Name: Obrazowanie FITC-dekstranu jako reportera regulowanej egzocytozy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 50 s
Description: Poznaj metodę obrazowania FITC-dekstranu do rozróżniania trybów regulowanej egzocytozy w żywych komórkach. Technika ta umożliwia wizualizację zdarzeń egzocytotycznych w czasie rzeczywistym w komórkach tucznych i innych typach komórek sekretorycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Dr. U. Ashery za hojny dar cDNA. Dziękujemy doktorom G. Mass, L. Mittlemanowi, M. Shaharbani i Y. Zilbersteinowi z Centrum Obrazowania Komórkowego i Molekularnego Sacklera za ich nieocenioną pomoc w mikroskopii. Praca ta była wspierana przez Amerykańsko-Izraelską Dwunarodową Fundację Naukową (grant 2013263 dla R. Sagi-Eisenberga, I. Hammela i S.J. Galli) oraz grant 933/15 z Izraelskiej Fundacji Naukowej. założony przez Izraelską Akademię Nauk (dla R. Sagi-Eisenberga) i NIH przyznaje U19 AI 104209 i R01 AR067145 (dla S.J. Galli).

1. Przygotowania
<ol>
	<li>Przygotowanie pożywek hodowlanych RBL
	<ol>
		<li>Wymieszaj 500 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco z 56 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 5,5 ml roztworu penicyliny, streptomycyny i nystatyny, 5,5 ml roztworu L-glutaminy 200 mM. Powoduje to DMEM o niskim poziomie glukozy uzupełnionym 10% FBS, 100 μg / ml streptomycyny, 100 jednostek / ml penicyliny, 12 jednostek / ml nystatyny i 2 mM L-glutaminy.</li>
		<li>Przefiltrować media za pomocą filtra próżniowego o wielkości porów 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utrzymanie komórek RBL.
	<ol>
		<li>Wyhoduj komórki RBL do maksymalnej konfluencji 90% w 10 cm naczyniu. Jeśli hodowla komórkowa jest zdrowa, komórki powinny mieć kształt wrzeciona z okazjonalnymi wypukłościami.</li>
		<li>W celu rozszczepienia komórek należy odłączyć komórki od naczynia poprzez zasysanie pożywki i zastąpienie 2 ml roztworu B. Inkubować przez 5-10 minut w wilgotnej atmosferze 5% CO2 w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Po odłączeniu komórek zneutralizuj trypsynę, dodając 2 ml pożywki hodowlanej za pomocą pipety i podziel komórki w stosunku 1:2 - 1:10.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie bufora 20x Tyrode
	<ol>
		<li>Przygotuj podstawowy 20-krotny roztwór 54 mM KCl, 20 mM MgCl2, 2,74 M NaCl i 8 mM NaH2PO4 w wodzie podwójnie destylowanej (DDW). Dobrze wymieszać i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Hodowla komórek RBL do mikroskopii żywych komórek
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworu FITC-dekstranu.
	<ol>
		<li>Zmieszać 1 mg sproszkowanego dekstranu FITC (150 K) na 1 ml pożywki hodowlanej (patrz krok 1.1.1). Aby uzyskać pełnokomorową szklankę nakryciową, przygotuj 3 ml.</li>
		<li>Używając jednostki filtrującej strzykawkę z octanu celulozy o wielkości porów 0,22 μm, przefiltruj rozpuszczony dekstran FITC.</li>
		<li>Dodać mysie IgE do stężenia 1 μg/ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wysiewanie komórek RBL do obrazowania
	<ol>
		<li>Dzień przed obrazowaniem odessać pożywkę z szalki hodowlanej i zastąpić 2 ml roztworu B. Inkubować przez 5 - 10 minut w wilgotnej atmosferze 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Po odłączeniu komórek zneutralizuj trypsynę, dodając 2 ml pożywki hodowlanej.</li>
		<li>Policz komórki RBL za pomocą hemocytometru i odpowiednio dostosuj objętość za pomocą pożywki hodowlanej, aby uzyskać stężenie komórek 7,5 x 105 / ml.</li>
		<li>Dodać 10 μl zawiesiny komórkowej do komorowego szkła nakrywkowego wstępnie wypełnionego świeżą pożywką hodowlaną uzupełnioną FITC-dekstranem (w wyniku czego w komorze zostanie wysiew7,5 x 10 3 komórek).</li>
		<li>Hodować komórki RBL przez noc w wilgotnej atmosferze 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Komórki powinny pozostać na poziomie sub-konfluencji, aby upewnić się, że komórki są oddzielone i że łatwo jest zidentyfikować każdą komórkę indywidualnie pod mikroskopem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Transfekcja komórek RBL - opcjonalnie.
	<ol>
		<li>Aby zobrazować zdarzenia egzocytarne w połączeniu z innymi fluorescencyjnie znakowanymi białkami, zobacz protokół transfekcji dla komórek RBL w Azouz i wsp.67</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Mikroskopia egzocytozy na żywych komórkach
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworów:
	<ol>
		<li>Przygotować końcowy roztwór buforowy Tyrode'a, rozcieńczając roztwór podstawowy w DDW w rozcieńczeniu 1:20 i uzupełnić 20 mM Hepes pH 7, 1,8 mM CaCl2, 1 mg/ml BSA i 5,6 mM glukozy.</li>
		<li>Świeżo przygotuj 20-krotny odczynnik sekretagogiczny w buforze Tyrode'a [1 μg/ml dinitropfenylu sprzężony z albuminą surowicy ludzkiej (DNP-HAS (Ag)) w naszym przypadku, dla stężenia 50 ng/ml 1x].</li>
		<li>Przygotować roztwór chlorku amonu o stężeniu 400 mM, rozpuszczając proszek w buforze Tyrode'a.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie komórek.
	<ol>
		<li>Umyj nakrycie z komorą 3 razy, odsysając pożywkę z komory i ponownie napełniając ją 300 μl buforu Tyrode, podgrzanego do temperatury 37 °C. Na koniec uzupełnij komorę 300 μl buforu Tyrode, podgrzanego do 37 °C.</li>
		<li>Umieść szklaną pokrywę z komorą w komorze inkubatora mikroskopu. Upewnij się, że komora jest stabilna.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustawianie mikroskopu
	<ol>
		<li>Aby wybrać obszar zainteresowania do śledzenia, włącz fluorescencyjne źródło światła (tradycyjnie lampę rtęciową) i wybierz odpowiedni filtr fluorescencyjny (wybierz filtr dla zielonych fluoroforów do oglądania FITC-dstranu). Gdy obszar zainteresowania jest ostry i znajduje się w środku pola widzenia, wyłącz źródło światła, aby uniknąć fotowybielania i toksyczności. 
		UWAGA: Część dekstranu FITC-wbudowanego w komórki może zachować fluorescencję. Dzieje się tak, ponieważ dekstran FITC może być również sortowany do przedziałów nielizosomalnych, takich jak endosomy.</li>
		<li>Włącz odpowiednie oświetlenie do wzbudzenia FITC. Jeśli używasz mikroskopu laserowego, włącz laser o długości fali 488 nm. Emisja powinna być zgromadzona w okolicach 500 - 550 nm (szczyt emisji FITC przy 510 - 520 nm).</li>
		<li>Podczas korzystania z mikroskopu konfokalnego otwórz otwór do maksimum. Pozwoli to na użycie mniejszej mocy lasera, aby uniknąć bielenia i toksyczności oraz zapewni wychwycenie zdarzeń egzocytozy ze wszystkich płaszczyzn komórki.</li>
		<li>Skalibruj odstęp czasu między akwizycjami obrazu.
		<ol>
			<li>Różne komórki mogą różnić się kinetyką regulowanej egzocytozy68. W przypadku specyficznego obrazowania egzocytozy złożonej zalecamy odstęp czasu wynoszący co najmniej 5 sekund. Jednak z reguły, aby umożliwić szybkie obrazowanie, upewnij się, że czas akwizycji pojedynczej klatki jest krótki.</li>
			<li>W przypadku korzystania z laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego należy ustawić kierunek skanowania na dwukierunkowy, nie dopuszczać do uśredniania i ustawić rozdzielczość na 512 x 512 (zalecane; dwa ostatnie przepisy pomogą również zminimalizować bielenie i toksyczność).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowanie egzocytozy.
	<ol>
		<li>Obrazuj komórki przez żądany czas trwania, w zależności od typu komórki lub sekretagogii. W komórkach RBL wyzwalanych IgE/Ag większość zdarzeń egzocytarnych występuje w ciągu 15 - 20 minut od aktywacji.</li>
		<li>W celu aktywacji komórek dodaj do komory 16 μl z 20x roztworu wydzielającego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Potwierdzenie obecności FITC-dekstranu w komórkach.
	<ol>
		<li>Aby potwierdzić obecność i lokalizację FITC-dekstranu w SGs, delikatnie dodaj 16 μl roztworu chlorku amonu (należy uważać, aby nie przesunąć komory, aby nie stracić ostrości) do komory (uzyska to końcowe stężenie 20 mM). Spowoduje to alkalizację SG i wygaszenie fluorescencji FITC, co nastąpi w ciągu kilku sekund.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów finansowych

Tutaj opisujemy, w jaki sposób śledzenie fluorescencji dekstranu FITC załadowanego do SG może być wykorzystane do specyficznego wychwytywania złożonych zdarzeń egzocytozy. Udało się to osiągnąć poprzez ustawienie mikroskopu tak, aby uzyskiwał obraz co 15 sekund, zapewniając w ten sposób, że w czasie rejestrowane będą tylko długotrwałe zdarzenia, a tym samym wykluczając krótkie zdarzenia, które odpowiadałyby pełnej egzocytozie lub egzocytozie typu kiss-and-run. Aby ustalić metodę, wykazaliśmy, że knockdown izoform Rab5, k...

Regulowana egzocytoza jest podstawowym mechanizmem, dzięki któremu łatwo wytwarzany ładunek jest uwalniany z komórki wydzielniczej w odpowiedzi na określony wyzwalacz. Ładunek jest wstępnie formowany i sekwestrowany w pęcherzykach wydzielniczych, w których jest przechowywany do momentu, gdy wyzwalacz przekaże sygnał do uwolnienia zawartości SG. Różne rodzaje sygnałów mogą powodować różne tryby regulowanej egzocytozy lub różne tryby regulowanej egzocytozy mogą występować jednocześnie. Znane są trzy główne tryby regulowanej egzocytozy: pełna egzocytoza, która polega na pełnym zespoleniu pojedynczej granulki wydzielniczej z błoną plazmatyczną; egzocytoza typu kiss-and-run, która polega na przejściowym połączeniu granulki wydzielniczej z błoną plazmatyczną, a następnie jej recyklingowi; oraz egzocytoza złożona, która charakteryzuje się homotypowym połączeniem kilku SG przed (tj. egzocytozą wieloziarnistą) lub sekwencyjną (tj. egzocytozą sekwencyjną) do fuzji z błoną plazmatyczną<klasa sup="xref">1. Egzocytoza złożona jest uważana za najbardziej rozległy sposób uwalniania ładunku2, ponieważ pozwala na szybkie wydzielanie ładunku, w tym z SG, które znajdują się dystalnie od błony komórkowej. Egzocytoza złożona została udokumentowana zarówno w komórkach zewnątrzwydzielniczych, jak i endokrynnych3,4,5,6,7,8,9, a także w komórkach odpornościowych. W komórkach odpornościowych, takich jak eozynofile10,11,12 i neutrophils13, egzocytoza złożona umożliwia szybkie i silne uwalnianie mediatorów, które są wymagane do zabijania inwazyjnych patogenów, takich jak bakterie lub pasożyty. Komórki tuczne (MC) wykorzystują egzocytozę złożoną w celu skutecznego uwalniania wstępnie zmagazynowanych mediatorów stanu zapalnego podczas wrodzonej odpowiedzi immunologicznej, anafilaksji i innych reakcji alergicznych14,15,16,17. Ponieważ różne tryby egzocytozy mogą występować jednocześnie18,19, wyzwaniem stało się rozróżnienie ich w czasie rzeczywistym lub zidentyfikowanie ich odpowiednich mechanizmów fuzji, a tym samym wyjaśnienie ich podstawowych mechanizmów.
Tutaj prezentujemy metodę, opartą na obrazowaniu żywych komórek załadowanego FITC-dekstranu, która pozwala na śledzenie zdarzeń egzocytarnych w czasie rzeczywistym i rozróżnianie ich różnych trybów. W szczególności nasza metoda pozwala na wyłączne monitorowanie egzocytozy złożonej.
FITC-dekstran jest koniugatem wrażliwego na pH fluoroforu FITC z glukanem polisacharydowym dekstranem. Wykazano, że znakowane fluorescencyjnie dektrans dostają się do komórki przez mikropinocytozę20,21 i makropinocytoza22,23. W miarę dojrzewania przedziałów endocytarnych do lizosomów wykazano, że FITC-dekstran gromadzi się w lizosomie bez widocznej degradacji. Ponieważ jednak FITC jest wysoce wrażliwym na pH fluoroforem24, a światło lizosomu jest kwaśne, fluorescencja FITC-dekstranu słabnie po osiągnięciu lizosomu24. W związku z tym ustalenie, że dekstrans jest ładunkiem docelowym lizosomów, w połączeniu z czułością pH FITC, stworzyło podstawy do zastosowania FITC-dekstranu w badaniach egzocytozy lizosomów25,26,27,28,29.
W kilku typach komórek, w tym MCs, neutrofile, eozynofile, cytotoksyczne limfocyty T, melanosomy i inne, SG wykazują cechy lizosomalne i są klasyfikowane jako organelle związane z lizosomami (LRO) lub lizosomy wydzielnicze30,31. Ponieważ LRO mają kwaśne pH światła, FITC-dekstran może być używany do wizualizacji ich egzocytozy, w wyniku wyższego pH związanego z eksterioryzacją LRO. Rzeczywiście, FITC-dekstran został użyty do monitorowania egzocytozy w MCs18,32,33. W tej metodzie FITC-dekstran jest dodawany do hodowli komórkowej, pobierany przez komórki przez pinocytozę i sortowany do SG. Podobnie jak w lizosomach, fluorescencja FITC jest wygaszana w SG, gdy znajdują się one w komórce. Jednak po fuzji SG z błoną plazmatyczną, a w konsekwencji wystawieniu na działanie środowiska zewnętrznego, dekstran FITC odzyskuje swoją fluorescencję wraz ze wzrostem pH SG, co umożliwia proste śledzenie zdarzeń egzocytarnych za pomocą mikroskopii żywych komórek. Tutaj dostosowaliśmy tę metodę, aby umożliwić unikalne śledzenie egzocytozy złożonej.
Wcześniej używano dwóch innych metod do śledzenia egzocytozy złożonej. Mikroskopia elektronowa była pierwszą metodą charakteryzowania struktur egzocytarnych, która sugerowała występowanie różnych trybów egzocytozy. W szczególności obserwacje "tuneli wydzielniczych" w komórkach groniastych trzustki34 i MCs35,36,37 dały początek hipotezie egzocytozy złożonej. Jednakże, chociaż wysoka rozdzielczość mikroskopii elektronowej ma moc ujawniania stopionych pęcherzyków, nie może śledzić dynamiki ich fuzji, a zatem nie może określić, czy odpowiadają one fuzji SG podczas egzocytozy złożonej, czy fuzji ponownie wychwyconych granulek po ich endocytozie. Przeszkodę tę można pokonać innymi metodami, które mogą mierzyć egzocytozę w żywych komórkach, takimi jak pomiary pojemności błony plazmatycznej za pomocą zacisków krosowych11,13,38,39 lub amperometry40 nośnika. Jednak mocowanie punktowe wymaga specjalnej konfiguracji i może nie być odpowiednie dla wszystkich typów ogniw. Pomiary amperometryczne są w stanie śledzić egzocytozę tylko wtedy, gdy ładunek jest uwalniany w bardzo bliskiej odległości od elektrody. Dlatego korzystanie z obrazowania żywych komórek ma przewagę nad tymi metodami, ponieważ nie tylko pozwala na śledzenie egzocytozy w czasie rzeczywistym, ale także umożliwia szybkie i proste pozyskiwanie danych z całej komórki.
Śledzenie FITC-dekstranu za pomocą mikroskopii żywych komórek oferuje również pewne zalety innym metodom opartym na obrazowaniu żywych komórek. Na przykład szeroko stosowaną metodą jest mikroskopia fluorescencyjna z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM) komórek załadowanych fluorescencyjną sondą SG lub wyrażających fluorescencyjny ładunek SG lub białko błonowe znakowane białkiem fluorescencyjnym26,41,42,43. Siła tej metody polega na jej zdolności do monitorowania wyłącznie zdarzeń zachodzących w pobliżu błony komórkowej (zwanych dalej śladem węglowym), a więc zdarzeń egzocytarnych. Jest to jednak również wada tej metody, ponieważ można obrazować tylko frakcję komórkową, która przylega do szkła nakrywkowego i znajduje się blisko soczewki mikroskopu44. To, czy takie ślady rzeczywiście reprezentują całą powierzchnię błony komórkowej, jest nadal dyskusyjne45,46,47. W związku z tym użycie barwnika wrażliwego na pH, takiego jak dekstran FITC, oraz standardowego mikroskopu fluorescencyjnego lub mikroskopu konfokalnego z otwartym otworkiem umożliwia obrazowanie całej komórki, uchwycając w ten sposób całkowite zdarzenia egzocytarne, które zachodzą w tej komórce.
Dodatkowe reportery wrażliwe na pH, które są używane do badania regulowanej egzocytozy za pomocą obrazowania całych komórek lub TIRFM, obejmują ładunek SG lub białko błonowe SG połączone z floryną, wrażliwym na pH wariantem GFP. Przykłady obejmują NPY-flouryna-, β-heksoseaminidaza-flouryna i synapto-phluorin48,49,50,51,52. Podczas gdy ekspresja tych sond może bardziej odzwierciedlać endogenny skład SG, pociąga za sobą transfekcję komórek, a zatem może być mniej odpowiednia dla komórek, które są trudne do transfekcji. Dlatego podczas badania komórek, które są trudne do transfekcji lub w warunkach eksperymentalnych, które wymagają wielu manipulacji genomowych, korzystne jest zastosowanie związku, który można po prostu uzupełnić do pożywki do hodowli komórkowej, takiego jak dekstran FITC. FITC-dekstran ma również przewagę nad pomarańczą akrydynową (AO), innym barwnikiem wrażliwym na pH, który został użyty do śledzenia egzocytozy za pomocą mikroskopii żywych komórek53,54,55,56,57,58. Wykazano, że AO indukuje fotolizę pęcherzyków, która powoduje fałszywe błyski, które nie odpowiadają rzeczywistym procesom wydzielania27. W przeciwieństwie do tego, FITC-dekstran odzwierciedla lepsze zdarzenia wydzielania, prawdopodobnie ze względu na niską produkcję reaktywnego tlenu indukowaną przez światło27.
Warto zauważyć, że alternatywnym podejściem do badania egzocytozy jest śledzenie napływu barwnika z zewnętrznego podłoża do SG poprzez pory fuzyjne, które otwierają się podczas tego procesu. W takim przypadku barwnik jest dodawany do podłoża zewnętrznego wraz ze spustem wydzielniczym. Następnie, gdy por fuzyjny się otworzy, barwnik dyfunduje do klasy SG59,60. Niewątpliwą zaletą tej metody jest to, że oferuje ona również możliwość oszacowania wielkości porów fuzji, przy użyciu barwników o zmiennej wielkości. Na przykład dektrans o różnej masie cząsteczkowej (MW), sprzężony z różnymi fluoroforami, może być stosowany jako barwniki zewnątrzkomórkowe, przy czym maksymalny rozmiar dekstranu, który może przeniknąć do SG, odpowiadałby rozmiarowi porów fuzyjnych59,61,62,63,64. Ponadto takie podejście nie wymaga stosowania sondy wrażliwej na pH. Jednak istotną wadą jest to, że stosunek sygnału do szumu jest bardzo niski, ponieważ podczas akwizycji obrazów w mediach obecna jest duża ilość barwnika, co skutkuje wysokim tłem.
Ogólnie rzecz biorąc, użycie FITC-dekstranu jako markera egzocytozy przezwycięża kilka wad wcześniej opisanych metod, takich jak stosunek sygnału do szumu, toksyczność, dynamiczne śledzenie i złożoność.
Tutaj opisujemy użycie FITC-dekstranu do monitorowania egzocytozy złożonej w linii komórek tucznych RBL-2H3 (tutaj określanej jako RBL, pierwotnie ustalonej przez Ecclestona i wsp.65 i dalej klonowane przez Barsumian et al.66), w odpowiedzi na aktywację immunoglobuliny E (IgE)/antygenu (Ag).

<table><tbody><tr><td>DMEM o niskim poziomie glukozy</td><td>Indukcje biologiczne</td><td>01-050-1A</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu</td><td>Gibco</td><td>12657</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór pióra-paciorkowca-nystatyny</td><td>Indukcje biologiczne</td><td>03-032-1B</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina 200 mM roztwór&nbsp;</td><td>Indukcje biologiczne</td><td>03-020-1A</td><td></td></tr><tr><td>FITC dekstran 150K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46946-500MG-F</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna / EDTA roztwór B</td><td>Indukcje biologiczne</td><td>03-052-1A</td><td>Ciepłe w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem</td></tr><tr><td>Filtr górnego próżni 0,22 &mikro; m Wielkość porów&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430769-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Jednostka filtrująca strzykawkę z octanu celulozy, 0,22 i mikro; m wielkość porów</td><td>Sartorius</td><td>16534K</td><td></td></tr><tr><td>Komorowe szkło nakrywkowe&nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>155411</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia hodowlane traktowane kulturami tkankowymi</td><td>Corning Sigma-Aldrich</td><td>CLS430167</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>Anty-DNP monoklonalna IgE</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8406</td><td></td></tr><tr><td>DNP-HSA (Ag)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6661&nbsp;</td><td>Unikaj bezpośredniej ekspozycji na światło</td></tr><tr><td>Bufor Hepes 1M, pH 7,4</td><td>Indukcje biologiczne</td><td>03-025-1B</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>MERK</td><td>102382</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Laboratoria BDH</td><td>284515V</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek amonu</td><td>MERK</td><td>1145</td><td></td></tr><tr><td>RURY Sól dipotasowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>108321-27-3</td><td></td></tr><tr><td>Hydrat</td> <td>octanu wapniaSigma-Aldrich</td><td>114460-21-8</td><td></td></tr><tr><td>Tetrahydrat octanu magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5661</td><td></td></tr><tr><td>Glutaminian potasu (jednohydrat soli potasowej kwasu L-glutaminowego)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1501</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>MERK</td><td>6346</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>MERK</td><td>106404</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>MERK</td><td>105833</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>MERK</td><td>104936</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporator&nbsp;</td>Mikroskop konfokalny <td>BTX</td><td>ECM830</td><td></td></tr><tr><td>, Zeiss</td><td>Zeiss</td><td>LSM 5 Pascal, Axiovert 200M</td><td>używany na rysunku 3. Wyposażony w elektroniczny inkubator strumienia powietrza z regulacją temperatury </td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny, Zeiss</td><td>Zeiss</td><td>LSM 800, Axio Observer.Z1 /7</td><td>używany na rysunku 2. Wyposażony w detektor GaAsP, elektroniczny inkubator strumienia powietrza z kontrolowaną temperaturą </td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny, Leica</td><td></td><td>Leica SP5</td><td>Używany na rysunku 1. Wyposażone w detektor Leica HyD i inkubator najwyższego stopnia (okolab)</td></tr><tr>Komórki <td></td><td></td><td>RBL-2H3</td>, <td>komórki RBL-2H3 zostały sklonowane w laboratorium Reubena P. Siraganian. Patrz odnośnik 67</td></tr></tbody></table>

obrazowanie fitc-dekstranu jako reportera regulowanej egzocytozy

Imaging FITC-dextran as a Reporter for Regulated Exocytosis

Regulowana egzocytoza to proces, w którym ładunek, który jest przechowywany w granulkach wydzielniczych (SG), jest uwalniany w odpowiedzi na wyzwalacz wydzielniczy. Regulowana egzocytoza ma fundamentalne znaczenie dla komunikacji międzykomórkowej i jest kluczowym mechanizmem wydzielania neuroprzekaźników, hormonów, mediatorów stanu zapalnego i innych związków przez różne komórki. Znane są co najmniej trzy odrębne mechanizmy regulowanej egzocytozy: pełna egzocytoza, w której pojedynczy SG w pełni łączy się z błoną plazmatyczną, egzocytoza typu kiss-and-run, w której pojedynczy SG przejściowo łączy się z błoną plazmatyczną, oraz egzocytoza złożona, w której kilka SG łączy się ze sobą, przed lub po fuzji SG z błoną plazmatyczną. Rodzaj regulowanej egzocytozy podejmowanej przez komórkę jest często podyktowany rodzajem wyzwalacza wydzielniczego. Jednak w wielu komórkach pojedynczy wyzwalacz wydzielniczy może aktywować jednocześnie wiele trybów regulowanej egzocytozy. Pomimo ich obfitości i znaczenia w różnych typach i gatunkach komórek, mechanizmy determinujące różne sposoby wydzielania są w dużej mierze nierozwiązane. Jednym z głównych wyzwań w badaniu różnych trybów regulowanej egzocytozy jest trudność w ich rozróżnieniu, a także w ich oddzielnym badaniu. W tym miejscu opisujemy zastosowanie izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC)-dekstranu jako reportera egzocytozy i obrazowania żywych komórek w celu rozróżnienia różnych szlaków regulowanej egzocytozy, koncentrując się na egzocytozie złożonej, w oparciu o odporność i czas trwania zdarzeń egzocytarnych.

Rysunek 1a przedstawia schematycznie, w jaki sposób dekstran-FITC może służyć jako wskaźnik regulowanej egzocytozy i odzwierciedlać różne tryby zdarzeń egzocytotycznych. Najpierw komórki inkubuje się z dekstranem-FITC, który jest internalizowany drogą pinocytozy i kierowany do ziarnistości wydzielniczych (SG). Ponieważ SG komórek tułowiowych (MCs) są dużymi gęstymi ziarnistościami (LROs), ich niskie pH wygasza fluorescencję FITC, co przedstawiono tutaj jako c...

Tutaj szczegółowo opisujemy metodę obrazowania żywych komórek regulowanej egzocytozy. Metoda ta wykorzystuje dekstran FITC, który gromadzi się w organellach związanych z lizosomami, jako reporter. Ta prosta metoda pozwala również na rozróżnienie różnych trybów regulowanej egzocytozy w komórkach, które są trudne do manipulowania genetycznie.

Obrazowanie FITC-dekstranu jako reportera regulowanej egzocytozy

Regulated exocytosis is a process by which cargo, which is stored in secretory granules (SGs), is released in response to a secretory trigger. Regulated ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w badaniach nad regulowaną egzocytozą, umożliwiając naukowcom rozróżnienie różnych trybów egzocytozy w żywej komórce. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest prosta i wymaga minimalnych zakłóceń w komórkach. Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w egzocytozę komórek tucznych, można ją również zastosować do innych komórek wydzielniczych, takich jak neutrofile i eozynofile.Na początek przygotuj roztwór podstawowy 20x buforu Tyrode zgodnie z protokołem tekstowym. Następnie wymieszaj trzy miligramy proszku FITC-dekstranu z trzema mililitrami pożywki hodowlanej. Przefiltrować rozpuszczony dextan FITC-dekstanu za pomocą jednostki filtrującej strzykawkę z octanu celulozy.Następnie dodaj mysie IgE do stężenia jednego mikrograma na mililitr. Dzień przed obrazowaniem odessać pożywkę z naczynia hodowlanego i zastąpić ją dwoma mililitrami roztworu Trypsyna EDTA B. Następnie inkubuj naczynie przez pięć do 10 minut. Po odłączeniu komórek dodaj dwa mililitry pożywki hodowlanej do naczynia, aby zneutralizować trypsynę.Następnie użyj hemocytometru, aby policzyć komórki RBL. Dostosuj objętość zawiesiny za pomocą pożywki hodowlanej, aby osiągnąć stężenie 750 000 komórek na mililitr. Następnie dodaj 10 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do komorowego szkła nakrywkowego ze świeżą pożywką hodowlaną uzupełnioną FITC-dekstranem i hoduj komórki RBL przez noc.W pierwszej kolejności należy przygotować ostateczną wersję bufora Tyrode zgodnie z protokołem tekstowym. Następnie przygotuj 20x odczynnik sektorogiczny w świeżo przygotowanym buforze. Rozpuść chlorek amonu w proszku w buforze Tyrode'a, aby uzyskać 400-milimolowy roztwór chlorku amonu.Następnie odessać pożywkę z komory nakrywkowej i zastąpić ją 300 mikrolitrami wstępnie podgrzanego buforu Tyrode. Po dwukrotnym powtórzeniu procesu mycia uzupełnij komorę 300 mikrolitrami buforu Tyrode. Następnie umieść komorę nakrywkową w komorze inkubatora mikroskopu i upewnij się, że komora jest stabilna.Włącz fluorescencyjne źródło światła i wybierz odpowiedni filtr fluorescencyjny. Gdy obszar zainteresowania jest ostry, w środku pola view, wyłącz źródło światła. Następnie włącz laser o długości 488 nanometrów, którego emisja zbiera się na około 500 do 550 nanometrów.Następnie skalibruj odstęp czasu między akwizycjami obrazu. Ustaw kierunek skanowania na dwukierunkowy, nie zezwalaj na uśrednianie, otwórz otwór otworkowy i ustaw rozdzielczość na 512 na 512. Następnie zobrazuj komórki przez czas odpowiedni dla określonego typu komórki lub sekretagogi.Następnie dodaj 16 mikrolitrów z roztworu sekretagogicznego do komory i kontynuuj filmowanie. Na koniec, aby potwierdzić obecność i lokalizację dekstranu FITC w granulkach wydzielniczych, delikatnie dodaj do komory 16 mikrolitrów roztworu chlorku amonu. W tym protokole FITC-dekstran został wykorzystany jako reporter do obrazowania żywych komórek regulowanej egzocytozy.Obrazowanie uwalniania FITC-dekstranu pozwala na uchwycenie sekwencyjnego charakteru egzocytozy złożonej. Po dodaniu chlorku amonu do pożywki, FITC-dekstran staje się widoczny i jest kolokalizowany z neuropeptydem Y znakowanym mRFP, jako wydzielniczy ziarnisty reporter w komórkach RBL. Podczas próby tej procedury ważne jest, aby zminimalizować toksyczność dla komórek podczas filmowania poprzez zminimalizowanie ekspozycji komórek na działanie lasera.Można to osiągnąć dzięki zastosowaniu niskiej mocy lasera i krótkiego czasu akwizycji. Ponieważ złożone zdarzenia egzocytotyczne są dłużej żywe w porównaniu z innymi regulowanymi zdarzeniami egzocytarnymi, możemy kategorycznie uchwycić złożoną egzocytozę, ustawiając długi odstęp czasu między akwizycjami.

imaging-fitc-dextran-as-a-reporter-for-regulated-exocytosis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszym filmie demonstrujemy sposób znakowania i wizualizacji pojedynczej egzocytozy oraz transportu pęcherzyków synaptycznych w komórkach bipolarnych siatkówki złotych rybek przy użyciu mikroskopii TIRF (całkowitego wewnętrznego odbicia fluorescencji).

Obrazowanie egzocytozy w bipolarnych komórkach siatkówki z wykorzystaniem mikroskopii TIRF

Ten film demonstruje technikę wizualizacji egzocytozy w komórkach tucznych. Komórki są inkubowane z dekstranem FITC - fluorescencyjnym reporterem - który jest pobierany przez komórki wewnątrz granulek wydzielniczych (SG), gdzie kwaśne pH wygasza jego fluorescencję. Po stymulacji egzocytozy ziarnistości, wyższe pH pożywki indukuje fluorescencję reporterową wewnątrz stopionych SG, która jest wizualizowana za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Technika in vitro do wizualizacji egzocytozy granulek wydzielniczych w komórkach tucznych

Mikroskopia fluorescencyjna z pełnym wewnętrznym odbiciem (pTIRFM) oparta na polaryzacji umożliwia wykrywanie dynamiki błony komórkowej w czasie rzeczywistym. W artykule opisano implementację pTIRFM do badania przebudowy błony podczas regulowanej egzocytozy. Technikę tę można uogólnić na inne procesy w biologii komórki, które bezpośrednio lub pośrednio wiążą się ze zmianami kształtu błony.

Obrazowanie deformacji błony plazmatycznej za pomocą pTIRFM

Endocytoza za pośrednictwem klatryny, szybki i bardzo dynamiczny proces internalizuje wiele białek, w tym receptory sygnałowe. Opisany tutaj protokół bezpośrednio wizualizuje kinetykę poszczególnych zdarzeń endocytarnych. Ma to zasadnicze znaczenie dla zrozumienia, w jaki sposób rdzeniowi członkowie maszynerii endocytarnej koordynują się ze sobą i jak ładunek białka wpływa na ten proces.

Wizualizacja endocytozy receptorów sprzężonych z białkiem G za pośrednictwem klatryny w rozdzielczości pojedynczego zdarzenia za pomocą mikroskopii TIRF

Ten artykuł przedstawia metodę badania dynamiki pęcherzyków neuroprzekaźników w komórkach neuroblastoma, przy użyciu konstruktu synaptobrevin2-pHluorin i mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego wewnętrznego odbicia. Przedstawiono również opracowaną strategię przetwarzania obrazów i analizy danych.

Sondy GFP TIRFM i pH do oceny dynamiki pęcherzyków neuroprzekaźników w komórkach nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y: obrazowanie komórek i analiza danych

Opisujemy, jak dostarczać białka i nieprzepuszczalne dla komórek małe cząsteczki do hodowanych komórek ssaków za pomocą prostego protokołu koinkubacji z odczynnikiem, który powoduje nieszczelność organelli endocytarnych.

Dostarczanie białek, peptydów lub nieprzepuszczalnych dla komórek małych cząsteczek do żywych komórek przez inkubację z odczynnikiem endosomolitycznym dfTAT

Znakowanie domeny zewnątrzkomórkowej białka błonowego za pomocą wrażliwego na pH fluoroforu, superekliptycznej pHluoryny (SEP), pozwala na określenie subkomórkowej lokalizacji, ekspresji i transportu. Obrazowanie białek znakowanych SEP za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM) umożliwia ilościowe określenie poziomów białek w obwodowej ER i błonie plazmatycznej.

Wykorzystanie receptorów znakowanych pHluoryną do monitorowania lokalizacji subkomórkowej i transportu

Zautomatyzowane testy wykorzystujące wielodołkowe mikropłytki są korzystnym podejściem do identyfikacji regulatorów szlaku, umożliwiając ocenę wielu warunków w jednym eksperymencie. W tym przypadku dostosowaliśmy dobrze znany protokół obrazowania i kwantyfikacji makropinosomów do 96-dołkowego formatu mikropłytek i zapewniamy kompleksowy zarys automatyzacji przy użyciu wielomodowego czytnika płytek.

Zautomatyzowane obrazowanie i analiza w celu ilościowego oznaczania makropinosomów znakowanych fluorescencyjnie

W obecnym badaniu, dekstran znakowany fluoresceiną izotiocyjanianem (FITC) jest podawany myszom przez zgłębnik doustny w celu oceny przepuszczalności jelit zarówno in vivo, jak i w próbkach osocza i kału. Ponieważ funkcja bariery jelitowej jest zaburzona w wielu procesach chorobowych, ten bezpośredni i ilościowy test może być stosowany w różnych obszarach badawczych.

Ocena integralności bariery jelitowej u myszy przy użyciu dekstranu znakowanego izotiocyjanianem fluoresceiny

Zdolność do pomiaru kinetyki uwalniania pęcherzyków może pomóc zapewnić wgląd w niektóre z podstaw nerwowe. Tu używane obrazu w czasie rzeczywistym pęcherzyków oznaczone czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym FM 4-64 do pomiaru tempa uwalniania pęcherzyków presynaptycznych neuronów hipokampa w hodowli.

Pomiar egzocytozy w Neurony Korzystanie FM etykietowania

Poznaj metodę obrazowania FITC-dekstranu do rozróżniania trybów regulowanej egzocytozy w żywych komórkach. Technika ta umożliwia wizualizację zdarzeń egzocytotycznych w czasie rzeczywistym w komórkach tucznych i innych typach komórek sekretorycznych.

Obrazowanie FITC-dekstranu jako reportera regulowanej egzocytozy

Przeglądaj więcej filmów