Wykrywanie lokalizacji subkomórkowej białka poprzez znakowanie białek zielonej fluorescencji i barwienie 4',6-diamidino-2-fenyloindolem w Caenorhabditis elegans
30 lipca 2018
Ten protokół pokazuje, jak śledzić translokację jądra białka pod wpływem stresu cieplnego, używając białka fuzyjnego białka zielonej fluorescencji (GFP) jako markera i barwienia 4',6-diamidino-2-fenyloindolem (DAPI). Protokół barwienia DAPI jest szybki i zachowuje sygnały lokalizacji subkomórkowej GFP i białka.
Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie C.elegans, takie jak biologia komórki. Główną zaletą tej techniki jest to, że szybko i skutecznie można jednocześnie uzyskać sygnały barwienia jądrowego, GFP i zmian lokalizacji subkomórkowej. Aby rozpocząć, wygeneruj tablicę pozachromosomalną dopasowaną do konstruktu translacyjnego genów docelowych.
Alternatywnie, uzyskaj takie linie z Centrum Genetycznego Caenorhabditis, które jest publicznym zasobem dla badań nad C.elegans. Lub z wcześniej opublikowanego laboratorium badawczego. Po wystawieniu robaków na działanie promieniowania gamma w celu zintegrowania linii pozachromosomalnych z genomem, wybierz linie o stabilnej ekspresji, tak aby każde zwierzę wykazywało ekspresję białka markerowego, takiego jak GFP lub wałek.
Aby usunąć mutacje powstałe podczas promieniowania, należy przeciąć linie co najmniej dwa razy. Użyj otrzymanej linii transgenicznej, aby wykryć zmiany wzorca ekspresji białek pod wpływem stresu. Następnie, po przygotowaniu płytek ślimakowych NGM zgodnie z protokołem tekstowym, należy smugować klon OP50 i hodować bakterie w płynnym bulionie LB przez noc.
Wysadź płytki NGM płynną kulturą OP50 i inkubuj płytki w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc, aby wyhodować trawnik bakteryjny jako źródło pożywienia dla robaków. Przed użyciem schłodzić płytki w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 minut. Hoduj linię transgeniczną w temperaturze 20 stopni Celsjusza bez głodu, przez co najmniej dwa pokolenia przed testem stresu cieplnego.
Wybierz od ośmiu do dziesięciu młodych, ciężarnych dorosłych osobników na nową płytkę ślimakową. Następnie pozwól im złożyć jaja przez około trzy do pięciu godzin i usuń wszystkie dorosłe osobniki z talerzy. Aby zsynchronizować robaki, pozwól jajom się wykluć i hoduj larwy przez około 48 godzin do czwartego stadium larwalnego lub L4.
Można to zidentyfikować po sromie, który jest strukturą półksiężyca. Następnie poddaj robaki stresowi cieplnemu, inkubując płytki z larwami L4 w temperaturze 35 stopni Celsjusza przez dwie do pięciu godzin. Dołącz termometr do inkubatora, aby dokładnie zmierzyć temperaturę.
Odpipetować 10 mikrolitrów M9 na środek szklanego szkiełka. Następnie zbierz robaki poddane szokowi cieplnemu i przenieś je do kropli bufora. Alternatywnie użyj M9, aby zmyć robaki z talerza.
Następnie odwirować próbkę przy 1000-krotności grawitacji w temperaturze pokojowej przez jedną minutę. Wyrzucić supernatant, a następnie dodać robaki do szkiełka podstawowego. Pod mikroskopem preparacyjnym użyj miękkiej tkanki, aby odsączyć nadmiar płynu.
Następnie, będąc jeszcze pod mikroskopem, dodaj 10 mikrolitrów 95% alkoholu na robaki i kontynuuj ich obserwację. Natychmiast po wyschnięciu etanolu powtórz dodawanie etanolu jeszcze dwa razy. Ma to kluczowe znaczenie dla procesu parowania etanolu ze zwierząt pod mikroskopem preparacyjnym.
Gdy etanol zejdzie ze zwierząt, natychmiast przejdź do następnego kroku. Dodaj 10 mikrolitrów DAPI do robaków. Natychmiast nałóż szkiełko nakrywkowe i uszczelnij szkiełko przezroczystym żelem do paznokci.
Po pozostawieniu lakieru do paznokci na około 10 minut, obejrzyj zwierzęta pod mikroskopem fluorescencyjnym. Aby utrwalić zwierzęta acetonem, użyj M9, aby zmyć płytkę poddaną szokowi termicznemu i odwirować próbkę przy 1000-krotności grawitacji w temperaturze pokojowej przez jedną minutę. Odrzucić supernatant i użyć jednego mililitra wody destylowanej do przemycia osadu.
Po usunięciu supernatantu dodać 400 mikrolitrów 30% acetonu i inkubować próbkę przez 15 minut. Następnie odwiruj probówkę przy 1000-krotności grawitacji w temperaturze pokojowej przez jedną minutę. Po wyrzuceniu supernatantu użyj 500 mikrolitrów wody destylowanej, aby dwukrotnie umyć zwierzęta.
Dodaj 200 mikrolitrów DAPI do osadu lub czterokrotność całkowitej objętości robaków do probówki i inkubuj próbkę przez 15 minut. Odwirować próbkę i odrzucić supernatant. Następnie użyj 500 mikrolitrów wody destylowanej, aby dwukrotnie umyć granulat przed montażem i obrazowaniem jak poprzednio.
Aby przeprowadzić obrazowanie, włącz źródło światła UV i mikroskop fluorescencyjny. Następnie włącz komputer podłączony do mikroskopu. Załaduj szkiełko do mikroskopu fluorescencyjnego.
Użyj soczewki obiektywowej 10X, aby zlokalizować robaki. Następnie zwiększ moc powiększenia do 400X i skup się na próbce. Następnie otwórz oprogramowanie dostarczone z mikroskopem.
Kliknij Akwizycja, a następnie kliknij Kamera i wybierz kamerę podłączoną do mikroskopu. W tym samym akwizycji kliknij na Akwizycja wielowymiarowa. Spowoduje to otwarcie nowego okna nawigacji Akwizycji wielowymiarowej.
Kliknij przycisk wielokanałowy, a pojawią się wszystkie dostępne kanały. Wybierz kolor niebieski, zielony i DIC, aby obserwować próbkę. W oknie nawigacyjnym Akwizycja wielowymiarowa pozostaw włączone niebieskie kanały DAPI, zielony GFP i szary DIC, a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy inne kanały, takie jak czerwona Rhodamine i biała Brightfield, aby je zamknąć.
Aby zmierzyć czas ekspozycji dla każdego kanału, kliknij lewym przyciskiem myszy niebieski kanał DAPI, aby go wybrać, a następnie kliknij zmierz"aby zrobić obraz na żywo z automatycznym czasem ekspozycji. Po lewej stronie okna obrazu na żywo ręcznie dostosuj czas ekspozycji, jeśli chcesz, a następnie kliknij przycisk OK. W podobny sposób ustaw czasy ekspozycji dla kanałów GFP i DIC. W oknie nawigacyjnym Akwizycji wielowymiarowej kliknij Start", aby automatycznie zebrać trzy obrazy w trzech różnych kanałach, w kolejności, z ustawionymi czasami ekspozycji.
Aby zapisać plik, w menu głównym kliknij Plik, Zapisz jako.Wprowadź nazwę pliku i folder. Zapisz plik jako domyślny format pliku, aby zachować szczegółowe informacje o obrazowaniu do wykorzystania w przyszłości. Aby wyeksportować plik w innych formatach, w obszarze Plik kliknij przycisk Eksportuj.
Ustaw nazwę pliku i folder. Zaznacz Utwórz folder projektu"aby lepiej uporządkować dane. Po wybraniu żądanego typu pliku z menu rozwijanego kliknij Start"eksportować.
W C.elegans występują dwa homologi białek kanału wewnątrzkomórkowego chlorków, exl-1 i exc-4. Niedawne badania wykazały, że exl-1 reguluje radzenie sobie ze stresem u zwierząt. W tym przypadku translacyjny konstrukt GFP exl-1 został zintegrowany z genomem zwierzęcym i stworzono linie transgeniczne, które stabilnie wyrażają zieloną fluorescencyjną eksl-1.
Pod wpływem stresu cieplnego GFP exl-1 gromadzi się w jądrze w okolicy jelita, gdy silny sygnał GFP nakłada się na jądro. Aby potwierdzić subkomórkową lokalizację exl-1, przeprowadzono barwienie DAPI zarówno u zwierząt utrwalonych etanolem, jak i acetonem. Obie metody pokazują wyraźne jądra w ciele zwierzęcia, a nakładające się na siebie sygnały GFP i DAPI potwierdzają, że exl-1 GFP rzeczywiście nagromadził się w jądrach w okolicy jelita.
Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać szybkie utrwalenie, aby zachować sygnał GFP i translokację jądrową białka pod wpływem stresu u C.elegans.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół demonstruje sposób śledzenia translokacji jądrowej białka w warunkach stresu termicznego z wykorzystaniem białka fuzyjnego GFP jako markera oraz barwienia DAPI. Metoda ta jest szybka i wydajna, umożliwiając jednoczesną obserwację barwienia jądra oraz zmian w lokalizacji subkomórkowej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Neurobiologia
- Genetyka
Wprowadzenie
- Zrozumienie lokalizacji białek jest kluczowe w biologii komórki.
- Stres termiczny może wpływać na translokację i lokalizację białek.
- Białka fuzyjne GFP są cennymi markerami do śledzenia białek.
- Barwienie DAPI umożliwia wizualizację jąder komórkowych.
Cel badania
- W celu śledzenia translokacji jądrowej białka podczas stresu cieplnego.
- W celu wykorzystania GFP jako markera lokalizacji białka.
- W celu zademonstrowania szybkiego protokołu barwienia DAPI.
Zastosowane metody
- Generowanie pozachromosomalnych macierzy z konstruktami translacyjnymi.
- Naświetlanie C.elegans promieniowaniem gamma w celu integracji.
- Selekcja linii o stabilnej ekspresji z wykorzystaniem białek markerowych.
- Jednoczesna obserwacja lokalizacji jądrowej i podkomórkowej.
Główne wyniki
- Skuteczne śledzenie translokacji jądrowej w warunkach stresu cieplnego.
- Efektywna wizualizacja barwienia GFP i DAPI.
- Wykazanie skuteczności protokołu w organizmach C.elegans.
- Uzyskanie wglądu w dynamikę lokalizacji białek.
Wnioski
- Protokół ten stanowi cenne narzędzie do badania dynamiki białek.
- Szybkie i wydajne metody usprawniają badania w dziedzinie biologii komórki.
- Przyszłe zastosowania mogą zostać rozszerzone na inne warunki stresowe.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół umożliwia szybkie śledzenie zmian w subkomórkowej lokalizacji białek w odpowiedzi na stres bez użycia przeciwciał, co wspiera wczesny etap walidacji celów w procesach odkrywania leków. Dzięki połączeniu znakowania GFP z barwieniem jąder DAPI, metoda ta zapewnia ilościowe, wizualne potwierdzenie zdarzeń translokacji – takich jak akumulacja jądrowa pod wpływem stresu termicznego – co może pomóc w ograniczeniu ryzyka mechanistycznego hipotez terapeutycznych. Kompatybilność tej metody ze standardowymi mikroskopami fluorescencyjnymi sprawia, że jest ona dostępna w ramach przygotowań do przesiewów wysokoprzepustowych oraz do użytku przez interdyscyplinarne zespoły w działach R&D branży biofarmaceutycznej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju bifarmaceutycznym
Wstępne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia bezpośrednią obserwację indukowanej stresem translokacji białek, wspierając funkcjonalną walidację celów oraz badanie szlaków sygnałowych.
- Wartość operacyjna: Eliminuje konieczność stosowania przeciwciał lub znaczników radioaktywnych, skracając czas i obniżając koszty opracowania testu.
- Wartość prognostyczna: Potwierdza zmiany w lokalizacji subkomórkowej, które mogą wskazywać na mechanizm działania lub modulację odpowiedzi na stres.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Generuje stabilne linie transgeniczne wykazujące ekspresję białek znakowanych GFP, co zapewnia spójne i powtarzalne platformy przesiewowe.
- Wyjście ilościowe: Umożliwia jednoczesny pomiar sygnału GFP i barwienia jąder DAPI w celu analizy kolokalizacji.
- Skalowalność: Kompatybilność ze standardową mikroskopią fluorescencyjną pozwala na adaptację do formatów wielodołkowych w celu przesiewania związków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla badania chorób: Śledzenie lokalizacji EXL-1, białka z rodziny CLIC posiadającego homologi u ssaków (np. CLIC4), co wspiera ocenę celów translacyjnych.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Potwierdzenie translokacji jądrowej w warunkach stresu termicznego, a nie stresu oksydacyjnego, co pomaga zdefiniować zachowanie celu w zależności od konkretnych warunków.
- Ciągłość przedkliniczna: Zapewnienie systemu wielokrotnego użytku do oceny dynamiki białek w różnych warunkach stresowych przed walidacją in vivo.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od testowania hipotez dotyczących celu molekularnego po identyfikację związku wiodącego, w szczególności w odniesieniu do białek reagujących na stres. Wspiera ona wczesne decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez walidację zaangażowania celu oraz dynamiki subkomórkowej przed rozpoczęciem kampanii przesiewowych związków.
- Biologia odkrywcza: Weryfikacja hipotez terapeutycznych poprzez wizualizację zmian w lokalizacji białek w określonych warunkach stresowych.
- Przesiewanie: Przygotowanie zwalidowanych systemów komórkowych do przesiewania bibliotek związków z wbudowanym odczytem lokalizacji.
- Analityka: Generowanie danych o ko-lokalizacji (nakładanie się GFP/DAPI) jako ilościowego wyniku oceny wpływu związków na transport białek.
- Badania translacyjne: Powiązanie wyników uzyskanych na *C. elegans* z systemami ssaków poprzez konserwatywne białka CLIC, co wspiera walidację celu w różnych gatunkach.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Stworzenie modułowego, wielokrotnego użytku schematu śledzenia dynamiki subkomórkowej dowolnego białka znakowanego GFP pod wpływem stresu lub ekspozycji na związki.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność w wyjaśnianiu mechanizmów, dostarczając bezpośrednich dowodów wizualnych na translokację białek w żywych komórkach.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje protokoły fiksacji i obrazowania w różnych zespołach, co poprawia powtarzalność i ogranicza zmienność.
- Wartość strategiczna: Przyspiesza harmonogramy walidacji celów, umożliwiając szybszą selekcję portfolio i ograniczając inwestycje w fałszywie dodatnie cele.
- Wpływ na portfolio: Wspiera postęp w oparciu o analizę ryzyka poprzez potwierdzenie zachowania celu w modelach stresu istotnych dla danej choroby.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie obsługi C. elegans, generowania linii transgenicznych oraz mikroskopii fluorescencyjnej.
- Metoda zależy od dostępu do mikroskopu fluorescencyjnego z zestawami filtrów FITC i DAPI oraz optyką Nomarskiego.
- Niezbędna jest standaryzacja utrwalania (etanol/aceton) oraz czasu barwienia w celu zachowania sygnału GFP i zapewnienia spójnego znakowania jąder DAPI.
- Adaptacja do innych systemów modelowych może wymagać optymalizacji siły promotora, wydajności tagowania oraz paradygmatów stresu.
- Ograniczenie praktyczne: Metoda najlepiej sprawdza się w przypadku białek o wykrywalnej translokacji; może nie rozdzielić szybkich lub przejściowych zdarzeń przemieszczania bez obrazowania na żywo.
