Name: In vivo (in vivo) Fotoznakowanie komórek w okrężnicy w celu oceny potencjału migracyjnego komórek krwiotwórczych u nowonarodzonych myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-10T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Poznaj technikę fotoznakowania komórek w okrężnicy noworodków myszy w celu śledzenia ich migracji do pozajelitowych tkanek. Ta metoda umożliwia badanie interakcji układu immunologicznego z mikrobiomem u noworodków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Nitya Jain została wsparta przez NIH/NIAID Career Transition Award 1K22AI116661-01.

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone za zgodą i zgodnie z Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) w Massachusetts General Hospital.
UWAGA: Ten protokół wymaga użycia lasera klasy 3b (LG3). Podczas obsługi tego lasera należy zawsze używać laserowych okularów ochronnych LG3. Należy przestrzegać odpowiednich wytycznych dotyczących szkolenia i bezpieczeństwa, aby uniknąć ryzyka obrażeń.
1. Projektowanie i montaż lasera
<ol>
	<li>Podłącz diodę elektroluminescencyjną (LED) (405 nm, 19,3 mW, 1400 mA, sprzężoną ze światłowodem) do sterownika LED za pomocą 4-pinowego połączeniowego M8, który jest dołączony do diody LED. Ostrożnie dokręć, aby zamocować połączenie.</li>
	<li>Przed podłączeniem krosowego optogenetyki do diody LED, przytrzymaj otwór złącza diody LED do światła, aby upewnić się, że nie ma widocznych przeszkód. W razie potrzeby przedmuchaj otwór, aby usunąć wszelkie przeszkody i włóż plastra optogenetycznego do otworu.</li>
	<li>Podłącz kaniulę światłowodową do krosowego optogenetyki, wkładając kaniulę do dowolnego końca tulei złącza. Podłącz drugi koniec tulei złącza do krosowego. Zastosuj wystarczający nacisk, aby zabezpieczyć połączenie, ale uważaj, aby nie zgiąć ani nie złamać światłowodu w kaniuli. 
	UWAGA: Delikatna kaniula światłowodowa jest pokryta nasadką ochronną, gdy laser nie jest używany.</li>
	<li>Ustaw sterownik LED w trybie fali ciągłej (CW) z pokrętłem regulacji ciągłej na 0 i limitem prądu ustawionym na 1.2 A.</li>
</ol>
2. Fotokonwersja komórek w okrężnicy
UWAGA: Samce i samice myszy były wystawione na działanie światła wewnątrzokrężnicy 405 nm 1 - 2 dni po urodzeniu i zostały uśmiercone przed 1 tygodniem życia.
<ol>
	<li>Zabezpiecz ciemne miejsce dostępem do gniazdka elektrycznego. Podłącz sterownik LED do gniazdka. 
	UWAGA: Ta procedura jest wykonywana w minimalnym białym świetle, ponieważ długotrwała ekspozycja myszy na światło otoczenia może spowodować niepożądaną fotokonwersję komórek. Jako alternatywę używane jest czerwone światło. 
	UWAGA: Kolejny krok polega na użyciu środka znieczulającego dla zwierząt. Podanie środka znieczulającego odbywa się w kapturze klasy II lub przy użyciu innego odpowiedniego systemu oczyszczania. Wdychanie środka znieczulającego może powodować zawroty głowy, senność, a nawet utratę przytomności.</li>
	<li>Znieczulij mysz poprzez wystawienie na działanie 4 - 5% izofluranu w 100% O2 w pudełku indukcyjnym. Sprawdź prawidłową głębokość znieczulenia, mocno ściskając tylną łapę (brak odpowiedzi). Utrzymuj znieczulenie przez stożek nosowy o stężeniu około 2% izofluranu. Należy zapobiec narażeniu osób zajmujących się izofluranem na działanie izofluranu przy użyciu odpowiedniego kaptura lub urządzenia do usuwania środków znieczulających.</li>
	<li>Ustaw znieczuloną mysz do ekspozycji wewnątrzokrężnicy, używając 1 ręki, aby delikatnie podrapać tył myszy palcem wskazującym i kciukiem. Odwróć mysz, aby odsłonić brzuch. Poluzuj uchwyt, jeśli mysz zacznie tracić różowy kolor lub jeśli jej tempo oddychania zacznie zwalniać. Zabezpiecz ogon myszy między palcem serdecznym a małym.</li>
	<li>Drugą ręką zdejmij nasadkę ochronną z kaniuli. Utrzymując długą oś kaniuli równolegle do linii środkowej myszy, delikatnie włóż kaniulę światłowodową przez odbyt do okrężnicy, tak aby wszystkie 5 mm światłowodu znalazło się wewnątrz myszy. 
	UWAGA: Ta procedura jest wykonywana powoli i z ostrożnością, aby nie przebić ściany okrężnicy. Drobne poruszanie i skręcanie kaniuli wspomaga postęp w okrężnicy.</li>
	<li>Załóż okulary ochronne i zwiększ prąd lasera do maksymalnej wartości (do końca zgodnie z ruchem wskazówek zegara). Potwierdź obecność światła UV, patrząc na półprzezroczysty brzuch myszy. 
	UWAGA: Laserowe gogle ochronne LG3 znacznie zmniejszają widoczność. Poproś kolegę (noszącego sprzęt ochronny) o pomoc w założeniu gogli i włączeniu lasera.</li>
	<li>Wystaw okrężnicę na działanie światła laserowego na łącznie 2 minuty. Wyjmij kaniulę na około 1 mm co 30 sekund, aby zmaksymalizować obszar świetlny wystawiony na działanie światła. Po upływie 2 minut wyłącz laser.</li>
	<li>Powoli wyjmij kaniulę z myszy. Po wyzdrowieniu ze znieczulenia w pustej ciepłej klatce wróć mysz do klatki domowej. </li>
</ol>
3. Izolacja limfocytów jelitowych
<ol>
	<li>Przygotuj 1 l buforu Hank's Balanced Salt Solution/surowicy cielęcej (HBSS/CS), 200 ml buforu paskowego nabłonka, 500 ml pożywki myjącej i 200 ml pożywki myjącej wolnej od kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA). 
	UWAGA: Objętości odczynników są obliczane dla próbki o wielkości 9.
	<ol>
		<li>Przygotować bufor HBSS/CS (HBSS; 5% CS), dodając 50 ml CS do 950 ml HBSS. Przechowuj go na lodzie.</li>
		<li>Przygotować bufor paskowy nabłonka [HBSS; 5% CS; 1 mM ditiotreitol (DTT); 5 mM EDTA; 15 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-etanosulfonowego (HEPES) (pH 7,2 - 7,5)] dodając 10 ml CS, 200 μl 1 M DTT, 2 ml 0,5 M EDTA i 3 ml 1 M buforu HEPES do 185 ml HBSS. Umieścić bufor pasków nabłonka w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Przygotować pożywkę do płukania (HBSS; 1% CS; 1 mM EDTA), dodając 5 ml CS i 1 ml 0,5 M EDTA do 494 ml HBSS. Przechowuj go w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przygotować pożywkę myjącą wolną od EDTA (HBSS; 1% CS; 15 mM HEPES), dodając 2 ml CS i 3 ml 1 M HEPES do 195 ml HBSS. Przechowuj go w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Wykonać bufor FACS [1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) (pH = 7,2); 2% CS], dodając 10 ml CS do 490 ml PBS. Przechowuj go na lodzie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować naczynie do pobierania tkanek, umieszczając sitko o wielkości 70 μm w naczyniu hodowlanym o wymiarach 60 x 10 mm. Dodać 10 ml buforu HBSS/CS (HBSS; 5% bufor CS sporządzony w kroku 3.1.1 i przechowywany na lodzie) do naczynia i umieścić go na lodzie.</li>
	<li>Poddać mysz eutanazji poprzez przedawkowanie wziewnego izofluranu przy użyciu odpowiedniego środka znieczulającego (około 3 minuty ekspozycji na >4% izofluranu w powietrzu w pomieszczeniu lub w 100%O2). Po pozornym ustaniu oddychania i ruchów odruchowych sprawdź, czy nie ma głębokiego bólu, mocno ściskając tylną łapę (zalecane jest użycie kleszczy). Zapewnij eutanazję poprzez ścięcie głowy za pomocą nożyczek chirurgicznych lub nowej prostej brzytwy. 
	UWAGA: Zwichnięcie szyjki macicy nie jest zalecane na tym etapie ze względu na wielkość i wiek zwierzęcia. Metody te są zgodne z wytycznymi AVMA z 2013 r. dotyczącymi eutanazji i zatwierdzone przez MGH IACUC.</li>
	<li>Zbierz okrężnicę za pomocą czystych kleszczy i nożyczek, aby otworzyć brzuch. Odbij jelita po 1 stronie brzucha myszy, aby odsłonić okrężnicę. Usuń całą okrężnicę, najpierw przecinając ją dystalnie (w kierunku odbytu) do jelita ślepego. Następnie, mocno chwytając okrężnicę kleszczami, nożyczkami przeciąć cewkę moczową do odbytnicy. Wytnij okrężnicę jak najbliżej odbytu. Zbierz śledzionę po usunięciu okrężnicy (patrz kroki 4.1 - 4.2 poniżej). 
	UWAGA: Podczas gdy protokół fotokonwersji celuje tylko w ~25% okrężnicy noworodka (5 mm kaniuli światłowodowej), cała okrężnica jest pobierana, aby pomóc w izolacji komórek.</li>
	<li>Oczyść okrężnicę za pomocą kleszczy, aby wypchnąć zawartość z okrężnicy na suchy ręcznik papierowy. Homogenizuj tkankę za pomocą żyletek, aby drobno posiekać okrężnicę na pastę na pokrywie szalki hodowlanej, a następnie przenieś tę pastę do sitka komórkowego na szalce Petriego.</li>
	<li>Dodaj czyste mieszadło magnetyczne o długości 8 mm do sitka i umieść naczynie na 9-pozycyjnej płycie mieszadła magnetycznego. Ustaw prędkość mieszadła magnetycznego na 800 obr./min i inkubuj komórki przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Wyrzucić bufor i powtórzyć płukanie, używając 10 ml HBSS/CS (HBSS; 5% bufor CS sporządzony w kroku 3.1.1 i przechowywany na lodzie). Wyrzuć bufor pod koniec prania.</li>
	<li>Oddzielić komórki nabłonka, dodając 10 ml wstępnie podgrzanego buforu paskowego nabłonka (HBSS; 5% CS; 1mM DTT; 5mM EDTA; 15mM buforu HEPES [pH 7,2 - 7,5], który został sporządzony w kroku 3.1.2 i przechowywany w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C) do sitka komórkowego i mieszać z prędkością 800 obr./min przez 30 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C. Pod koniec inkubacji przenieść bufor wzbogacony we frakcję nabłonkową do czystej probówki o pojemności 15 ml. 
	UWAGA: Nabłonek i związane z nim komórki (komórki nabłonka jelitowego i limfocyty nabłonka jelitowego) są uwalniane do buforu, podczas gdy komórki w nienaruszonej blaszce właściwej pozostają na sitku komórkowym podczas tego kroku11.
	<ol>
		<li>Odwirować wzbogaconą frakcję nabłonka jelitowego (IELs) przy 700 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml buforu FACS. Przechowuj go na lodzie do użycia w kroku 3.15.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przemyć frakcję blaszki właściwej w sitku do komórek 2x za pomocą HBSS/CS. W tym celu dodać 10 ml roztworu HBSS/CS (HBSS; 5% bufor CS sporządzony w kroku 3.1.1, który był przechowywany na lodzie) do sitka komórkowego i mieszać z prędkością 800 obr./min przez 5 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C. Wyrzuć bufor po każdym praniu.</li>
	<li>Przemyć próbkę 2x w płynie myjącym. Dodać 10 ml pożywki do przemywania (HBSS; 1% CS; 1 mM buforu EDTA, który został sporządzony w kroku 3.1.3 i przechowywany w temperaturze pokojowej) do sitka komórkowego i mieszać z prędkością 800 obr./min przez 15 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C. Wyrzuć bufor po każdym praniu.
	<ol>
		<li>Po użyciu środka myjącego przechowuj go na lodzie do użycia w kroku 3.14.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przemyć próbkę 2x HBSS/CS. Dodać 10 ml buforu HBSS/CS (HBSS; 5% bufor CS sporządzony w kroku 3.1.1, który był przechowywany na lodzie) do sitka do komórek i mieszać z prędkością 800 obr./min przez 5 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C. Wyrzuć bufor po każdym praniu.</li>
	<li>Inkubować tkankę w buforze płuczącym wolnym od EDTA. Dodać 10 ml wolnego od EDTA buforu do przemywania (HBSS; 1% CS; 15 mM buforu HEPES, który został sporządzony w kroku 3.1.4 i przechowywany w temperaturze pokojowej) do sitka komórkowego i inkubować płytkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej bez mieszania. Odrzuć bufor na końcu tego kroku.</li>
	<li>Przemyć próbkę 2x HBSS/CS i przygotować roztwór enzymu. Dodać 10 ml buforu HBSS/CS (HBSS; 5% buforu CS sporządzonego w kroku 3.1.1, który był przechowywany na lodzie) do sitka komórkowego i mieszać z prędkością 800 obr./min przez 10 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C. Wyrzuć bufor po każdym praniu.
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór enzymatyczny (bufor płuczący wolny od EDTA; 0,1 mg/ml DNazy I; 167 mg/ml kolagenazy) podczas drugiego okresu płukania: dodać 9 mg DNazy I i 15 mg liofilizowanej kolagenazy do 90 ml buforu płuczącego wolnego od EDTA. Roztwór należy przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Trawić frakcję blaszki właściwej zawartą w sitku do komórek w celu uzyskania limfocytów blaszki właściwej (LPL). Dodać 10 ml roztworu enzymatycznego (bufor płuczący wolny od EDTA; 0,1 mg/ml DNazy I; 167 mg/ml buforu kolagenazy sporządzonego w kroku 3.12.1 i przechowywanego w temperaturze pokojowej) do sitka komórkowego i mieszać z prędkością 800 obr./min przez 45 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: LPL są uwalniane do roztworu po trawieniu enzymatycznym.
	<ol>
		<li>Zebrać roztwór enzymu zawierający komórki i przefiltrować go przez nowe sitko do komórek do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 20 ml pożywki do płukania na zimno (HBSS; 1% CS; 1 mM bufor EDTA sporządzony w kroku 3.1.3 i przechowywany na lodzie w kroku 3.9.1) do przefiltrowanych komórek, aby zablokować aktywność kolagenazy w roztworze enzymu. Odwirować probówkę o sile 700 x g przez 6 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad zawierający LPL w 1 ml buforu FACS.</li>
	<li>Połączyć frakcje IEL (z kroku 3.7.1) i LPL (z kroku 3.14) i wybarwić je przeciwciałami sprzężonymi z fluorescencją do analizy cytometrycznej przepływowej (patrz krok 5). 
	UWAGA: Frakcje IEL i LPL mogą być barwione oddzielnie, jeśli wymagane są informacje o przedziałach.</li>
</ol>
4. Izolacja limfocytów ze śledziony
<ol>
	<li>Przygotować probówkę zbiorczą, dodając 500 μl buforu FACS do probówki mikrowirówkowej. Przechowuj go na lodzie.</li>
	<li>Po usunięciu jelita grubego (krok 3.4) należy pobrać całą śledzionę i umieścić ją w probówce zbiorczej. Przechowuj chusteczkę na lodzie.</li>
	<li>Za pomocą elektrycznego homogenizatora tkankowego homogenizować śledzionę w probówce do mikrowirówek przez około 1 minutę. Odwirować próbkę przy 300 x g [mikrowirówka] przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odessać supernatant.</li>
	<li>Przeprowadź lizę czerwonych krwinek, ponownie zawieszając próbkę w 500 μl buforu do lizy chlorku amonu i potasu (ACK) w celu zainicjowania śmierci komórki przez lizę osmotyczną. Pozostawić próbkę do inkubacji przez 1-2 minuty w temperaturze pokojowej, a następnie ponownie zawiesić ją w 725 μl buforu FACS.</li>
	<li>Odwirować próbkę o masie 300 x g [mikrowirówka] przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odessać sklarowany nad osadem. Zawiesić osad w 500 μl buforu FACS i przefiltrować go przez sitko o wielkości 40 μm do nowej probówki do mikrowirówki. Przenieść całą próbkę do nowej probówki do mikrowirówki i wybarwić ją przeciwciałami sprzężonymi z fluorescencją do analizy metodą cytometrii przepływowej (patrz krok 5).</li>
</ol>
5. Identyfikacja komórek Dendra-r+ za pomocą cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Odwirować próbki IEL/LPL i śledziony przy 300 x g [mikrowirówka] przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odessać supernatant.</li>
	<li>Zawiesić granulki w 100 μl mieszanki barwiącej przeciwciała. Przygotować mieszaninę do barwienia przeciwciał, dodając 1 μl fluorescencyjnie sprzężonego przeciwciała anty-CD45 do 100 μl buforu FACS na próbkę. 
	UWAGA: Ważne jest, aby przed eksperymentem miareczkować przeciwciała używane do cytometrii przepływowej w celu określenia optymalnego stężenia w miejscu, w którym występuje nasycenie wiązaniem.</li>
	<li>Próbki należy inkubować przez 35 minut na lodzie (w ciemnym miejscu).</li>
	<li>Zawiesić próbki w 300 μl buforu FACS i odwirować je przy 300 x g [mikrowirówce] przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant i ponownie zawiesić próbki w 325 μl buforu FACS. Przeanalizować próbki za pomocą cytometru przepływowego.</li>
</ol>

<ol><li>Maynard, C. L., Elson, C. O., Hatton, R. D., Weaver, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+interactions+of+the+intestinal+microbiota+and+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reciprocal interactions of the intestinal microbiota and immune system.</a> Nature. 489, 231-241 (2012).</li>
<li>Paun, A., Yau, C., Danska, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Influence+of+the+Microbiome+on+Type+1+Diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The Influence of the Microbiome on Type 1 Diabetes.</a> Journal of Immunology. 198, 590-595 (2017).</li>
<li>Mathis, D., Benoist, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbiota+and+autoimmune+disease%3A+the+hosted+self%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Microbiota and autoimmune disease: the hosted self.</a> Cell Host Microbe. 10, 297-301 (2011).</li>
<li>Kollmann, T. R., Kampmann, B., Mazmanian, S. K., Marchant, A., Levy, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protecting+the+Newborn+and+Young+Infant+from+Infectious+Diseases%3A+Lessons+from+Immune+Ontogeny%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Protecting the Newborn and Young Infant from Infectious Diseases: Lessons from Immune Ontogeny.</a> Immunity. 46, 350-363 (2017).</li>
<li>Jain, N., Walker, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diet+and+host-microbial+crosstalk+in+postnatal+intestinal+immune+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Diet and host-microbial crosstalk in postnatal intestinal immune homeostasis.</a> Nature Reviews in Gastroenterology and Hepatology. 12, 14-25 (2015).</li>
<li>Mowat, A. M., Agace, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+specialization+within+the+intestinal+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Regional specialization within the intestinal immune system.</a> Nature Reviews in Immunology. 14, 667-685 (2014).</li>
<li>Macpherson, A. J., Uhr, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+protective+IgA+by+intestinal+dendritic+cells+carrying+commensal+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induction of protective IgA by intestinal dendritic cells carrying commensal bacteria.</a> Science. 303, 1662-1665 (2004).</li>
<li>Mowat, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+basis+of+tolerance+and+immunity+to+intestinal+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Anatomical basis of tolerance and immunity to intestinal antigens.</a> Nature Reviews in Immunology. 3, 331-341 (2003).</li>
<li>Diehl, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbiota+restricts+trafficking+of+bacteria+to+mesenteric+lymph+nodes+by+CX%283%29CR1%28hi%29+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Microbiota restricts trafficking of bacteria to mesenteric lymph nodes by CX(3)CR1(hi) cells.</a> Nature. 494 (3), 116-120 (2013).</li>
<li>Pham, A. H., McCaffery, J. M., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+lines+with+photo-activatable+mitochondria+to+study+mitochondrial+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Mouse lines with photo-activatable mitochondria to study mitochondrial dynamics.</a> Genesis. 50, 833-843 (2012).</li>
<li>Conway, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATG5+regulates+plasma+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">ATG5 regulates plasma cell differentiation.</a> Autophagy. 9, 528-537 (2013).</li>
<li>Buzoni-Gatel, D., Lepage, A. C., Dimier-Poisson, I. H., Bout, D. T., Kasper, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+transfer+of+gut+intraepithelial+lymphocytes+protects+against+murine+infection+with+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Adoptive transfer of gut intraepithelial lymphocytes protects against murine infection with Toxoplasma gondii.</a> Journal of Immunology. 158, 5883-5889 (1997).</li>
<li>Guo, X., Muite, K., Wroblewska, J., Fu, Y. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+Adoptive+Transfer+of+Group+3+Gut+Innate+Lymphoid+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Purification and Adoptive Transfer of Group 3 Gut Innate Lymphoid Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1422, 189-196 (2016).</li>
<li>Morton, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoscopic+photoconversion+reveals+unexpectedly+broad+leukocyte+trafficking+to+and+from+the+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Endoscopic photoconversion reveals unexpectedly broad leukocyte trafficking to and from the gut.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 6696-6701 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Identyfikacja i charakterystyka komórek, które wchodzą w interakcje z mikrobiotą jelita grubego i znajdują się pod jej wpływem, są ważne i powinny ułatwić zrozumienie, w jaki sposób informacje z mikrośrodowiska błony śluzowej są przekazywane reszcie organizmu. Jedna z metod badania migracji komórek związanych z jelitami wymaga izolacji komórek związanych z jelitami, a następnie adoptywnego transferu do myszy biorcy w celu określenia ich wzorców naprowadzania tkanek i funkcji12,13<sup cl...

Przewód pokarmowy ssaków jest siedliskiem setek gatunków bakterii, które żyją w symbiozie z gospodarzem1. Komórki odpornościowe obecne w lokalnym środowisku wymuszają pokojowe współistnienie z tymi drobnoustrojami i tworzą barierę ochronną przed inwazją patogenów. W związku z tym dwukierunkowe interakcje między komórkami odpornościowymi a mikrobiotą mają kluczowe znaczenie dla stworzenia społeczności komensalnej, która edukuje układ odpornościowy gospodarza i ustala próg reaktywności immunologicznej na patogeny. Zmiany w składzie mikrobiologicznym lub dysbioza mogą zaburzać homeostazę immunologiczną i zaburzać obwody regulacyjne, które hamują stany zapalne jelit, prowadząc do chorób o podłożu immunologicznym, takich jak cukrzyca typu 1 i IBD2,3.
Okres bezpośrednio po urodzeniu jest unikalnym okresem rozwoju, podczas którego zaczynają tworzyć się społeczności mikroorganizmów jelitowych, jednocześnie dojrzewa układ odpornościowy4. Mikrobiota pourodzona nie jest stabilna, a zmiany w składzie społeczności zachodzą naturalnie i często5. Komórki odpornościowe, które wchodzą w interakcje z mikrobiotą, znajdują się w dwóch różnych lokalizacjach anatomicznych w jelicie - blaszce właściwej i nabłonku jelitowym6. W jelicie obecnych jest wiele rodzajów komórek odpornościowych, w tym limfocyty (takie jak limfocyty T, limfocyty B i wrodzone komórki limfoidalne), a także komórki mieloidalne (w tym komórki dendrytyczne, monocyty i makrofagi). Komórki te, znane również jako komórki krwiotwórcze, pełnią wiele funkcji, które zachowują barierę jelitową i utrzymują homeostazę.
Oprócz funkcji regulacyjnych w miejscach jelitowych, komórki odpornościowe błony śluzowej mogą również przenosić wiadomości mikrobiologiczne do miejsc pozajelitowych, aby regulować odporność ogólnoustrojową7,8,9. Jest to obszar rosnącego zainteresowania badawczego i podkreśla potrzebę opracowania metod identyfikacji komórek odpornościowych, które migrują z tkanek jelitowych w celu zbadania ich funkcji. Opisany tutaj protokół wykorzystuje dostępny na rynku model mysim, w którym fotokonwertowalne białko fluorescencyjne jest wykorzystywane do znakowania komórek. Myszywycięte metodą PhAM powszechnie wykazują ekspresję zielonego fluorescencyjnego białka Dendra2, które jest nieodwracalnie przełączane na czerwoną fluorescencję po aktywacji światłem ultrafioletowym (UV) 10. Używając kaniuli światłowodowej do dostarczania światła o długości 405 nm do okrężnicy nowonarodzonych myszy, pokazujemy, że fotoprzekształcone komórki krwiotwórcze, które powstały w okrężnicy lub przeszły przez nią, można znaleźć w śledzionie.

<table><tbody><tr><td>Laser</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dioda elektroluminescencyjna (LED)</td><td>THORLABS</td><td>M405FP1</td><td>UWAGA: jest to laser klasy 3b. Podczas korzystania z lasera należy nosić okulary ochronne. Emituje falę o długości 405 nm i prąd o natężeniu 1400 mA. Jest sprzężony z włóknem. Akceptuje złącze SMA. https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=M405FP1</td></tr><tr><td>sterownik LED</td><td>THORLABS</td><td>LEDD1B</td><td>Napędza stały prąd 1200 mA przez laser. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=2616</td></tr><tr><td>krosowy Optogenetics</td><td>THORLABS</td><td>M87L01</td><td>o długości 1 m ze złączem SMA. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=11405&pn=M87L01#11454</td></tr><tr><td>Kaniula</td><td>światłowodowa Soczewki doryckie&nbsp;</td><td>MFC_480/500-0.5_5mm_ZF1.25_C45</td><td>Kaniula o długości 5 mm i średnicy zewnętrznej 500 &mikro; m i średnicy wewnętrznej 480 &mikro;m. Wartość NA wynosi 0,5. Skuwka to tlenek cyrkonu, średnica zewnętrzna 1,25 mm. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=6036</td></tr><tr><td>Zasilacz</td><td>THORLABS</td><td>KPS101</td><td>Dostarcza 15 V o natężeniu prądu 2,4 A https://www.thorlabs.com/search/thorsearch.cfm?search=KPS101</td></tr><tr><td>laserowe gogle ochronne LG3&nbsp;</td><td>Soczewki THORLABS</td><td>LG3</td><td>Orange o przepuszczalności światła widzialnego 47% https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=762&pn=LG3#2523</td></tr><tr><td>Światło czerwone&nbsp;</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>74327-10</td><td>Lampa 15 W https://us.vwr.com/store/product/12360027/paterson-safelight-electron-microscopy-sciences</td></tr><tr><td>Izolacja komórek jelitowych</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-893-1389</td><td>UWAGA: wdychanie tego środka znieczulającego może powodować zawroty głowy, senność, a nawet utratę przytomności. Ten środek znieczulający powinien być stosowany w okapie klasy II.&nbsp; https://www.pattersonvet.com/Supplies/ProductFamilyDetails/PIF_762328?carouselPageNumber=3</td></tr><tr><td>1X HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025076</td><td>wolne od Ca / Mg https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-hbss-calcium-magnesium-no-phenol-red-4/14025076?searchHijack=true&searchTerm=14025076&searchType=RAPID&matchedCatNo=14025076</td></tr><tr><td>Surowicy cielęcej</td><td>Hyclon AZM</td><td>197696</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td>stężenie 0,5 M https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020?SID=srch-srp-15575020</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>10197777001</td><td>UWAGA: działa szkodliwie po połknięciu i działa drażniąco na skórę. Stężenie 1 M https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/dttro?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>Stężenie 1 M https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15630080?SID=srch-hj-15630080</td></tr><tr><td>szalka Petriego</td><td>Corning</td><td>353004</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-easy-grip-tissue-culture-dishes-2/08772f?searchHijack=true&searchTerm=08772F&searchType=RAPID&matchedCatNo=08772F</td></tr><tr><td>sitko komórkowe 70 mikronów</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087712</td></tr><tr><td>Mikro magnetyczna kostka</td><td>mieszająca Fisherbrand</td><td>1451364</td><td>Spłucz w 70% etanolu po każdym użyciu. Przed każdym użyciem spłucz kilka razy w wodzie destylowanej. Pręt ma długość 8 mm i ośmiokątny kształt. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-octagonal-magnetic-stir-bars-12/1451364#?keyword=1451364</td></tr><tr><td>Mieszadła magnetyczne</td><td>Mieszadełka laboratoryjne Corning</td><td>440826</td><td>https://www.coleparmer.com/i/corning-440826-nine-position-stirrer-120-vac-60-hz/8430420?PubID=UX&persist=true&ip=no&gclid=CjwKCAiAqbvTBRAPEiwANEkyCLPLrWABXmOUI0QE53NLV0Owxlcs2V1K6rWbRPOwlcVVDq000FBiQxoCqQAQAvD_BwE</td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Roche</td><td>5401020001</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/05401020001?lang=en&region=US&gclid=CjwKCAiAjuPRBRBxEiwAeQ2QPhE44qlvxjmo1PYu3zCas3w-_d6P9gKjXW82-c1EOm6NjPHCc5WuixoC_0IQAvD_BwE</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>10104159001</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/10104159001?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Gibco</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/20012027?SID=srch-hj-20012-027 Pipet aid</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>14387165 https://www.fishersci.com/shop/products/s1-pipette-fillers/14387165#?keyword=14387165</td></tr><tr><td>10 ml pipeta serologiczna</td><td>Falcon</td><td>357530</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659</td></tr><tr><td>Pipeta serologiczna 25 ml</td><td>Falcon</td><td></td><td>357515 https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659</td></tr><tr><td>15 ml stożkowa probówka wirówkowa</td><td>Thermo Scientific</td><td>339651</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650</td></tr><tr><td>50 ml stożkowa probówka wirówkowa</td><td>Thermo Scientific</td><td>339653</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650</td></tr><tr><td>Zawiesina jednokomórkowa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówki Eppendorfa</td><td>Seal-Rite</td><td>1615-5500</td><td>Mieści 1,5 mL. https://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube.aspx</td></tr><tr><td>Homogenizator tkankowy&nbsp;</td><td>Kimble</td><td>K7495400000</td><td>wymaga 2 baterii AA. https://www.fishersci.com/shop/products/kontes-pellet-pestle-cordless-motor-cordless-motor/k7495400000</td></tr><tr><td>Końcówki homogenizatora&nbsp;</td><td>Kimble</td><td>7495210590</td><td>Plastikowe, końcówki 0,5 ml https://www.fishersci.com/shop/products/kimble-chase-kontes-pellet-pestle-14/k7495210590#?keyword=7495210590</td></tr><tr><td>bufor lizujący ACK</td><td>Gibco</td><td>A10492-01</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1049201?SID=srch-hj-A10492-01</td></tr><tr><td>Sitko do komórek 40 mikronów</td><td>Falcon</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711przeciwciała</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BV786 anty-mysie CD45&nbsp;</td><td>BD</td><td>564225</td><td>Clone 3O-F11 https://www.bdbiosciences.com/us/reagents/research/antibodies-buffers/immunology-reagents/anti-mouse-antibodies/cell-surface-antigens/bv786-rat-anti-mouse-cd45-30-f11/p/564225</td></tr><tr><td>żywy/martwy</td><td>Invitrogen</td><td>L34962</td><td></td></tr> <tr><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L34962Inne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Razor ostrza</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td>Służy do dekapitacji. https://us.vwr.com/store/product/4548306/vwr-razor-blades</td></tr></tbody></table>

in vivo (in vivo) fotoznakowanie komórek w okrężnicy w celu oceny potencjału migracyjnego komórek krwiotwórczych u nowonarodzonych myszy

In Vivo Photolabeling of Cells in the Colon to Assess Migratory Potential of Hematopoietic Cells in Neonatal Mice

Bakteryjne społeczności jelitowe powstają we wczesnym okresie życia i wpływają na rozwój i funkcjonowanie komórek odpornościowych. Mikrobiota noworodka jest podatna na liczne czynniki zewnętrzne, w tym stosowanie antybiotyków i dietę, co wpływa na podatność na choroby autoimmunologiczne i zapalne. Zaburzenia takie jak nieswoiste zapalenie jelit (IBD) charakteryzują się masowym napływem komórek odpornościowych do jelit. Jednak komórki odpornościowe uwarunkowane przez mikrobiotę mogą dodatkowo emigrować z jelit, aby wpływać na odpowiedź immunologiczną w miejscach pozajelitowych. W związku z tym istnieje potrzeba zidentyfikowania i scharakteryzowania komórek, które mogą przenosić wiadomości mikrobiologiczne z jelit do miejsc dystalnych. W tym miejscu opisujemy metodę znakowania komórek w okrężnicy nowonarodzonych myszy in vivo, która umożliwia ich identyfikację w miejscach pozajelitowych po migracji.

Do doprowadzania światła o długości fali 405 nm do jelit grubych 2-dniowych myszy PhAMexcised użyto kabla światłowodowego. W poprzednich eksperymentach ustalono, że 30 s ekspozycji zapewnia maksymalną fotokonwersję komórek jelita grubego przy minimalnej cytotoksyczności (Rycina 1A). W związku z tym, zgodnie z opisem w protokole, przeprowadzono sekwencyjne 30 s ekspozycje różnych segmentów jelita grubego. Po naświetlaniu laserem mys...

Opisany tutaj protokół wykorzystuje metodę fotoznakowania u nowonarodzonych myszy do specyficznej identyfikacji komórek odpornościowych, które migrują z jelita grubego do miejsc pozajelitowych. Strategia ta będzie przydatna do badania interakcji gospodarz-mikrobiom we wczesnym okresie życia.

In vivo (in vivo) Fotoznakowanie komórek w okrężnicy w celu oceny potencjału migracyjnego komórek krwiotwórczych u nowonarodzonych myszy

Enteric bacterial communities are established early in life and influence immune cell development and function. The neonatal microbiota is susceptible to ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie immunologii błony śluzowej dotyczące interakcji mikrobiomu immunologicznego noworodka z gospodarzem gospodarza, takie jak: czy komórki przenoszą wiadomości mikrobiologiczne, a jeśli tak, to jakie to komórki? Główną zaletą tej techniki jest to, że niespecyficznie i nieodwracalnie znakuje komórki rezydujące w okrężnicy u młodych myszy, umożliwiając nam określenie ich wzorców transportu do miejsc pozajelitowych. Aby zmontować laser, podłącz diodę elektroluminescencyjną lub diodę LED do sterownika LED za pomocą czteropinowego połączeniowego M8 diody LED i ostrożnie dokręć, aby zamocować połączenie.Przytrzymaj otwór złącza diody LED do światła, aby upewnić się, że nie ma widocznych przeszkód. Włóż plastra optogenetycznego do otworu. Włóż kaniulę do dowolnego końca tulei złącza.Następnie przymocuj drugi koniec tulei złącza do końca krosowego, łącząc kaniulę światłowodową z światłowodowym. Użyj pokrętła regulacji ciągłej, aby ustawić sterownik LED w trybie fali ciągłej przy zero, a limit prądu ustawić na 1.2 amps. Gdy laser będzie gotowy, podłącz sterownik LED do źródła zasilania w ciemnym miejscu.Jedną ręką delikatnie prz

in-vivo-photolabeling-cells-colon-to-assess-migratory-potential

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Niniejszy artykuł opisuje metodę znakowania naczyń krwionośnych w skórze zarodkowej i grasicy.

Metoda znakowania naczyń krwionośnych u embrionów myszy

Zakażenie noworodków ludzkim wirusem cytomegalii (HCMV) stanowi ważną przyczynę upośledzenia umysłowego, jednak zdarzenia molekularne prowadzące do patogenezy wywołanej przez wirusa są nadal słabo poznane. Aby zbadać dynamikę infekcji mózgu, dostosowaliśmy obrazowanie in vivo całych zwierząt do przeprowadzenia analizy przebiegu w czasie noworodków zakażonych wirusem rekombinowanym lucyferazy.

Zastosowanie obrazowania in vivo do monitorowania postępu eksperymentalnego zakażenia mysim wirusem cytomegalii u noworodków

Opisujemy ogólny protokół śledzenia komórek in vivo za pomocą MRI w modelu mysim z komórkami oznaczonymi ex vivo. Dołączony jest typowy protokół do znakowania komórek, przetwarzania akwizycji obrazu i kwantyfikacji.

Rezonans magnetyczny in vivo 19F do śledzenia komórek

Kombinatoryczne oznaczanie 5 fluorescencyjnych białek hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych pozwala na śledzenie klonów in vivo za pomocą mikroskopii konfokalnej i dwufotonowej, dostarczając wglądu w architekturę hematopoetyczną szpiku kostnego podczas regeneracji. Metoda ta umożliwia nieinwazyjne mapowanie losów kodowanych spektralnie komórek pochodzących z HSPC w nienaruszonych tkankach przez długi czas po przeszczepie.<br...

In vivo (in vivo) Klonalne śledzenie hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych oznaczonych pięcioma białkami fluorescencyjnymi przy użyciu mikroskopii konfokalnej i wielofotonowej

Natura interakcji między krwiotwórczymi komórkami macierzystymi i progenitorowymi (HSPC) a niszami szpiku kostnego jest słabo poznana. Niestandardowe modyfikacje sprzętowe i wieloetapowy protokół akwizycji pozwalają na wykorzystanie mikroskopii dwufotonowej i konfokalnej do obrazowania znakowanych ex vivo HSPC umieszczonych w obszarach szpiku kostnego, śledząc interakcje i ruch.

4-wymiarowe śledzenie in vivo hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych w dorosłym szpiku kostnym nazębnym myszy

Monocyty są kluczowymi regulatorami odporności wrodzonej i odgrywają kluczową rolę w odnowie obwodowego jednojądrzastego systemu fagocytarnego oraz w przypadku stanów zapalnych. W artykule opisano procedurę obrazowania w czasie rzeczywistym szpiku kostnego kalwarii myszy w celu zbadania mechanizmu mobilizacji monocytów.

Śledzenie monocytów szpiku kostnego myszy in vivo

Szczegółowo opisujemy protokół monitorowania zachowania neutrofili i monocytów w żyłach krezkowych w stanie stacjonarnym i stanach zapalnych za pomocą mikroskopii konfokalnej przyżyciowej na znieczulonych myszach.

Obrazowanie neutrofili i monocytów w żyłach krezkowych za pomocą mikroskopii przyżyciowej na znieczulonych myszach w czasie rzeczywistym

Mechanizmy rządzące ruchliwością śródmiąższową komórek T efektorowych CD4 w miejscach zapalenia są stosunkowo nieznane. Przedstawiamy nieinwazyjne podejście do wizualizacji i manipulacji limfocytami T CD4 przygotowanymi in vitro w zapalnej skórze właściwej ucha, co pozwala na badanie dynamicznego zachowania tych komórek in situ.

Obrazowanie migracji śródmiąższowej komórek T CD4 w stanie zapalnym skóry właściwej

Protokoły ilościowej oceny chemotaksji i migracji limfocytów są ważnymi narzędziami do badań immunologicznych. Opisano w nim protokół in vitro, który umożliwia multipleksowaną ocenę migracji komórek w czasie rzeczywistym, a także komplementarną technikę in vivo umożliwiającą śledzenie komórek natywnych do śledziony.

Kwantyfikacja chemotaksji ludzkich monocytów in vitro i handlu mysimi limfocytami in vivo

Opisujemy metodę wizualizacji IELs γδ znakowanych GFP za pomocą obrazowania przyżyciowego mysiego jelita cienkiego za pomocą mikroskopii konfokalnej z odwróconym wirującym dyskiem. Technika ta umożliwia śledzenie żywych komórek w błonie śluzowej przez okres do 4 godzin i może być wykorzystana do badania różnych interakcji jelitowych między układem odpornościowym a nabłonkiem.

Obrazowanie przyżyciowe limfocytów śródnabłonkowych w jelicie cienkim myszy

Migracja neutrofili polega na szybkiej i ciągłej przebudowie błony plazmatycznej w odpowiedzi na chemoatraktant i jego interakcje z mikrośrodowiskiem zewnątrzkomórkowym. Opisana w niniejszym dokumencie jest procedura oparta na przyżyciowej mikroskopii subkomórkowej w celu zbadania dynamiki przebudowy błony w neutrofilach wstrzykniętych do ucha znieczulonych myszy.

Obrazowanie migracji neutrofili w skórze myszy w celu zbadania przebudowy błony subkomórkowej w warunkach fizjologicznych

Poznaj technikę fotoznakowania komórek w okrężnicy noworodków myszy w celu śledzenia ich migracji do pozajelitowych tkanek. Ta metoda umożliwia badanie interakcji układu immunologicznego z mikrobiomem u noworodków.

In vivo (in vivo) Fotoznakowanie komórek w okrężnicy w celu oceny potencjału migracyjnego komórek krwiotwórczych u nowonarodzonych myszy (Wideo) | JoVE Journal

In vivo (in vivo) Fotoznakowanie komórek w okrężnicy w celu oceny potencjału migracyjnego komórek krwiotwórczych u nowonarodzonych myszy

Przeglądaj więcej filmów