-1 BMP-related signaling.</a> Development. 130 (26), 6453-6464 (2003).</li>
<li>Leopold, L. E., Heestand, B. N., Seong, S., Shtessel, L., Ahmed, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+pairing+during+meiosis+triggers+multigenerational+transgene+silencing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Lack of pairing during meiosis triggers multigenerational transgene silencing in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (20), E2667-E2676 (2015).</li>
<li>Schultz, R. D., Bennett, E. E., Ellis, E. A., Gumienny, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+extracellular+matrix+organization+by+BMP+signaling+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Regulation of extracellular matrix organization by BMP signaling in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 9 (7), e101929(2014).</li>
<li>Matus, D. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasive+cell+fate+requires+G1+cell-cycle+arrest+and+histone+deacetylase-mediated+changes+in+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Invasive cell fate requires G1 cell-cycle arrest and histone deacetylase-mediated changes in gene expression.</a> Developmental Cell. 35 (2), 162-174 (2015).</li>
<li>Reddy, K. C., Villeneuve, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+HIM-17+links+chromatin+modification+and+competence+for+initiation+of+meiotic+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">C. elegans HIM-17 links chromatin modification and competence for initiation of meiotic recombination.</a> Cell. 118 (4), 439-452 (2004).</li>
<li>Ames, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-cell-autonomous+role+of+BEC-1%2FBECN1%2FBeclin1+in+coordinating+cell-cycle+progression+and+stem+cell+proliferation+during+germline+development%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A non-cell-autonomous role of BEC-1/BECN1/Beclin1 in coordinating cell-cycle progression and stem cell proliferation during germline development.</a> Current Biology. 27 (6), 905-913 (2017).</li>
<li>Pekar, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+the+environment%2C+DAF-7%2FTGFbeta+signaling+and+LAG-2%2FDSL+ligand+expression+in+the+germline+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Linking the environment, DAF-7/TGFbeta signaling and LAG-2/DSL ligand expression in the germline stem cell niche.</a> Development. 144 (16), 2896-2906 (2017).</li>
<li>Schvarzstein, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+helicase+HIM-6%2FBLM+both+promotes+MutSgamma-dependent+crossovers+and+antagonizes+MutSgamma-independent+interhomolog+associations+during+caenorhabditis+elegans+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">DNA helicase HIM-6/BLM both promotes MutSgamma-dependent crossovers and antagonizes MutSgamma-independent interhomolog associations during caenorhabditis elegans meiosis.</a> Genetics. 198 (1), 193-207 (2014).</li>
<li>Flemming, A. J., Shen, Z. Z., Cunha, A., Emmons, S. W., Leroi, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+polyploidization+and+cellular+proliferation+drive+body+size+evolution+in+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Somatic polyploidization and cellular proliferation drive body size evolution in nematodes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (10), 5285-5290 (2000).</li>
<li>Nagamatsu, Y., Ohshima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+for+the+control+of+body+size+by+a+G-kinase+and+a+downstream+TGFbeta+signal+pathway+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+to+Cells%22%5BJournal%5D)">Mechanisms for the control of body size by a G-kinase and a downstream TGFbeta signal pathway in Caenorhabditis elegans.</a> Genes to Cells. 9 (1), 39-47 (2004).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do zadeklarowania.

W artykule przedstawiono szybką i skuteczną metodę weryfikacji zmian subkomórkowych białek od cytoplazmy do jądra. Ekspresję białka wykazano za pomocą fuzji GFP, podczas gdy strukturę jądra zweryfikowano za pomocą barwienia DAPI (ryc. 3). Ponieważ barwienie immunologiczne białek C. elegans jest trudne, większość lokalizacji subkomórkowych białka C. elegans charakteryzuje się znakowaniem ich białkami markerowymi, takimi jak GFP, Laz, mCherry i inne 18,19,20,21.<sup class="xr...

Zmiana lokalizacji subkomórkowej białka jest powszechnym mechanizmem w odpowiedzi na wewnętrzne lub zewnętrzne sygnały, takie jak stres cieplny, głód, stres oksydacyjny, apoptoza, fosforylacja białek i inne. Na przykład stres cieplny indukuje translokację jądrową członka FOXO DAF-16 1,2, a proapoptotyczne białko BCL-2 BID przemieszcza się do mitochondriów po otrzymaniu sygnalizacji śmierci3,4. Dostępne są różne techniki wykrywania tych zmian. Połączenie western blotting i biochemicznie izolujących struktur subkomórkowych (np. mitochondriów lub jąder) może z powodzeniem osiągnąć cel3. Wymaga jednak specyficznego przeciwciała przeciwko białku będącemu przedmiotem zainteresowania. W ten sposób dobrze ugruntowane przeciwciało staje się kluczem do sukcesu. Alternatywnym podejściem jest znakowanie różnych struktur subkomórkowych lub organelli różnymi markerami, takimi jak białko zielonej fluorescencji (GFP), białko czerwonej fluorescencji (RFP), białko żółtej fluorescencji (YFP) i mCherry, a tymczasem znakowanie interesującego białka innymi markerami. Następnie obserwuj je pod mikroskopem konfokalnym, aby zlokalizować cele5,6. Izotopy promieniotwórcze są alternatywnym wyborem do znakowania białek docelowych, a następnie wykrywania ich lokalizacji subkomórkowej7. Metoda ta wymaga jednak odpowiedniego przeszkolenia i obchodzenia się z odpadami promieniotwórczymi. W takich okolicznościach, jak brak swoistego przeciwciała, brak odpowiedniego markera lub niedobór sprzętu, takiego jak mikroskop konfokalny, należy rozważyć alternatywne podejście. Aby zidentyfikować translokację jądrową białka, atrakcyjne jest znakowanie docelowych białek tylko markerem i barwienie jąder odczynnikiem chemicznym 4',6-diamidyn-2-fenyloindolowym (DAPI), ponieważ wymaga to tylko zwykłego mikroskopu fluorescencyjnego. 
Immunoznakowanie C. elegans przeciwciałami jest trudne ze względu na niską przepuszczalność zarówno skorupki jaja, jak i kolagenowego naskórka otaczającego zwierzę. Tymczasem, ponieważ białka C. elegans znacznie różnią się od ortologów kręgowców, kilka firm komercyjnych dostarcza C. elegans określone produkty. Małemu laboratorium trudno jest wytworzyć dla siebie przeciwciała przeciwko C. elegans. Naukowcy należący do społeczności często używają oznakowanych białek jako markerów, aby wykazać lokalizację białka lub ekspresję genów. W tym artykule użyto EXL-1::GFP jako przykładu do śledzenia translokacji jądrowej białka pod wpływem stresu cieplnego8. Zintegrowany translacyjny exl-1::gfp do genomu zwierzęcego służy do stabilnej ekspresji genu za pomocą fuzji gfp. Badania wykazały, że exl-1 ulega ekspresji w jelicie, ścianie ciała, mięśniach i innych strukturach subkomórkowych8. Protokół ten pokazuje, jak zsynchronizować robaki z czwartym stadium larwalnym (L4), przeprowadzić eksperyment ze stresem cieplnym i przeprowadzić barwienie DAPI, utrwalanie etanolu, utrwalanie acetonu i obrazowanie pod zwykłym mikroskopem fluorescencyjnym.

<table><tbody><tr><td>DAPI</td><td>Biotium</td><td>40043</td><td>zarówno Hoechst 33258, jak i Hoechst 33342 również działają</td></tr><tr><td>dobrze OP50</td><td>CGC</td><td>OP50</td><td>https://cgc.umn.edu/</td></tr> <tr><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td></td><td>https://cgc.umn.edu/</td></tr> <tr><td>Kim Wipe</td><td>Kimberly-Clark Corporation</td><td></td> tkanki <td>miękkie</td></tr><tr><td>Zeiss&nbsp; AX10</td><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Zeiss</td><td></td></tr><tr><td>Axiovision Rel 4.8</td><td>Oprogramowanie mikroskopu Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AxioCam MR Rev3</td><td>Aparat cyfrowy</td><td>Zeiss</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przezroczysty żel</td><td></td><td></td><td></td>do paznokci</tr><tr><td>60 mm szalki</td><td></td><td></td><td></td>Petriego</tr><tr><td>Szkiełka szklane</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe szklane</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-20 i mikro; Pipetor</td><td></td><td></td><td></td>L</tr><tr><td>20-200 &mikro; Pipetor</td><td></td><td></td><td></td>L</tr><tr><td>200-1000 &mikro; Pipetor</td><td></td><td></td><td></td>L</tr><tr><td>1-200 &mikro; Końcówki</td><td></td><td></td><td></td>do pipet L</tr><tr><td>200-1000 &micro; Końcówki</td><td></td><td></td><td></td>do pipet L</tr><tr><td>Probówki</td><td></td><td></td><td></td>do mikrowirówek 1,5 ml</tr><tr><td>Platynowy druciany pick</td><td></td><td></td><td></td> ślimakowy</tr></tbody></table>

wykrywanie lokalizacji subkomórkowej białka poprzez znakowanie białek zielonej fluorescencji i barwienie 4',6-diamidino-2-fenyloindolem w caenorhabditis elegans

Detecting Protein Subcellular Localization by Green Fluorescence Protein Tagging and 4',6-Diamidino-2-phenylindole Staining in Caenorhabditis elegans

W tym protokole, białko fuzyjne zielonej fluorescencji (GFP) i barwienie 4',6-diamidino-2-fenyloindolem (DAPI) są używane do śledzenia zmian lokalizacji subkomórkowej białek; w szczególności translokacji jądrowej w warunkach stresu cieplnego. Białka reagują odpowiednio na sygnały zewnętrzne i wewnętrzne. Powszechnym mechanizmem jest zmiana jego lokalizacji subkomórkowej. W tym artykule opisano protokół śledzenia lokalizacji białka, który nie wymaga przeciwciała, znakowania radioaktywnego ani mikroskopu konfokalnego. W tym artykule GFP jest używany do znakowania docelowego białka EXL-1 u C. elegans, członka rodziny chlorkowych białek kanałów wewnątrzkomórkowych (CLIC), w tym CLIC4 ssaków. Zintegrowana transgeniczna linia transgeniczna exl-1::gfp (z promotorem i pełną sekwencją genu) została utworzona przez transformację i promieniowanie γ i stabilnie wyraża gen i gfp. Ostatnie badania wykazały, że w przypadku stresu cieplnego, a nie stresu oksydacyjnego, EXL-1::GFP gromadzi się w jądrze. Nakładanie się sygnału GFP zarówno na strukturę jąder, jak i sygnały DAPI potwierdza zmiany lokalizacji subkomórkowej EXL-1 pod wpływem stresu. Protokół ten przedstawia dwie różne metody utrwalania barwienia DAPI: utrwalanie etanolem i utrwalanie acetonem. Przedstawiony w tym artykule protokół barwienia DAPI jest szybki i wydajny oraz zachowuje zarówno sygnał GFP, jak i zmiany lokalizacji subkomórkowej białka. Ta metoda wymaga jedynie mikroskopu fluorescencyjnego z Nomarskim, filtra FITC i filtra DAPI. Nadaje się do małych laboratoriów, badań studenckich, badań uczniów szkół średnich i sal lekcyjnych biotechnologii.

Wewnątrzkomórkowe białka kanałów chlorkowych (CLIC) są białkami wielofunkcyjnymi, które są wysoce konserwowane między gatunkami12. Wiele badań wykazuje, że CLIC regulują stres komórkowy, autofagię, apoptozę, kancerogenezę, angiogenezę oraz wrodzoną odpowiedź immunologiczną makrofagów w systemie ssaków13,14,15,16,<sup class="xre...

Ten protokół pokazuje, jak śledzić translokację jądra białka pod wpływem stresu cieplnego, używając białka fuzyjnego białka zielonej fluorescencji (GFP) jako markera i barwienia 4',6-diamidino-2-fenyloindolem (DAPI). Protokół barwienia DAPI jest szybki i zachowuje sygnały lokalizacji subkomórkowej GFP i białka.

Wykrywanie lokalizacji subkomórkowej białka poprzez znakowanie białek zielonej fluorescencji i barwienie 4',6-diamidino-2-fenyloindolem w Caenorhabditis elegans

In this protocol, a green fluorescence protein (GFP) fusion protein and 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining are used to track protein ...

Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie C.elegans, takie jak biologia komórki. Główną zaletą tej techniki jest to, że szybko i skutecznie można jednocześnie uzyskać sygnały barwienia jądrowego, GFP i zmian lokalizacji subkomórkowej. Aby rozpocząć, wygeneruj tablicę pozachromosomalną dopasowaną do konstruktu translacyjnego genów docelowych.Alternatywnie, uzyskaj takie linie z Centrum Genetycznego Caenorhabditis, które jest publicznym zasobem dla badań nad C.elegans. Lub z wcześniej opublikowanego laboratorium badawczego. Po wystawieniu robaków na działanie promieniowania gamma w celu zintegrowania linii pozachromosomalnych z genomem, wybierz linie o stabilnej ekspresji, tak aby każde zwierzę wykazywało ekspresję białka markerowego, takiego jak GFP lub wałek.Aby usunąć mutacje powstałe podczas promieniowania, należy przeciąć linie co najmniej dwa razy. Użyj otrzymanej linii transgenicznej, aby wykryć zmiany wzorca ekspresji białek pod wpływem stresu. Następnie, po przygotowaniu płytek ślimakowych NGM zgodnie z protokołem tekstowym, należy smugować klon OP50 i hodować bakterie w płynnym bulionie LB przez noc.Wysadź płytki NGM płynną kulturą OP50 i inkubuj pł

detecting-protein-subcellular-localization-green-fluorescence-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisano procedurę hodowli w środowisku ciekłym oraz rozdziału szczepów C. elegans wykazujących ekspresję fluorescencyjnych białek reporterowych, która nie wymaga użycia kosztownego sprzętu do sortowania. Podejście to można zastosować w przypadku licznych indukowalnych genów C. elegans w celu odkrywania leków lub biosensingu zanieczyszczeń.

Przesiewanie wysokoprzepustowe i biosensing z wykorzystaniem fluorescencyjnych szczepów C. elegans

"Freeze-cracking", metoda wystawiania wewnętrznych tkanek nicienia C. elegans na działanie przeciwciał w celu lokalizacji białek.

Barwienie przeciwciał u C. elegans za pomocą "krakingu zamrażalnego"

Aby zbadać związek między homeostazą białek, stresem i starzeniem się, monitorowaliśmy zmiany w fałdowaniu białek, śledząc dysfunkcję białek, lokalizację białek w komórce i stabilność białek na poziomie organizmu, komórkowym i białkowym, używając genetycznie wykonalnego metazoanu Caenorhabditis elegans jako systemu modelowego.

Wykorzystanie Caenorhabditis elegans jako systemu modelowego do badania homeostazy białek w organizmie wielokomórkowym

Mięśnie szkieletowe są niezbędne do poruszania się i są głównym magazynem białka w organizmie. Pomiary zdrowia mięśni w obrębie C. Opisano elegans. Potencjalne zmiany w strukturze i funkcji mięśni ocenia się za pomocą zlokalizowanego GFP i barwników kationowych.

Metody oceny subkomórkowych kompartmentów mięśniowych u C. elegans

Przezroczyste jelito C. elegans może służyć jako "komora tkankowa in vivo" do badania biogenezy błony wierzchołkowej i światła na poziomie pojedynczej komórki i subkomórkowej podczas tubulingenezy wielokomórkowej. Protokół ten opisuje, w jaki sposób połączyć standardowe znakowanie, genetykę utraty funkcji/RNAi i podejścia mikroskopowe w celu przeanalizowania tych procesów na poziomie molekularnym.

Jelito C. elegans jako model morfogenezy światła międzykomórkowego i biogenezy błony spolaryzowanej in vivo na poziomie pojedynczej komórki: znakowanie przez barwienie przeciwciałami, analiza utraty funkcji RNAi i obrazowanie

Caenorhabditis elegans (C. elegans) jest dobrym modelem do badania transportu aksonalnego i wewnątrzkomórkowego. W tym miejscu opisuję protokół rejestracji i analizy in vivo transportu aksonalnego i wewnątrzwiciowego u C. elegans.

Unieruchomienie Caenorhabditis elegans w celu analizy transportu wewnątrzkomórkowego w neuronach

Przedstawiono protokół obrazowania dynamicznych mikrotubul in vivo przy użyciu fluorescencyjnie znakowanego białka wiążącego End. Opisaliśmy metody znakowania, obrazowania i analizowania dynamicznych mikrotubul w neuronie tylnej bocznej mikrotubuli (PLM) C. elegans.

In vivo (in vivo) Ocena dynamiki i orientacji mikrotubul w neuronach Caenorhabditis elegans

Mikroby jelitowe, w tym bakterie zewnątrzkomórkowe i patogeny wewnątrzkomórkowe, takie jak wirus Orsay i mikrosporydia (grzyby), są często kojarzone z dzikimi nicieniami Caenorhabditis. W artykule przedstawiono protokół wykrywania i ilościowego oznaczania drobnoustrojów, które kolonizują i/lub infekują nicienie C. elegans, a także pomiaru obciążenia patogenami po kontrolowanych infekcjach w laboratorium.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ RNA (FISH) w celu wizualizacji kolonizacji i infekcji mikrobiologicznej w jelitach Caenorhabditis elegans

Artykuł opisuje optymalizację parametrów akwizycji mikroskopii fluorescencyjnej w celu wizualizacji aksonalnego transportu endogennych znakowanych ładunków w rozdzielczości pojedynczego neuronu u żywego nicienia.

Optymalizacja wizualizacji transportu aksonalnego ładunków endogennych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej u żywych Caenorhabditis elegans

Tutaj przedstawiamy instrukcje dotyczące skutecznego wykorzystania SegElegans, systemu głębokiego uczenia, który opracowaliśmy do automatycznego segmentowania pojedynczych robaków na mikroskopii szerokopolowej, do późniejszego wykorzystania w oprogramowaniu do analizy obrazów, takiego jak ImageJ. Oferujemy możliwości korzystania z systemu zarówno online, jak i offline.

Automatyczna analiza obrazów fluorescencyjnych C. elegans z użyciem SegElegans

Przepływ pracy z mikroiniekcją CRISPR/Cas9 do endogennego fluorescencyjnego oznaczania w linii komórkowej Caenorhabditis elegans w celu uzyskania homozygotycznych linii knock-in do analizy lokalizacji białka in vivo lokalizacji białka.

Endogenouszne fluorescencyjne oznaczanie genów specyficznych dla komórek germinalnych za pośrednictwem CRISPR/Cas9 u Caenorhabditis elegans

Poznaj metodę szybkiej lokalizacji subkomórkowej białka z użyciem GFP i DAPI w Caenorhabditis elegans. Technika umożliwia jednoczesną obserwację translokacji jądrowej pod wpływem stresu cieplnego.

Wykrywanie lokalizacji subkomórkowej białka poprzez znakowanie białek zielonej fluorescencji i barwienie 4,6-diamidino-2-fenyloindolem w Caenorhabditis elegans (Wideo) | JoVE Journal

Wykrywanie lokalizacji subkomórkowej białka poprzez znakowanie białek zielonej fluorescencji i barwienie 4',6-diamidino-2-fenyloindolem w Caenorhabditis elegans

Przeglądaj więcej filmów