Cyfrowy PCR do ilościowego oznaczania krążących mikroRNA w ostrym zawale mięśnia sercowego i chorobach sercowo-naczyniowych
3 lipca 2018
Krążące mikroRNA okazały się obiecujące jako biomarkery chorób sercowo-naczyniowych i ostrych zawałów mięśnia sercowego. W tym badaniu opisujemy protokół ekstrakcji miRNA, odwrotnej transkrypcji i cyfrowego PCR w celu bezwzględnej kwantyfikacji miRNA w surowicy pacjentów z chorobami sercowo-naczyniowymi.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie diagnostyki, takie jak to, czy mikro RNA są ważnymi biomarkerami w chorobach sercowo-naczyniowych. W porównaniu z ilościowym PCR w czasie rzeczywistym, cyfrowy PCR wykazuje lepsze właściwości techniczne w zakresie ilościowego oznaczania mikroRNA w krążeniu. Ponieważ próbka jest podzielona na około 20 000 kropel, nie są konieczne żadne podwójne pomiary, a do oceny ilościowej nie jest potrzebna standardowa krzywa.
Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat kwantyfikacji mikroRNA u pacjentów z chorobami sercowo-naczyniowymi, może być również stosowana u innych pacjentów i chorób, ponieważ inne mikroRNA okazały się obiecujące jako biomarkery progresji raka, może być również stosowana u pacjentów onkologicznych. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności, ponieważ generowane kropelki są delikatne i należy obchodzić się z nimi ostrożnie. Po wyizolowaniu RNA z próbek surowicy kontynuuj odwrotną transkrypcję, aby uzyskać bardziej stabilne komplementarne DNA dla dPCR.
Na początek rozmrozić zestaw do odwrotnej transkrypcji na lodzie. Następnie odkręć enzymy i startery. Następnie przygotuj mieszankę wzorcową zgodnie z opisem w protokole tekstowym.
Połącz 10 mikrolitrów mieszanki głównej z pięcioma mikrolitrami wyekstrahowanego RNA w każdym dołku 96-dołkowej płytki. Następnie odwirować płytkę w temperaturze 2 000 x g w czterech stopniach Celsjusza przez dwie minuty. Kontynuuj transkrypcję wsteczną zgodnie z opisem w protokole tekstowym.
Najpierw rozmrozić komercyjną mieszankę dPCR, cDNA i startery PCR na lodzie i odwirować bezpośrednio przed użyciem. Następnie przygotuj mieszankę wzorcową zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Dodaj 1,33 mikrolitra objętości produktu do odwrotnej transkrypcji do 18,67 mikrolitrów objętości mieszanki głównej i krótko odwirować.
Za pomocą pipety przenieś 20 mikrolitrów próbki do każdej studzienki w rzędzie pożywki kasety z ośmioma dołkami. Następnie wlej 70 mikrolitrów oleju wytwarzającego kropelki do szybów naftowych kasety. Następnie umieść uszczelkę na górze kasety i umieść ją w generatorze kropel.
Zamknij generator kropel i poczekaj, aż trzy kontrolki zaświecą się na zielono. Za pomocą pipety ostrożnie przenieś 40 mikrolitrów próbki uformowanej w krople do oddzielnych studzienek 96-dołkowej płytki. Następnie uszczelnij płytkę folią dPCR w temperaturze 180 stopni Celsjusza na cztery sekundy.
Umieść zapieczętowaną płytkę PCR w cyklerze i postępuj zgodnie z instrukcjami dotyczącymi jazdy na rowerze przedstawionymi w protokole tekstowym. Wyjmij płytkę z termocyklera i przenieś ją na podstawę uchwytu na talerze. Następnie umieść górną część uchwytu płytki na płytce PCR.
Na koniec uruchom komercyjne oprogramowanie dPCR. W tym protokole wykorzystano cyfrowy PCR do ilościowego oznaczania mikroRNA w surowicy pacjentów z chorobami sercowo-naczyniowymi. Próbki pobrano od 16 pacjentów przed, osiem godzin po i 16 godzin po interwencji przezskórnej.
Pacjenci z zawałem mięśnia sercowego z uniesieniem odcinka ST wykazywali znaczny wzrost poziomu miR-499 w porównaniu z pacjentami ze stabilną chorobą wieńcową. Po opanowaniu tę technikę można wykonać w ciągu około godziny w celu utworzenia kropelek z 96 próbek, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o ostrożnym obchodzeniu się z kropelkami.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak prawidłowo wykonać cyfrowy PCR, poprzez prawidłowe tworzenie kropel, cykl, czytanie i analizowanie.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia protokół ekstrakcji i oznaczania ilościowego krążących mikroRNA jako potencjalnych biomarkerów chorób układu sercowo-naczyniowego. Dzięki zastosowaniu cyfrowej PCR metoda ta ma na celu zwiększenie dokładności pomiaru miRNA w próbkach surowicy pobranych od pacjentów z chorobami układu sercowo-naczyniowego.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Choroby układu sercowo-naczyniowego
- Biomarkery
- Analiza microRNA
Wstęp
- MikroRNA to małe niekodujące RNA uczestniczące w regulacji genów.
- Okazały się one potencjalnymi biomarkerami dla wielu chorób, w tym schorzeń układu sercowo-naczyniowego.
- Cyfrowy PCR oferuje zalety nad tradycyjnymi metodami ilościowego oznaczania mikroRNA.
- Zrozumienie profili miRNA może pomóc w diagnostyce i leczeniu chorób układu sercowo-naczyniowego.
Cel badania
- Walidacja mikroRNA jako biomarkerów chorób układu sercowo-naczyniowego.
- Wykazanie skuteczności cyfrowego PCR w kwantyfikacji krążących miRNA.
- Dostarczenie wiarygodnego protokołu dla badaczy w tej dziedzinie.
Zastosowane metody
- Izolacja miRNA z próbek surowicy.
- Transkrypcja odwrotna w celu syntezy komplementarnego DNA.
- Cyfrowy PCR do bezwzględnej kwantyfikacji miRNA.
- Porównanie cyfrowego PCR z ilościowym PCR w czasie rzeczywistym.
Główne wyniki
- Cyfrowy PCR wykazał wyższą dokładność w kwantyfikacji miRNA.
- Metoda ta pozwala na analizę tysięcy kropli bez konieczności stosowania krzywych wzorcowych.
- Potencjalne zastosowanie metody wykracza poza choroby układu sercowo-naczyniowego i obejmuje inne schorzenia, takie jak nowotwory.
- W przypadku nowych użytkowników techniki odnotowano trudności w obchodzeniu się z kruchymi kroplami.
Wnioski
- Badanie wspiera wykorzystanie krążących mikroRNA jako biomarkerów chorób układu sercowo-naczyniowego.
- Cyfrowa PCR jest obiecującym narzędziem do precyzyjnej kwantyfikacji miRNA.
- Dalsze badania mogłyby rozszerzyć zastosowanie tej metody na inne jednostki chorobowe.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowe oznaczanie krążących mikroRNA za pomocą cyfrowego PCR zapewnia odtwarzalne i wysokoczułe podejście do walidacji biomarkerów w badaniach nad chorobami układu sercowo-naczyniowego. Metoda ta wspiera walidację celów oraz opracowywanie testów, umożliwiając kwantyfikację absolutną bez konieczności stosowania krzywych wzorcowych, co redukuje zmienność w badaniach wieloośrodkowych. Technika ta zwiększa pewność prognostyczną w fazie wczesnego odkrywania poprzez powiązanie ekspresji miRNA z patologią, co dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań w ramach weryfikacji hipotez terapeutycznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez ilościowe oznaczanie specyficznych dla choroby cząsteczek miRNA, takich jak miR-499 w AMI.
- Wartość operacyjna: Pozwala na wyznaczenie bezwzględnej liczby kopii miRNA bez użycia krzywych wzorcowych, co poprawia powtarzalność wyników między ośrodkami.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję portfolio w oparciu o biomarkery poprzez powiązanie poziomów miRNA z patologią układu sercowo-naczyniowego.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na generowanie zwalidowanych systemów biologicznych (cDNA z RNA surowicy) do późniejszych etapów procesów przesiewowych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia wysoką liniowość i niską zmienność wyników, co jest odpowiednie dla standaryzacji testów.
- Skalowalność: Umożliwia przetworzenie 96 próbek w około jednej godzinie po przygotowaniu mieszaniny reakcyjnej, co wspiera przesiewy o średniej przepustowości.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy kwantyfikację miRNA w fazie odkrycia z walidacją przedkliniczną za pomocą istotnych dla choroby biomarkerów surowiczych.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Zmniejsza niejednoznaczność w walidacji celu poprzez korelację ekspresji miRNA z uszkodzeniem układu sercowo-naczyniowego.
- Dostosowanie biomarkerów: Wspiera rozwój biomarkerów translacyjnych poprzez kwantyfikację miRNA o wysokiej specyficzności tkankowej i chorobowej.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesów odkrywczych – od testowania hipotez po identyfikację związków wiodących – dostarczając ilościowych danych dotyczących miRNA, które pozwalają ocenić wiarygodność celu oraz gotowość analizy.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez ilościowe określanie uwalniania miRNA z komórek układu sercowo-naczyniowego do krążenia.
- Przesiew: Generuje znormalizowane wyniki gotowe do analizy, charakteryzujące się wysoką czułością w ocenie kandydatów na biomarkery.
- Analityka: Umożliwia bezpośrednie porównanie poziomów miRNA w różnych warunkach dzięki zastosowaniu ilościowania absolutnego bez użycia krzywych wzorcowych.
- Badania translacyjne: Zwiększa ciągłość badań nad biomarkerami poprzez powiązanie profili krążącego miRNA z patologią układu sercowo-naczyniowego.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę ilościową z możliwością ponownego wykorzystania w różnych wskazaniach kardiologicznych i onkologicznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w zakresie walidacji biomarkerów dzięki ilościowemu oznaczaniu miRNA o niskiej zmienności i wysokiej czułości.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność i standaryzację poprzez partycjonowanie w kropelkach, co eliminuje konieczność wykonywania pomiarów dublowanych.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji typu go/no-go poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w relacjach między biomarkerami a celami terapeutycznymi.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia postęp skorygowany o ryzyko dzięki ilościowym danym miRNA powiązanym z patologią.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w izolacji RNA, odwrotnej transkrypcji oraz obchodzeniu się z kropelkami, aby zapobiec utracie próbki.
- Wymaga sprzętu do generowania kropeltek, cyklerów PCR oraz oprogramowania dPCR do dokładnego oznaczania ilościowego.
- Wymaga standaryzacji protokołów tworzenia i uszczelniania kropeltek pomiędzy zespołami w celu uzyskania powtarzalnych wyników.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania parametrów przy zastosowaniu różnych typów próbek poza surowicą, takich jak plazma lub lizaty tkankowe.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak delikatność kropeltek, co może wpływać na wydajność w przypadku użytkowników bez doświadczenia.
