Name: Analiza N-glikanów z odmian Raphanus sativus przy użyciu PNGazy H+ (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Poznaj uproszczoną metodę analizy N-glikanów z różnych odmian rzepy Raphanus sativus przy użyciu PNGazy H+. Technika eliminuje zmiany buforu podczas hydrolizy enzymatycznej i derywatyzacji z 2-aminobenzamidem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była częściowo wspierana przez Chińską Fundację Nauk Przyrodniczych (granty o numerach 31471703, A0201300537 i 31671854 dla J.V. i L.L., granty o numerze 31470435 dla G.Y.) oraz Plan 100 Zagranicznych Talentów (grant numer JSB2014012 dla J.V.).

1. Pobieranie próbek
<ol>
	<li>Kup różne odmiany świeżej rzodkiewki (Raphanus sativus L.).</li>
</ol>
2. Izolacja białka z rzodkiewki
<ol>
	<li>Homogenizuj około 100 g świeżej rzodkiewki za pomocą blendera kuchennego przez 10 minut.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i odwirować przy 14 000 × g w temperaturze 4 °C przez 20 minut w celu usunięcia nierozpuszczalnego materiału.</li>
	<li>Ostrożnie przenieść supernatant do nowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i dodać równą objętość 2 M roztworu kwasu trichlorooctowego (TCA). 
	UWAGA: Dodanie TCA spowoduje wytrącenie rozpuszczalnych (gliko)białek.</li>
	<li>Odwirować w temperaturze 14 000 × g w temperaturze 4 °C przez 30 minut i usunąć supernatant z granulowanych (gliko) białek.</li>
	<li>Przemyć osad 20 ml wody dejonizowanej i odwirować w temperaturze 14 000 × g w temperaturze 4 °C przez 5 minut w celu usunięcia rozpuszczalnych oligosacharydów i polisacharydów.</li>
	<li>Powtórz krok 2.5. cztery razy.</li>
	<li>Ponownie zawiesić granulki w 1 ml wody dejonizowanej i przenieść do świeżej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
</ol>
3. Przygotowanie N-glikanów 
<ol>
	<li>Zmieszać 50 μl roztworu białkowego z kroku 2.7. (równe 5 g świeżej rzodkiewki) z 0,2 mU rekombinowanej PNGazy H+ w 10 mM kwasu octowego.</li>
	<li>Mieszaninę reakcyjną inkubować w temperaturze 37 °C przez 12 godzin. Po inkubacji odwirować przy 14 000 × g przez 5 minut, aby usunąć dodatkowe białko i enzym.</li>
	<li>Przenieść supernatant do świeżej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
</ol>
4. Oczyszczanie N-glikanów 
<ol>
	<li>Przygotować kolumnę do ekstrakcji do fazy stałej (SPE) w celu wzbogacenia N-glikanów i usunięcia soli i innych zanieczyszczeń z mieszaniny reakcyjnej, zwiększając selektywność fluorogenicznego środka znakującego 2-aminobenzamid (2-AB) do derywatyzacji N-glikanów.
	<ol>
		<li>Dodaj 3 ml wody dejonizowanej, aby umyć kolumnę.</li>
		<li>Dodać 3 ml 80% roztworu acetonitrylu zawierającego kwas trifluorooctowy (TFA, 0,1% v/v) w celu uaktywnienia kolumny SPE.</li>
		<li>Dodaj 3 ml wody dejonizowanej, aby zrównoważyć kolumnę SPE.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieść próbkę z kroku 3.3 na kolumnę i odrzucić przepływ</li>.
	<li>Dodaj 1,5 ml wody dejonizowanej, aby umyć kolumnę i wyrzuć przepływ.</li>
	<li>Uwolnione N-glikany należy wypłukać z kolumny za pomocą 1,5 ml wodnego 20% roztworu acetonitrylu zawierającego 0,1% TFA (v/v) do probówki wirówkowej o pojemności 2 ml.</li>
	<li>Usunąć rozpuszczalnik przez odparowanie odśrodkowe w temperaturze pokojowej. Odparowywać aż do całkowitego wyschnięcia próbki.</li>
</ol>
5. Derywatyzacja fluorescencyjna N-glikanów
<ol>
	<li>Przygotować 1 ml roztworu 2-AB, składającego się z 35 mM 2-AB i 0,1 M cyjanoborowodorku sodu w roztworze dimetylosulfotlenku dimetylu/kwasu octowego (7:3, v/v).</li>
	<li>Dodać 5 μl roztworu 2-AB do wysuszonych próbek (etap 4.5) pochodzących z sześciu różnych rzodkiewki. Wirować każdą próbkę, aż do całkowitego rozpuszczenia.</li>
	<li>Inkubować mieszaninę przez 2 godziny w temperaturze 65 °C.</li>
	<li>Pozostawić próbkę do ostygnięcia do temperatury pokojowej przez 5 minut, a następnie dodać 5 μl wody dejonizowanej i 40 μl acetonitrylu. Odwirować probówki o stężeniu 14 000 x g przez 3 minuty.</li>
	<li>Przenieść 48 μl z supernatantu do 300 μl fiolki HPLC o wysokim odzysku. Próbki derywatyzowanego N-glikanu należy przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do jednego miesiąca.</li>
</ol>
6. Profilowanie N-glikanów metodą HILIC-UPLC 
<ol>
	<li>Analizuj próbki za pomocą standardowego systemu UPLC podłączonego do detektora fluorescencyjnego online ustawionego na długości fal wzbudzenia/emisji odpowiednio 330 nm/420 nm.</li>
	<li>Do analizy należy użyć kolumny glikanowej do chromatografii cieczowej z oddziaływaniem hydrofobowym (HILIC)-UPLC w temperaturze kolumny 60 °C.</li>
	<li>Przygotować rozpuszczalnik A, rozcieńczając 50 ml roztworu podstawowego (1 M roztwór mrówczanu amonu, pH 4,5) 950 ml wody przeznaczonej do chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (LCMS). Przygotować roztwór podstawowy w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Dodać 43 ml kwasu mrówkowego do 700 ml H2O klasy LCMS.</li>
		<li>Dostosuj pH do 4,5 przez stopniowe dodawanie wodnego roztworu amoniaku (25% w/w).</li>
		<li>Przenieść rozpuszczalnik do cylindra miarowego i napełnić do 1000 ml preparatem H2O. Przechowywać w temperaturze 4-6 °C przez okres do 3 miesięcy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj acetonitrylu klasy LCMS jako rozpuszczalnika B.</li>
	<li>Oddzielić N-glikany za pomocą następującej elucji gradientowej:
	<ol>
		<li>Zacznij od dodania 95% rozpuszczalnika B do rozpuszczalnika A. Ustaw natężenie przepływu na 0,5 ml/min w zakresie od 0 do 44,5 min.</li>
		<li>Od 0 min do 6 min stopniowo zmniejszaj udział rozpuszczalnika B z gradientem liniowym do 78%.</li>
		<li>Od 6 min do 44,5 min stopniowo zmniejszaj udział rozpuszczalnika B z gradientem liniowym do 55,9%.</li>
		<li>Od 44,5 min do 46,5 min gwałtownie zmniejszyć udział rozpuszczalnika B z gradientem liniowym od 55,9% do 0% i utrzymać na poziomie 0% przez 2 min, a następnie rozpocząć płukanie kolumny. Zmniejsz natężenie przepływu do 0,25 ml/min z 44,5 do 55 min.</li>
		<li>Przemyć kolumnę dalej, zwiększając rozpuszczalnik B do 95% z 48,5 min do 50,5 min i utrzymywać na poziomie 95% przez 4,5 min.</li>
		<li>Ponownie wyrównać kolumnę do warunków początkowych 95% rozpuszczalnika B przy 0,5 ml/min od 50,5 do 57 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wstrzyknąć 45 μl próbki do systemu UPLC.</li>
	<li>Elucja N-glikanów za pomocą UPLC z czasem retencji od 15 do 40 minut.</li>
	<li>Zebrać każdą zaobserwowaną frakcję pikową UPLC za pomocą probówek wirówkowych o pojemności 2 ml i wysuszyć próbki przez odparowanie odśrodkowe.</li>
	<li>Wstrzyknąć około 1 pmol wzorca dekstranu znakowanego 2-AB (2-20 jednostek glukozy), aby skalibrować profilowanie roślinnego N-glikanu i przypisać ich czasy elucji do standaryzowanych jednostek glukozy.</li>
</ol>
7. Analiza MS MALDI-TOF
<ol>
	<li>Rozpuścić próbki z kroku 6.8 w 5 μl wody klasy LCMS. Zmieszać 1 μl roztworu próbki i 1 μl roztworu 6-aza-2-tiotyminy (ATT) (0,3% w/v w 70% v/v wodnym roztworze acetonitrylu) i odpipetować mieszaninę na nośnik próbki MALDI-TOF.</li>
	<li>Analizować próbki za pomocą spektrometru mas MALDI-TOF w trybie jonów dodatnich, naciskając przycisk Start.</li>
	<li>Analizuj widma masowe za pomocą dołączonego oprogramowania do analizy MALDI-TOF-MS.</li>
	<li>Zinterpretuj widma za pomocą oprogramowania do interpretacji glikanów o otwartym kodzie źródłowym19. Ustaw parametry wyszukiwania dla etykietowania 2-AB, [M+Na]+ i ustaw parametr dokładności na 2,0 Da.</li>
</ol>

<ol><li>Altmann, F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17033195">The Role of Protein Glycosylation in Allergy.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 142 (2), 99-115 (2007).</li>
<li>Van Ree, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2+%281%2C+2%29-xylose+and+%CE%B1+%281%2C+3%29-fucose+residues+have+a+strong+contribution+in+IgE+binding+to+plant+glycoallergens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">β (1, 2)-xylose and α (1, 3)-fucose residues have a strong contribution in IgE binding to plant glycoallergens.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (15), 11451-11458 (2000).</li>
<li>Biswas, H., Chattopadhyaya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+of+Curcuma+longa+rhizome+lectin%3A+Role+of+N-linked+glycosylation%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Stability of Curcuma longa rhizome lectin: Role of N-linked glycosylation.</a> Glycobiology. 26 (4), 410-426 (2016).</li>
<li>Lefebvre, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+N-glycosylation+sites+and+CXC+motifs+in+trafficking+of+Medicago+truncatula+Nod+factor+perception+protein+to+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Role of N-glycosylation sites and CXC motifs in trafficking of Medicago truncatula Nod factor perception protein to plasma membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (14), 10812-10823 (2012).</li>
<li>Severino, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+glycan+moiety+on+the+structure-function+relationships+of+PD-L1%2C+type+1+ribosome-inactivating+protein+from+P.+dioica+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+BioSystems%22%5BJournal%5D)">The role of the glycan moiety on the structure-function relationships of PD-L1, type 1 ribosome-inactivating protein from P. dioica leaves.</a> Molecular BioSystems. 6 (3), 570-579 (2010).</li>
<li>Lige, B., Ma, S., Van Huystee, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+the+site-directed+removal+of+N-glycosylation+from+cationic+peanut+peroxidase+on+its+function%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">The effects of the site-directed removal of N-glycosylation from cationic peanut peroxidase on its function.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 386 (1), 17-24 (2001).</li>
<li>Ceriotti, A., Duranti, M., Bollini, R. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/jxb/article/49/324/1091/481062">Effects of N-glycosylation on the folding and structure of plant proteins.</a> Journal of Experimental Botany. 49 (324), 1091-1103 (1998).</li>
<li>Kamerling, J. P., Gerwig, G. J. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/46698050_Strategies_for_the_Structural_Analysis_of_Carbohydrates">Strategies for the Structural Analysis of Carbohydrates.</a> Comprehensive Glycoscience. , 1-68 (2007).</li>
<li>Huang, Y., Mechref, Y., Novotny, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+nonreductive+release+of+O-linked+glycans+for+subsequent+analysis+through+MALDI+mass+spectrometry+and+capillary+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Microscale nonreductive release of O-linked glycans for subsequent analysis through MALDI mass spectrometry and capillary electrophoresis.</a> Analytical Chemistry. 73 (24), 6063-6069 (2001).</li>
<li>Triguero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+enzymatic+N-glycan+release+comparison+for+N-glycan+profiling+of+monoclonal+antibodies+expressed+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Chemical and enzymatic N-glycan release comparison for N-glycan profiling of monoclonal antibodies expressed in plants.</a> Analytical Biochemistry. 400 (2), 173-183 (2010).</li>
<li>Tretter, V., Altmann, F., Marz, L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1868849">Peptide-N4-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagine amidase F cannot release glycans with fucose attached α1 → 3 to the asparagine-linked N-acetylglucosamine residue.</a> European Journal of Biochemistry. 199 (3), 647-652 (1991).</li>
<li>Fan, J. -Q., Lee, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+studies+on+substrate+structure+requirements+of+glycoamidases+A+and+F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Detailed studies on substrate structure requirements of glycoamidases A and F.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (43), 27058-27064 (1997).</li>
<li>Altmann, F., Paschinger, K., Dalik, T., Vorauer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+peptide-N4-%28N-acetyl-%CE%B2-glucosaminyl%29asparagine+amidase+A+and+its+N-glycans%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterisation of peptide-N4-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagine amidase A and its N-glycans.</a> European Journal of Biochemistry. 252 (1), 118-123 (1998).</li>
<li>Altmann, F., Schweiszer, S., Weber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+comparison+of+peptide%3A+N-glycosidases+F+and+A+reveals+several+differences+in+substrate+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconjugate+Journal%22%5BJournal%5D)">Kinetic comparison of peptide: N-glycosidases F and A reveals several differences in substrate specificity.</a> Glycoconjugate Journal. 12 (1), 84-93 (1995).</li>
<li>Wang, T., Voglmeir, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PNGases+as+valuable+tools+in+glycoprotein+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+and+Peptide+Letters%22%5BJournal%5D)">PNGases as valuable tools in glycoprotein analysis.</a> Protein and Peptide Letters. 21 (10), 976-985 (2014).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+and+characterization+of+a+novel+extremely+acidic+bacterial+N-glycanase+with+combined+advantages+of+PNGase+F+and+A%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience+Reports%22%5BJournal%5D)">Discovery and characterization of a novel extremely acidic bacterial N-glycanase with combined advantages of PNGase F and A.</a> Bioscience Reports. 34 (6), 00149(2014).</li>
<li>Du, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+sample+preparation+methodology+for+plant+N-.glycan+analysis+using+acid-stable+PNGase+H%2B%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rapid sample preparation methodology for plant N-.glycan analysis using acid-stable PNGase H+.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (48), 10550-10555 (2015).</li>
<li>Wang, T., Hu, X. -C., Cai, Z. -P., Voglmeir, J., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Qualitative+and+Quantitative+Analysis+of+Carbohydrate+Modification+on+Glycoproteins+from+seeds+of+Ginkgo+biloba%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Qualitative and Quantitative Analysis of Carbohydrate Modification on Glycoproteins from seeds of Ginkgo biloba.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (35), 7669-7679 (2017).</li>
<li>Ceroni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GlycoWorkbench%3A+a+tool+for+the+computer-assisted+annotation+of+mass+spectra+of+glycans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">GlycoWorkbench: a tool for the computer-assisted annotation of mass spectra of glycans.</a> Journal of Proteome Research. 7 (4), 1650-1659 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiony przez nas protokół pozwala na porównanie profili N-glikanów różnych odmian rzodkiewki. Istotną zaletą tej metody w porównaniu z istniejącymi protokołami jest to, że nie są wymagane żadne zmiany buforowe między enzymatycznym uwalnianiem N-glikanów a reakcją derywatyzacji z użyciem 2-AB. Najbardziej krytycznym etapem tej procedury jest oczyszczanie N-glikanów za pomocą kolumny SPE, ponieważ brak usunięcia soli lub innych zanieczyszczeń z mieszaniny reakcyjnej może negatywnie wpłynąć na wydaj...

N-glikany w roślinach przyciągnęły coraz większą uwagę w ostatnich latach, ponieważ poprzednie badania wykazały, że N-glikany są potencjalnym źródłem immunologicznych reakcji krzyżowych, które mogą wywoływać reakcje alergiczne1,2. Wykazano wcześniej, że N-glikany na glikoproteinach roślinnych mogą wpływać na aktywność katalityczną3,4, termostabilność i fałdowanie5,6 lub subkomórkowa lokalizacja i wydzielanie7. Aby skorelować struktury glikanów z ich odpowiednimi funkcjami, N-glikany muszą najpierw zostać uwolnione z glikoprotein chemicznie lub enzymatycznie. Klasyczną metodą chemiczną uwalniania zarówno N-, jak i O-glikanów jest eliminacja β, w której alkalicznej próbce towarzyszy redukcja borowodorkiem w celu uzyskania aldytolu8. Jednak procedura ta wyklucza znakowanie fluoroforem i powoduje znaczny rozpad jednostek monosacharydowych od redukującego końca struktury glikanu. Deglikozylacja chemiczna oparta na traktowaniu wodorotlenkiem/węglanem amonu jest również powszechnie stosowaną metodą alternatywną9. Żadna z tych chemicznych metod uwalniania nie powoduje degradacji nienaruszonych białek, co umożliwia analizę spektrometryczną mas nieznakowanych pul glikanów bez ingerencji fragmentów peptydów w tym samym zakresie mas. Jednak jedną z wad tych metod jest zwiększona szybkość degradacji α1,3-fukozylowanych N-glikanów, powszechnej struktury węglowodanowej występującej w roślinach10. Alternatywnie, szeroko stosowane są również enzymatyczne metody uwalniania z wykorzystaniem peptydowo-N-glikanaz (PNGazy, EC 3.5.1.52). Rekombinowana PNGaza F (z Flavobacterium meningosepticum) jest najczęstszym wyborem i pozwala na uwalnianie wszystkich typów N-glikanów, z wyjątkiem struktur zawierających rdzeń α1,3 fukozy11,12. Dlatego PNGaza A (wyizolowana z nasion migdałów) jest zwykle używana do analizy N-glikanów roślinnych13. Jednak enzym ten deglikozyluje tylko glikopeptydy pochodzące z proteolitu i nie jest w stanie deglikozylować natywnych glikoprotein14. W związku z tym przed dalszą analizą wymagane jest wieloetapowe badanie próbki, co powoduje rozległe straty glikanów, zwłaszcza tych o niskiej obfitości15. Ogólnym celem tej metody jest przedstawienie zoptymalizowanego przepływu pracy w zakresie uwalniania N-glikanów i znakowania fluorescencyjnego w prosty i niezawodny sposób. Podstawowym założeniem jest to, że PNGaza H+, która została niedawno odkryta w Terriglobus roseus i może być rekombinacyjnie wyrażana w E. coli, może hydrolizować N-glikany bezpośrednio z rusztowania białkowego w kwaśnych warunkach16. Kluczową zaletą stosowania PNGazy H+ w porównaniu z alternatywnymi metodami jest to, że reakcje znakowania fluorescencyjnego można przeprowadzać w tej samej probówce reakcyjnej bez zmiany reakcyjnych17,18. Proste warunki przygotowania i wysoki odzysk oligosacharydów o niskiej obfitości sprawiają, że metoda ta jest cennym narzędziem w analizie N-glikanów. Protokół ten jest odpowiedni do analizy N-glikanów z różnych gatunków roślin.

<table><tbody><tr><td>< silny> chemiczny: < / silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>kwas trichlorooctowy&nbsp;</td><td>SCR, Szanghaj</td><td>80132618</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy lodowaty</td><td>Huada, Kanton</td><td>64-19-7</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>Odczynnik ogólny</td><td>G80988C</td><td></td></tr><tr><td>Kwas trifluorooctowy</td><td>Energetyczny</td><td>W810031</td><td></td>chemiczny</tr><tr><td>2-aminobenzamid</td><td>Heowns, Tianjin</td><td>A41900</td><td></td></tr><tr><td>Cyjanoborowodorek sodu</td><td>J& K Scientific Ltd</td><td>314162</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Huada, Kanton</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>Drabinka dekstranowa znakowana 2AB, 200 pmol</td><td>Agilent Technologies</td><td>AT-5190-6998</td><td></td></tr><tr><td>6-Aza-2-tiotymina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>275514</td><td></td></tr><tr><td>Narzędzia/Materiały:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blender kuchenny</td><td>Niedźwiedź, Wirówka Guangzhou</td><td>LLJ-A10T1</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Parownik odśrodkowy Techcomp</td><td>CT15RT</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Hualida, kolumna Taicang</td><td>LNG-T120</td><td></td></tr><tr><td>SPE</td><td>Supelco</td><td>Supelclean ENVI Carb SPE kolumna</td><td></td></tr><tr><td>Spektrometr masowy MALDI-TOF</td><td>Bruker</td><td>Autoflex</td><td></td></tr><tr><td>HPLC Analysis:</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>fiolka HPLC o wysokim odzysku</td><td>Agilent Technologies</td><td>&nbsp;# 5188-2788</td><td></td></tr><tr><td>System HPLC</td> Detektor fluorescencji <td>Shimadzu</td><td>Nexera</td><td></td></tr><tr><td>do HPLC</td><td>Shimadzu</td><td>RF-20Axs&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Piec kolumnowy</td><td>Hengxin</td><td>CO-2000</td><td></td></tr><tr><td>HPLC Kolumna</td><td>Wody</td><td>Acquity UPLC BEH kolumna glikanowa</td><td>2,1 i razy; 150 mm, 1,7 &mu; m wielkość cząstek</td></tr><tr><td>Woda klasy LCMS</td><td>Merck Millipore</td><td>#WX00011</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl klasy LCMS</td><td>Merck Millipore</td><td># 100029</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy</td><td>Aladyn</td><td>F112034</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór amoniaku</td><td>Aladdin</td><td>A112080</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza n-glikanów z odmian raphanus sativus przy użyciu pngazy h+

Analysis of N-glycans from Raphanus sativus Cultivars Using PNGase H+

W ostatnich latach dużym zainteresowaniem poświęcono ugrupowania węglowodanowe roślin, ponieważ są one potencjalnym źródłem reakcji krzyżowych, wywołujących alergie odpowiedzi immunologicznych. Ponadto struktury węglowodanowe odgrywają również kluczową rolę w metabolizmie roślin. W tym miejscu przedstawiamy prostą i szybką metodę przygotowania i analizy N-glikanów z różnych odmian rzodkiewki (Raphanus sativus) przy użyciu N-glikanazy specyficznej dla uwalniania struktur węglowodanowych pochodzenia roślinnego. Aby to osiągnąć, surowe osady kwasu trichlorooctowego homogenatów rzodkiewki potraktowano PNGazą H+ i znakowano za pomocą 2-aminobenzamidu jako znacznika fluorescencyjnego. Znakowane próbki N-glikanów zostały następnie przeanalizowane za pomocą ultrasprawnej chromatografii cieczowej (UPLC) i spektrometrii mas z desorpcją laserową wspomaganą matrycą i jonizacją czasu przelotu (MALDI-TOF) w celu szczegółowej oceny strukturalnej i ilościowego określenia względnej obfitości struktur N-glikanów pochodzących z rzodkiewki. Protokół ten może być również wykorzystany do analizy N-glikanów z różnych innych gatunków roślin i może być przydatny do dalszych badań nad funkcją i wpływem N-glikanów na zdrowie człowieka.

Rysunek 1 przedstawia schematyczny przegląd opisanego protokołu, obejmujący izolację (gliko-)białek z rzodkiewki, przygotowanie N-glikanów, analizę UPLC oraz analizę MALDI-TOF-MS tych składników. Rysunek 2 przedstawia reprezentatywne chromatogramy UPLC pochodnych N-glikanów analizowanych odmian rzodkiewki. Rysunek 3 przedstawia uzyskane wyniki struktur N-glikanów pochodnych...

Opisujemy prostą i szybką metodę przygotowania i analizy N-glikanów z różnych odmian rzodkiewki (Raphanus sativus).

Analiza N-glikanów z odmian Raphanus sativus przy użyciu PNGazy H+

In recent years, the carbohydrate moieties of plants have received considerable attention, as they are a potential source of cross-reactive, ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na pytania z zakresu glikonauki roślinnej, takie jak to, w jaki sposób można szybko analizować i charakteryzować N-glikany pochodzenia roślinnego. Główną zaletą tej techniki jest to, że nie wymaga ona żadnych zmian buforowych między enzymatycznym uwalnianiem N-glikanów a reakcjami derywatyzacji z 2-aminobenzamidem. Procedurę zademonstrują panna Ya-Min Du i panna Shen-Li Zhen; dwóch doktorantów z Centrum Badawczego Glikomiksu i Bioinżynierii Glikanów na Uniwersytecie Rolniczym w Nankinie.Aby rozpocząć izolowanie białek, użyj blendera kuchennego, aby homogenizować około 100 gramów świeżej rzodkiewki przez dziesięć minut. Przenieś powstałą zawiesinę do 50-mililitrowej probówki wirówkowej. Wirować przy 14 000 razy grawitacji w czterech stopniach Celsjusza przez 20 minut, aby usunąć nierozpuszczalny materiał.Następnie ostrożnie przenieś supernatant do nowej 50-mililitrowej probówki wirówkowej. Dodać równą ilość dwumolowego roztworu kwasu trichlorooctowego. Wirować pod ciśnieniem 14 000 razy większym niż grawitacja w czterech stopniach Celsjusza przez 30 minut.A następnie usuń supernatant. Umyj granulkę 20 mililitrami wody dejonizowanej. Odwirować ponown

analysis-of-n-glycans-from-raphanus-sativus-cultivars-using-pngase-h

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opisujemy metodę analizy zmian w glikanach typu N w początkowej fazie życia glikoprotein po ich biosyntezie w komórkach ssaków. Jest to realizowane poprzez analizę pulse-chase metabolicznie znakowanych glikanów, ich enzymatyczne uwalnianie z glikoprotein oraz badanie za pomocą HPLC.

Analiza typu pulse-chase łańcuchów cukrowych wiązanych glikozydowo do azotu (N-glikanów) w glikoproteinach komórek ssaków

Opisano szybką metodę pozwalającą na poznanie struktury polisacharydów w macierzy zewnątrzkomórkowej. Metoda ta wykorzystuje specyficzność glikozylohydrolaz oraz czułość spektrometrii mas, co umożliwia analizę niewielkich ilości materiału. Technikę tę można dostosować do bezpośredniego zastosowania w tkance.

Profilowanie masy oligosacharydów (OLIMP) wielocukrów zewnątrzkomórkowych

Użycie specyficznych glikozydaz do usuwania cukrów z glikoprotein, a następnie przeprowadzenie elektroforezy SDS-PAGE, jest cenną metodą wykrywania modyfikacji glikanowych w próbkach białek i stanowi dobry wybór do wstępnych badań z zakresu glikobiologii. Zmiany występujące po deglikozylacji można wykryć jako przesunięcia w mobilności w żelu lub poprzez barwienie odczynnikami wrażliwymi na glikany.

Identyfikacja i charakterystyka glikozylacji białek przy użyciu specyficznych endo- i egzoglikozydaz

Opisano technikę o nazwie Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP), służącą do charakterystyki glikanów ścian komórkowych roślin. Metoda ta łączy specyficzność przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko określonym epitopom glikanów z miniaturową analityczną platformą mikromacierzy, która umożliwia przesiewowe badanie występowania glikanów w szerokim zakresie kontekstów biologicznych.

Profilowanie glikanów polimerów ściany komórkowej roślin z wykorzystaniem mikromacierzy

Protokół o wysokiej przepustowości został opracowany dla połączonego oczyszczania proteomiki i glikomiki oraz kwantyfikacji LC-MS/MS w osoczu. Analiza deamidacji motywów glikozylacji sprzężonych z N była specyficzna dla miejsc deglikozylowanych. Dokładne oznaczanie ilościowe N-glikanów osiągnięto poprzez sprzężenie separacji N-glikanów wspomaganej filtrem z normalizacją indywidualności podczas znakowania strategią znaczników hydrazydu glikanów.

Ilościowa glikomika i proteomika połączone ze strategią oczyszczania

Ten artykuł przedstawia ulepszoną formę nowatorskiej techniki glikomicznej od dołu do góry, przeznaczonej do analizy zbiorczego profilu składu glikanów w niefrakcjonowanych biopłynach poprzez chemiczny rozkład glikanów na ich składowe specyficzne dla wiązania monosacharydy do wykrycia przez GC-MS. Potencjalne zastosowania obejmują wczesne wykrywanie raka i innych zaburzeń glikanowo-afektywnych.

Analiza węzłów glikanowych: oddolne podejście do glikomiksu

Opisano protokół analizy strukturalnej polisacharydów metodą elektroforezy żelowej (PACE), na przykładzie mannanu.

Charakterystyka strukturalna polisacharydów ściany komórkowej Mannanów w roślinach przy użyciu PACE

Immunoglobulina G (IgG) N-glikan jest scharakteryzowany za pomocą hydrofilowej chromatografii oddziaływań UPLC. Ponadto struktura N-glikanu IgG jest wyraźnie oddzielona. Przedstawiono tutaj wprowadzenie do tej metody eksperymentalnej, tak aby mogła być szeroko stosowana w warunkach badawczych.

Analiza N-glikanu immunoglobuliny G metodą ultrasprawnej chromatografii cieczowej

Profilowanie polimerów w mikromatrycach (MAPP) to wysokoprzepustowa technika analizy składu glikanów w próbkach biologicznych.

Profilowanie polimerów w mikromacierzy (MAPP) do wysokoprzepustowej analizy glikanów

Przedstawiamy szczegółowy protokół uwalniania O-glikanów z mucyn oraz późniejszego odsolania, permetylacji i analizy za pomocą spektrometrii mas MALDI-TOF.

Profilowanie permetylowanych mulynowych O-glikanów za pomocą laserowej desorpcji/jonizacji wspomaganej matrycą w czasie przelotu

Poznaj uproszczoną metodę analizy N-glikanów z różnych odmian rzepy Raphanus sativus przy użyciu PNGazy H+. Technika eliminuje zmiany buforu podczas hydrolizy enzymatycznej i derywatyzacji z 2-aminobenzamidem.

Analiza N-glikanów z odmian Raphanus sativus przy użyciu PNGazy H⁺

Przeglądaj więcej filmów