Izolacja tętniczek siatkówki do badań fizjologii komórek ex vivo

Zrozumienie, w jaki sposób kontrolowany jest przepływ krwi w siatkówce, jest ważnym celem, ponieważ nieprawidłowy przepływ krwi jest związany z rozwojem różnych zagrażających wzrokowi chorób siatkówki, takich jak retinopatia cukrzycowa, jaskra i niedrożność żył gałęziowych. Tętniczki siatkówki odgrywają kluczową rolę w regulacji przepływu krwi w siatkówce poprzez rozszerzanie i zwężanie ich średnicy światła, w czym pośredniczą zmiany kurczliwości komórek mięśni gładkich otaczających te naczynia. Zrozumienie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw regulacji perfuzji siatkówki wymaga zatem przygotowań, w ramach których można uzyskać dostęp do komórek mięśni gładkich tętniczek siatkówki i badać je w warunkach jak najbardziej zbliżonych do fizjologicznych.

W tym filmie pokazujemy prosty protokół izolacji tętniczek z siatkówki szczura, który można zastosować w badaniach z klamrą łatkową, obrazowaniem wapnia i miografią ciśnieniową. W ciągu ostatnich kilku lat preparat ten był stosowany w celu uzyskania dalszych informacji na temat regulacji kurczliwości mięśni gładkich naczyń krwionośnych i przepływu krwi w siatkówce zarówno w zdrowiu, jak i chorobie. Uzupełnić jednolitrowy roztwór o niskiej zawartości wapnia zawierający Hanks'or LCH, jak pokazano w tabeli materiałów.

Zmontuj sprzęt do izolacji przed pobraniem tkanki. Szklana pipeta Pasteura musi być wypolerowana ogniowo, aby wygładzić, ale nie zwęzić końcówki. Przytnij plastikową pipetę do otworu około pięciu do siedmiu milimetrów.

Umieść oczy na naczyniu preparacyjnym, zanurzonym w roztworze LCH. Użyj jednego zestawu kleszczy, aby zakotwiczyć oko w misce, przytrzymując przyczepy mięśni oczodołu lub nerw wzrokowy. Upewnij się, że punkt kotwiczenia znajduje się jak najbliżej twardówki, aby ustabilizować oko.

Za pomocą ostrza przetnij rogówkę wzdłuż ora serrata i wyjmij soczewkę, delikatnie naciskając na twardówkę kleszczami. Mały, okrągły obszar, który widzimy z tyłu oka na tym obrazie, to nerw wzrokowy. Za pomocą ostrza przeciąć muszlę oczną na pół symetrycznie przez tarczę optyczną.

Za pomocą zamkniętych kleszczyków delikatnie wyszczotkuj siatkówki z dwóch połówek muszli ocznej, uważając, aby usunąć wszelkie pozostałe nasadki na tarczy nerwu wzrokowego. Powtórz proces z drugim okiem i przenieś wypreparowane siatkówki do probówki za pomocą plastikowej pipety i małej kropli podłoża LCH. Za pomocą plastikowej pipety napełnij probówkę LCH do około pięciu mililitrów i pozwól, aby siatkówki osiadły na dnie probówki.

Umyj chusteczkę około trzy razy, usuwając około czterech mililitrów roztworu z probówki i dodając świeży LCH za pomocą plastikowej pipety. W razie potrzeby należy usunąć obce tkanki. Umyj wnętrze szklanej pipety Pasteura z polerowaną końcówką z LCH, aby zapobiec przywieraniu chusteczki do pipety.

Za pomocą tej samej pipety usuń około czterech mililitrów roztworu z probówki i dodaj około dwóch mililitrów świeżego LCH. Delikatnie rozdziel siatkówki, powoli przeciągając tkankę przez końcówkę szklanej pipety i wyrzuć zawartość do probówki. Staraj się nie wprowadzać pęcherzyków na tym etapie i powtarzaj proces, aż siatkówki zostaną rozbite do rozmiaru około dwóch do trzech milimetrów kwadratowych.

Umyj wnętrze pipety około dwoma mililitrami LCH i wylej je do probówki. Pozwól, aby zawartość opadła na dno przez pięć do 10 minut. Powtórz proces rozcierania, jak opisano wcześniej, z nieco większą siłą, aż kawałki tkanki osiągną rozmiar około jednego milimetra kwadratowego.

Pozwól tkance się uspokoić i powtórz jeszcze raz z jeszcze większą siłą, aż zawartość zostanie całkowicie zhomogenizowana i nie pozostaną żadne kawałki siatkówki. Roztwór na tym etapie powinien mieć mleczny wygląd. Technika ta pozwoli uzyskać do ośmiu segmentów tętniczki na izolację, o długości od 200 do 2 500 mikrometrów.

Kaniulacja jednego końca tętniczki z okluzją przeciwległego końca pozwala na pomiar zwężenia naczyń krwionośnych wywołanego ciśnieniem, znanego również jako odpowiedź miogenna. Miografię ciśnienia tętniczego przeprowadza się w następujący sposób. Porcję homogenatu siatkówki przenosi się do fizjologicznej komory rejestracyjnej zamontowanej na stoliku mikroskopu odwróconego.

Pozostaw homogenat na dnie komory na co najmniej pięć minut. Skanuj wzrokowo w poprzek komory rejestracyjnej, aby zidentyfikować tętniczki o długości większej niż 200 mikrometrów i posiadające otwarty koniec, przez który można kaniulować naczynie. Zakotwicz jeden koniec naczynia za pomocą cienkich kleszczy i małego ślizgu z drutu wolframowego umieszczonego nad statkiem.

Używając zachodzących na siebie końców drutu wolframowego, manewruj naczyniem tak, aby przebiegało poziomo w poprzek wanny, tak aby otwarty koniec znajdował się w jednej linii z kaniulą ciśnieniową. Wypełnij komorę zerowym wapniem Hanks'a w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Kaniulacje wykonuje się za pomocą szklanych pipet.

Kaniulę umieszcza się na otwartym końcu naczynia za pomocą drobnego mikromanipulatora. Końcówka jest umieszczona bezpośrednio przy otworze, co ocenia się poprzez regulację płaszczyzny ostrości na mikroskopie, tak aby zarówno koniec naczynia, jak i końcówka kaniuli były ustawione w tym samym czasie, a kaniula ciśnieniowa przesuwała się do otworu naczynia. Pipeta pomocnicza jest wymagana do pomocy w procesie kaniulacji i służy do delikatnego przytrzymywania tętniczki i prowadzenia ściany tętniczki przez kaniulę ciśnieniową w tym samym czasie, gdy kaniula jest wprowadzana do światła naczynia.

Procedura ta wymaga jednoczesnego, kontrolowanego ruchu obu manipulatorów i rozległej praktyki, aby osiągnąć wysoki wskaźnik sukcesu. Po jednej minucie zapisu przy zerowej milimetrze słupa rtęci, ciśnienie śródświetlne wzrasta do 40 milimetrów słupa rtęci, a naczynie powinno się gwałtownie rozszerzyć, potwierdzając pomyślną kaniulację. Zwężenie naczyń krwionośnych wywołane ciśnieniem, czyli reakcja miogenna, rozwija się następnie przez około 15 minut.

Zapis patch clamp z komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych siatkówki umożliwia badanie prądów jonowych błony plazmatycznej, które regulują wewnątrzkomórkowy wapń, a tym samym kurczliwość komórkową. Rejestracja całokomórkowa i jednokanałowa jest możliwa z pojedynczych komórek mięśni gładkich nadal osadzonych w ich tętniczkach macierzystych w następujący sposób. Tętniczki siatkówki są izolowane i zakotwiczane w komorze nagraniowej za pomocą zsuwów z drutu wolframowego.

Blaszka podstawowa musi zostać strawiona, aby umożliwić utworzenie uszczelnienia o wysokiej wytrzymałości między pipetą plastrową a błoną komórkową mięśni gładkich tętniczek. Tętniczki są przerośnięte sekwencyjną serią roztworów enzymatycznych w temperaturze 37 stopni Celsjusza, co powoduje również elektryczne rozprzęganie sąsiednich komórek, jak wskazują strzałki na obrazie. Poziom trawienia jest wstępnie oceniany na podstawie wizualnego oddzielenia warstw śródbłonka i mięśni gładkich podczas etapu kolagenazy.

Usunięcie wszelkich pozostałych pasm blaszki podstawnej i/lub neuropile obwodowej uzyskuje się poprzez ostrożne przesuwanie zamkniętych końcówek cienkich kleszczyków wzdłuż powierzchni naczynia. W przypadku zaciskania plastrów końcówka pipety do plastrów jest umieszczana pionowo nad komórką zainteresowania i stopniowo opuszczana za pomocą delikatnego, powolnego ruchu mikromanipulatora, aby zetknąć się z błoną mięśni gładkich tętniczek. Ocenia się to na podstawie ruchu komórki i zmiany oporu pipety, mierzonego za pomocą protokołu testu szczelności komórek w oprogramowaniu do akwizycji.

Gdy pipeta jest opuszczana na celę, opór uszczelnienia wzrośnie około pięciokrotnie. Podciśnienie jest przejściowo przykładane do tylnej części pipety i stopniowo tworzy się gigaseal. Wymaga to wielokrotnego stosowania podciśnienia w ciągu jednej do pięciu minut.

Do zapisu całych komórek stosuje się głównie metodę perforowanego patch-clamp. Gigaseal jest formowany, jak opisano wcześniej, za pomocą pipety zawierającej roztwór podobny do roztworu wewnątrzkomórkowego i amfoterycynę B. Opór dostępu jest monitorowany za pomocą protokołu testu membranowego w oprogramowaniu do akwizycji. Gdy rezystancja dostępowa spadnie do mniej niż 15 megaomów, wykonywana jest kompensacja rezystancji szeregowej.

Zazwyczaj możliwe jest skompensowanie oporu szeregowego o około 75% w trybie perforowanej łaty. Kroki napięcia lub protokoły rampy mogą być następnie wykorzystane do pomiaru prądów w całym ogniwie. Po dysocjacji siatkówki można zidentyfikować tętniczki pierwotne, wtórne i przedkapilarne na podstawie ich kalibru i rozmieszczenia komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych.

Tętniczki pierwszego i drugiego rzędu wydają się wizualnie podobne pod mikroskopią jasnego pola, ale można je rozróżnić na podstawie ich wielkości. Tętniczki przedkapilarne są najmniejszymi naczyniami tętniczymi w preparacie i są łatwo rozpoznawalne dzięki przerywanemu układowi komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych. Izolowane tętniczki można wyraźnie odróżnić od naczyń włosowatych i żyłek w obrębie izolacji.

Naczynia włosowate są widoczne jako siatka naczyń małego kalibru o średnicy około czterech do 10 mikrometrów, podczas gdy żyłki są cienkościenne i nie mają pokrycia komórkami mięśni gładkich. Tętniczki pierwotne, wtórne i przedkapilarne nadają się do miografii ciśnieniowej, obrazowania wapnia i badań patch-clamp. Korzystając z tętniczek pod ciśnieniem, zbadaliśmy mechanizmy molekularne zaangażowane w generowanie odpowiedzi miogennej.

Mikrofotografie na tym zdjęciu pokazują tętniczkę siatkówki szczura w różnych punktach czasowych podczas eksperymentu z miografią ciśnieniową. Poniższy wykres przebiegu czasowego pokazuje zmiany średnicy naczynia podczas całego trwania eksperymentu. Natychmiast po zwiększeniu ciśnienia naczynie rozszerza się, po czym następuje aktywne zwężenie miogenne, które po 15 minutach osiąga poziom w stanie ustalonym.

Dodanie wortmanniny do roztworu Hanksa o zerowym stężeniu wapnia pod koniec eksperymentu rozszerza naczynie do jego średnicy biernej w celu normalizacji. Ten slajd przedstawia przykład jednokanałowego zapisu patch-clamp z komórki mięśni gładkich tętniczki siatkówki przed i po rozciąganiu błony. Ten plaster na komórkach zawiera dwa aktywowane rozciąganiem kanały TRPV2, których aktywność wzrasta wraz z przyłożeniem podciśnienia do pipety z plastrem.

Opisane tutaj protokoły wymagają praktyki, ale powinny być osiągalne przy minimalnym rozwiązywaniu problemów. Zalecamy użycie izolowanych tętniczek w tym samym dniu, w którym odbywa się izolacja. Metoda jest zoptymalizowana pod kątem tętniczek siatkówki szczura, ale może być stosowana na siatkówkach myszy.

Obecnie szeroko stosujemy ten preparat, ale tam, gdzie to możliwe, staramy się również zweryfikować nasze kluczowe wyniki za pomocą całych wierzchowców siatkówki ex vivo oraz pomiarów in vivo średnicy naczyń krwionośnych i przepływu krwi.