Name: Spektrometria mas oprysków liściowych: technika szybkiej jonizacji otoczenia do bezpośredniej oceny metabolitów z tkanek roślinnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 43 s
Description: Poznaj spektrometrię mas oprysków liściowych do bezpośredniej analizy tkanek roślinnych bez przygotowania próbek. Ta metoda umożliwia szybką detekcję alkaloidów i pestycydów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca została sfinansowana przez grant Programu Badań nad Genomem Roślinnym NSF IOS-1238812 oraz Stypendium Podoktorskie z Biologii IOS-1400818. Praca została również sfinansowana przez Monsanto Graduate Student Fellowship dla Katherine A. Sammons. Fulbright African Researcher Scholars Program (2017-2018) dziękuje za dofinansowanie przyznane Nokwandzie P. Makunga. Jesteśmy bardzo wdzięczni za darowiznę źródła nanosprayu od Jessiki Prenni i ośrodka Proteomiki i Metabolomiki na Uniwersytecie Stanowym Kolorado.

1. Modyfikacje źródła Nanospray dla sprayu do liści MS
<ol>
	<li>Użyj zmodyfikowanego źródła nanosprayu do opryskiwania liści MS. Ponieważ do opryskiwania liści MS nie są potrzebne żadne składniki płynne, zmodyfikuj źródło, wyjmując sondę LC ze źródła.</li>
	<li>Zamontuj drut MS do spryskiwania liści, który będzie przykładał napięcie do tkanki roślinnej, za pomocą odpowiedniego kołka do podłączenia do źródła. szpilkę do jednego końca izolowanego drutu; zacisk do przeciwległego końca drutu. 
	UWAGA: Zacisk (typ zacisku krokodylkowego) może, ale nie musi mieć zębów. W przypadku małych tkanek preferowany jest zacisk bez zębów. Do źródła nanosprayu można dodać opcjonalne elastyczne ramię z zaciskiem, aby pomóc w pozycjonowaniu tkanki roślinnej. Należy zauważyć, że protokół ten szczegółowo opisuje, jak wykonać oprysk z liści w systemie MS hybrydowego kwadrupolowego analizatora masy pułapki jonowej (patrz Tabela materiałów); jednak inne systemy MS mogą zostać zmienione w celu wykonania tej techniki6. Sprzężenie sprayu do liści MS z przenośnym spektrometrem mas Analiza chemiczna w czasie rzeczywistym może być wykonywana na miejscu, bez konieczności transportu materiału roślinnego do laboratorium19,20.</li>
	<li>Umieść antystatyczną matę podłogową na podłodze poniżej źródła, aby zmniejszyć wyładowania elektryczne, które mogą wystąpić ze źródła podczas korzystania z dużej objętościtagmi.</li>
</ol>
2. Przygotowanie systemu MS do opryskiwania liści MS
<ol>
	<li>Jeśli system był ostatnio używany, pozwól mu ostygnąć w dotyku i usuń wszelkie alternatywne źródła oraz stożek zamiatania. Podłącz źródło nanosprayu do liści MS</li>.
	<li>Utwórz plik strojenia z odpowiednimi parametrami jonizacji ustawionymi w następujący sposób: osłona, gaz pomocniczy i przemiatanie na 0; napięcie rozpylania do 2 - 5 kV; temperatura kapilary do 150 - 250 °C; i poziom RF soczewki S na 50. Zapisz plik strojenia z żądanymi parametrami8,13. Zoptymalizuj napięcie i temperaturę, aby uzyskać najlepszą jonizację tkanki i związku (związków) będących przedmiotem zainteresowania. 
	UWAGA: Dobrymi punktami startowymi są 4 kV i 200 °C.</li>
	<li>Utwórz plik metody zawierający plik MS z opryskiem do liści zawierający: dodatni i ujemny pełny MS, rozdzielczość 70 000, cel AGC 1 x 106, maksymalny IT 200 ms i żądany zakres skanowania m/z. Alternatywnie użyj tylko 1 polaryzacji.</li>
</ol>
3. Przygotowanie instrumentu, rozpuszczalników i tkanek roślinnych
UWAGA: Zawsze noś rękawiczki i nie używaj tkanki roślinnej, która została wykonana gołymi rękami. W przeciwnym razie jony zanieczyszczające, takie jak glikol polietylenowy, zdominują widma.
<ol>
	<li>Tkanki roślinne do analizy należy przenieść do tego samego pomieszczenia, w którym znajduje się system MS, aby umożliwić szybkie pobranie próbek.</li>
	<li>W przypadku tkanki roślinnej, która nie ma naturalnie spiczastej końcówki, użyj żyletki na szklanym szkiełku, aby wyciąć zwężający się punkt (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). Określ ilość tkanki potrzebnej do analizy w oparciu o czułość instrumentu, rodzaj tkanki i związek (związki) będący przedmiotem zainteresowania (np. młody liść S. tortuosum o długości ~5 mm).
	<ol>
		<li>Pokrój liście S. tortuosum po 10 tygodniach od wykiełkowania w cienkie paski, każdy ze zwężającym się końcem, aby utworzyć punkt.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj kleszczy, aby delikatnie wybrać tkankę roślinną na końcu, która zostanie zaciśnięta. Trzymając tkankę kleszczami, ostrożnie przenieś ją do zacisku. 
	UWAGA: Nie dotykaj źródła przyrządu, jeśli voltage jest włączony.</li>
	<li>Wyreguluj elastyczne ramię i drut z zaciskiem, aby ustawić tkankę w jednej linii z wlotem MS tak, aby odległość między tkanką roślinną a wlotem jonów MS wynosiła 5 - 10 mm dla potrójnego kwadrupola (np. TSQ) i liniowego kwadrupola pułapki (LTQ) oraz 10 - 50 mm dla analizatora masy pułapki jonowej (np. orbitrap)<klasa sup="xref">8.
	<ol>
		<li>Podłącz przeciwległy koniec przewodu do źródła. Jeśli pierwsze próby dają niską intensywność sygnału, przesuń tkankę roślinną bliżej wlotu jonów (patrz Dyskusja, aby uzyskać informacje na temat optymalizacji).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Załaduj plik metody, nazwij plik danych i ustaw lokalizację przechowywania pliku. Następnie włącz system MS, klikając Play i kliknij Start, aby rozpocząć pobieranie danych.</li>
	<li>Nanieś rozpuszczalnik (np. metanol) za pomocą pipety z końcówką do napełniania żelem, aby zmaksymalizować odległość między rękami i wysokie napięcie, aby chronić użytkownika. 
	UWAGA: Wymagana objętość rozpuszczalnika zależy od wielkości, suchości i tekstury tkanki, zwykle ~ 2 - 20 μL. Liście S. tortuosum nie wymagają dodawania rozpuszczalnika. Ostrożnie nałóż rozpuszczalnik i nie dotykaj źródła przyrządu, gdy voltage jest włączony. Używaj rozpuszczalników i naczyń szklanych klasy LC-MS, które zostały umyte kwasem i nie zawierają detergentów. W niektórych tkankach sygnał można zaobserwować bez dodatku rozpuszczalnika ze względu na naturalną zawartość wody w tkance roślinnej. Jednak większą intensywność sygnału i zmniejszony sygnał / szum uzyskuje się zwykle poprzez nałożenie rozpuszczalnika na tkankę.</li>
	<li>Zbieraj dane tak długo, jak długo sygnał się utrzymuje lub do momentu zebrania odpowiednich widm, zwykle 30 - 60 s. W razie potrzeby zastosuj dodatkowy rozpuszczalnik, aby utrzymać wysoką intensywność sygnału przez dłuższy czas. Zatrzymaj pobieranie danych i wstrzymaj system MS.</li>
	<li>Usuń chusteczkę i umyj zacisk 100% metanolem i niestrzępiącą się chusteczką. Oczyść wlot jonów MS po około 1 - 2 godzinach od pobrania za pomocą sprayu do liści MS zgodnie ze specyfikacją dostawcy. Należy również oczyścić wlot jonów MS między analizami różnych typów tkanek.</li>
</ol>
4. Ocena jakości danych
<ol>
	<li>Otwórz plik danych i sprawdź wzrokowo chronogram podstawowej masy szczytowej. Sprawdź, czy intensywność sygnału wynosi od ~1.0 x10 7 do 5.0 x 108. Jeśli sygnał jest niższy, przesuń tkankę bliżej wlotu jonów. Jeśli jest wyższy, przedni koniec systemu MS ulegnie zabrudzeniu, więc odsuń tkankę dalej od wlotu jonów.</li>
	<li>Na podstawie obecności lub braku jonów będących przedmiotem zainteresowania w wytworzonych widmach masowych, zmień parametry. 
	UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.</li>
</ol>
5. Fragmentacja masy tandemowej
<ol>
	<li>Zdecyduj, które jony są interesujące dla tandemowej fragmentacji masy (MS/MS); sygnał widm masowych, który jest > 1,0 x 10,5, jest wystarczający do wyboru jonów dla MS/MS.</li>
	<li>Utwórz nowy plik metody z listą dołączania m/z z dokładnością do 4 miejsc po przecinku. Kliknij Listy globalne i Włączenie. W obszarze Właściwości PRM wybierz energię fragmentacji [np. znormalizowana energia zderzenia (NCE) 30 - 50 to dobry zakres na początek] i inne parametry MS/MS.
	<ol>
		<li>Aby uzyskać dane MS/MS dla alkaloidów mesembrynowych, należy rozdrobnić następujące jony, 276.1583 m/z, 290.1742 m/z i 292.1897 m/z, przy NCE 35. 
		UWAGA: Akwizycja danych MS/MS może być przeprowadzona natychmiast po MS lub w późniejszym czasie. Ta sama tkanka może często pozostać zaciśnięta po pełnym stwardnieniu rozsianym i może być ponownie wykorzystana do pozyskania danych dotyczących stwardnienia rozsianego/stwardnienia rozsianego. Jeśli jednak ponowne rozpylanie nie zapewni wystarczającego sygnału, należy użyć nowej tkanki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Załaduj plik metody MS/MS i nazwany plik danych. Włącz system MS i zacznij zbierać dane, w razie potrzeby dodając rozpuszczalnik. Po zebraniu odpowiednich widm, zwykle po 30 - 60 s, należy przerwać akwizycję.</li>
	<li>Zbieraj fragmentację przy wielu różnych energiach podczas przypisywania jonów fragmentów. 
	UWAGA: Ponieważ spray do liści MS nie ma separacji chromatograficznej, widma fragmentacji mogą zawierać wiele jonów, a fragmentacja przy różnych energiach pomoże uzyskać jasność.</li>
</ol>
6. Przypuszczalna identyfikacja na podstawie dokładnej fragmentacji masy i tandemu
<ol>
	<li>Dokonaj przypuszczalnej identyfikacji, odwołując się do dokładnych pomiarów masy z publicznie dostępnych baz danych metabolitów, takich jak Metlin21, Human Metabolome Database22, Mass Bank23, Lipid Maps24, National Institute of Standards and Technology MS Search25, ReSpect for Phytochemicals26, lub GNPS27.</li>
	<li>Ponieważ te bazy danych nie są wyczerpujące, należy przeprowadzić dodatkowy przegląd literatury na temat gatunków roślin scharakteryzowanych chemicznie jako konieczne.</li>
	<li>Należy dopasować jony fragmentacyjne z oprysku do liści MS/MS do wyżej wymienionych baz danych, gdy dostępne są informacje na temat MS/MS, lub do literatury. Alternatywnie można zastosować ręczną interpretację jonów fragmentacyjnych MS/MS lub fragmentację autentycznego wzorca przeprowadzoną przez wtrysk bezpośredni lub LC-MS/MS.</li>
</ol>
7. Analiza danych
<ol>
	<li>Konwertuj pliki MS raw na pliki mzXML za pomocą narzędzia msConvert z Proteowizard28.</li>
	<li>Użyj pakietu oprogramowania XCMS zaimplementowanego w języku R do pobierania szczytowego. Do analizy MS sprayu do liści należy stosować metodę bezpośredniego przetwarzania naparu. 
	UWAGA: Dobrze oznaczone skrypty używane do przetwarzania danych można znaleźć pod adresem https://github.com/HegemanLab/Leaf-Spray-Code.</li>
	<li>Aby uzyskać pomiary półilościowe, uwzględniające zmienność eksperymentalną, należy znormalizować intensywność każdego metabolitu przez całkowity prąd jonowy (TIC), ponieważ intensywność sygnału MS oprysku do liści może się różnić, częściowo z powodu niewielkich różnic w położeniu liścia w źródle oraz różnic w kształcie i wielkości liścia.</li>
	<li>Alternatywnie można użyć oprogramowania dostarczonego przez dostawcę do analizy danych lub MZmine2 (które można znaleźć pod adresem http://mzmine.github.io/)29.</li>
</ol>

<ol><li>Pitt, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+and+applications+of+liquid+chromatography+-+mass+spectrometry+in+clinical+biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22The+Clinical+Biochemist+Reviews%22%5BJournal%5D)">Principles and applications of liquid chromatography - mass spectrometry in clinical biochemistry.</a> The Clinical Biochemist Reviews. 30 (1), 19-34 (2009).</li>
<li>Cooks, R. G., Ouyang, Z., Takats, Z., Wiseman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+technologies.+Ambient+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Detection technologies. Ambient mass spectrometry.</a> Science. 311 (5767), 1566-1570 (2006).</li>
<li>Kim, H. K., Verpoorte, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+preparation+for+plant+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemical+Analysis%22%5BJournal%5D)">Sample preparation for plant metabolomics.</a> Phytochemical Analysis. 21 (1), 4-13 (2010).</li>
<li>Takats, Z., Wiseman, J. M., Gologan, B., Cooks, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+sampling+under+ambient+conditions+with+desorption+electrospray+ionization%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry sampling under ambient conditions with desorption electrospray ionization.</a> Science. 306 (5695), 471-473 (2004).</li>
<li>Liu, J., Wang, H., Cooks, R. G., Ouyang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leaf+spray%3A+direct+chemical+analysis+of+plant+material+and+living+plants+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Leaf spray: direct chemical analysis of plant material and living plants by mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 83 (20), 7608-7613 (2011).</li>
<li>Chan, S. L. -F., Wong, M. Y. -M., Tang, H. -W., Che, C. -M., Ng, K. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-spray+ionization+mass+spectrometry+for+raw+herb+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Tissue-spray ionization mass spectrometry for raw herb analysis.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 25 (19), 2837-2843 (2011).</li>
<li>Wang, H., Liu, J., Cooks, R. G., Ouyang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paper+spray+for+direct+analysis+of+complex+mixtures+using+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Paper spray for direct analysis of complex mixtures using mass spectrometry.</a> Angewandte Chemie International Edition. 49 (5), 877-880 (2010).</li>
<li>Liu, J., Wang, H., Cooks, R. G., Ouyang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leaf+spray%3A+Direct+chemical+analysis+of+plant+material+and+living+plants+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Leaf spray: Direct chemical analysis of plant material and living plants by mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 83 (20), 7608-7613 (2011).</li>
<li>Malaj, N., Ouyang, Z., Sindona, G., Cooks, R. G. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2012/ay/c2ay25222h">Analysis of pesticide residues by leaf spray mass spectrometry.</a> Analytical Methods. 4 (7), 1913-1919 (2012).</li>
<li>Snyder, D. T., Schilling, M. C., Hochwender, G., Kaufman, A. D. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2015/ay/c4ay02639j">Analytical methods profiling phenolic glycosides in Populus deltoides and Populus grandidentata by leaf spray ionization tandem mass spectrometry.</a> Analytical Methods. 7 (3), 870-876 (2015).</li>
<li>Falcone, C. E., Cooks, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+recognition+of+emerald+ash+borer+infestation+using+leaf+spray+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Molecular recognition of emerald ash borer infestation using leaf spray mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 30 (11), 1304-1312 (2016).</li>
<li>Liu, J., Gu, Z., Yao, S., Zhang, Z., Chen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+analysis+of+Callicarpa+L.+using+direct+spray+ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+and+Biomedical+Analysis%22%5BJournal%5D)">Rapid analysis of Callicarpa L. using direct spray ionization mass spectrometry.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 124, 93-103 (2016).</li>
<li>Freund, D. M., Martin, A. C., Cohen, J. D., Hegeman, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+detection+of+surface+localized+specialized+metabolites+from+Glycyrrhiza+lepidota+%28American+licorice%29+by+leaf+spray+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Direct detection of surface localized specialized metabolites from Glycyrrhiza lepidota (American licorice) by leaf spray mass spectrometry.</a> Planta. 247 (1), 267-275 (2018).</li>
<li>Smith, M. T., Crouch, N. R., Gericke, N., Hirst, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psychoactive+constituents+of+the+genus+Sceletium+N.E.Br.+and+other+Mesembryanthemaceae%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ethnopharmacology%22%5BJournal%5D)">Psychoactive constituents of the genus Sceletium N.E.Br. and other Mesembryanthemaceae: a review.</a> Journal of Ethnopharmacology. 50 (3), 119-130 (1996).</li>
<li>Gerickea, N., Viljoen, A. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18761074">Sceletium-a review update.</a> Journal of Ethnopharmacology. 119 (3), 653-663 (2008).</li>
<li>Terburg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+effects+of+Sceletium+tortuosum+%28Zembrin%29%2C+a+dual+5-HT+reuptake+and+PDE4+inhibitor%2C+in+the+human+amygdala+and+its+connection+to+the+hypothalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Acute effects of Sceletium tortuosum (Zembrin), a dual 5-HT reuptake and PDE4 inhibitor, in the human amygdala and its connection to the hypothalamus.</a> Neuropsychopharmacology. 38 (13), 2708-2716 (2013).</li>
<li>Coetzee, D. D., López, V., Smith, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-mesembrine+Sceletium+extract+%28TrimesemineTM%29+is+a+monoamine+releasing+agent%2C+rather+than+only+a+selective+serotonin+reuptake+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ethnopharmacology%22%5BJournal%5D)">High-mesembrine Sceletium extract (TrimesemineTM) is a monoamine releasing agent, rather than only a selective serotonin reuptake inhibitor.</a> Journal of Ethnopharmacology. 177, 111-116 (2016).</li>
<li>Shikanga, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+permeation+of+mesembrine+alkaloids+from+Sceletium+tortuosum+across+porcine+buccal%2C+sublingual%2C+and+intestinal+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Planta+Medica%22%5BJournal%5D)">In vitro permeation of mesembrine alkaloids from Sceletium tortuosum across porcine buccal, sublingual, and intestinal mucosa.</a> Planta Medica. 78 (3), 260-268 (2012).</li>
<li>Pulliam, C. J., Bain, R. M., Wiley, J. S., Ouyang, Z., Cooks, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+in+the+home+and+garden%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+The+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry in the home and garden.</a> Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 26 (2), 224-230 (2015).</li>
<li>Lawton, Z. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+validation+of+a+portable+mass+spectrometer+featuring+interchangeable%2C+ambient+ionization+sources%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Analytical validation of a portable mass spectrometer featuring interchangeable, ambient ionization sources.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 28 (6), 1048-1059 (2017).</li>
<li>Metlin. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://metlin.scripps.edu">http://metlin.scripps.edu</a> (2018).</li>
<li>Human Metabolome Database. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.hmdb.ca/">http://www.hmdb.ca/</a> (2018).</li>
<li>Mass Bank. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.massbank.jp/?lang=en">http://www.massbank.jp/?lang=en</a> (2018).</li>
<li>Lipid Maps. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.lipidmaps.org/data/standards/index.html">http://www.lipidmaps.org/data/standards/index.html</a> (2018).</li>
<li>National Institute of Standards and Technology MS Search. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://chemdata.nist.gov/mass-spc/ms-search/">http://chemdata.nist.gov/mass-spc/ms-search/</a> (2018).</li>
<li>ReSpect. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://spectra.psc.riken.jp/">http://spectra.psc.riken.jp/</a> (2018).</li>
<li>GNPS. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://gnps.ucsd.edu/">https://gnps.ucsd.edu/</a> (2018).</li>
<li>Chambers, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cross-platform+toolkit+for+mass+spectrometry+and+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics.</a> Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).</li>
<li>Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Ore, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MZmine2%3A+modular+framework+for+processing%2C+visualizing%2C+and+analyzing+mass+spectrometry-based+molecular+profile+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MZmine2: modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data.</a> BMC Bioinformatics. 11, 395(2010).</li>
<li>Meyer, G. M. J., Wink, C. S. D., Zapp, J., Maurer, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GC-MS%2C+LC-MS%28n%29%2C+LC-high+resolution-MS%28n%29%2C+and+NMR+studies+on+the+metabolism+and+toxicological+detection+of+mesembrine+and+mesembrenone%2C+the+main+alkaloids+of+the+legal+high+%26%2334%3BKanna%26%2334%3B+isolated+from+Sceletium+tortuosum%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">GC-MS, LC-MS(n), LC-high resolution-MS(n), and NMR studies on the metabolism and toxicological detection of mesembrine and mesembrenone, the main alkaloids of the legal high &#34;Kanna&#34; isolated from Sceletium tortuosum.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (3), 761-778 (2015).</li>
<li>Zhang, N., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/Content/ArticleHtml/2013/AY/c3ay00018d">Rapid detection of polyhydroxylated alkaloids in mulberry using leaf spray mass spectrometry.</a> Analytical Methods. 5 (10), 2455-2460 (2013).</li>
<li>Pereira, I., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2016/ay/c6ay01154c">Rapid screening of agrochemicals by paper spray ionization and leaf spray mass spectrometry: which technique is more appropriate?</a> Analytical Methods. 8, 6023-6029 (2016).</li>
<li>Zhang, J. I., Li, X., Cooks, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+analysis+of+steviol+glycosides+from+Stevia+leaves+by+ambient+ionization+mass+spectrometry+performed+on+whole+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22The+Analyst%22%5BJournal%5D)">Direct analysis of steviol glycosides from Stevia leaves by ambient ionization mass spectrometry performed on whole leaves.</a> The Analyst. 137 (13), 3091-3098 (2012).</li>
<li>Freund, D. M., Hegeman, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+stable+isotope-enabled+mass+spectrometry-based+plant+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Recent advances in stable isotope-enabled mass spectrometry-based plant metabolomics.</a> Current Opinion in Biotechnology. 43, 41-48 (2017).</li>
<li>Wurtzel, E. T., Kutchan, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+metabolism%2C+the+diverse+chemistry+set+of+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Plant metabolism, the diverse chemistry set of the future.</a> Science. 353 (6305), 1232-1236 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Skuteczne zastosowanie tego protokołu opiera się na optymalizacji różnych etapów dla gatunku rośliny, typu tkanki i związku docelowego (związków) będących przedmiotem zainteresowania. Dobrym punktem wyjścia są parametry opisane w protokole. Należy podjąć i przetestować następujące decyzje eksperymentalne: czy użyć (1) przeciętej lub nieprzeciętej tkanki oraz (2) rozpuszczalnika lub jego braku, (3) jakiego rozpuszczalnika użyć i w jakiej objętości, (4) jaka powinna być odległość tkanki od wlotu jonów oraz (5) amplitudy na...

Rośliny zawierają szeroki zakres małych molekuł o różnych właściwościach chemicznych. MS jest potężną techniką analizy związków roślinnych, ponieważ może zapewnić kompozycje pierwiastkowe o wysokiej czułości i swoistości do wykrywania i identyfikacji metabolitów1. Najczęściej MS przeprowadza się na próbkach ekstrahowanych rozpuszczalnikiem, które są rozdzielane za pomocą chromatografii przed analizą MS1. Jednak zastosowanie chromatografii cieczowej (LC) wymaga długiego czasu analizy i często wiąże się z intensywnym przygotowaniem próbki1. W przeciwieństwie do tego, bezpośrednia analiza chemiczna nienaruszonych tkanek, która omija chromatografię, jest bardzo szybką techniką, wymagającą minimalnego przygotowania próbki2. Tak więc w przypadkach, w których można zrezygnować z etapów chromatograficznych, bezpośrednia analiza chemiczna może być bardzo korzystna.
Typowy LC-MS dla produktów naturalnych i badań metabolomicznych opiera się na długotrwałych, masowych ekstrakcjach suszonych lub mrożonych materiałów roślinnych zawierających wiele tkanek i typów komórek3. Alternatywnie, bezpośrednia analiza chemiczna, taka jak wykrywanie metabolitów z tkanki roślinnej przez MS, może wyizolować typy komórek i uniknąć artefaktów przygotowania4. Spray do liści MS, określany również jako tissue-spray5,6, to technika bezpośredniej jonizacji MS w otoczeniu, która zasadniczo nie wymaga przygotowania próbki5,7. Spray do liści MS jest ściśle spokrewniony z MS w sprayu papierowym, techniką jonizacji otoczenia o cechach jonizacji elektrorozpylającej, która pozwala na wykrywanie analitów osadzonych na papierze7. Pomimo nazwy, spray do liści MS ma zastosowanie do różnych typów tkanek roślinnych, nie tylko liści, i został zademonstrowany między innymi na owocach, nasionach, korzeniach, tkankach kwiatowych i bulwach6,8,9,10,11,12. Technika ta ułatwia jonizację endogennych fitochemikaliów bezpośrednio z materiałów roślinnych do spektrometru mas w celu detekcji8. Spray do liści MS może również dostarczyć informacji o przestrzennym rozmieszczeniu substancji chemicznych w różnych typach tkanek w roślinach13. Gdy oprysk do liści MS zostanie porównany z ekstrakcją rozpuszczalnikiem i LC-MS, wyniki sugerują, że oprysk do liści MS pozwala na szybkie wykrycie metabolitów powierzchniowych z unikalnych typów komórek, takich jak trichomy13. Rysunek 1 ilustruje eksperymentalną konfigurację MS z opryskiem do liści. Bezpośrednia jonizacja elektronrozpylania następuje już po niewielkich modyfikacjach źródła. Wysokie napięcie jest przykładane do tkanki roślinnej za pomocą metalowego zacisku, wytwarzając rozpylanie silnie naładowanych kropelek tworzących stożek Taylora, który przenosi jony do wlotu jonów MS. Jonizacja elektronatryskowa następuje z naturalnej cieczy rośliny lub z rozpuszczalnika nałożonego na powierzchnię rośliny. Spiczasta końcówka na tkance ułatwia elektrorozpylanie i może występować naturalnie lub powstać w wyniku cięcia.
Spray do liści MS to szybka metoda jakościowej i półilościowej analizy nienaruszonych tkanek roślinnych, która znalazła zastosowanie w szerokiej gamie zastosowań. Na przykład technika ta została wykorzystana do wykrywania związków endogennych w celu rozróżnienia spokrewnionych gatunków, a nawet do oceny zmian w tych samych gatunkach uprawianych w różnych warunkach. Wcześniejsze badania wykazały to podejście poprzez pomiar metabolitów w borówkach piękności (Callicarpa L.)12 i żeń-szeń amerykański (Panax quinquefolium L.)6. W tym ostatnim przykładzie ginsenozydy, aminokwasy i oligosacharydy można było wykryć po zwilżeniu surowej tkanki żeń-szenia. Dziki i uprawiany żeń-szeń amerykański został odróżniony od plastrów bulw6. Integralność bulw żeń-szenia została zachowana po oprysku z liści MS, co pozwoliło na późniejszą kontrolę morfologiczną i mikroskopową6. Ponadto można również wykryć związki egzogenne w próbkach roślin. Na skórkach lub miąższu owoców i warzyw wykryto szereg pestycydów (acetamipryd, difenyloamina, imazalil, linuron i tiabendazol) na skórkach lub miąższu owoców i warzyw9. Chociaż te i wiele innych badań wykazały przydatność sprayu do liści MS do różnych konkretnych celów, szczegółowy protokół nie został wcześniej zgłoszony.
Tutaj opis protokołu nie będzie skupiał się na optymalizacji metody dla konkretnej tkanki lub związku. Wykrywanie alkaloidów mesembryny z Sceletium tortuosum (L.) N.E.Br. (Aizoaceae) służy raczej jako przykład do omówienia niezbędnych środków optymalizacyjnych, które należy podjąć podczas przygotowywania eksperymentu z opryskiem do liści MS dla gatunku, tkanki lub związku (związków) po raz pierwszy. S. tortuosum jest soczystym gatunkiem endemicznym dla półpustynnego regionu Karroo w Republice Południowej Afryki. Tradycyjna medycyna ludów San i Khoi Khoi, była używana do tłumienia apetytu i pragnienia, a także ze względu na swoje działanie psychotropowe i przeciwbólowe14,15. Obecnie standaryzowane ekstrakty są stosowane w leczeniu zaburzeń neuropsychiatrycznych i neuropsychologicznych16,17. Do głównych interesujących związków należy alkaloid mesembryna i jej pochodne, z których wiele znajduje się również w pokrewnych gatunkach Sceletium15. Zarówno dzikie, jak i uprawne populacje S. tortuosum mają zmienne stężenia alkaloidów mesembryny, co stanowi wyzwanie dla kontroli jakości18. Metoda szybkiego wykrywania alkaloidów mesembryny, takich jak spray do liści MS, może być przydatna w monitorowaniu produktów Sceletium. Ponieważ wcześniej nie istniał szczegółowy wizualny protokół eksperymentalny dla techniki opryskiwania liści MS, zilustrujemy metodę na przykładzie S. tortuosum i opiszemy: modyfikację źródła nanoaerozolu, selekcję i przygotowanie tkanek roślinnych, pozyskiwanie danych, interpretację wyników, oraz optymalizacja parametrów MS.

<table><tbody><tr><td>Pin połączeniowy</td><td>Pin Digi-Key elctronics</td><td>WM2563CT-ND</td><td>pin zostanie włożony do źródła Thermo Scientific, aby zapewnić napięcie</td></tr><tr><td>mały zacisk</td><td>Digi-Key elctronics</td><td>314-1018-ND</td><td>CLIP MICRO ALIGATOR COPPER 5A</td></tr><tr><td>duży zacisk</td><td>Digi-Key elctronics</td><td>290-1951-ND</td> ZACISK <td>KROKODYLKOWY WĄSKI NIKIEL 5A</td></tr><tr><td>Koszulka termokurczliwa</td><td>Digi-Key elctronics</td><td>Q2Z1-KIT-ND</td><td>do pokrywa złącza lutownicze</td></tr><tr><td>NSI źródło Nanospray Źródło jonów</td><td>Thermo scientific</td><td>NA</td><td>Inna marka będzie działać, jeśli nie używasz instrumentu Thermo</td></tr><tr><td>Q Exactive - hybrydowy kwadrupol Orbitrap</td><td>Thermo scientific</td><td>NA</td><td>Inna marka będzie działać, jeśli nie używasz instrumentu</td></tr><tr><td>Thermo Tune Software</td><td>Thermo scientific</td><td></td><td>Inna marka będzie działać, jeśli nie używasz instrumentu Thermo</td></tr><tr><td>Xcalibur Software</td><td>Thermo scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zakład zainteresowania - S. tortousum</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

spektrometria mas oprysków liściowych: technika szybkiej jonizacji otoczenia do bezpośredniej oceny metabolitów z tkanek roślinnych

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Rośliny produkują tysiące małych molekuł, które różnią się pod względem właściwości chemicznych. Spektrometria mas (MS) jest potężną techniką analizy metabolitów roślinnych, ponieważ zapewnia masy cząsteczkowe o wysokiej czułości i swoistości. Spray do liści MS to technika jonizacji otoczenia, w której tkanka roślinna jest wykorzystywana do bezpośredniej analizy chemicznej za pomocą elektrorozpylania, eliminując chromatografię z procesu. Takie podejście do pobierania próbek metabolitów pozwala na jednoczesne wykrywanie szerokiego zakresu klas chemicznych z nienaruszonych tkanek roślinnych, minimalizując ilość potrzebnego przygotowania próbki. W przypadku stosowania z precyzyjną masą MS o wysokiej rozdzielczości, spray do liści MS ułatwia szybkie wykrywanie metabolitów będących przedmiotem zainteresowania. Za pomocą tej techniki możliwe jest również zbieranie danych o fragmentacji masy w tandemie, aby ułatwić identyfikację związku. Połączenie dokładnych pomiarów masy i fragmentacji jest korzystne w potwierdzaniu tożsamości związków. Technika opryskiwania liści MS wymaga jedynie niewielkich modyfikacji źródła jonizacji nanosprayu i jest użytecznym narzędziem do dalszego rozszerzania możliwości spektrometru masowego. Tutaj analizowana jest świeża tkanka liści Sceletium tortuosum (Aizoaceae), tradycyjnej rośliny leczniczej z Afryki Południowej; liczne alkaloidy mesembryny są wykrywane za pomocą sprayu do liści MS.

W 10. tygodniu po kiełkowaniu, świeżo zebrane liście S. tortuosum wyhodowane w szklarni zostały poddane analizie metodą leaf spray MS. Schemat procesu eksperymentalnego wykrywania metabolitów z liści S. tortuosum z wykorzystaniem metody leaf spray MS przedstawiono na Rysunku 2. Wybrano liść, wycięto z niego wąski pasek z zwężonym końcem w celu uformowania ostrza, a następnie przymocowano go za pomocą aparatury zaciskowej do leaf spray MS. Tk...

Spektrometria mas w sprayu z liści to technika bezpośredniej analizy chemicznej, która minimalizuje przygotowanie próbki i eliminuje chromatografię, pozwalając na szybkie wykrywanie małych cząsteczek z tkanek roślinnych.

Spektrometria mas oprysków liściowych: technika szybkiej jonizacji otoczenia do bezpośredniej oceny metabolitów z tkanek roślinnych

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Oprysk do liści MS to szybka metoda analizy jakościowej i półilościowej nienaruszonych tkanek roślinnych, która ma szeroki zakres zastosowań. Główną zaletą tej techniki jest to, że tkanka roślinna może być analizowana bezpośrednio, praktycznie bez przygotowania próbki. Chociaż metoda ta zapewnia dobry wgląd w alkaloidy mesembryny ze Sceletium, może być również stosowana do analizy różnych innych gatunków roślin i egzogennych substancji chemicznych, takich jak pestycydy.Osoby, które są nowicjuszami w tej metodzie, mogą uznać ją za wyzwanie, ponieważ konieczna jest optymalizacja protokołu dla każdego gatunku rośliny, rodzaju tkanki i związku będącego przedmiotem zainteresowania. Użyj zmodyfikowanego źródła nano sprayu do opryskiwania liści, MS.As do opryskiwania liści nie są potrzebne żadne składniki płynne do opryskiwania liści, zmodyfikuj źródło, usuwając sondę chromatografii cieczowej ze źródła. Drut do spektrometrii mas w sprayu do liści, który będzie przykładał napięcie do tkanki roślinnej, ma kołek, który został przylutowany do drutu na jednym końcu i zacisk, który został przylutowany na drugim końcu.Jeśli system był ostatnio używany, pozwól mu ostygnąć w dotyku przed usunięcie

leaf-spray-mass-spectrometry-rapid-ambient-ionization-technique-to

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Laserowa ablacja z jonizacją elektrosprayową (LAESI) jest źródłem jonów dla spektrometrii mas pracującym pod ciśnieniem atmosferycznym. W trybie obrazowania laser średniofalowy w podczerwieni bada rozkład cząsteczek w przekroju tkanki lub biofilmie. Technika ta stanowi nowe podejście do różnorodnych badań bioanalitycznych prowadzonych w natywnych warunkach doświadczalnych.

Obrazowanie molekularne tkanek biologicznych i biofilmów w ciśnieniu atmosferycznym przy użyciu spektrometrii mas LAESI

Nieukierunkowana metabolomika dostarcza hipotezy generującej migawkę profilu metabolicznego.  Protokół ten zademonstruje ekstrakcję i analizę metabolitów z komórek, surowicy lub tkanki.  Szereg metabolitów jest badany za pomocą ekstrakcji ciecz-faza cieczowa, ultraprzepływowej chromatografii cieczowej/spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości (UPLC-HRMS) w połączeniu z oprogramowaniem do analizy różnicowej.

Nieukierunkowana metabolomika ze źródeł biologicznych przy użyciu ultrasprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości (UPLC-HRMS)

Obrazowanie metodą spektrometrii mas (MSI) to potężne narzędzie, które może być używane do odkrywania i identyfikowania różnych związków chemicznych w nienaruszonych tkankach, zachowując związki w ich naturalnym środowisku, co może dostarczyć nowych informacji na temat procesów biologicznych. W niniejszym artykule opisano metodę MSI opracowaną do analizy małych cząsteczek.

Obrazowanie metodą spektrometrii mas MALDI, do badania metabolitów w guzkach korzeniowych Medicago truncatula

Przedstawiono metodę identyfikacji gatunków materiału botanicznego poprzez bezpośrednią analizę w czasie rzeczywistym - spektrometria mas o wysokiej rozdzielczości i wielowymiarowa analiza statystyczna.

Szybka, wysokoprzepustowa identyfikacja gatunków materiału botanicznego za pomocą bezpośredniej analizy w czasie rzeczywistym Spektrometria mas o wysokiej rozdzielczości

Przedstawiono protokół kompleksowej ekstrakcji lipidów, metabolitów i białek z tkanek biologicznych przy użyciu jednej próbki.

Prosta metoda ekstrakcji frakcjonowanej do kompleksowej analizy metabolitów, lipidów i białek z pojedynczej próbki

Ekstrakcja gazowana to nowa technika laboratoryjna do analizy związków lotnych i półlotnych. Gaz nośny rozpuszcza się w ciekłej próbce poprzez zastosowanie nadciśnienia i wymieszanie próbki. Komora na próbkę jest następnie dekompresowana. Gatunki analitów są uwalniane do fazy gazowej w wyniku musowania.

Ekstrakcja gazowana lotnych związków organicznych w połączeniu z ciśnieniem atmosferycznym Jonizacja chemiczna Kwadrupolowa spektrometria mas

Ten protokół opisuje pojedynczą przepustowość dla uzupełniających technik analitycznych i omicznych, której kulminacją jest w pełni sparowana charakterystyka naturalnej materii organicznej i proteomiki mikrobiologicznej w różnych ekosystemach. Podejście to pozwala na solidne porównania w celu identyfikacji szlaków i przemian metabolicznych ważnych dla opisu produkcji gazów cieplarnianych i przewidywania reakcji na zmiany środowiskowe.

Jednoprzepustowe komplementarne techniki analityczne o wysokiej rozdzielczości do charakteryzowania złożonych mieszanin naturalnej materii organicznej

Ten artykuł przedstawia metody przygotowania próbek dla unikalnej metody analitycznej w czasie rzeczywistym opartej na spektrometrii mas otoczenia. Metoda ta pozwala nam na przeprowadzanie analizy cząsteczek biologicznych in vivo w czasie rzeczywistym bez konieczności przeprowadzania specjalnych zabiegów wstępnych.

Przygotowanie próbki do spektrometrii mas z jonizacją elektrorozpylania sondy

Przedstawiono metodę nieukierunkowanej analizy metabolitów i lipidów w ziarnie pszenicy. Protokół obejmuje metodę ekstrakcji metabolitu acetonitrylu oraz metodologię chromatografii cieczowej z odwróconą fazą i spektrometrią mas, z akwizycją w dodatnich i ujemnych trybach jonizacji elektrorozpylanej.

Nieukierunkowana chromatografia cieczowa i analiza metabolomiczna ziarna pszenicy oparta na spektrometrii mas

Ta metoda wykorzystuje obrazowanie metodą spektrometrii mas (MSI) do zrozumienia procesów metabolicznych w liściach S. alba po wystawieniu na działanie ksenobiotyków. Metoda pozwala na przestrzenną lokalizację interesujących związków i ich przewidywanych metabolitów w określonych, nienaruszonych tkankach.

Badanie metabolizmu ksenobiotyków w liściach Salix alba za pomocą obrazowania metodą spektrometrii mas

Opracowana metoda znakowania 13C6-Glucose w połączeniu z chromatografią cieczową o wysokiej rozdzielczości spektrometrią mas jest wszechstronna i stanowi podstawę do przyszłych badań nad pierwotnymi organami i szlakami zaangażowanymi w syntezę metabolitów wtórnych w roślinach leczniczych, jak również kompleksowe wykorzystanie tych wtórnych metabolitów.

13C6-Znakowanie glukozy związane z LC-MS: Identyfikacja pierwotnych organów roślinnych w syntezie metabolitów wtórnych

Poznaj spektrometrię mas oprysków liściowych do bezpośredniej analizy tkanek roślinnych bez przygotowania próbek. Ta metoda umożliwia szybką detekcję alkaloidów i pestycydów.

Spektrometria mas oprysków liściowych: technika szybkiej jonizacji otoczenia do bezpośredniej oceny metabolitów z tkanek roślinnych (Wideo) | JoVE Journal

Spektrometria mas oprysków liściowych: technika szybkiej jonizacji otoczenia do bezpośredniej oceny metabolitów z tkanek roślinnych

Przeglądaj więcej filmów