Name: Cyfrowy PCR do ilościowego oznaczania krążących mikroRNA w ostrym zawale mięśnia sercowego i chorobach sercowo-naczyniowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-03T14:45:00.000+00:00
Duration: 4 min 41 s
Description: Poznaj cyfrowy PCR do ilościowego oznaczania krążących mikroRNA jako biomarkerów chorób sercowo-naczyniowych. Ta metoda zapewnia wyższą dokładność niż tradycyjne qPCR bez konieczności stosowania krzywych kalibracyjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy nie mają żadnych podziękowań.

1. Ekstrakcja miRNA z osocza/surowicy
Uwaga: Aby odpowiednio określić ilościowo miRNA, kluczowym krokiem jest prawidłowa izolacja mikroRNA z osocza/surowicy. Kluczową rzeczą, o której należy pamiętać, zwłaszcza że istnieją różne protokoły, jest przestrzeganie tego samego przepływu pracy podczas przetwarzania próbek. W tym protokole miRNA jest ekstrahowane z 50 μl surowicy. Nie używaj więcej niż 200 μl, ponieważ ogranicza to prawidłowy proces ekstrakcji.
<ol>
	<li>Przygotować surowicę lub rozmrozić zamrożone próbki.</li>
	<li>Dodać 250 μl (5 objętości) komercyjnego odczynnika do lizy do 50 μl surowicy. Wspomagaj lizę poprzez wirowanie. Umieść probówkę z lizatem na stole w temperaturze pokojowej na 5 minut.</li>
	<li>Uzupełnij lizat 3,5 μl kontroli kolców (1,6 x 107 kopii/μl) i wymieszaj je przez wirowanie.</li>
	<li>Dodać 50 μl chloroformu (tj. taką samą ilość jak w wyjściowej próbce surowicy) w celu rozdzielenia faz. Energicznie potrząsaj probówką przez 15 sekund. Umieść probówkę na stole w temperaturze pokojowej na 2 - 3 minuty.</li>
	<li>W celu separacji faz odwirować probówkę o sile 12 000 x g w temperaturze 4 °C przez 15 min. 
	Uwaga: Próbki są teraz rozdzielane na górną fazę wodną zawierającą RNA, białą interfazę i dolną, różową fazę organiczną.</li>
	<li>Przenieść górną fazę wodną (100 μl) zawierającą RNA do nowej probówki. Nie przenoś żadnego białego materiału interfazowego, ponieważ fałszuje to prawidłową liczbę RNA.</li>
	<li>Dodać 150 μl (tj. 1,5 razy więcej niż objętość przeniesionej próbki) 100% etanolu. Wymieszaj materiały, pipetując je w górę i w dół. Nie odwiruj ich i szybko przejdź do następnego kroku.</li>
	<li>Pobrać pipetą 250 μl próbki na dostępną w handlu kolumnę wirową w probówce zbiorczej o pojemności 2 ml. Zamknij pokrywę. Odwirować kolumnę przy >8 000 x g w temperaturze pokojowej przez 15 s. Odrzuć przepływ.</li>
	<li>Dodać 700 μl komercyjnego buforu do mycia nr 1 do kolumny wirowej. Zamknij pokrywę i odwiruj kolumnę przy >8 000 x g w temperaturze pokojowej przez 15 s. Wyrzucić przepływowy bufor myjący.</li>
	<li>Dodać 500 μl komercyjnego buforu myjącego nr 2 do kolumny wirowej. Zamknij pokrywę i odwiruj kolumnę przy >8 000 x g w temperaturze pokojowej przez 15 s. Wyrzucić przepływowy bufor myjący.</li>
	<li>Odpipetować 500 μl 80% etanolu do kolumny wirowej. Zamknij pokrywkę, odwiruj kolumnę przy >8 000 x g w temperaturze pokojowej przez 2 minuty. Wyrzuć probówkę zbiorczą z przepływem.</li>
	<li>Przenieść kolumnę wirującą do nowej probówki zbiorczej o pojemności 2 ml. Odwirować kolumnę z pełną prędkością z otwartą pokrywą, aby wysuszyć membranę. Wyrzuć probówkę zbiorczą z przepływem.</li>
	<li>Przenieś kolumnę wirową do nowej probówki zbiorczej o pojemności 1,5 ml. Eluuj RNA, nakładając 30 μl wody wolnej od RNaz bezpośrednio na środek membrany. Zamknij pokrywę. Odwirować kolumnę z pełną prędkością przez 1 minutę.</li>
	<li>Przechowywać RNA w temperaturze -70 °C. 
	Uwaga: Przechowywanie oczyszczonego RNA w wodzie wolnej od RNaz w temperaturze od -70 °C do -20 °C zapewnia brak degradacji RNA przez 1 rok. Zgodnie z protokołem producenta, minimalna ilość wody wolnej od RNaz do rozcieńczenia RNA wynosi 10 μL. Użycie mniej niż 10 μL może niewystarczająco nawodnić błonę i zmniejszyć całkowitą wydajność RNA.</li>
</ol>
2. Odwrotna transkrypcja
Uwaga: Komplementarne DNA (cDNA) zostało zsyntetyzowane przy użyciu następującego protokołu 15 μL odwrotnej transkrypcji (RT) (całkowita objętość reakcji).
<ol>
	<li>Rozmrozić zestaw RT na lodzie. Przechowuj enzymy w zamrażarce tak długo, jak to możliwe, aby zapobiec ich degradacji i odwiruj je przed użyciem. Rozmrozić startery RT na lodzie i odwirować je przed użyciem.</li>
	<li>Przygotować mieszankę wzorcową zgodnie z opisem w tabeli 1.</li>
	<li>Połączyć 10 μl mieszanki głównej i 5 μl wyekstrahowanego RNA na dołek w 96-dołkowej płytce.</li>
	<li>Odwirować płytkę dołka przy 2 000 x g w temperaturze 4 °C przez 2 minuty.</li>
	<li>Do odwrotnej transkrypcji należy użyć protokołu cyklu termicznego opisanego w Tabeli 2. 
	Uwaga: Jak opisano poniżej, cDNA może być bezpośrednio przetwarzane w cyfrowym urządzeniu do PCR (patrz Tabela materiałów); alternatywnie może być przechowywany w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
3. Wytwarzanie kropelek i cyfrowy PCR
Uwaga: Digital PCR został przeprowadzony przy użyciu następującego protokołu 40 μL.
<ol>
	<li>Rozmrozić komercyjną mieszaninę dPCR, przygotowane cDNA i startery PCR na lodzie. Odwiruj je na krótko przed użyciem.</li>
	<li>Przygotować mieszankę wzorcową zgodnie z opisem w tabeli 3.</li>
	<li>Dodać 1,33 μl/dołek produktu RT i krótko odwirować.</li>
	<li>Pobrać pipetę po 20 μl próbki do każdego dołka kasety 8-dołkowej (średni rząd). 
	Uwaga: Jeśli kaseta z 8 dołkami nie jest całkowicie wypełniona, wypełnij pozostałe studzienki kontrolami bez matrycy (NTC), które pomijają cDNA (tj. produkt RT wytwarzany z wodą zamiast wyekstrahowanego RNA) lub komercyjnym buforem dPCR. NTC służy jako kontrola zanieczyszczeń. W pozostałych studniach nie wolno używać wody, ponieważ pogorszy to jakość tworzenia się kropel.</li>
	<li>Odpipetować 70 μl oleju z generacji kropelek do sond do szybów naftowych (dolny rząd) kasety 8-dołkowej.</li>
	<li>Umieść uszczelkę na górze kasety 8-dołkowej i umieść kasetę w generatorze kropel. Zamknij generator kropel. Poczekaj, aż 3 kontrolki zaświecą się na zielono. 
	Uwaga: Kropelki są teraz generowane.</li>
	<li>Ostrożnie i powoli przenieść 40 μl próbki uformowanej kropelkami (górny rząd) do oddzielnych studzienek na płytce 96-dołkowej za pomocą pipetowania.</li>
	<li>Po zakończeniu tworzenia kropel na próbkach należy uszczelnić płytkę PCR folią dPCR do przekłuwania w temperaturze 180 °C przez 4 sekundy.</li>
	<li>Umieścić uszczelnioną folią płytkę PCR w cyklerze i poddać ją cyklicznie zgodnie z opisem w tabeli 4, z szybkością narastania 2,5 °C/s.</li>
</ol>
4. Odczyt i analiza kropelek
<ol>
	<li>Przenieś płytkę z termocyklera na podstawę uchwytu na płytkę. Dokręć płytkę do PCR, umieszczając górną część uchwytu płytki na płytce PCR.</li>
	<li>Uruchom komercyjne oprogramowanie dPCR.</li>
	<li>Wprowadź nazwę próbki, nazwę eksperymentu i cel w konfiguracji. Wybierz bezwzględną kwantyfikację.</li>
	<li>Rozpocznij odczyt kropli, klikając przycisk URUCHOM. Wybierz FAM/HEX lub FAM/VIC jako chemię detekcji podczas pracy z sondami hydrolizy. 
	Uwaga: Komercyjne oprogramowanie dPCR automatycznie przeanalizuje dane.</li>
	<li>Sprawdź liczbę kropel w tabeli wyników, aby upewnić się, że krople są prawidłowo generowane.</li>
	<li>Zaznacz wszystkie dołki z tym samym ilościowo oznaczonym miRNA i kliknij ANALIZUJ. Użyj plamy 2D, aby oznaczyć dodatnie krople i ręcznie skorygować automatycznie analizowane dane (rysunek 1).</li>
</ol>
5. Prawidłowe obliczenia na próbce
<ol>
	<li>Znormalizować próbkę, mnożąc próbkę przez współczynnik normalizacji (NF). 
	NF = mediana [pomiary C. elegans miR-39]wszystkie próbki/[C. elegans miR-39]podana próbka</li>
	<li>Obliczyć końcowe stężenie miRNA w surowicy, dostosowując do współczynników rozcieńczenia (DF). 
	[miRNA]final = [miRNA]wartość surowa x DFRT x DFdPCR x DFEx 
	gdzie: 
	[miRNA]wartość surowa = miRNA oznaczone ilościowo za pomocą komercyjnego oprogramowania dPCR; 
	DFRT = współczynnik rozcieńczenia matrycy w odwrotnej transkrypcji; 
	DFdPCR = współczynnik rozcieńczenia matrycy w dPCR; 
	DFEx = współczynnik rozcieńczenia w ekstrakcji.</li>
</ol>
6. Seria rozcieńczeń syntetycznych oligonukleotydów
<ol>
	<li>Rozmrozić liofilizowany syntetyczny oligonukleotyd na lodzie. Krótko odwirować.</li>
	<li>Rozcieńczyć liofilizowany syntetyczny oligonukleotyd w wodzie wolnej od nukleaz do końcowego stężenia 10 pmol/μL. Krótko odwirować.</li>
	<li>Rozcieńczyć go w wodzie wolnej od nukleaz, jak opisano w Tabeli 5. Odwirować krótko rozcieńczenie między każdym etapem rozcieńczania przy 8 000 x g przez 10 s.</li>
	<li>Kontynuuj odwrotną transkrypcję zgodnie z opisem w kroku 2 i analizuj próbki za pomocą cyfrowego PCR zgodnie z opisem w kroku 3 i kroku 4.</li>
</ol>

<ol><li>Schulte, C., Zeller, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((microRNA-based+diagnostics+and+therapy+in+cardiovascular+disease+-+summing+up+the+facts%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Diagnosis+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">microRNA-based diagnostics and therapy in cardiovascular disease - summing up the facts.</a> Cardiovascular Diagnosis and Therapy. 5, 17-36 (2015).</li>
<li>Sun, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+microRNAs+in+myocardial+infarction%3A+from+molecular+mechanism+to+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">The role of microRNAs in myocardial infarction: from molecular mechanism to clinical application.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18, (2017).</li>
<li>Dimmeler, S., Zeiher, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs%3A+novel+biomarkers+for+cardiovascular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs: novel biomarkers for cardiovascular diseases.</a> European Heart Journal. 31, 2705-2707 (2010).</li>
<li>Creemers, E. E., Tijsen, A. J., Pinto, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs%3A+novel+biomarkers+and+extracellular+communicators+in+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs: novel biomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease.</a> Circulation Research. 110, 483-495 (2012).</li>
<li>Oerlemans, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+assessment+of+acute+coronary+syndromes+in+the+emergency+department%3A+the+potential+diagnostic+value+of+circulating+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Early assessment of acute coronary syndromes in the emergency department: the potential diagnostic value of circulating microRNAs.</a> EMBO Molecular Medicine. 4, 1176-1185 (2012).</li>
<li>Olivieri, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+potential+of+circulating+miR-499-5p+in+elderly+patients+with+acute+non+ST-elevation+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Internation+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Diagnostic potential of circulating miR-499-5p in elderly patients with acute non ST-elevation myocardial infarction.</a> Internation Journal of Cardiology. 167, 531-536 (2013).</li>
<li>Navickas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+circulating+microRNAs+as+biomarkers+of+cardiovascular+disease%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Identifying circulating microRNAs as biomarkers of cardiovascular disease: a systematic review.</a> Cardiovascular Research. 111, 322-337 (2016).</li>
<li>Devaux, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+and+prognostic+value+of+circulating+microRNAs+in+patients+with+acute+chest+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Internal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Diagnostic and prognostic value of circulating microRNAs in patients with acute chest pain.</a> Journal of Internal Medicine. 277, 260-271 (2015).</li>
<li>Schwarzenbach, H., da Silva, A. M., Calin, G., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data+normalization+strategies+for+microRNA+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Data normalization strategies for microRNA quantification.</a> Clinical Chemistry. 61, 1333-1342 (2015).</li>
<li>Hindson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+droplet+digital+PCR+system+for+absolute+quantitation+of+DNA+copy+number%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number.</a> Analytical Chemistry. 83, 8604-8610 (2011).</li>
<li>Hindson, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantification+by+droplet+digital+PCR+versus+analog+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR.</a> Nature Methods. 10, 1003-1005 (2013).</li>
<li>Robinson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+digital+PCR+as+a+novel+detection+method+for+quantifying+microRNAs+in+acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Internation+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Droplet digital PCR as a novel detection method for quantifying microRNAs in acute myocardial infarction.</a> Internation Journal of Cardiology. 257, 247-254 (2018).</li>
<li>Mitchell, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs+as+stable+blood-based+markers+for+cancer+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 10513-10518 (2008).</li>
<li>D'Alessandra, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs+are+new+and+sensitive+biomarkers+of+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs are new and sensitive biomarkers of myocardial infarction.</a> European Heart Journal. 31, 2765-2773 (2010).</li>
<li>Forootan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+determine+limit+of+detection+and+limit+of+quantification+in+quantitative+real-time+PCR+%28qPCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecular+Detection+and+Quantification%22%5BJournal%5D)">Methods to determine limit of detection and limit of quantification in quantitative real-time PCR (qPCR).</a> Biomolecular Detection and Quantification. 12, 1-6 (2017).</li>
<li>Dingle, T. C., Sedlak, R. H., Cook, L., Jerome, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tolerance+of+droplet-digital+PCR+vs+real-time+quantitative+PCR+to+inhibitory+substances%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Tolerance of droplet-digital PCR vs real-time quantitative PCR to inhibitory substances.</a> Clinical Chemistry. 59, 1670-1672 (2013).</li>
<li>Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+digital+PCR+versus+qPCR+for+gene+expression+analysis+with+low+abundant+targets%3A+from+variable+nonsense+to+publication+quality+data%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data.</a> Scientific Reports. 7, 2409(2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Digital PCR to stosunkowo nowa metoda PCR w punkcie końcowym, która umożliwia bezpośrednią bezwzględną kwantyfikację kwasów nukleinowych w próbce. Metoda ta ma szczególne zalety, w tym zmniejszoną zmienność, zwiększoną powtarzalność w ciągu dnia i doskonałą czułość11,12. Ponadto, ze względu na podział próbki na około 20 000 pojedynczych reakcji i analiz punktów końcowych, dPCR jest bardziej odporny na substancje zakłócające w PCR w porównaniu z ilościowym RT-PCR<...

Krążące miRNA zostały zidentyfikowane jako obiecujące markery wielu chorób, w tym chorób układu krążenia1. MiRNA to małe, niekodujące jednoniciowe cząsteczki RNA (o długości około 22 nukleotydów), które biorą udział w regulacji potranskrypcyjnej poprzez zmianę translacji informacyjnego RNA i wpływają na ekspresję genów2 i są uwalniane do krążenia zarówno w stanach fizjologicznych, jak i patologicznych. Ilościowa ekspresja specyficznych miRNA może być powiązana z patologią, a niektóre miRNA wykazują wysoką specyficzność tkankową i chorobową1. W chorobach sercowo-naczyniowych miRNA stały się atrakcyjnymi kandydatami jako nowe biomarkery, ponieważ są niezwykle stabilne w surowicy i można je łatwo określić ilościowo za pomocą metodologii PCR3. Potencjalna wartość miRNA jako biomarkerów zawału mięśnia sercowego została oceniona w małych badaniach, ale brakuje walidacji w dużych kohortach2. Na przykład miR-499 ulega silnej ekspresji w mięśniu sercowym i wykazano, że jest znacznie zwiększony w AMI4,5,6. Ponadto reguluje zaprogramowaną śmierć komórki (apoptozę) i różnicowanie kardiomiocytów, a tym samym bierze udział w kilku mechanizmach zgodnie z klasą AMI7. Poza kilkoma małymi badaniami wykazującymi wyższość i przyrostową wartość miRNA w diagnostyce AMI, wyższość lub równość z troponinami sercowymi o wysokiej czułości nie została jeszcze udowodniona w badaniach na dużą skalę2,5,6,8. W związku z tym potrzebne są bardziej prospektywne badania w dużych kohortach, aby ocenić potencjalną wartość diagnostyczną miRNA. Dodatkowo, metody kwantyfikacji miRNA muszą być zoptymalizowane i ustandaryzowane przy użyciu porównywalnych protokołów9. Standaryzowane testy mogą zmniejszyć niespójne wyniki i mogą pomóc miRNA stać się potencjalnymi biomarkerami do rutynowego zastosowania klinicznego, ponieważ biomarkery muszą być określone ilościowo w powtarzalny sposób, aby zapewnić ich zastosowanie kliniczne.
Ostatnio wprowadzono dPCR jako analizę punktu końcowego. Dzieli próbkę na około 20 000 indywidualnych reakcji10. System dPCR wykorzystuje następnie matematyczną analizę statystyczną Poissona sygnałów fluorescencyjnych (reakcje pozytywne i negatywne), umożliwiając bezwzględną kwantyfikację bez krzywej standardowej10. Łącząc dPCR z fluorescencyjnymi sondami hydrolizy, możliwa jest wysoce specyficzna bezpośrednia bezwzględna kwantyfikacja miRNA. Wykazano, że cyfrowa reakcja łańcuchowa polimerazy wykazuje lepsze właściwości techniczne (w tym zmniejszoną zmienność, zwiększoną odtwarzalność z dnia na dzień, wysoki stopień liniowości i wysoką czułość) do ilościowego określania poziomów miRNA w krążeniu w porównaniu z ilościowym PCR10,11. Te doskonałe właściwości techniczne mogą pomóc w złagodzeniu obecnych ograniczeń w stosowaniu krążących miRNA jako biomarkerów i mogą prowadzić do ustanowienia miRNA jako biomarkerów w dużych, wieloośrodkowych badaniach klinicznych układu sercowo-naczyniowego i ogólnie jako metody diagnostycznej. W poprzednim badaniu niedawno zastosowaliśmy dPCR do bezwzględnej kwantyfikacji krążących miRNA u pacjentów z AMI i byliśmy w stanie wykazać lepszy potencjał diagnostyczny w porównaniu z kwantyfikacją miRNA za pomocą qPCR12.
W tej publikacji chcemy pokazać, że użycie dPCR jest dokładną i powtarzalną metodą bezpośredniego oznaczania ilościowego krążących miRNA układu sercowo-naczyniowego. Bezwzględna kwantyfikacja poziomów miRNA w surowicy za pomocą cyfrowego PCR wykazuje potencjał do zastosowania w dużych, wieloośrodkowych badaniach klinicznych dotyczących układu sercowo-naczyniowego. W niniejszej publikacji szczegółowo opisujemy, jak skutecznie przeprowadzić digital PCR oraz jak wykryć bezwzględną liczbę kopii miRNA w surowicy.

<table><tbody><tr><td>Ekstrakcja RNA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy Serum/Plasma Kit (50)</td><td>Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland</td><td>217184</td><td>Zestaw do ekstrakcji mikroRNA. Zestaw zawiera komercyjny bufor RWT (nazywany numerem jeden w manuskrypcie)&nbsp; i RPE (nazywany numerem dwa w rękopisie).</td></tr><tr><td>miRNeasy Serum/Plasma Spike-in-Control; miRNA Syn-cel-miR-39; 10pmol</td><td>Qiagen-Próbka i Assay Technologies, Hilden, Deutschland</td><td>219610</td><td>Spike-in do normalizacji, sekwencja: 5'-UCACCGGGUGUAAUCAGCUUG-3'</td></tr><tr><td><silna>odwrotna transkrypcja</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do odwrotnej transkrypcji mikroRNA TaqMan (1000 reakcji)</td><td>Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA</td><td>4366597</td><td>Zestaw do odwrotnej transkrypcji mikroRNA</td></tr><tr><td>TaqMan Testy mikroRNA M</td><td>Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA</td><td>4440887</td><td>Testy stosowane w odwrotnej transkrypcji</td></tr><tr><td>has-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns)</td><td>Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA</td><td>4440887</td> Numer <td>testu 001352</td></tr><tr><td>cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns)</td><td>Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA</td><td>4440887</td><td>Numer testu 000200</td></tr><tr><td>Płytka PCR, 96-dołkowa, segmentowa, półspódniczka</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>AB0900</td><td>96-dołkowa płytka do odwrotnej transkrypcji</td></tr><tr><td>Microseal ' B&rsquo; pieczęć Uszczelki</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>MSB1001</td><td>Folia zapewniająca prawidłowe przechowywanie</td></tr><tr><td>C1000 Touch Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>1851196</td><td>Cycler używany do odwrotnej transkrypcji</td></tr><tr><td>Droplet Digital PCR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 nmol RNA oligo has-miR-499-5p</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td>Niestandardowe</td><td>Sekwencja: 5'-phos-UUAAGACUUGCAGUGUGUGUUU-3'ddPCR</td></tr> <tr><td>Supermix do sond (bez dUTP)</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>1863024</td><td>Supermix stosowany w testach</td></tr><tr><td>mikroRNA TaqMan</td><td>Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA</td><td>4440887</td><td>Testy stosowane w cyfrowym PCR (sonda do hydrolizy fluorescencyjnej)</td></tr><tr><td>has-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns)</td><td>Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA</td><td>4440887</td><td>Numer testu 001352, komercyjne startery</td></tr><tr><td>cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns)</td><td>Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA</td><td>4440887</td><td>Numer testu 000200, komercyjne startery</td></tr><tr><td>Wkłady i uszczelki DG8</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>1864007</td><td>Kartridż pobiera do 8 próbek do generowania kropel</td></tr><tr><td>Wkład DG8 Holder</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>1863051</td><td>Mieści wkłady do generowania kropel</td></tr><tr><td>Olej do generowania kropel</td><td>do sond Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>1863005</td><td>Olej stosowany w</td></tr><tr><td>96-dołkowych płytkach ddPCR</td> do generowania kropelek <td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>12001925</td><td>96-dołkowa płytka do</td></tr><tr><td>zgrzewania płytek ddPCR PCR, foliowa, przebijalna</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>1814040</td><td>Folia przebijalna, kompatybilna z czytnikiem kropel</td></tr><tr><td>ddPCR Czytnik kropel</td><td>Olej Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>1863004</td><td>Olej używany do odczytu kropel</td></tr><tr><td>QX100 lub QX200 Generator kropel</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>1863002</td><td>Generator kropel, generuje kropelki z emulsji próbka/olej</td></tr><tr><td>PX1 PCR Uszczelniacz</td><td>płytek Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>1814000</td><td>Uszczelnia płytkę przed PCR</td></tr><tr><td>C1000 Touch Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>1851196</td><td>Cycler używany do</td></tr><tr><td>czytnika kropel ddPCR QX100 lub QX200</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>1863003</td><td>Odczytuje kropelki PCR-dodatnie i PCR-ujemne za pomocą detektora</td></tr> <tr><td>optycznegoKontrola buforowa ddPCR dla sond</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>1863052</td><td>Ślepa kontrola&nbsp; oraz do napełnienia pozostałych studzienek 8-dołkowej kasety kasetowej</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>QuantaSof Software</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>1864011</td><td>Program do odczytu kropel</td></tr><tr><td>Prism Windows 5</td><td>GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA</td><td></td><td>Program do analizy statystycznej</td></tr></tbody></table>

cyfrowy pcr do ilościowego oznaczania krążących mikrorna w ostrym zawale mięśnia sercowego i chorobach sercowo-naczyniowych

Digital PCR for Quantifying Circulating MicroRNAs in Acute Myocardial Infarction and Cardiovascular Disease

Krążące mikroRNA (miRNA) w surowicy okazały się obiecujące jako biomarkery chorób sercowo-naczyniowych i ostrego zawału mięśnia sercowego (AMI), uwalniane z komórek sercowo-naczyniowych do krążenia. Krążące miRNA są wysoce stabilne i można je określić ilościowo. Ilościowa ekspresja określonych miRNA może być powiązana z patologią, a niektóre miRNA wykazują wysoką specyficzność tkankową i chorobową. Znalezienie nowych biomarkerów chorób sercowo-naczyniowych ma znaczenie dla badań medycznych. Całkiem niedawno wynaleziono cyfrową reakcję łańcuchową polimerazy (dPCR). dPCR, w połączeniu z fluorescencyjnymi sondami hydrolizy, umożliwia specyficzną bezpośrednią bezwzględną kwantyfikację. dPCR wykazuje doskonałe właściwości techniczne, w tym niską zmienność, wysoką liniowość i wysoką czułość w porównaniu z ilościową reakcją łańcuchową polimerazy (qPCR). W związku z tym dPCR jest dokładniejszą i bardziej powtarzalną metodą bezpośredniego oznaczania ilościowego miRNA, szczególnie do stosowania w dużych, wieloośrodkowych badaniach klinicznych dotyczących układu sercowo-naczyniowego. W niniejszej publikacji opisujemy, jak skutecznie przeprowadzić digital PCR w celu oceny bezwzględnej liczby kopii w próbkach surowicy.

Cyfrowy PCR (dPCR) w połączeniu z fluorescencyjnymi sondami hydrolizy umożliwia badaczom bezpośrednią kwantyfikację absolutnej ilości specyficznych miRNA w kopiach/µL. Ponieważ próbka w dPCR jest dzielona na około 20 000 pojedynczych reakcji PCR, dPCR nie wymaga powtórzeń technicznych10. System dPCR wykorzystuje matematyczną analizę statystyczną Poissona sygnałów fluorescencyjnych (różnicując reakcje pozytywne i negatywne), co umożliwia kwantyfikację absolutną bez ...

Krążące mikroRNA okazały się obiecujące jako biomarkery chorób sercowo-naczyniowych i ostrych zawałów mięśnia sercowego. W tym badaniu opisujemy protokół ekstrakcji miRNA, odwrotnej transkrypcji i cyfrowego PCR w celu bezwzględnej kwantyfikacji miRNA w surowicy pacjentów z chorobami sercowo-naczyniowymi.

Cyfrowy PCR do ilościowego oznaczania krążących mikroRNA w ostrym zawale mięśnia sercowego i chorobach sercowo-naczyniowych

Circulating serum microRNAs (miRNAs) have shown promise as biomarkers for the cardiovascular disease and acute myocardial infarction (AMI), being released ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie diagnostyki, takie jak to, czy mikro RNA są ważnymi biomarkerami w chorobach sercowo-naczyniowych. W porównaniu z ilościowym PCR w czasie rzeczywistym, cyfrowy PCR wykazuje lepsze właściwości techniczne w zakresie ilościowego oznaczania mikroRNA w krążeniu. Ponieważ próbka jest podzielona na około 20 000 kropel, nie są konieczne żadne podwójne pomiary, a do oceny ilościowej nie jest potrzebna standardowa krzywa.Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat kwantyfikacji mikroRNA u pacjentów z chorobami sercowo-naczyniowymi, może być również stosowana u innych pacjentów i chorób, ponieważ inne mikroRNA okazały się obiecujące jako biomarkery progresji raka, może być również stosowana u pacjentów onkologicznych. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności, ponieważ generowane kropelki są delikatne i należy obchodzić się z nimi ostrożnie. Po wyizolowaniu RNA z próbek surowicy kontynuuj odwrotną transkrypcję, aby uzyskać bardziej stabilne komplementarne DNA dla dPCR.Na początek rozmrozić zestaw do odwrotnej transkrypcji na lodzie. Następnie odkręć enzymy i startery. Następnie przygotuj mieszankę wzorcową zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Połącz 10 mikrolitrów mieszanki głównej z pięcioma mikrolitrami wyekstrahowanego RNA w każdym dołku 96-dołkowej płytki. Następnie odwirować płytkę w temperaturze 2 000 x g w czterech stopniach Celsjusza przez dwie minuty. Kontynuuj transkrypcję wsteczną zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Najpierw rozmrozić komercyjną mieszankę dPCR, cDNA i startery PCR na lodzie i odwirować bezpośrednio przed użyciem. Następnie przygotuj mieszankę wzorcową zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Dodaj 1,33 mikrolitra objętości produktu do odwrotnej transkrypcji do 18,67 mikrolitrów objętości mieszanki głównej i krótko odwirować.Za pomocą pipety przenieś 20 mikrolitrów próbki do każdej studzienki w rzędzie pożywki kasety z ośmioma dołkami. Następnie wlej 70 mikrolitrów oleju wytwarzającego kropelki do szybów naftowych kasety. Następnie umieść uszczelkę na górze kasety i umieść ją w generatorze kropel.Zamknij generator kropel i poczekaj, aż trzy kontrolki zaświecą się na zielono. Za pomocą pipety ostrożnie przenieś 40 mikrolitrów próbki uformowanej w krople do oddzielnych studzienek 96-dołkowej płytki. Następnie uszczelnij płytkę folią dPCR w temperaturze 180 stopni Celsjusza na cztery sekundy.Umieść zapieczętowaną płytkę PCR w cyklerze i postępuj zgodnie z instrukcjami dotyczącymi jazdy na rowerze przedstawionymi w protokole tekstowym. Wyjmij płytkę z termocyklera i przenieś ją na podstawę uchwytu na talerze. Następnie umieść górną część uchwytu płytki na płytce PCR.Na koniec uruchom komercyjne oprogramowanie dPCR. W tym protokole wykorzystano cyfrowy PCR do ilościowego oznaczania mikroRNA w surowicy pacjentów z chorobami sercowo-naczyniowymi. Próbki pobrano od 16 pacjentów przed, osiem godzin po i 16 godzin po interwencji przezskórnej.Pacjenci z zawałem mięśnia sercowego z uniesieniem odcinka ST wykazywali znaczny wzrost poziomu miR-499 w porównaniu z pacjentami ze stabilną chorobą wieńcową. Po opanowaniu tę technikę można wykonać w ciągu około godziny w celu utworzenia kropelek z 96 próbek, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o ostrożnym obchodzeniu się z kropelkami.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak prawidłowo wykonać cyfrowy PCR, poprzez prawidłowe tworzenie kropel, cykl, czytanie i analizowanie.

digital-pcr-for-quantifying-circulating-micrornas-acute-myocardial

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

W niniejszej pracy opisujemy zoptymalizowany protokół multipleksowej ilościowej reakcji polimerazy w odwrotnej transkrypcji (qRT-PCR) w połączeniu z platformą mikroprzepływową, stanowiący efektywne pod względem kosztów i czasu narzędzie do wysokoprzepustowego przesiewowania poziomów ekspresji mikroRNA (miRNA), szczególnie w przypadku pracy z ograniczoną ilością materiału próbnego.

Wysokoprzepustowe profilowanie mikroRNA: zoptymalizowana wielokanałowa qRT-PCR w skali nanolitrowej na IFC Fluidigm Dynamic ArrayTM

Pomiar biomarkerów w złożonych próbkach biologicznych coraz częściej pomaga w podejmowaniu decyzji klinicznych. Opisujemy wysoce czułą metodę jednoczesnego pomiaru białka C wiążącego miozynę sercową, kinazy kreatynowej MB i troponiny sercowej I w próbkach surowicy od osób z zawałem mięśnia sercowego i zdrowych osób z grupy kontrolnej.

Czuła i specyficzna metoda ilościowa do oznaczania białka C wiążącego miozynę sercową w surowicy za pomocą elektrochemiluminescencyjnego testu immunologicznego

Krążące mikroRNA pojawiły się ostatnio jako obiecujące i nowe biomarkery dla różnych nowotworów i innych chorób. Celem tego artykułu jest omówienie trzech różnych platform i metod PCR w czasie rzeczywistym opartych na sondach, które są dostępne do ilościowego określania i określania obfitości krążących mikroRNA.

Oparte na sondzie podejścia PCR w czasie rzeczywistym do ilościowego pomiaru mikroRNA

Opisana jest czuła i dokładna metoda kwantyfikacji mikroRNA bez komórek przy użyciu chemii opartej na barwniku i technologii kropelkowej cyfrowego PCR.

Kwantyfikacja krążącego mikroRNA przy użyciu chemii barwnika wiążącego DNA i kropelkowego cyfrowego PCR

MikroRNA odgrywają ważną rolę regulacyjną i stają się nowymi celami terapeutycznymi dla różnych chorób ludzkich. Wykazano, że miRNA są przenoszone w lipoproteinach o dużej gęstości. Opracowaliśmy uproszczoną metodę szybkiego izolowania oczyszczonego HDL nadającego się do analizy miRNA z ludzkiego osocza.

Szybka i uproszczona metoda wysokoprzepustowej izolacji miRNA z wysoko oczyszczonej lipoproteiny o wysokiej gęstości

Ten raport opisuje protokół pomiaru bezwzględnych poziomów miRNA w osoczu, przy użyciu ilościowego PCR z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym z lub bez wstępnej amplifikacji. Protokół ten pozwala lepiej zrozumieć ilość miRNA w osoczu i umożliwia jakościową ocenę odpowiednich danych z różnych badań lub laboratoriów.

Bezwzględna kwantyfikacja poziomów mikroRNA w osoczu u małp Cynomolgus przy użyciu ilościowego PCR z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym

mikro-RNA (miRNA) to krótkie i wysoce homologiczne sekwencje RNA, służące jako posttranskrypcyjne regulatory informacyjnych RNA (mRNA). Obecne metody wykrywania miRNA różnią się czułością i swoistością. Opisujemy protokół, który łączy hybrydyzację in situ i barwienie immunologiczne w celu jednoczesnego wykrywania cząsteczek miRNA i białka na odcinkach tkanki serca myszy.

Specyficzne tkankowo profilowanie ekspresji miRNA w wycinkach serca myszy przy użyciu hybrydyzacji in situ

Przedstawiamy protokół do oceny poziomów ekspresji krążących mikroRNA (miRNA) w próbkach osocza od pacjentów z rakiem. W szczególności wykorzystaliśmy dostępny na rynku zestaw do cyrkulacji ekstrakcji miRNA i odwrotnej transkrypcji. Na koniec przeanalizowaliśmy panel 24 wybranych miRNA przy użyciu niestandardowych płytek sondy wstępnie wykrytej w czasie rzeczywistym.

Wykrywanie niestandardowego panelu krążącego mikroRNA u pacjentów z przerzutowym rakiem jelita grubego

Ten protokół opisuje szczegółową metodę cyfrowego kropelkowego PCR (dd-PCR) do precyzyjnej kwantyfikacji kolistych poziomów RNA (circRNA) w komórkach przy użyciu rozbieżnych starterów.

Kwantyfikacja kolistych RNA za pomocą cyfrowego PCR kropelkowego

Szczurzy model ostrego zawału mięśnia sercowego (AMI) jest przydatny do badania skutków zawału dla patofizjologicznych i fizjologicznych funkcji serca.

Ostry zawał mięśnia sercowego u szczurów

Poznaj cyfrowy PCR do ilościowego oznaczania krążących mikroRNA jako biomarkerów chorób sercowo-naczyniowych. Ta metoda zapewnia wyższą dokładność niż tradycyjne qPCR bez konieczności stosowania krzywych kalibracyjnych.

Cyfrowy PCR do ilościowego oznaczania krążących mikroRNA w ostrym zawale mięśnia sercowego i chorobach sercowo-naczyniowych

Przeglądaj więcej filmów