Cyfrowy PCR do ilościowego oznaczania krążących mikroRNA w ostrym zawale mięśnia sercowego i chorobach sercowo-naczyniowych
3 lipca 2018
Krążące mikroRNA okazały się obiecujące jako biomarkery chorób sercowo-naczyniowych i ostrych zawałów mięśnia sercowego. W tym badaniu opisujemy protokół ekstrakcji miRNA, odwrotnej transkrypcji i cyfrowego PCR w celu bezwzględnej kwantyfikacji miRNA w surowicy pacjentów z chorobami sercowo-naczyniowymi.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie diagnostyki, takie jak to, czy mikro RNA są ważnymi biomarkerami w chorobach sercowo-naczyniowych. W porównaniu z ilościowym PCR w czasie rzeczywistym, cyfrowy PCR wykazuje lepsze właściwości techniczne w zakresie ilościowego oznaczania mikroRNA w krążeniu. Ponieważ próbka jest podzielona na około 20 000 kropel, nie są konieczne żadne podwójne pomiary, a do oceny ilościowej nie jest potrzebna standardowa krzywa.
Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat kwantyfikacji mikroRNA u pacjentów z chorobami sercowo-naczyniowymi, może być również stosowana u innych pacjentów i chorób, ponieważ inne mikroRNA okazały się obiecujące jako biomarkery progresji raka, może być również stosowana u pacjentów onkologicznych. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności, ponieważ generowane kropelki są delikatne i należy obchodzić się z nimi ostrożnie. Po wyizolowaniu RNA z próbek surowicy kontynuuj odwrotną transkrypcję, aby uzyskać bardziej stabilne komplementarne DNA dla dPCR.
Na początek rozmrozić zestaw do odwrotnej transkrypcji na lodzie. Następnie odkręć enzymy i startery. Następnie przygotuj mieszankę wzorcową zgodnie z opisem w protokole tekstowym.
Połącz 10 mikrolitrów mieszanki głównej z pięcioma mikrolitrami wyekstrahowanego RNA w każdym dołku 96-dołkowej płytki. Następnie odwirować płytkę w temperaturze 2 000 x g w czterech stopniach Celsjusza przez dwie minuty. Kontynuuj transkrypcję wsteczną zgodnie z opisem w protokole tekstowym.
Najpierw rozmrozić komercyjną mieszankę dPCR, cDNA i startery PCR na lodzie i odwirować bezpośrednio przed użyciem. Następnie przygotuj mieszankę wzorcową zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Dodaj 1,33 mikrolitra objętości produktu do odwrotnej transkrypcji do 18,67 mikrolitrów objętości mieszanki głównej i krótko odwirować.
Za pomocą pipety przenieś 20 mikrolitrów próbki do każdej studzienki w rzędzie pożywki kasety z ośmioma dołkami. Następnie wlej 70 mikrolitrów oleju wytwarzającego kropelki do szybów naftowych kasety. Następnie umieść uszczelkę na górze kasety i umieść ją w generatorze kropel.
Zamknij generator kropel i poczekaj, aż trzy kontrolki zaświecą się na zielono. Za pomocą pipety ostrożnie przenieś 40 mikrolitrów próbki uformowanej w krople do oddzielnych studzienek 96-dołkowej płytki. Następnie uszczelnij płytkę folią dPCR w temperaturze 180 stopni Celsjusza na cztery sekundy.
Umieść zapieczętowaną płytkę PCR w cyklerze i postępuj zgodnie z instrukcjami dotyczącymi jazdy na rowerze przedstawionymi w protokole tekstowym. Wyjmij płytkę z termocyklera i przenieś ją na podstawę uchwytu na talerze. Następnie umieść górną część uchwytu płytki na płytce PCR.
Na koniec uruchom komercyjne oprogramowanie dPCR. W tym protokole wykorzystano cyfrowy PCR do ilościowego oznaczania mikroRNA w surowicy pacjentów z chorobami sercowo-naczyniowymi. Próbki pobrano od 16 pacjentów przed, osiem godzin po i 16 godzin po interwencji przezskórnej.
Pacjenci z zawałem mięśnia sercowego z uniesieniem odcinka ST wykazywali znaczny wzrost poziomu miR-499 w porównaniu z pacjentami ze stabilną chorobą wieńcową. Po opanowaniu tę technikę można wykonać w ciągu około godziny w celu utworzenia kropelek z 96 próbek, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o ostrożnym obchodzeniu się z kropelkami.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak prawidłowo wykonać cyfrowy PCR, poprzez prawidłowe tworzenie kropel, cykl, czytanie i analizowanie.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia protokół ekstrakcji i ilościowego wyznaczania krążących mikroRNA jako potencjalnych biomarkerów chorób układu krążenia. Dzięki zastosowaniu cyfrowej PCR metoda ma na celu poprawę dokładności pomiaru miRNA w próbkach surowicy pacjentów z chorobami układu krążenia.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Choroba układu krążenia
- Biomarkery
- Analiza mikroRNA
Tło
- MikroRNA to małe niekodujące RNA zaangażowane w regulację genów.
- Wykazały się jako potencjalne biomarkery różnych chorób, w tym chorób układu krążenia.
- Cyfrowa PCR oferuje zalety w stosunku do tradycyjnych metod ilościowego wyznaczania mikroRNA.
- Rozumienie profili miRNA może pomóc w diagnozowaniu i leczeniu chorób układu krążenia.
Cel badania
- Walidacji mikroRNA jako biomarkerów chorób układu krążenia.
- Wykazaniu skuteczności cyfrowej PCR w ilościowym wyznaczaniu krążących miRNA.
- Dostarczeniu niezawodnego protokołu dla badaczy w tej dziedzinie.
Stosowane metody
- Ekstrakcja miRNA z próbek surowicy.
- Odwrotna transkrypcja do syntezy dopełniającego DNA.
- Cyfrowa PCR do bezwzględnego ilościowego wyznaczania miRNA.
- Porównanie cyfrowej PCR z ilościową rzeczywistą czasową PCR.
Główne wyniki
- Cyfrowa PCR wykazała wyższą dokładność w ilościowym wyznaczaniu miRNA.
- Metoda umożliwia analizę tysięcy kropli bez konieczności krzywych standardowych.
- Potencjalne zastosowanie metody rozciąga się poza choroby układu krążenia na inne stany, takie jak rak.
- Zostały zauważone wyzwania w manipulacji delikatnymi kroplami dla nowych użytkowników techniki.
Wnioski
- Badanie potwierdza zastosowanie krążących mikroRNA jako biomarkerów chorób układu krążenia.
- Cyfrowa PCR jest obiecującym narzędziem do precyzyjnego ilościowego wyznaczania miRNA.
- Dalsze badania mogą rozszerzyć zastosowanie tej metody na inne choroby.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantifying circulating microRNAs with digital PCR provides a reproducible, high-sensitivity approach for biomarker validation in cardiovascular disease research. This method supports target validation and assay development by enabling absolute quantification without standard curves, reducing variability in multi-center studies. The technique enhances predictive confidence in early discovery by linking miRNA expression to pathology, informing go/no-go decisions in therapeutic hypothesis interrogation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying disease-specific miRNAs like miR-499 in AMI.
- Operational Value: Provides absolute miRNA copy numbers without standard curves, improving reproducibility across sites.
- Predictive Value: Supports biomarker-led portfolio triage by linking miRNA levels to cardiovascular pathology.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates validated biological systems (cDNA from serum RNA) for downstream screening workflows.
- Operational Value: Delivers high linearity and low variability outputs suitable for assay standardization.
- Scalability: Enables processing of 96 samples in approximately one hour post-mastered, supporting medium-throughput screening.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase miRNA quantification to preclinical validation via disease-relevant serum biomarkers.
- Mechanistic De-risking: Reduces ambiguity in target validation by correlating miRNA expression with cardiovascular injury.
- Biomarker Alignment: Supports translational biomarker development by quantifying miRNAs with high tissue and disease specificity.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification, providing quantitative miRNA data that informs target confidence and assay readiness.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying miRNA release from cardiovascular cells into circulation.
- Screening: Produces assay-ready, standardized outputs with high sensitivity for evaluating biomarker candidates.
- Analytics: Enables direct comparison of miRNA levels across conditions using absolute quantification without standard curves.
- Translational Research: Advances biomarker continuity by linking circulating miRNA profiles to cardiovascular pathology.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable quantification platform applicable across cardiovascular and oncological indications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in biomarker validity through low-variability, high-sensitivity miRNA quantification.
- Operational Value: Ensures reproducibility and standardization via droplet-based partitioning eliminating duplicate measurements.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in biomarker-target relationships.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement through quantitative, pathology-linked miRNA data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA isolation, reverse transcription, and droplet handling to prevent sample loss.
- Needs droplet generation equipment, PCR cyclers, and dPCR software for accurate quantification.
- Demands cross-team standardization of droplet formation and sealing protocols for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when applying to different sample types beyond serum, such as plasma or tissue lysates.
- Includes practical limitations like fragile droplet handling, which may affect throughput for inexperienced users.
