Name: Izolacja tętniczek siatkówki do badań fizjologii komórek ex vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: Poznaj metodę izolacji tętniczek siatkówki szczura do badań elektrofizjologicznych i myografii ciśnieniowej. Protokół umożliwia analizę kurczliwości mięśni gładkich naczyń i regulacji przepływu krwi w siatkówce.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Rozwój protokołów opisanych w tym artykule był wspierany przez granty z następujących agencji finansujących: BBSRC (BB/I026359/1), Fight for Sight (1429 i 1822), The Juvenile Diabetes Research Foundation (2-2003-525), Wellcome Trust (074648/Z/04), British Heart Foundation (PG/11/94/29169), HSC R&D Division (STL/4748/13) i MRC (MC_PC_15026).

<ol><li>Kohner, E. M., Patel, V., Rassam, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+blood+flow+and+impaired+autoregulation+in+the+pathogenesis+of+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Role of blood flow and impaired autoregulation in the pathogenesis of diabetic retinopathy.</a> Diabetes. 44, 603-607 (1995).</li>
<li>Hafez, A. S., Bizzarro, R. L., Lesk, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+optic+nerve+head+and+peripapillary+retinal+blood+flow+in+glaucoma+patients%2C+ocular+hypertensives%2C+and+normal+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of optic nerve head and peripapillary retinal blood flow in glaucoma patients, ocular hypertensives, and normal subjects.</a> American Journal of Ophthalmology. 136, 1022-1031 (2003).</li>
<li>Curtis, T. M., Gardiner, T. A., Stitt, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+lesions+of+diabetic+retinopathy%3A+clues+towards+understanding+pathogenesis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Eye+%28London%29%22%5BJournal%5D)">Microvascular lesions of diabetic retinopathy: clues towards understanding pathogenesis?</a> Eye (London). 23, 1496-1508 (2009).</li>
<li>Pournaras, C. J., Rungger-Brändle, E., Riva, C. E., Hardarson, S. H., Stefansson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+retinal+blood+flow+in+health+and+disease%29%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of retinal blood flow in health and disease).</a> Progress in Retinal and Eye Research. 27, 284-330 (2008).</li>
<li>Kuwabara, T., Cogan, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+retinal+vascular+patterns.+I.+Normal+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Studies of retinal vascular patterns. I. Normal architecture.</a> Archives of Ophthalmology. 64, 904-911 (1960).</li>
<li>Scholfield, C. N., McGeown, J. G., Curtis, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+physiology+of+retinal+and+choroidal+arteriolar+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Cellular physiology of retinal and choroidal arteriolar smooth muscle cells.</a> Microcirculation. 14 (1), 11-24 (2007).</li>
<li>Puro, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinovascular+physiology+and+pathophysiology%3A+new+experimental+approach%2Fnew+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31 (3), 258-270 (2012).</li>
<li>Kur, J., Newman, E. A., Chan-Ling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+physiological+mechanisms+underlying+blood+flow+regulation+in+the+retina+and+choroid+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Cellular and physiological mechanisms underlying blood flow regulation in the retina and choroid in health and disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31 (5), 377-406 (2012).</li>
<li>Delaey, C., Van de Voorde, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+Mechanisms+in+the+Retinal+and+Choroidal+Circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Research%22%5BJournal%5D)">Regulatory Mechanisms in the Retinal and Choroidal Circulation.</a> Ophthalmic Research. 32 (6), 249-256 (2000).</li>
<li>Metea, M. R., Newman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+cells+dilate+and+constrict+blood+vessels%3A+a+mechanism+of+neurovascular+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Glial cells dilate and constrict blood vessels: a mechanism of neurovascular coupling.</a> Journal of Neuroscience. 26, 2862-2870 (2006).</li>
<li>Pournaras, C. J., Rungger-Brändle, E., Riva, C. E., Hardarson, S. H., Stefansson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+retinal+blood+flow+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of retinal blood flow in health and disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 27 (3), 284-330 (2008).</li>
<li>Hughes, S., Chan-Ling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+smooth+muscle+cell+and+pericyte+differentiation+in+the+rat+retina+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Characterization of smooth muscle cell and pericyte differentiation in the rat retina in vivo.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (8), 2795-2806 (2004).</li>
<li>Shepro, D., Morel, N. M. <a target="_blank" href="https://www.fasebj.org/doi/abs/10.1096/fasebj.7.11.8370472">Pericyte physiology.</a> The FASEB Journal. 7 (11), 1031-1038 (1993).</li>
<li>Kornfield, T. E., Newman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Blood+Flow+in+the+Retinal+Trilaminar+Vascular+Network%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Regulation of Blood Flow in the Retinal Trilaminar Vascular Network.</a> Journal of Neuroscience. 34 (34), 11504-11513 (2014).</li>
<li>Matsushita, K., Puro, D. G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1779733/">Topographical heterogeneity of KIR currents in pericyte-containing microvessels of the rat retina: effect of diabetes.</a> Journal of Physiology. 573, 483-495 (2006).</li>
<li>Needham, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+K%2B+and+Cl-+channels+in+the+regulation+of+retinal+arteriolar+tone+and+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">The role of K+ and Cl- channels in the regulation of retinal arteriolar tone and blood flow.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (4), 2157-2165 (2014).</li>
<li>Hessellund, A., Jeppesen, P., Aalkjaer, C., Bek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+vasomotion+in+porcine+retinal+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmologicaogica+Scandinavica%22%5BJournal%5D)">Characterization of vasomotion in porcine retinal arterioles.</a> Acta Ophthalmologicaogica Scandinavica. 81, 278-282 (2003).</li>
<li>Delaey, C., Van de Voord, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pressure-induced+myogenic+responses+in+isolated+bovine+retinal+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Pressure-induced myogenic responses in isolated bovine retinal arteries.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41, 1871-1875 (2000).</li>
<li>Kur, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+ion+channels+and+subcellular+Ca2%2B+signaling+in+arachidonic+acid-induced+dilation+of+pressurized+retinal+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Role of ion channels and subcellular Ca2+ signaling in arachidonic acid-induced dilation of pressurized retinal arterioles.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (5), 2893-2902 (2014).</li>
<li>Kur, J., Bankhead, P., Scholfield, C. N., Curtis, T. M., McGeown, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca%282%2B%29+sparks+promote+myogenic+tone+in+retinal+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Ca(2+) sparks promote myogenic tone in retinal arterioles.</a> British Journal of Pharmacology. 168 (7), 1675-1686 (2013).</li>
<li>Fernández, J. A., McGahon, M. K., McGeown, J. G., Curtis, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CaV3.1+T-Type+Ca2%2B+Channels+Contribute+to+Myogenic+Signaling+in+Rat+Retinal+Arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">CaV3.1 T-Type Ca2+ Channels Contribute to Myogenic Signaling in Rat Retinal Arterioles.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (9), 5125-5132 (2015).</li>
<li>McGahon, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV2+Channels+Contribute+to+Stretch-Activated+Cation+Currents+and+Myogenic+Constriction+in+Retinal+Arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">TRPV2 Channels Contribute to Stretch-Activated Cation Currents and Myogenic Constriction in Retinal Arterioles.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (13), 5637-5647 (2016).</li>
<li>Guidoboni, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraocular+Pressure%2C+Blood+Pressure%2C+and+Retinal+Blood+Flow+Autoregulation%3A+A+Mathematical+Model+to+Clarify+Their+Relationship+and+Clinical+Relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Intraocular Pressure, Blood Pressure, and Retinal Blood Flow Autoregulation: A Mathematical Model to Clarify Their Relationship and Clinical Relevance.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (7), 4105-4118 (2014).</li>
<li>Scholfield, C. N., Curtis, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+cytosolic+calcium+regulation+among+different+microvascular+smooth+muscle+cells+of+the+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in cytosolic calcium regulation among different microvascular smooth muscle cells of the rat retina.</a> Microvascular Research. 59 (2), 233-242 (2000).</li>
<li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+Ca2%2B+indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> Journal of Biological Chemistry. 260, 3440-3450 (1985).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSakmann%2C+B+%22Single+Channel+Recording%2C+Second+Edition%22">Single Channel Recording, Second Edition</a>. , Plenum Press. New York. 53-90 (1995).</li>
<li>Fernández, J. A., Bankhead, P., Zhou, H., McGeown, J. G., Curtis, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+detection+and+measurement+of+isolated+retinal+arterioles+by+a+combination+of+edge+enhancement+and+cost+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Automated detection and measurement of isolated retinal arterioles by a combination of edge enhancement and cost analysis.</a> PLoS One. 9, e91791(2014).</li>
<li>McGahon, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+downregulates+large-conductance+Ca2%2B-activated+potassium+beta+1+channel+subunit+in+retinal+arteriolar+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Diabetes downregulates large-conductance Ca2+-activated potassium beta 1 channel subunit in retinal arteriolar smooth muscle.</a> Circulation Research. 100 (5), 703-711 (2007).</li>
<li>Curtis, T. M., Scholfield, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nifedipine+blocks+Ca2%2B+store+refilling+through+a+pathway+not+involving+L-type+Ca2%2B+channels+in+rabbit+arteriolar+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Nifedipine blocks Ca2+ store refilling through a pathway not involving L-type Ca2+ channels in rabbit arteriolar smooth muscle.</a> Journal of Physiology. 532 (3), 609-623 (2001).</li>
<li>Tumelty, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelin+1+stimulates+Ca2%2B-sparks+and+oscillations+in+retinal+arteriolar+myocytes+via+IP3R+and+RyR-dependent+Ca2%2B+release%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Endothelin 1 stimulates Ca2+-sparks and oscillations in retinal arteriolar myocytes via IP3R and RyR-dependent Ca2+ release.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (6), 3874-3879 (2011).</li>
<li>Huynh, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insight+into+the+assembly+of+TRPV+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Structural insight into the assembly of TRPV channels.</a> Structure. 22 (2), 260-268 (2014).</li>
<li>McGahon, M. K., Dawicki, J. M., Scholfield, C. N., McGeown, J. G., Curtis, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A-type+potassium+current+in+retinal+arteriolar+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">A-type potassium current in retinal arteriolar smooth muscle cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (9), 3281-3287 (2005).</li>
<li>McGahon, M. K., Zhang, X., Scholfield, C. N., Curtis, T. M., McGeown, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+downregulation+of+the+BKbeta1+subunit+in+diabetic+arteriolar+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Channels+%28Austin%29%22%5BJournal%5D)">Selective downregulation of the BKbeta1 subunit in diabetic arteriolar myocytes.</a> Channels (Austin). 1 (3), 141-143 (2007).</li>
<li>Ljubimov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basement+membrane+abnormalities+in+human+eyes+with+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Basement membrane abnormalities in human eyes with diabetic retinopathy.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44, 1469-1479 (1996).</li>
<li>Roy, S., Maiello, M., Lorenzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+expression+of+basement+membrane+collagen+in+human+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Increased expression of basement membrane collagen in human diabetic retinopathy.</a> Journal of Clinical Investigation. 93, 438-442 (1994).</li>
<li>Scholfield, C. N., McGeown, J. G., Curtis, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+physiology+of+retinal+and+choroidal+arteriolar+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Cellular physiology of retinal and choroidal arteriolar smooth muscle cells.</a> Microcirculation. 14 (1), 11-24 (2007).</li>
<li>Hinds, K., Monaghan, K. P., Frølund, B., McGeown, J. G., Curtis, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+control+of+arteriolar+diameter+in+the+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">GABAergic control of arteriolar diameter in the rat retina.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (10), 6798-6805 (2013).</li>
<li>Torring, M. S., Aalkjaer, C., Bek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constriction+of+porcine+retinal+arterioles+induced+by+endothelin-1+and+the+thromboxane+analogue+U46619+in+vitro+decreases+with+increasing+vascular+branching+level%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmologica%22%5BJournal%5D)">Constriction of porcine retinal arterioles induced by endothelin-1 and the thromboxane analogue U46619 in vitro decreases with increasing vascular branching level.</a> Acta Ophthalmologica. 92 (3), 232-237 (2014).</li>
<li>P, S. kov J. ensen, S, M. etz M. ariendal P. edersen, Aalkjaer, C., Bek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vasodilating+effects+of+insulin+and+lactate+are+increased+in+precapillary+arterioles+in+the+porcine+retina+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmologica%22%5BJournal%5D)">The vasodilating effects of insulin and lactate are increased in precapillary arterioles in the porcine retina ex vivo.</a> Acta Ophthalmologica. 94 (5), 454-462 (2016).</li>
</ol>

Dr Joanna Kur jest obecnie pracownikiem firmy Medtronic (Twin-Cities, Minnesota, USA), jej obecna praca nie koliduje z tą prezentowaną tutaj.

Opisane powyżej protokoły wymagają praktyki, ale powinny być osiągalne przy minimalnym rozwiązywaniu problemów. W ciągu przeciętnego dnia uzyskalibyśmy 6 - 8 użytecznych tętniczek z izolacji i osiągnęlibyśmy 3 - 4 udane eksperymenty. Jeśli jednak wystąpią problemy, istnieją pewne kroki, które można podjąć, aby poprawić wskaźniki sukcesu. Czasami stwierdzaliśmy, szczególnie w przypadku młodszych szczurów (< 8 tygodni), że wydajność tętniczek może być niska. Aby obejść ten problem, sugerujemy odwirowanie tkanki siatkówki (10 - 30 s przy 500 x g) między każdym z etapów rozcierania w krokach 1.12 - 1.14. Często pomaga to poprawić wydajność naczyń krwionośnych, ale także zwiększa ilość resztek komórkowych w preparacie.
Podczas kaniulacji naczyń do badań miografii ciśnieniowej ważne jest, aby dokładnie sprawdzić tętniczki pod kątem bocznych gałęzi, które mogły zostać rozszczepione w pobliżu miejsca rozwidlenia. Stanowi to częstą przyczynę wycieku i utraty ciśnienia podczas eksperymentowania. Głównym problemem, który może pojawić się w przypadku protokołów [Ca2+]i , jest poziom obciążenia barwnikiem. Słabe obciążenie barwnikiem prowadzi do niskiego stosunku sygnału do szumu, podczas gdy przeciążenie powoduje zakłócenie normalnej homeostazyCa2+ . Aby zmniejszyć prawdopodobieństwo wystąpienia któregokolwiek z tych problemów, można usunąć niewielką porcję homogenatu siatkówki, a izolowane naczynia być okresowo sprawdzane podczas protokołu załadunku. Podczas przeprowadzania eksperymentów z zaciskami krosowymi, wskaźnik powodzenia tworzenia gigaseal zależy w dużym stopniu od tego, jak dobrze blaszka podstawna została strawiona. Podczas początkowego testowania tego protokołu lub stosowania nowych partii enzymów może być konieczne dostosowanie stężenia/czasu trawienia enzymów. Uważne monitorowanie separacji warstw śródbłonka i mięśni gładkich zapewni wystarczające trawienie, aby usunąć wystarczającą ilość blaszki podstawnej, aby uzyskać dostęp. Konieczne jest również dokładne monitorowanie, aby uniknąć nadmiernego trawienia, które może objawiać się, gdy naczynie zaczyna się zwężać. Jeśli tak się stanie, komórki mięśni gładkich są często zbyt delikatne, aby można je było zarejestrować za pomocą zacisku krosowego. Podczas stosowania enzymów ważne jest, aby uwzględnić DNAzę I, aby zapewnić usunięcie nici DNA uwolnionych z uszkodzonych komórek podczas procesu izolacji. Fragmenty DNA są lepkie i powodują, że kleszcze przylegają do tętniczki podczas końcowych etapów procesu czyszczenia (krok 4.4), co często prowadzi do utraty naczynia. Czyszczenie naczyń jest trudne technicznie i najlepiej wykonywać je przy dużym powiększeniu (20X) delikatnymi ruchami zamiatania zamkniętych kleszczy o najdrobniejszej możliwej średnicy końcówki. Pomiędzy zamiataniem wyczyść kleszcze rolką laboratoryjną.
Jak podkreślono wcześniej, kluczową motywacją stojącą za opracowaniem protokołów opisanych w tym manuskrypcie było lepsze zrozumienie, dlaczego przepływ krwi jest zakłócony podczas chorób naczyniowych siatkówki. Większość naszej dotychczasowej pracy koncentrowała się na cukrzycowej chorobie oczu28,33. Tętniczki można wyizolować z siatkówek eksperymentalnych modeli cukrzycy u gryzoni przy użyciu metod opisanych w punkcie 1. Podczas eksperymentów na izolowanych tętniczkach siatkówki od zwierząt z cukrzycą ważne jest, aby starać się dokładnie odtworzyć stany hiperglikemii doświadczane przez naczynia in vivo. Z tego powodu normalnie podnieślibyśmy poziom D-glukozy w naszych roztworach izolacyjnych i eksperymentalnych do 25 mM. Pogrubienie błon podstawnych naczyń krwionośnych jest dobrze rozpoznanym zjawiskiem w naczyniach siatkówki podczas cukrzycy34,35. W przypadku wykorzystywania zwierząt z przedłużoną cukrzycą (> 1 miesiąc trwania choroby) często konieczne jest zwiększenie stężenia enzymów lub czasu trawienia, aby umożliwić zastosowanie metod rejestracji typu patch-clamp.
Istotnym ograniczeniem stosowania izolowanych ex vivo tętniczek siatkówki do badania fizjologii i patofizjologii naczyń siatkówki jest utrata otaczającego neuropile siatkówki. Chociaż usunięcie komórek glejowych i neuronalnych siatkówki umożliwia łatwy dostęp do komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych siatkówki w celu badań fizjologii komórki, odpowiedź naczyń na mediatory wazoaktywne może się dramatycznie zmienić przy braku i obecności tkanki siatkówki. Dobrym przykładem jest działanie adenozynotrójfosforanu (ATP), które jest tego dobrą ilustracją. W izolowanych tętniczkach siatkówki szczura dodanie ATP powoduje silne zwężenie naczyń36, podczas gdy w obecności nienaruszonego neuropile naczynia rozszerzają się37. Dlatego, gdy tylko jest to możliwe, zwykle staramy się potwierdzić kluczowe wyniki naszych izolowanych preparatów tętniczych za pomocą całych wierzchowców siatkówki ex vivo oraz pomiarów in vivo średnicy naczynia i przepływu krwi16,37. Warto zauważyć, że ostatnio pojawiły się nowe metody badania małych tętniczek i naczyń włosowatych w całych perfundowanych siatkówkach świń ex vivo38,39. Takie preparaty prawdopodobnie znacznie poprawią naszą wiedzę na temat tego, w jaki sposób neuropile siatkówki reguluje napięcie tętniczek i naczyń włosowatych siatkówki oraz jak zmiany w hemodynamice siatkówki modulują aktywność neuronów w siatkówce.
Chociaż procedury opisane w tym artykule koncentrują się na wykorzystaniu izolowanych tętniczek siatkówki szczura w celu zrozumienia fizjologii komórek mięśni gładkich tętniczek, obecnie opracowujemy protokoły, które umożliwią również badanie funkcji komórek śródbłonka w tych naczyniach. W pracach wstępnych udało nam się zmodyfikować trawienie enzymatyczne segmentów tętniczek siatkówki w celu uzyskania żywotnych rurek komórkowych śródbłonka, które są podatne na obrazowanie Ca2 + i badania zapisu patchclamp. Kaniulacja izolowanych tętniczek na obu końcach, umożliwiająca doświetlne dostarczanie leków, może w przyszłości umożliwić również zbadanie zależnych od śródbłonka odpowiedzi rozszerzających naczynia krwionośne w tych naczyniach.

Zrozumienie, w jaki sposób kontrolowany jest przepływ krwi w siatkówce, jest ważnym celem, ponieważ nieprawidłowy przepływ krwi jest związany z patogenezą różnych zagrażających wzrokowi chorób siatkówki1,2,3,4. Krążenie siatkówkowe, które zaopatruje wewnętrzne neurony siatkówki i komórki glejowe, ma układ tętnicy końcowej, w którym cała krew z tętnic siatkówkowych i tętniczek przechodzi przez naczynia włosowate do żyłek siatkówki i wreszcie żył5. Przepływ krwi w siatkówce jest regulowany przez napięcie tętnic i tętniczek siatkówki, a także aktywność skurczową perycytów znajdujących się na ścianach naczyń włosowatych siatkówki i żyłek zawłosionych 6,7,8. Kontrola napięcia naczyniowego siatkówki jest złożona i modulowana przez szereg danych wejściowych z układu krążenia i otaczającej tkanki siatkówki, w tym gazometry, krążące cząsteczki i hormony oraz substancje wazoaktywne uwalniane ze śródbłonka naczyniowego siatkówki i makrogleju9,10,11. Tętniczki siatkówki to małe gałęzie tętnicze siatkówki i składają się z pojedynczej warstwy komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych i wewnętrznej wyściółki z podłużnie ułożonych komórek śródbłonka12,13,14. Naczynia te stanowią główne miejsce oporu naczyniowego w krążeniu siatkówkowym i dlatego odgrywają ważną rolę w lokalnej kontroli przepływu krwi w siatkówce. Tętniczki siatkówki regulują przepływ krwi włośniczkowej w siatkówce poprzez rozszerzenie lub zwężenie ich średnicy światła, w czym pośredniczą zmiany kurczliwości mięśni gładkich naczyń krwionośnych10,15,16. Zrozumienie mechanizmów molekularnych, za pomocą których tętniczki siatkówki regulują perfuzję siatkówki, wymaga zatem przygotowań, w ramach których można uzyskać dostęp do komórek mięśni gładkich tętniczek i badać je w warunkach jak najbardziej zbliżonych do fizjologicznych.
Preparaty ex vivo izolowanych naczyń krwionośnych siatkówki zapewniają dostęp do komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych, zachowując jednocześnie ich funkcjonalność i połączenie z leżącym poniżej śródbłonkiem. Większość dotychczasowych badań z wykorzystaniem izolowanych naczyń koncentrowała się na dużych naczyniach tętniczych bydła lub świń (60 - 150 μm). Można je zamontować w dostępnych na rynku systemach miografów przewodowych lub ciśnieniowych, aby umożliwić farmakologiczne badanie mechanizmów kurczliwości komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych17,18. Takie preparaty w znacznym stopniu przyczyniły się do poszerzenia naszej wiedzy na temat fizjologii naczyń siatkówki w normalnych warunkach. W niewielu badaniach wykorzystano tętniczki siatkówki wyizolowane od małych zwierząt laboratoryjnych, ponieważ ich mniejsza średnica (~ 8 - 45 μm) uniemożliwia ich stosowanie w konwencjonalnych systemach miografii19,20,21,22. Istotną zaletą stosowania naczyń krwionośnych pochodzących od małych zwierząt laboratoryjnych jest jednak szeroka dostępność modeli chorób modyfikowanych genetycznie, transgenicznych i siatkówkowych. Małe zwierzęta laboratoryjne są również bardziej podatne na badania interwencyjne in vivo.
Tutaj opisujemy proste protokoły izolacji i kaniulacji tętniczek siatkówki szczura do eksperymentów z miografią ciśnieniową. Szczegółowo opisano również protokoły obrazowania i elektrofizjologii Ca2+ z wykorzystaniem tych naczyń. Mogą one dostarczyć dalszych informacji na temat regulacji kurczliwości mięśni gładkich naczyń krwionośnych i przepływu krwi w siatkówce.

<table><tbody><tr><td>Zlewki</td><td>Fisherbrand</td><td>15409083</td><td>Lub dowolny produkt równoważny</td></tr><tr><td>Nożyczki zakrzywione</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-109-3542</td><td>Lub dowolny produkt równoważny</td></tr><tr><td>Jednorazowa plastikowa pipeta / transfer</td><td>Sarstedt</td><td>86.1174</td><td>6 ml jest najlepsza, ale dopuszczalne są inne rozmiary; Usuń końcówkę, aby poszerzyć otwór</td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Brunel Microscopes LTD</td><td></td><td>Lub dowolny produkt equilavent</td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>World Precision Instruments</td><td>Dumont #5 14095</td><td>Dowolne równoważne drobne kleszcze</td></tr><tr><td>Pipeta</td><td>Pasteur Fisherbrand</td><td>11546963</td><td>Polerowane ogniowo w celu zmniejszenia tarcia, ale nie na tyle, aby zwęzić końcówkę</td></tr><tr><td>szalka Petriego Sigma-Aldrich</td><td>P7741</td><td>Lub dowolny produkt equilavent 10 cm</td><td></td></tr><tr><td>Smoczek do pipet</td><td>Fisherbrand</td><td>12426180</td><td>Lub dowolny produkt equilavent</td></tr><tr><td>Zaopatrzenie w wodę oczyszczoną</td><td>Merek</td><td>Milli-Q Zintegrowany system oczyszczania wody</td><td>Lub dowolny system equilavent</td></tr><tr><td>Probówka z okrągłym dnem</td><td>Fisherbrand</td><td>14-958-10 B</td><td>5 mL; dowolny produkt equilavent</td></tr><tr><td>Kleszcze odsetkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-467-230</td><td>Lub dowolny produkt równoważny</td></tr><tr><td>Ostrza jednokrawędziowe</td><td>Agar Scientific</td><td>T585</td><td>Lub dowolny produkt ekwiwalentny</td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>Dow Corning</td><td>184</td><td>Lub dowolna giętka powierzchnia&nbsp;</td></tr><tr><td>Stojak na probówki</td><td>Fisherbrand Derlin</td><td>10257963</td><td>Lub dowolny równoważny produkt</td></tr><tr><td>Miografia</td><td></td><td></td><td></td>ciśnieniowa</tr><tr><td>3-osiowy manipulator mechaniczny</td><td>Scientifica</td><td>LBM-7&nbsp;</td><td>x2 (lub dowolny produkt równoważny)</td></tr><tr><td>Krany 3-drogowe</td><td>Cole-Parmer</td><td>UY-30600-02</td><td>Lub dowolny produkt równoważny</td></tr><tr><td>Stół powietrzny</td><td>Technical Manufacturing Corporation&nbsp;</td><td>Clean Bench</td><td>Lub dowolne równoważne</td></tr><tr><td>oprogramowanie do analizy produktów&nbsp;</td><td>Obraz J</td><td>https://downloads.imagej.net/fiji/</td> <td>Darmowe oprogramowanie do obrazowania</td></tr><tr><td>Wtyczka analityczna</td><td>Myotraker&nbsp;</td><td>https://doi.org/10.1371/journal.pone.0091791.s002</td><td>Niestandardowa wtyczka do imageJ Dostępna bezpłatnie do pobrania</td></tr><tr><td>Szkło do pipet kaniulacyjnych</td><td>Instrumenty World Percision</td><td>TW150F-4</td><td>Lub dowolny produkt równoważny</td></tr><tr><td>Komputer</td><td></td><td>Dell Optiplex 7010</td><td>Lub dowolny równoważny produkt</td></tr><tr><td>Termometr cyfrowy</td><td>RS</td><td>206-3722</td><td>Lub dowolny produkt równoważny</td></tr><tr><td>Fluo-4-AM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F14201</td><td>Zrób 1 mM zapasu w</td></tr><tr><td>kleszczach</td> DMSO <td>World Precision Instruments</td><td>Dumont #7 14097</td><td>Dowolne równoważne drobne kleszcze</td></tr><tr><td>Fura-2-AM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F1221</td><td>Zrób 1 mM zapas w</td></tr><tr><td>DMSO Komora nagraniowa ze szklanym dnem</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0759</td><td>Lub dowolny równoważny produkt</td></tr><tr><td>Szkło</td> <td>do pipet HelperInstrumenty World Percision</td><td>IB150F-3</td><td>Lub dowolny produkt równoważny</td></tr><tr><td>Grzałka liniowa</td><td>Wykonany</td><td></td> na zamówienie <td>ekwiwalent komercyjny SH-27B Rozwiązanie Grzałka liniowa z aparatu Harvarda</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Nikon</td><td>Eclypse TE 300</td><td>Lub dowolny równoważny produkt</td></tr><tr><td>Manometr</td><td>Riester</td><td>LF1459</td><td>Lub dowolny produkt równoważny</td></tr><tr><td>Ściągacz</td> <td>do mikroelektrodInstrumenty Sutter</td><td>P97</td><td>Lub dowolny równoważny produkt</td></tr><tr><td>Microforge +&nbsp; Mikroskop Olympus CX 31</td><td>Glassworks</td><td>Fine Point F-550</td><td>Lub dowolny produkt równoważny</td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Instrumenty Sutter</td><td>MP-285</td><td>Lub dowolny produkt równoważny</td></tr><tr><td>Wielokanałowy rozdzielacz&nbsp;</td><td>Zautomatyzuj</td><td>naukowy ołówek perfuzyjny</td><td>lub dowolny równoważny produkt</td></tr><tr><td>Napełniacz do pipet&nbsp;</td>Strzykawka <td>BD Plastipak</td><td>1 ml</td><td>podgrzewana i ciągnięta do wewnętrznej średnicy pipety</td></tr><tr><td>Uchwyt na pipety</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>1-HL-U</td><td>Lub dowolny produkt równoważny</td></tr><tr><td>Pompa ssąca</td><td>Interpet</td><td>AP1</td><td>Przerobiona pompa napowietrzająca przez odwrócenie mieszka</td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>BD Plastipak</td><td>20mL Luer-lok</td><td>Lub dowolny produkt równoważny</td></tr><tr><td>Drut wolframowy</td><td>Adwent</td><td>W558818</td><td>75&mu; m średnica</td></tr><tr><td>Tygon Rurki</td><td>VWR</td><td>różne rozmiary</td><td>Lub dowolny równoważny produkt</td></tr><tr><td>Kamera USB</td><td>&nbsp; Logitech&nbsp;</td><td>HD Pro Webcam C920</td><td>Lub dowolny równoważny produkt</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do przechwytywania wideo</td><td>Hypercam</td><td>w wersji 2.28.01</td><td>Lub dowolny produkt równoważny</td></tr><tr><td>Kąpiel wodna</td><td>Grant</td><td>Sub Aqua 12 Plus</td><td>Lub dowolny produkt równoważny</td></tr><tr><td>x20 obiektyw</td><td>Nikon</td><td>20x/0.40 WD 3.8, &infin;/0.17</td><td>Lub dowolny produkt równoważny</td></tr><tr><td>x4 obiektyw</td><td>Nikon</td><td>4x/0.10, WD 30, &infin;/-</td><td>Lub dowolny produkt equilavent</td></tr><tr><td>Łączniki Y</td><td>World Percision Instruments</td><td>14012</td><td>Lub dowolny produkt equilavent</td></tr><tr><td>Gwintowniki 3-drogowe</td> z mocowaniem <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>krosowym</td></tr> Cole-Parmer UY-30600-02 Lub dowolny produkt równoważny <tr><td>3-osiowy manipulator mechaniczny</td><td>Scientifica</td><td>LBM-7&nbsp;</td><td>Lub dowolny równoważny produkt</td></tr><tr><td>Stół powietrzny</td><td>Korporacja Techniczno-Produkcyjna&nbsp;</td><td>Czysta ławka</td><td>Lub dowolny równoważny produkt</td></tr><tr><td>Amfoterycyna B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2411</td><td>3 mg rozpuszczona dziennie w 50 &mu; L z DMSO (sonicate to dissolve)</td></tr><tr><td>Wzmacniacz</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>Axopatch 200a</td><td>Lub dowolny produkt równoważny</td></tr><tr><td>Przetwornik analogowo-cyfrowy</td><td>Axon</td><td>Digidata 1440A</td><td>Lub dowolny produkt równoważny</td></tr><tr><td>Kolagenaza Typ 1A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9891&nbsp;</td><td>0,1 mg/ml w LCH</td></tr><tr><td>Komputer</td><td>Dell</td><td>Optiplex 7010</td><td>Lub dowolny produkt równoważny</td></tr><tr><td>Termometr cyfrowy</td><td>RS</td><td>206-3722</td><td>Lub dowolny produkt równoważny</td></tr><tr><td>DNAzy I</td><td>Milipore</td><td>260913</td><td>Zapas roboczy 1 MU mL-1 (10 MU rozcieńczony w 10 ml LCH)&nbsp;</td></tr><tr><td>Klatka Faradaya</td><td>Wykonane</td><td></td> na zamówienie <td>Dowolny równoważny produkt handlowy</td></tr><tr><td>Drobne kleszcze</td><td>Dumont</td><td>No. 7</td><td>Dowolny bardzo drobny kleszcz</td></tr><tr><td>Komora nagraniowa ze szklanym dnem</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0759</td><td>Lub dowolny produkt równoważny</td></tr><tr><td>Headstage</td><td>Molecular Devices</td><td>CV203BU</td><td>Lub dowolny produkt równoważny</td></tr><tr><td>Grzejnik liniowy</td><td>Wykonane</td> <td>na zamówienie</td><td>Ekwiwalent komercyjny SH-27B Roztwór Grzałka liniowa z Harvard</td></tr><tr><td>Aparat Mikroskop odwrócony</td><td>Nikon</td><td>Eclypse TE 300</td><td>Lub dowolny produkt równoważny</td></tr><tr><td>Ściągacz mikroelektrod</td><td>Instrumenty Sutter</td><td>P97</td><td>Lub dowolny produkt równoważny</td></tr><tr><td>Microforge +&nbsp; Mikroskop Olympus CX 31</td><td>Glassworks</td><td>Fine Point F-550</td><td>Lub dowolny produkt równoważny</td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Instrumenty Sutter</td><td>MP-285</td><td>Lub dowolny produkt równoważny</td></tr><tr><td>Wielokanałowy rozdzielacz&nbsp;</td><td>Zautomatyzuj naukowy</td><td>ołówek perfuzyjny</td><td>Lub dowolny produkt równoważny</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do łatania</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>Pclamp v10.2</td><td>Lub dowolny równoważny produkt</td></tr><tr><td>Napełniacz do pipet&nbsp;</td>Strzykawka <td>BD Plastipak</td><td>1mL</td><td>podgrzewana i ciągnięta do wewnętrznej średnicy pipety</td></tr><tr><td>Uchwyt na pipety</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>1-HL-U</td><td>Lub dowolny równoważny produkt</td></tr><tr><td>Proteaza Typ XIV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5147&nbsp;</td><td>0,01 mg/ml w LCH</td></tr><tr><td>Jednokanałowa szklana pipeta</td><td>Instrumenty World Percision</td><td>IB150F-3</td><td>Lub dowolny produkt równoważny</td></tr><tr><td>Pompa ssąca</td><td>Interpet</td><td>AP1</td><td>Przerobiona pompa napowietrzająca przez rewers mieszkowy</td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>BD Plastipak</td><td>20mL Luer-lok</td><td>Lub dowolny produkt równoważny</td></tr><tr><td>Drut wolframowy</td><td>Advent</td><td>W557418</td><td>50&mu; m</td></tr><tr><td>średnica Tygon Rurki</td><td>VWR</td><td>różne rozmiary</td><td>Dowolny równoważny produkt pasujący do</td></tr><tr><td>kamery USB</td><td>&nbsp; Logitech&nbsp;</td><td>HD Pro Webcam C920</td><td>Lub dowolny produkt równoważny</td></tr><tr><td>Kąpiel wodna</td><td>Grant</td><td>Sub Aqua 12 Plus</td><td>Lub dowolny produkt równoważny</td></tr><tr><td>Szkło do pipet pełnokomórkowych</td><td>Warner</td><td>Instruments GC150TF-7.5</td><td>Lub dowolny produkt równoważny</td></tr><tr><td>obiektyw x20</td><td>Nikon</td><td>20x/0.40 WD 3.8, &infin;/0.17</td><td>Lub dowolny produkt równoważny</td></tr><tr><td>x4 obiektyw</td><td>Nikon</td><td>4x/0.10, WD 30, &infin;/-</td><td>Lub dowolny produkt equilavent</td></tr><tr><td>x40 obiektyw</td><td>Nikon</td><td>40x/0.55, WD 2.1, &infin;/1.2</td><td>Lub dowolny produkt równoważny</td></tr><tr><td>Y-connectors</td><td>World Percision Instruments</td><td>14012</td><td>Lub dowolny produkt równoważny</td></tr><tr><td>Ca2+ Gwintowniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-kierunkowe</td><td>Cole-Parmer</td><td>UY-30600-02</td><td>Lub dowolny produkt równoważny</td></tr><tr><td>3-osiowy manipulator mechaniczny</td><td>Scientifica</td><td>LBM-7&nbsp;</td><td>Lub dowolny równoważny produkt</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do akwizycji&nbsp;</td><td>Cairn Research Sp. z o.o.</td><td>Silnik akwizycji V1.1.5</td><td>Lub dowolny produkt równoważny; mikrofluorymetria</td></tr><tr><td>Stół powietrzny</td><td>Korporacja Produkcji Technicznej&nbsp;</td><td>Clean Bench</td><td>Lub dowolny produkt equilavent</td></tr><tr><td>Oprogramowanie analityczne do obrazowania konfokalnego</td><td>Image J</td><td>https://downloads.imagej.net/fiji/</td> <td>Darmowe oprogramowanie do obrazowania</td></tr><tr><td>Komputer</td><td>Dell</td><td>Optiplex 7010</td><td>Lub dowolny produkt równoważny</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Leica</td><td>Geosystems SP5&nbsp;</td><td>Lub dowolny produkt ekwiwalentny; konfokalny</td></tr><tr><td>Termometr cyfrowy</td><td>RS</td><td>206-3722</td><td>Lub dowolny produkt równoważny</td></tr><tr><td>Drobne kleszcze</td><td>Dumont</td><td>nr 7</td><td>Dowolny bardzo drobny kleszcz</td></tr><tr><td>Komora nagraniowa ze szklanym dnem</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0759</td><td>Lub dowolny produkt równoważny</td></tr><tr><td>Grzałka liniowa</td><td>Wykonany</td><td></td> na zamówienie <td>ekwiwalent handlowy SH-27B Rozwiązanie Grzałka liniowa firmy Harvard</td></tr><tr><td>Apparatus Odwrócona mikroskop</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TE2000</td><td>Lub dowolny równoważny produkt; mikrofluorymetria</td></tr><tr><td>Monochromator&nbsp;</td><td>Cairn Research Sp. z o.o.</td><td>Optoscan</td><td>Lub dowolny równoważny produkt; mikrofluorymetria</td></tr><tr><td>Wielokanałowy kolektor tłoczny&nbsp;</td><td>Zautomatyzuj</td><td>naukowy ołówek perfuzyjny</td><td>lub dowolny równoważny produkt</td></tr><tr><td>Napełniacz do pipet&nbsp;</td>Strzykawka <td>BD Plastipak</td><td>1mL</td><td>podgrzewana i ciągnięta do wewnętrznej średnicy pipety</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do mikroskopu konfokalnego</td><td>Leica Geosystems</td><td>LAS-AF wersja 3.3.</td><td>Lub dowolny produkt ekwiwalentny; konfokalny</td></tr><tr><td>Pompa ssąca</td><td>Interpet</td><td>AP1</td><td>Przerobiona pompa napowietrzająca przez rewers mieszkowy</td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>BD Plastipak</td><td>20mL Luer-lok</td><td>Lub dowolny równoważny produkt</td></tr><tr><td>Drut wolframowy</td><td>Advent</td><td>W557418</td><td>50&mu; m</td></tr><tr><td>średnica Rurka Tygon VWR</td><td></td><td>różne rozmiary</td><td>Dowolny produkt equilavent pasujący do</td></tr><tr><td>kąpieli wodnej</td><td>Grant</td><td>Sub Aqua 12 Plus</td><td>Lub dowolny produkt równoważny</td></tr> soczewka <tr><td>x100</td><td>Nikon</td><td>x100 N.A. 1.3 olej</td><td>Lub dowolny produkt równoważny; obiektyw do mikrofluorymetrii</td></tr><tr><td>x20</td><td>Nikon</td><td>20x/0.40 WD 3.8, &infin;/0.17</td><td>Lub dowolny produkt równoważny; mikrofluorymetria</td></tr><tr><td>x20 obiektyw</td><td>Leica Geosystems</td><td>HCX PL FLUOTAR, 20x/0.50, &infin;/0.17/D</td><td>Lub dowolny produkt równoważny; konfokalny</td></tr><tr><td>obiektyw x4</td><td>Nikon</td><td>4x/0.10, WD 30, &infin;/-</td><td>Lub dowolny równoważny produkt; Obiektyw do mikrofluorymetrii</td></tr><tr><td>x63</td><td>Leica Geosystems</td><td>HCX PL APO, 63x/1.40 - 0.60 OIL CS &infin;/0.17/E</td><td>Lub dowolny równoważny produkt; konfokalne</td></tr><tr><td>złącza Y World</td><td>Percision Instrumenty</td><td>14012</td><td>Lub dowolny produkt równoważny</td></tr><tr><td>< pipety strong></td><td></td><td></td><td>Specyfikacje i ustawienia dotyczące produkcji pipet do eksperymentów</td></tr><tr><td>Helper pipeta</td><td>World Percision</td><td>IB150F-3</td><td>Średnica wewnętrzna: 0,86 mm Rampa: 261 Ciśnienie: 300 Ciepło: 280 Ciągnij: 0 Prędkość: 56 Czas: 250 Liczba cykli: 4 Średnica końcówki: 0,5-2 &mu; m Polerowanie: tak Odporność końcowa: >10 M&Omega;</td></tr><tr><td>Pipeta do kaniulacji</td><td>Instrumenty World Percision</td><td>TW150F-4</td><td>Średnica wewnętrzna: 1,17 mm Rampa: 290 Ciśnienie: 300 Ciepło: 280 Ciągnięcie: 0 Prędkość: 58 Czas: 150 Liczba cykli: 4 Średnica końcówki: 3-10 &mu; m Polerowanie: no Odporność końcowa: < 1 M&Omega;</td></tr><tr><td>Łatanie na komórkach</td><td>Instrumenty World Percision</td><td>IB150F-3</td><td>Średnica wewnętrzna: 0,86 mm Rampa: 261 Ciśnienie: 300 Ciepło: 280 Ciąg: 0 Prędkość: 56 Czas: 250 Liczba cykli: 4 Średnica końcówki: 0,5-2 &mu; m Polerowanie: tak Odporność końcowa: >5 M&Omega;</td></tr><tr><td>Łatanie całych komórek</td><td>Warner Instruments</td><td>GC150TF-7,5</td><td>Średnica wewnętrzna: 1,17 mm Rampa: 296 Ciśnienie: 200 Ciepło: 287 Ciąg: 0 Prędkość: 50 Czas: 250 Liczba cykli: 4 Średnica końcówki: 2-3 &mu; m Polerowanie: pomocne, ale nie konieczne Odporność końcowa: 1-2 M&Omega;</td></tr></tbody></table>

izolacja tętniczek siatkówki do badań fizjologii komórek ex vivo

Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies

Siatkówka jest wysoce aktywną metabolicznie tkanką, która wymaga znacznego dopływu krwi. Krążenie siatkówki podtrzymuje siatkówkę wewnętrzną, podczas gdy naczynia naczyniówkowe zaopatrują fotoreceptory. Zmiany w perfuzji siatkówki przyczyniają się do licznych zaburzeń zagrażających wzrokowi, w tym retinopatii cukrzycowej, jaskry i niedrożności żył gałęzi siatkówki. Zrozumienie mechanizmów molekularnych zaangażowanych w kontrolę przepływu krwi przez siatkówkę i tego, w jaki sposób są one zmieniane podczas choroby oczu, może prowadzić do identyfikacji nowych celów leczenia tych schorzeń. Tętniczki siatkówki są głównymi naczyniami oporowymi siatkówki, a co za tym idzie, odgrywają kluczową rolę w regulacji hemodynamiki siatkówki poprzez zmiany średnicy światła. W ostatnich latach opracowaliśmy metody izolowania tętniczek od siatkówki szczura, które nadają się do szerokiego zakresu zastosowań, w tym do badań fizjologii komórek. Preparat ten zaczął już przynosić nowe informacje na temat tego, w jaki sposób kontrolowany jest przepływ krwi w siatkówce i pozwolił nam zidentyfikować niektóre z kluczowych zmian, które zachodzą podczas choroby oczu. W tym artykule opisano metody izolacji tętniczek siatkówki szczura i załączamy protokoły ich stosowania w elektrofizjologii patch-clamp, obrazowaniu wapnia i badaniach miografii ciśnieniowej. Naczynia te mogą być również stosowane w badaniach opartych na PCR, western blotting i immunohistochemii.

Ten manuskrypt opisuje prosty protokół izolacji tętniczek od siatkówki szczura, który może być wykorzystany w badaniach elektrofizjologicznych, obrazowania wapnia i miografii ciśnieniowej.

Izolacja tętniczek siatkówki do badań fizjologii komórek ex vivo

The retina is a highly metabolically active tissue that requires a substantial blood supply. The retinal circulation supports the inner retina, while the ...

Zrozumienie, w jaki sposób kontrolowany jest przepływ krwi w siatkówce, jest ważnym celem, ponieważ nieprawidłowy przepływ krwi jest związany z rozwojem różnych zagrażających wzrokowi chorób siatkówki, takich jak retinopatia cukrzycowa, jaskra i niedrożność żył gałęziowych. Tętniczki siatkówki odgrywają kluczową rolę w regulacji przepływu krwi w siatkówce poprzez rozszerzanie i zwężanie ich średnicy światła, w czym pośredniczą zmiany kurczliwości komórek mięśni gładkich otaczających te naczynia. Zrozumienie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw regulacji perfuzji siatkówki wymaga zatem przygotowań, w ramach których można uzyskać dostęp do komórek mięśni gładkich tętniczek siatkówki i badać je w warunkach jak najbardziej zbliżonych do fizjologicznych.W tym filmie pokazujemy prosty protokół izolacji tętniczek z siatkówki szczura, który można zastosować w badaniach z klamrą łatkową, obrazowaniem wapnia i miografią ciśnieniową. W ciągu ostatnich kilku lat preparat ten był stosowany w celu uzyskania dalszych informacji na temat regulacji kurczliwości mięśni gładkich naczyń krwionośnych i przepływu krwi w siatkówce zarówno w zdrowiu, jak i chorobie. Uzupełnić jednolitrowy roztwór o niskiej zawartości wapnia zawierający Hanks'or LCH, jak pokazano w tabeli materiałów.Zmontuj sprzęt do izolacji przed pobraniem tkanki. Szklana pipeta Pasteura musi być wypolerowana ogniowo, aby wygładzić, ale nie zwęzić końcówki. Przytnij plastikową pipetę do otworu około pięciu do siedmiu milimetrów.Umieść oczy na naczyniu preparacyjnym, zanurzonym w roztworze LCH. Użyj jednego zestawu kleszczy, aby zakotwiczyć oko w misce, przytrzymując przyczepy mięśni oczodołu lub nerw wzrokowy. Upewnij się, że punkt kotwiczenia znajduje się jak najbliżej twardówki, aby ustabilizować oko.Za pomocą ostrza przetnij rogówkę wzdłuż ora serrata i wyjmij soczewkę, delikatnie naciskając na twardówkę kleszczami. Mały, okrągły obszar, który widzimy z tyłu oka na tym obrazie, to nerw wzrokowy. Za pomocą ostrza przeciąć muszlę oczną na pół symetrycznie przez tarczę optyczną.Za pomocą zamkniętych kleszczyków delikatnie wyszczotkuj siatkówki z dwóch połówek muszli ocznej, uważając, aby usunąć wszelkie pozostałe nasadki na tarczy nerwu wzrokowego. Powtórz proces z drugim okiem i przenieś wypreparowane siatkówki do probówki za pomocą plastikowej pipety i małej kropli podłoża LCH. Za pomocą plastikowej pipety napełnij probówkę LCH do około pięciu mililitrów i pozwól, aby siatkówki osiadły na dnie probówki.Umyj chusteczkę około trzy razy, usuwając około czterech mililitrów roztworu z probówki i dodając świeży LCH za pomocą plastikowej pipety. W razie potrzeby należy usunąć obce tkanki. Umyj wnętrze szklanej pipety Pasteura z polerowaną końcówką z LCH, aby zapobiec przywieraniu chusteczki do pipety.Za pomocą tej samej pipety usuń około czterech mililitrów roztworu z probówki i dodaj około dwóch mililitrów świeżego LCH. Delikatnie rozdziel siatkówki, powoli przeciągając tkankę przez końcówkę szklanej pipety i wyrzuć zawartość do probówki. Staraj się nie wprowadzać pęcherzyków na tym etapie i powtarzaj proces, aż siatkówki zostaną rozbite do rozmiaru około dwóch do trzech milimetrów kwadratowych.Umyj wnętrze pipety około dwoma mililitrami LCH i wylej je do probówki. Pozwól, aby zawartość opadła na dno przez pięć do 10 minut. Powtórz proces rozcierania, jak opisano wcześniej, z nieco większą siłą, aż kawałki tkanki osiągną rozmiar około jednego milimetra kwadratowego.Pozwól tkance się uspokoić i powtórz jeszcze raz z jeszcze większą siłą, aż zawartość zostanie całkowicie zhomogenizowana i nie pozostaną żadne kawałki siatkówki. Roztwór na tym etapie powinien mieć mleczny wygląd. Technika ta pozwoli uzyskać do ośmiu segmentów tętniczki na izolację, o długości od 200 do 2 500 mikrometrów.Kaniulacja jednego końca tętniczki z okluzją przeciwległego końca pozwala na pomiar zwężenia naczyń krwionośnych wywołanego ciśnieniem, znanego również jako odpowiedź miogenna. Miografię ciśnienia tętniczego przeprowadza się w następujący sposób. Porcję homogenatu siatkówki przenosi się do fizjologicznej komory rejestracyjnej zamontowanej na stoliku mikroskopu odwróconego.Pozostaw homogenat na dnie komory na co najmniej pięć minut. Skanuj wzrokowo w poprzek komory rejestracyjnej, aby zidentyfikować tętniczki o długości większej niż 200 mikrometrów i posiadające otwarty koniec, przez który można kaniulować naczynie. Zakotwicz jeden koniec naczynia za pomocą cienkich kleszczy i małego ślizgu z drutu wolframowego umieszczonego nad statkiem.Używając zachodzących na siebie końców drutu wolframowego, manewruj naczyniem tak, aby przebiegało poziomo w poprzek wanny, tak aby otwarty koniec znajdował się w jednej linii z kaniulą ciśnieniową. Wypełnij komorę zerowym wapniem Hanks'a w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Kaniulacje wykonuje się za pomocą szklanych pipet.Kaniulę umieszcza się na otwartym końcu naczynia za pomocą drobnego mikromanipulatora. Końcówka jest umieszczona bezpośrednio przy otworze, co ocenia się poprzez regulację płaszczyzny ostrości na mikroskopie, tak aby zarówno koniec naczynia, jak i końcówka kaniuli były ustawione w tym samym czasie, a kaniula ciśnieniowa przesuwała się do otworu naczynia. Pipeta pomocnicza jest wymagana do pomocy w procesie kaniulacji i służy do delikatnego przytrzymywania tętniczki i prowadzenia ściany tętniczki przez kaniulę ciśnieniową w tym samym czasie, gdy kaniula jest wprowadzana do światła naczynia.Procedura ta wymaga jednoczesnego, kontrolowanego ruchu obu manipulatorów i rozległej praktyki, aby osiągnąć wysoki wskaźnik sukcesu. Po jednej minucie zapisu przy zerowej milimetrze słupa rtęci, ciśnienie śródświetlne wzrasta do 40 milimetrów słupa rtęci, a naczynie powinno się gwałtownie rozszerzyć, potwierdzając pomyślną kaniulację. Zwężenie naczyń krwionośnych wywołane ciśnieniem, czyli reakcja miogenna, rozwija się następnie przez około 15 minut.Zapis patch clamp z komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych siatkówki umożliwia badanie prądów jonowych błony plazmatycznej, które regulują wewnątrzkomórkowy wapń, a tym samym kurczliwość komórkową. Rejestracja całokomórkowa i jednokanałowa jest możliwa z pojedynczych komórek mięśni gładkich nadal osadzonych w ich tętniczkach macierzystych w następujący sposób. Tętniczki siatkówki są izolowane i zakotwiczane w komorze nagraniowej za pomocą zsuwów z drutu wolframowego.Blaszka podstawowa musi zostać strawiona, aby umożliwić utworzenie uszczelnienia o wysokiej wytrzymałości między pipetą plastrową a błoną komórkową mięśni gładkich tętniczek. Tętniczki są przerośnięte sekwencyjną serią roztworów enzymatycznych w temperaturze 37 stopni Celsjusza, co powoduje również elektryczne rozprzęganie sąsiednich komórek, jak wskazują strzałki na obrazie. Poziom trawienia jest wstępnie oceniany na podstawie wizualnego oddzielenia warstw śródbłonka i mięśni gładkich podczas etapu kolagenazy.Usunięcie wszelkich pozostałych pasm blaszki podstawnej i/lub neuropile obwodowej uzyskuje się poprzez ostrożne przesuwanie zamkniętych końcówek cienkich kleszczyków wzdłuż powierzchni naczynia. W przypadku zaciskania plastrów końcówka pipety do plastrów jest umieszczana pionowo nad komórką zainteresowania i stopniowo opuszczana za pomocą delikatnego, powolnego ruchu mikromanipulatora, aby zetknąć się z błoną mięśni gładkich tętniczek. Ocenia się to na podstawie ruchu komórki i zmiany oporu pipety, mierzonego za pomocą protokołu testu szczelności komórek w oprogramowaniu do akwizycji.Gdy pipeta jest opuszczana na celę, opór uszczelnienia wzrośnie około pięciokrotnie. Podciśnienie jest przejściowo przykładane do tylnej części pipety i stopniowo tworzy się gigaseal. Wymaga to wielokrotnego stosowania podciśnienia w ciągu jednej do pięciu minut.Do zapisu całych komórek stosuje się głównie metodę perforowanego patch-clamp. Gigaseal jest formowany, jak opisano wcześniej, za pomocą pipety zawierającej roztwór podobny do roztworu wewnątrzkomórkowego i amfoterycynę B. Opór dostępu jest monitorowany za pomocą protokołu testu membranowego w oprogramowaniu do akwizycji. Gdy rezystancja dostępowa spadnie do mniej niż 15 megaomów, wykonywana jest kompensacja rezystancji szeregowej.Zazwyczaj możliwe jest skompensowanie oporu szeregowego o około 75% w trybie perforowanej łaty. Kroki napięcia lub protokoły rampy mogą być następnie wykorzystane do pomiaru prądów w całym ogniwie. Po dysocjacji siatkówki można zidentyfikować tętniczki pierwotne, wtórne i przedkapilarne na podstawie ich kalibru i rozmieszczenia komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych.Tętniczki pierwszego i drugiego rzędu wydają się wizualnie podobne pod mikroskopią jasnego pola, ale można je rozróżnić na podstawie ich wielkości. Tętniczki przedkapilarne są najmniejszymi naczyniami tętniczymi w preparacie i są łatwo rozpoznawalne dzięki przerywanemu układowi komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych. Izolowane tętniczki można wyraźnie odróżnić od naczyń włosowatych i żyłek w obrębie izolacji.Naczynia włosowate są widoczne jako siatka naczyń małego kalibru o średnicy około czterech do 10 mikrometrów, podczas gdy żyłki są cienkościenne i nie mają pokrycia komórkami mięśni gładkich. Tętniczki pierwotne, wtórne i przedkapilarne nadają się do miografii ciśnieniowej, obrazowania wapnia i badań patch-clamp. Korzystając z tętniczek pod ciśnieniem, zbadaliśmy mechanizmy molekularne zaangażowane w generowanie odpowiedzi miogennej.Mikrofotografie na tym zdjęciu pokazują tętniczkę siatkówki szczura w różnych punktach czasowych podczas eksperymentu z miografią ciśnieniową. Poniższy wykres przebiegu czasowego pokazuje zmiany średnicy naczynia podczas całego trwania eksperymentu. Natychmiast po zwiększeniu ciśnienia naczynie rozszerza się, po czym następuje aktywne zwężenie miogenne, które po 15 minutach osiąga poziom w stanie ustalonym.Dodanie wortmanniny do roztworu Hanksa o zerowym stężeniu wapnia pod koniec eksperymentu rozszerza naczynie do jego średnicy biernej w celu normalizacji. Ten slajd przedstawia przykład jednokanałowego zapisu patch-clamp z komórki mięśni gładkich tętniczki siatkówki przed i po rozciąganiu błony. Ten plaster na komórkach zawiera dwa aktywowane rozciąganiem kanały TRPV2, których aktywność wzrasta wraz z przyłożeniem podciśnienia do pipety z plastrem.Opisane tutaj protokoły wymagają praktyki, ale powinny być osiągalne przy minimalnym rozwiązywaniu problemów. Zalecamy użycie izolowanych tętniczek w tym samym dniu, w którym odbywa się izolacja. Metoda jest zoptymalizowana pod kątem tętniczek siatkówki szczura, ale może być stosowana na siatkówkach myszy.Obecnie szeroko stosujemy ten preparat, ale tam, gdzie to możliwe, staramy się również zweryfikować nasze kluczowe wyniki za pomocą całych wierzchowców siatkówki ex vivo oraz pomiarów in vivo średnicy naczyń krwionośnych i przepływu krwi.

isolation-of-retinal-arterioles-for-ex-vivo-cell-physiology-studies

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ex vivo ERG może być używany do rejestrowania aktywności elektrycznej komórek siatkówki bezpośrednio z izolowanych nienaruszonych siatkówk zwierząt lub ludzi. Pokazujemy tutaj, jak powszechne systemy ERG in vivo można dostosować do zapisów ERG ex vivo w celu zbadania aktywności elektrycznej komórek siatkówki.

Jednoczesne badanie funkcjonalne ex vivo dwóch siatkówk za pomocą systemu elektroretinogramu in vivo

Wiele zagrażających wzrokowi chorób oczu jest związanych z dysfunkcyjnymi mikronaczyniami siatkówki. Dlatego pomiar odpowiedzi tętniczek siatkówki jest ważny dla zbadania podstawowych mechanizmów patofizjologicznych. W artykule opisano szczegółowy protokół izolacji i przygotowania tętniczek siatkówki myszy do oceny wpływu substancji wazoaktywnych na średnicę naczyń krwionośnych.

Etapy przygotowania do pomiaru reaktywności tętniczek siatkówki myszy ex vivo

Pokazujemy trzy różne techniki przygotowania tkanek do immunohistochemicznej wizualizacji mikrokrążeń siatkówki szczura, tj. kriosekcje, całe wierzchowania i hipotoniczne izolowanie sieci naczyniowej.

Kriowycinki siatkówki, całe wierzchowania i hipotoniczne izolowane preparaty naczyniowe do immunohistochemicznej wizualizacji perycytów mikronaczyniowych

Protokół opisuje organotypowe eksplantaty myszy neuroretina, hodowana razem z nabłonkiem barwnikowym siatkówki (RPE), w pożywce zdefiniowanej przez R16, wolna od surowicy i antybiotyków. Metoda ta jest stosunkowo prosta do wykonania, tańsza i bardziej czasochłonna w porównaniu z eksperymentami in vivo i może być dostosowana do wielu zastosowań eksperymentalnych.

Długotrwała, pozbawiona surowicy hodowla organtypowych eksplantatów siatkówki myszy z nienaruszonym nabłonkiem barwnikowym siatkówki

Ten artykuł opisuje dobrze sprawdzony i powtarzalny test barwienia lektyny dla całego preparatu siatkówki Mount oraz protokoły wymagane do ilościowego pomiaru parametrów naczyniowych często zmienianych w retinopatiach proliferacyjnych i nieproliferacyjnych.

Kwantyfikacja parametrów naczyniowych w całych siatkówkach górskich myszy z retinopatiami nieproliferacyjnymi i proliferacyjnymi

Ten protokół opisuje metodę izolacji mysich komórek śródbłonka siatkówki po urodzeniu, zoptymalizowanych pod kątem wydajności, czystości i żywotności komórek. Komórki te nadają się do sekwencjonowania nowej generacji.

Izolacja mysich komórek śródbłonka siatkówki do sekwencjonowania nowej generacji

Intensywne przygotowanie nienaruszonych "rurek" śródbłonka mózgu myszy z tętniczek miąższowych mózgu jest zilustrowane do badania regulacji przepływu krwi w mózgu. Ponadto pokazujemy eksperymentalne mocne strony tego modelu badania śródbłonka do obrazowania fluorescencyjnego i pomiaru elektrofizjologii kluczowych szlaków sygnalizacji komórkowej, w tym zmian wewnątrzkomórkowych [Ca2+] i potencjału błonowego.

Izolacja i analiza funkcjonalna śródbłonka tętniczego miąższu mózgu myszy

Ten manuskrypt opisuje uproszczony protokół stopniowej izolacji komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) z oczu myszy. Protokół obejmuje wyłuszczenie i sekcję oczu myszy, a następnie izolację, wysiew i hodowlę komórek RPE.

Izolacja pierwotnych komórek barwnikowego nabłonka siatkówki myszy

Ten protokół przedstawia i opisuje etapy izolacji, sekcji, hodowli i barwienia eksplantatów siatkówki uzyskanych od dorosłej myszy. Metoda ta jest korzystna jako model ex vivo do badania różnych chorób nerwowo-naczyniowych siatkówki, takich jak retinopatia cukrzycowa.

Eksplantat siatkówki dorosłej myszy jako model ex vivo do badania chorób nerwowo-naczyniowych siatkówki

Test ochronny został opracowany do monitorowania odporności układu krwionośnego siatkówki na śmierć z powodu urazów związanych z cukrzycą/retinopatią cukrzycową, takich jak stres oksydacyjny i cytokiny.

Test do wykrywania ochrony naczyń krwionośnych siatkówki przed śmiercią związaną z cukrzycą u myszy

Tutaj przedstawiamy szczegółową metodologię izolowania siatkówki od oka myszy w celu przeprowadzenia rozszerzonych eksperymentów ex vivo. Protokół ten kładzie nacisk na udostępnienie tego wymagającego technicznie podejścia badaczom, którzy chcieliby skorzystać z możliwości badawczych, jakie daje utrzymanie gleju siatkówki in situ w żywej tkance.

Model eksplantatu ex vivo do badania interakcji glejowych w siatkówce myszy

Poznaj metodę izolacji tętniczek siatkówki szczura do badań elektrofizjologicznych i myografii ciśnieniowej. Protokół umożliwia analizę kurczliwości mięśni gładkich naczyń i regulacji przepływu krwi w siatkówce.

Izolacja tętniczek siatkówki do badań fizjologii komórek ex vivo

Przeglądaj więcej filmów