Name: Nowatorska technika chirurgiczna jako podstawa częściowej inżynierii wątroby in vivo u szczurów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 27 s
Description: Poznaj nową technikę chirurgiczną perfuzji płata wątroby in vivo u szczurów jako podstawę częściowej inżynierii wątroby. Metoda zapewnia długoterminowe przeżycie i utrzymanie funkcji wątroby.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy chcieliby podziękować Jensowi Geilingowi z Instytutu Anatomii I, Szpitala Uniwersyteckiego w Jenie, za stworzenie schematycznych rysunków anatomii wątroby szczura.

Pomieszczenia i wszystkie przeprowadzone procedury były zgodne z niemieckim ustawodawstwem dotyczącym dobrostanu zwierząt. Wszystkie gazy, ubrania okrywające i narzędzia chirurgiczne są sterylizowane w autoklawie i przygotowywane przed operacją. Wszystkie zabiegi przeprowadzane są w sterylnych warunkach.
1. Przygotowanie szczura do zabiegu chirurgicznego
<ol>
	<li>Umieść szczura w komorze indukcyjnej i znieczulaj go 4% odparowanym izofluranem i 100% tlenem w tempie 0,5 l/min przez około 3 minuty, aż szczur zostanie całkowicie znieczulony.</li>
	<li>Wyjmij szczura z komory indukcyjnej i zmierz jego masę ciała.</li>
	<li>Ogol sierść okolicy operacyjnej na brzuchu.</li>
	<li>Umieść zwierzę z powrotem w komorze izofluranu na dodatkowe 2 minuty, aby pogłębić znieczulenie.</li>
	<li>Umieść szczura na stole operacyjnym w pozycji leżącej.</li>
	<li>Przymocuj maskę anestezjologiczną do ust szczura i utrzymuj zwierzę w stanie znieczulenia ciągłym przepływem gazu składającego się z 2% odparowanego izofluranu i 100% tlenu przy natężeniu przepływu 0,5 l/min.</li>
	<li>Przymocuj kończyny za pomocą kawałków taśmy.</li>
	<li>Nałóż maść weterynaryjną na oba oczy, aby zapobiec wysuszeniu.</li>
	<li>Buprenorfinę należy podawać podskórnie w dawce 0,05 mg/kg mc. w celu złagodzenia bólu w okresie operacji.</li>
	<li>Zdezynfekuj pole operacyjne jamy brzusznej za pomocą 3 rund nalewki jodowej, a następnie 2 rund 70% alkoholu.</li>
	<li>Umieść wysterylizowaną gazę wokół obszaru, w którym zostanie wykonane nacięcie, aby pozostawić odsłonięte pole operacyjne brzucha.</li>
	<li>Przystąp do wykonania operacji, gdy odruch wycofania się z palca u szczura jest nieobecny.</li>
</ol>
2. Laparotomia szczura
<ol>
	<li>Wykonaj poprzeczne nacięcie skóry i mięśni brzucha za pomocą nożyczek i koagulatora elektrycznego.</li>
	<li>Zamocuj i pociągnij wyrostek mieczykowaty w kierunku głowy za pomocą nici polipropylenowego 4-0. 
	UWAGA: Zwróć uwagę, aby podnieść wyrostek mieczykowaty pionowo, aby lepiej odsłonić wątrobę, ale postępuj ostrożnie, aby uniknąć poważnego ograniczenia oddychania i uduszenia.</li>
	<li>Otwórz jamę otrzewnej, pociągając obie strony ścian brzucha w kierunku głowy za pomocą dwóch haczyków podżebrowych, aby odsłonić wątrobę.</li>
	<li>Przykryj dwunastnicę i jelito cienkie w jamie brzusznej zwilżoną gazą, aby uniknąć wysuszenia.</li>
	<li>Podnieś lewy i prawy płat środkowy do góry za pomocą zwilżonej gazy i przyłóż je do klatki piersiowej, aby lepiej odsłonić wnękę wątroby.</li>
	<li>Umieść szczura pod mikroskopem stereoskopowym (8-krotne powiększenie).</li>
	<li>Wlewaj trochę ciepłej soli fizjologicznej do jamy brzusznej i na powierzchnię wątroby i jelit co kilka minut, aby zapobiec wysuszeniu podczas całego zabiegu.</li>
</ol>
3. Utworzenie przejścia obejściowego w obrębie lewego płata bocznego
<ol>
	<li>Wyciąć lewą żyłę wrotną i podwiązać ją za pomocą jedwabnego szwu 6-0 u podstawy (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2A).</li>
	<li>Zablokuj lewą tętnicę wątrobową, lewy przewód żółciowy wraz z lewą żyłą wrotną pośrodkową, lewą pośrodkową tętnicę wątrobową i lewy środkowy przewód żółciowy za pomocą mikrozacisków, aby zapobiec przepływowi perfuzatu do lewego środkowego płata (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2B).</li>
	<li>Oddziel lewy płat boczny, odcinając otaczające więzadła płata mikronożyczkami.</li>
	<li>Zablokuj lewą boczną żyłę wątrobową, zaciskając u podstawy lewego płata bocznego za pomocą mikrozacisków (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C). 
	UWAGA: Upewnij się, że przez pomyłkę nie zaciskasz również lewej żyły wrotnej.</li>
	<li>Użyj zacisków na komary, aby przytrzymać ligaturę lewej żyły wrotnej i utrzymuj żyłę z odpowiednim napięciem do późniejszej kaniulacji.</li>
	<li>Ostrożnie wykonaj nacięcie w przedniej ścianie lewej żyły wrotnej, nakłuwając ją cewnikiem 24-G z igłą ( <silna klasa = "xfig" >Rysunek 3A). 
	UWAGA: Aby utworzyć bypass, potrzebne są punkty dostępu naczyniowego na lewej żyle wrotnej i lewej żyle wątrobowej. Na tym etapie preferowane jest utworzenie dostępu naczyniowego poprzez nakłucie naczyń igłą, a nie wykonywanie większego nacięcia za pomocą nożyczek. Zmniejsza to ryzyko krwawienia i późniejszego zwężenia.</li>
	<li>Wyjmij cewnik i wyjmij igłę z cewnika, aby uzyskać bezigłowy cewnik 24-G.</li>
	<li>Podłączyć cewnik do rurki perfuzyjnej, której drugi punkt końcowy łączy się ze strzykawką o pojemności 20 ml z 15 ml soli fizjologicznej w strzykawce o stężeniu 40 j./ml heparynizowanej soli fizjologicznej na pompie perfuzyjnej.</li>
	<li>Włącz pompę do perfuzji rurki w celu usunięcia powietrza z rurki i cewnika bezigłowego.</li>
	<li>Wyłącz pompę perfuzyjną.</li>
	<li>Ponownie wprowadź bezigłowy cewnik do lewej żyły wrotnej przez nakłute nacięcie na żyle (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3B). 
	UWAGA: Ze względu na to, że przestrzeń do zamocowania cewnika jest bardzo ograniczona, nie jest on w tym miejscu zamocowany. Dlatego chirurg powinien zachować ostrożność, aby uniknąć przemieszczenia cewnika kaniulowanego.</li>
	<li>Ostrożnie wykonaj kolejne nacięcie na brzegu odsłoniętego obszaru lewej bocznej żyły wątrobowej, nakłuwając ją cewnikiem igłowym 22 lub 24 G (<silna klasa="xfig">Ryc. 3C). 
	UWAGA: Zaleca się, aby cewnik był nieco mniejszy niż naczynie.</li>
	<li>Wyjmij cewnik i wyjmij igłę z cewnika, aby uzyskać bezigłowy cewnik 22-G.</li>
	<li>Włączyć pompę perfuzyjną, aby perfuzja heparynizowanego roztworu soli fizjologicznej do lewego płata bocznego za pomocą kaniulowanego cewnika bezigłowego 24-G lewej żyły wrotnej z szybkością przepływu 0,5 ml / min.</li>
	<li>Użyj suchej gazy, aby wchłonąć odpływający płyn odpadowy wokół obszaru nacięcia lewej bocznej żyły wątrobowej.</li>
	<li>Kankaniutować lewą boczną żyłę wątrobową poprzez nakłucie żyły za pomocą bezigłowego cewnika 22-G, aby wytworzyć ujście płynu w celu zminimalizowania zanieczyszczenia wewnątrz jamy brzusznej (<klasa silna = "xfig">Rysunek 3D). 
	UWAGA: Technicznie trudno jest przymocować kaniulowany cewnik do płata wątroby. Dlatego chirurg powinien zwrócić uwagę, aby uniknąć przemieszczenia cewnika. Alternatywnie, bez kaniulacji lewej bocznej żyły wątrobowej za pomocą cewnika, odzysk płynu może być również wchłonięty w obszarze nacięcia żyły tylko za pomocą suchej gazy.</li>
	<li>Kontynuuj perfuzję lewego płata bocznego solą fizjologiczną heparynizowaną przez około 20 minut (grupa 1), a następnie tylko solą fizjologiczną przez 2 godziny, 3 godziny lub 4 godziny (odpowiednio grupa 2, grupa 3 i grupa 4).</li>
	<li>Wyłącz pompę, aby zatrzymać perfuzję.</li>
</ol>
4. Fizjologiczna reperfuzja lewego płata bocznego
<ol>
	<li>Zdejmij oba cewniki z lewej żyły wrotnej i lewej bocznej żyły wątrobowej.</li>
	<li>Zamknij nacięcie lewej żyły wrotnej szwem poliamidowym 11-0.</li>
	<li>Nacięcie lewej bocznej żyły wątrobowej należy również zamknąć szwem poliamidowym 11-0.</li>
	<li>Odkręcić lewą boczną żyłę wątrobową.</li>
	<li>Odblokuj lewą żyłę wrotną pośrodkową, lewy przewód żółciowy i lewą tętnicę wątrobową.</li>
	<li>Odetnij ligaturę na lewej żyle wrotnej, aby ponownie otworzyć żyłę.</li>
</ol>
5. Zamknięcie ściany brzucha
<ol>
	<li>Zamknij warstwę mięśniową ściany brzucha poprzez przerwanie szycia szwem 4-0 z wchłanialnej poliglaktyny 910.</li>
	<li>Zamknąć warstwę skóry ściany brzucha poprzez przerwanie szycia wchłanialnym szwem polidioksanonowym 4-0.</li>
	<li>Po zamknięciu brzucha należy zdezynfekować nacięcie skóry 70% alkoholem.</li>
</ol>
6. Leczenie pooperacyjne szczura
<ol>
	<li>Umieść zwierzę na podkładce rozgrzewającej do resuscytacji na około 10 minut, a następnie umieść je w nowej klatce.</li>
	<li>Podawać buprenorfinę w dawce 0,05 mg/kg podskórnie 2 razy dziennie przez kolejne 3 dni po operacji, aby złagodzić ból.</li>
</ol>

<ol><li>Kim, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OPTN+%2F+SRTR+2016+Annula+Data+Report%3A+Liver%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation.+Suppl%22%5BJournal%5D)">OPTN / SRTR 2016 Annula Data Report: Liver.</a> American Journal of Transplantation. Suppl. 1, 172-253 (2018).</li>
<li>Palakkan, A. A., Hay, D. C., Anil Kumar, P. R., Kumary, T. V., Ross, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+tissue+engineering+and+cell+sources%3A+issues+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+International%22%5BJournal%5D)">Liver tissue engineering and cell sources: issues and challenges.</a> Liver International. 33, 666-676 (2013).</li>
<li>Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix%3A+not+just+pretty+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix: not just pretty fibrils.</a> Science. 326, 1216-1219 (2009).</li>
<li>Flaim, C. J., Chien, S., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extracellular+matrix+microarray+for+probing+cellular+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">An extracellular matrix microarray for probing cellular differentiation.</a> Nature Methods. 2, 119-125 (2005).</li>
<li>Wells, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+matrix+stiffness+in+regulating+cell+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">The role of matrix stiffness in regulating cell behavior.</a> Hepatology. 47, 1394-1400 (2008).</li>
<li>Ren, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+two+decellularization+methods+in+the+development+of+a+whole-organ+decellularized+rat+liver+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+International%22%5BJournal%5D)">Evaluation of two decellularization methods in the development of a whole-organ decellularized rat liver scaffold.</a> Liver International. 33, 448-458 (2013).</li>
<li>Yagi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human-scale+whole-organ+bioengineering+for+liver+transplantation%3A+a+regenerative+medicine+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Human-scale whole-organ bioengineering for liver transplantation: a regenerative medicine approach.</a> Cell Transplantation. 22, 231-242 (2013).</li>
<li>Jiang, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-chemical+decellularization+of+the+whole+liver+for+mesenchymal+stem+cells-based+functional+hepatic+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Cryo-chemical decellularization of the whole liver for mesenchymal stem cells-based functional hepatic tissue engineering.</a> Biomaterials. 35, 3607-3617 (2014).</li>
<li>Uygun, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+reengineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nature Medicine. 16, 814-820 (2010).</li>
<li>Baptista, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+whole+organ+decellularization+for+the+generation+of+a+vascularized+liver+organoid%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid.</a> Hepatology. 53, 604-617 (2011).</li>
<li>Bruinsma, B. G., Kim, Y., Berendsen, T. A., Yarmush, M. L., Uygun, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layer-by-layer+heparinization+of+decellularized+liver+matrices+to+reduce+thrombogenicity+of+tissue+engineered+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+and+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Layer-by-layer heparinization of decellularized liver matrices to reduce thrombogenicity of tissue engineered grafts.</a> Journal of Clinical and Translational Research. 1 (1), (2015).</li>
<li>Park, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+Liver+Extracellular+Matrix+as+Promising+Tools+for+Transplantable+Bioengineered+Liver+Promotes+Hepatic+Lineage+Commitments+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Decellularized Liver Extracellular Matrix as Promising Tools for Transplantable Bioengineered Liver Promotes Hepatic Lineage Commitments of Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Tissue Engineering Part A. 22, 449-460 (2014).</li>
<li>Ko, I. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+transplantable+porcine+livers+with+re-endothelialized+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Bioengineered transplantable porcine livers with re-endothelialized vasculature.</a> Biomaterials. 40, 72-79 (2015).</li>
<li>Bao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+portal+implantable+functional+tissue-engineered+liver+using+perfusion-decellularized+matrix+and+hepatocytes+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Construction of a portal implantable functional tissue-engineered liver using perfusion-decellularized matrix and hepatocytes in rats.</a> Cell Transplantation. 20, 753-766 (2011).</li>
<li>Pan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vivo+organ+engineering%3A+Perfusion+of+hepatocytes+in+a+single+liver+lobe+scaffold+of+living+rats%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">In-vivo organ engineering: Perfusion of hepatocytes in a single liver lobe scaffold of living rats.</a> The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 80, 124-131 (2016).</li>
<li>Madrahimov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marginal+hepatectomy+in+the+rat%3A+from+anatomy+to+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Marginal hepatectomy in the rat: from anatomy to surgery.</a> Annals of Surgery. 244, 89-98 (2006).</li>
<li>Mussbach, F., Settmacher, U., Dirsch, O., Dahmen, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+Livers%3A+A+New+Tool+for+Drug+Testing+and+a+Promising+Solution+to+Meet+the+Growing+Demand+for+Donor+Organs%5BTitle%5D)+AND+%22European+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">Bioengineered Livers: A New Tool for Drug Testing and a Promising Solution to Meet the Growing Demand for Donor Organs.</a> European Surgical Research. 57, 224-239 (2016).</li>
<li>Mussbach, F., Settmacher, U., Dirsch, O., Dahmen, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+engineering+as+a+new+source+of+donor+organs%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Der+Chirurg%22%5BJournal%5D)">Liver engineering as a new source of donor organs: A systematic review.</a> Der Chirurg. 87, 504-513 (2016).</li>
<li>Xie, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+systemic+and+hepatic+hemodynamic+parameters+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Monitoring of systemic and hepatic hemodynamic parameters in mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (92), e51955(2014).</li>
<li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+and+Recellularization+of+Rat+Livers+With+Hepatocytes+and+Endothelial+Progenitor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Artificial+Organs%22%5BJournal%5D)">Decellularization and Recellularization of Rat Livers With Hepatocytes and Endothelial Progenitor Cells.</a> Artificial Organs. 40, E25-E38 (2016).</li>
<li>Yagi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human-scale+whole-organ+bioengineering+for+liver+transplantation%3A+a+regenerative+medicine+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Human-scale whole-organ bioengineering for liver transplantation: a regenerative medicine approach.</a> Cell Transplantation. 22, 231-242 (2013).</li>
<li>Otsuka, H., Sasaki, K., Okimura, S., Nagamura, M., Nakasone, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterned+co-culture+of+hepatocyte+spheroids+layered+on+non-parenchymal+cells+to+understand+heterotypic+cellular+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Science+and+Technology+of+Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Micropatterned co-culture of hepatocyte spheroids layered on non-parenchymal cells to understand heterotypic cellular interactions.</a> Science and Technology of Advanced Materials. 14, 065003(2013).</li>
<li>Bale, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+coculture+strategies+for+primary+hepatocytes+and+liver+sinusoidal+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">Long-term coculture strategies for primary hepatocytes and liver sinusoidal endothelial cells.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 21, 413-422 (2015).</li>
<li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+perfusion-decellularization+methods+of+porcine+livers+for+clinical-scale+whole-organ+bioengineering%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Optimizing perfusion-decellularization methods of porcine livers for clinical-scale whole-organ bioengineering.</a> BioMed Research International. , 785474(2015).</li>
<li>Barakat, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+decellularized+porcine+liver+for+engineering+humanized+liver+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">Use of decellularized porcine liver for engineering humanized liver organ.</a> Journal of Surgical Research. 173 (1), e11-e25 (2012).</li>
<li>Navarro-Tableros, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recellularization+of+rat+liver+scaffolds+by+human+liver+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Recellularization of rat liver scaffolds by human liver stem cells.</a> Tissue Engineering Part A. 21 (11-12), 1929-1939 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Blokując i kaniulując lewą żyłę wrotną za pomocą cewnika jako wlotu płynu oraz lewą boczną żyłę wątrobową za pomocą innego cewnika jako ujścia płynu, udało nam się uzyskać płynowe obejście in vivo w lewym płacie bocznym, co wskazuje, że chociaż technika ta jest bardzo trudna ze względu na mały rozmiar naczyń do kaniulacji i wysokie ryzyko spowodowania krwawienia, Jest to wykonalne. Nawet szczury poddawane długiemu okresowi perfuzji wynoszącemu 4 godziny przeżyły co najmniej 1 tydzień, co pokazuje, że szczury mo...

Wskazania do przeszczepiania narządów stale się poszerzają. Z kolei wskaźniki dawstwa narządów i ogólna jakość narządów spadają, co prowadzi do rosnącego zapotrzebowania na przeszczepy. Liczba kandydatów dodanych do listy oczekujących na przeszczep wątroby stale rosła (np. w Stanach Zjednoczonych w 2016 r. dodano 11 340 pacjentów, w porównaniu z 10 636 w 2015 r.)1. Pomimo znacznych wysiłków, liczba dostępnych narządów nie odpowiada potrzebom klinicznym. Ze względu na zwiększoną częstość występowania chorób wątroby wielu pacjentów ze schyłkową fazą chorób wątroby umiera z listy oczekujących na przeszczep, zanim narząd dawcy stanie się dostępny. Aby sprostać ogromnemu zapotrzebowaniu na przeszczepy wątroby od dawców, aktywnie poszukuje się alternatywnych podejść wykorzystujących zasady inżynierii tkankowej wątroby2. W dzisiejszych czasach nowo opracowana biologiczna technika inżynierii wątroby może potencjalnie przezwyciężyć ten niedobór.
Inżynieria wątroby składa się z dwóch etapów: wytworzenia rusztowania bezkomórkowego, po którym następuje ponowne zasiedlenie rusztowania. Aby uzyskać biologiczne bezkomórkowe rusztowanie wątroby, eksplantowana wątroba jest perfundowana przez układ naczyniowy za pomocą jonowych lub niejonowych detergentów, które mogą usunąć materiał komórkowy z wątroby. W większości wcześniejszych badań biologiczne bezkomórkowe rusztowanie wątroby uzyskano przez perfuzję wątroby z kombinacją dodecylosiarczanu sodu i TritonX100. W efekcie wszystkie komórki zostały usunięte, przy jednoczesnym zachowaniu struktury macierzy zewnątrzkomórkowej. Rusztowania narządowe zostały ponownie obsiane dojrzałymi komórkami, liniami komórkowymi wątrobowokomórkowymi, a także śródbłonkowymi oraz pierwotnymi hepatocytami z jednoczesnym zastosowaniem lub bez jednoczesnego zastosowania komórek śródbłonka lub mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC). Większość badaczy skupia się na inżynierii wątroby ex vivo3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14. Jednak w większości poprzednich badań tylko małe kawałki ponownie zasiedlonych kostek rusztowania przeszczepiano do różnych heterotopowych miejsc implantacji. W kilku badaniach częściowo zasiedlone rusztowania przeszczepiono jako przeszczep pomocniczy. Jednak maksymalny zgłoszony czas przeżycia wynosił tylko 72 h8,14. O ile nam wiadomo, ortotopowe przeszczepienie pełnego przeszczepu wątroby nie zostało jeszcze przeprowadzone ani opublikowane. Długoterminowe funkcjonowanie i przeszczepianie zmodyfikowanych narządów jest wciąż w powijakach. Dlatego potrzebne jest alternatywne podejście do inżynierii wątroby ex vivo.
Inżynieria wątroby in vivo może stanowić alternatywę dla badania odbudowy wątroby w warunkach fizjologicznych. Zalety inżynierii wątroby in vivo w porównaniu z inżynierią wątroby ex vivo są wielorakie. Częściowe rusztowanie wątrobowe in vivo poddawane jest fizjologicznej perfuzji krwi o odpowiedniej temperaturze, wystarczającej ilości tlenu, składników odżywczych i czynników wzrostu, w przeciwieństwie do perfuzji ex vivo ze sztuczną pożywką hodowlaną. Co więcej, pozostała częściowo normalna wątroba utrzymuje funkcję wątroby, głównie umożliwiając długoterminowe przeżycie. Ponieważ wszczepiony przeszczep wątroby zmodyfikowany ex vivo nadal nie jest w stanie utrzymać długoterminowego przeżycia zwierząt doświadczalnych ze względu na funkcję wątroby8, przewidujemy, że częściowa inżynieria wątroby in vivo ostatecznie stanie się obiecującym modelem do dalszych badań nad ewolucją zmodyfikowanych wątroby z dłuższymi obserwacjami przeżycia niż ex vivo.
Niedawno, jedna grupa badawcza (Pan i współpracownicy) zaprezentowała, po raz pierwszy, technikę inżynierii wątroby in vivo15. Udało im się uzyskać izolowaną perfuzję prawego dolnego płata wątroby u żywych szczurów, pomimo wyzwań anatomicznych i technicznych. Poinformowali o pierwszych śródoperacyjnych wynikach ponownego zasiedlenia in vivo przy użyciu pierwotnej linii komórek hepatocytów szczura. Jednak chirurgiczny model perfuzji in vivo Pan i wsp. ma wady. Udało im się osiągnąć perfuzję pojedynczego płata wątroby u szczurów kosztem całkowitego zablokowania żyły wrotnej i żyły głównej dolnej, co może spowodować poważne szkody dla zwierzęcia. Szczury doświadczalne zostały uśmiercone po zaledwie 6 godzinach obserwacji śródoperacyjnej. Dlatego technika perfuzji płata wątroby in vivo wymaga dalszej poprawy, aby osiągnąć przeżycie pooperacyjne.
Opracowaliśmy nowy model przeżycia dla in vivo perfuzji płatów wątroby, oparty na wcześniejszych badaniach anatomii wątroby szczura16, technika kaniulacji żyły wrotnej do monitorowania hemodynamicznego u myszy17, oraz bioinżynieria wątroby18,19. Kluczowe kroki procedury są zilustrowane w Rysunek 1A - 1E.
Ta technika jest odpowiednia dla tych, którzy chcą wykorzystać ten eksperymentalny model perfuzji in vivo do podstawowych badań nad częściowym leczeniem narządów przez infuzję z lekami, decelularyzacja in vivo jako chemiczna resekcja chorób narządów (np. raka wątroby), hodowla komórkowa in vivo w matrycy decellularnej porównująca ex vivo dwuwymiarowe i trójwymiarowe systemy hodowli komórek<klasa sup="xref">20,21,22,23,24,25,26, oraz inżynieria wątroby in vivo poprzez decelularyzację i ponowne zasiedlenie.

<table><tbody><tr>Pompa <td></td><td></td><td></td><td>perfuzyjna</td></tr><tr><td>Perfusor VI</td><td>B. Braun,</td> Cewnik Melsungen <td></td><td></td></tr><tr><td></td> Versatus-W&nbsp;<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cewnik</td><td>Terumo</td><td>SR+DU2419PX</td><td>24G, 0,74&razy; 19mm</td></tr><tr><td>Versatus-W&nbsp; Cewnik</td><td>Terumo</td><td>SR+DU2225PX</td><td>22G, 0,9 i razy; </td></tr><tr><td>Mikro nożyczki do mikronarzędzi</td><td></td><td></td><td></td>chirurgicznych</tr> 25 mm <tr><td></td><td>F i middot; S&middot; L</td><td>nr 14058-09</td><td></td></tr><tr><td>mikro serrefine</td><td>F&middot; S&middot; L</td><td>No.18055-05</td><td></td></tr><tr><td>Aplikator mikrozacisków</td><td>F&middot; S&middot; L</td><td>nr 18057-14</td><td></td></tr><tr><td>Mikrokleszczyki proste</td><td>F&middot; S&middot; L</td><td>nr 00632-11</td><td></td></tr><tr><td>Zakrzywione mikrokleszczyki</td><td>F&middot; S&middot; L</td><td>nr 00649-11</td><td></td></tr><tr><td>mikro uchwyt na igły</td><td>F&middot; S&middot; L</td><td>nr 12061-01</td><td></td></tr><tr><td>ogólne narzędzia</td><td></td><td></td><td></td>chirurgiczne</tr><tr><td>standardowe sissors</td><td>F&middot; S&middot; L</td><td></td><td></td></tr><tr><td>zacisk na komary</td><td>F&middot; S&middot; L</td><td></td><td></td></tr><tr><td>kleszcz ząbkowany</td><td>F&middot; S&middot; L</td><td></td><td></td></tr><tr><td>kleszczyk ząbkowany</td><td>F&middot; S&middot; L</td><td></td><td></td></tr><tr><td>uchwyt na igłę</td><td>F&middot; S&middot; Szew</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> L <tr><td>4-0 prolene</td><td>ethicon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-0 ETHICON*II</td><td>ethicon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-0 jedwab</td><td>ethicon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>11-0 poliamid</td><td>ethicon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

nowatorska technika chirurgiczna jako podstawa częściowej inżynierii wątroby in vivo u szczurów

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

Inżynieria narządów to nowatorska strategia generowania substytutów narządów wątroby, które potencjalnie mogą być wykorzystane w transplantacji. Ostatnio inżynieria wątroby in vivo, w tym decelularyzacja narządów in vivo, a następnie ponowne zasiedlenie, okazała się obiecującym podejściem w porównaniu z inżynierią wątroby ex vivo. Nie udało się jednak osiągnąć przeżycia pooperacyjnego. Celem niniejszej pracy jest opracowanie nowatorskiej techniki chirurgicznej selektywnej perfuzji płatów wątroby in vivo u szczurów jako warunku wstępnego inżynierii wątroby in vivo. Obwod omijamy tylko przez lewy płat boczny. Następnie lewy płat boczny jest perfundowany heparynizowaną solą fizjologiczną. Eksperyment przeprowadza się w 4 grupach (n = 3 szczury w grupie) w oparciu o różne czasy perfuzji 20 min, 2 h, 3 h i 4 h. Przeżycie, jak również makroskopowo widoczna zmiana koloru i histologicznie określony brak komórek krwi w triadzie wrotnej i sinusoidach, są traktowane jako wskaźnik udanego ustanowienia modelu. Po selektywnej perfuzji lewego płata bocznego obserwujemy, że lewy płat boczny rzeczywiście zmienił kolor z czerwonego na bladożółty. W ocenie histologicznej nie są widoczne żadne komórki krwi w gałęzi żyły wrotnej, żyle centralnej i sinusoidach. Lewy płat boczny zmienia kolor na czerwony po ponownym otwarciu zablokowanych naczyń. 12/12 szczurów przeżyło zabieg dłużej niż tydzień. Jako pierwsi przedstawiliśmy model chirurgiczny perfuzji pojedynczego płata wątroby in vivo z długim okresem przeżycia wynoszącym ponad tydzień. W przeciwieństwie do wcześniej opublikowanego raportu, najważniejszą zaletą przedstawionej tu techniki jest to, że perfuzja 70% wątroby jest zachowana przez cały czas trwania zabiegu. Opracowanie tej techniki stanowi podstawę do częściowej inżynierii wątroby in vivo u szczurów, w tym decelularyzacji i recelularyzacji.

Do oceny efektu selektywnej perfuzji płata wątroby wykorzystano dwanaście samców szczurów szczepu Lewis (w wieku 12–13 tygodni). Eksperyment przeprowadzono w czterech grupach (n = 3 szczury na grupę). Stosując różne okresy perfuzji wynoszące 20 minut, 2 godziny, 3 godziny oraz 4 godziny, zgodnie z opisanymi powyżej krokami, pomyślnie przeprowadzono perfuzję pojedynczego płata in vivo.
In Vivo</stron...

Ustanawiamy nowatorską technikę chirurgiczną dla modelu perfuzji pojedynczego płata wątroby in vivo u szczurów jako warunek wstępny do dalszych badań in vivo częściowej inżynierii wątroby w przyszłości.

Nowatorska technika chirurgiczna jako podstawa częściowej inżynierii wątroby in vivo u szczurów

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...

W ciągu ostatnich kilku lat inżynieria wątroby stała się gorącym tematem na całym świecie ze względu na jej potencjał w generowaniu przeszczepów wątroby nadających się do przeszczepu. Jednak opłacalna długoterminowa funkcja i przeszczepianie zmodyfikowanych narządów są nadal wizją przyszłości. Ostatnio profuzja płatów wątroby in vivo stała się obiecującą strategią rozpoczęcia inżynierii wątroby.Główną zaletą tej techniki jest to, że in vivo, ponownie zasiedlone częściowe rusztowanie wątroby poddane skatologicznej obfitości krwi. Zapewnia to rusztowaniu odpowiednią temperaturę, wystarczającą ilość tlenu, składników odżywczych i czynników wzrostu, w przeciwieństwie do obfitości ex-vivo ze sztuczną pożywką hodowlaną. Kolejną zaletą jest to, że pozostała wątroba utrzymuje funkcję wątroby, a tym samym umożliwia długoterminowe przeżycie.Jednak model profuzji pojedynczego płata in vivo jest trudny technicznie, a przeżycie pooperacyjne nie zostało jeszcze osiągnięte. W tym miejscu przedstawimy kolejny model chirurgiczny z długoterminowym przeżyciem jako podstawą do dalszej inżynierii pojedynczego płata wątroby in vivo. Zanim zademonstrujemy model chirurgiczny, chcielibyśmy przedstawić krót

a-novel-surgical-technique-as-foundation-for-vivo-partial-liver

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Przedstawiamy łatwą do wdrożenia modyfikację klasycznej techniki dwóch mankietów stosowanej w ortotopowym przeszczepieniu wątroby u szczura.

Ortotopowa transplantacja wątroby u szczurów

Ortotopowe przeszczepienie wątroby u szczurów jest niezbędnym modelem eksperymentalnym w badaniach biomedycznych. W niniejszym materiale przedstawiamy procedury chirurgiczne ortotopowego przeszczepienia wątroby szczura z rekonstrukcją tętnicy wątrobowej z wykorzystaniem 50% częściowego graftu.

Procedury chirurgiczne w szczurzym modelu częściowego ortotopowego przeszczepu wątroby z rekonstrukcją tętnicy wątrobowej

Opisujemy projekt urządzenia "quick-linker" dla łatwiejszego ortotopowego przeszczepu wątroby szczura.

Produkcja urządzeń i przyrządów ułatwiających przeszczep wątroby szczura

Opisaliśmy protokół wykonywania częściowej hepatektomii (PHx) i przeszczepu komórek przez śledzionę w NOD. SCID (NOD. CB17-Prkdcscid/J) myszy. W tym protokole wykonuje się nacięcie w celu odsłonięcia i wycięcia lewego płata wątroby, a następnie kolejne nacięcie w celu dośledziony przeszczepu komórek.

Wewnątrzśledzionowe przeszczepienia hepatocytów po częściowej hepatektomii w NOD. Myszy SCID

Tutaj przedstawiono protokół polegający na ponownym przeszczepieniu wątroby szczurowi. W szczególności 70% wątroby wycięto in vivo przy użyciu zaktualizowanej techniki hepatektomii zorientowanej na naczynia. Tętnicę wątrobową zrekonstruowano w sposób end-to-side. Technika mankietu została zmodyfikowana w celu skrócenia czasu zespolenia żyły podwątrobowej głównej.

Ponownie zarteryalizowany częściowy przeszczep wątroby szczura z 70% hepatektomią in vivo zorientowaną na naczynia

Rekonstrukcja żyły głównej nadwątrobowej (SHVC) pozostaje trudnym krokiem w ortotopowym przeszczepie wątroby u szczurów. W tym artykule przedstawiamy krok po kroku protokół rekonstrukcji SHVC u szczurów przy użyciu nowatorskiej techniki zespolenia magnetycznego.

Szczurzy model ortotopowego przeszczepu wątroby z wykorzystaniem nowatorskiej techniki zespolenia magnetycznego do rekonstrukcji żyły głównej nadwątrobowej

Tutaj prezentujemy nową metodę częściowej resekcji lewego płata wątroby u noworodków (dzień 0) myszy. Ten nowy protokół jest odpowiedni do badania ostrego uszkodzenia wątroby i reakcji na uraz u noworodków.

Hepatektomia zrazikowa częściowa: chirurgiczny model morfologicznej regeneracji wątroby

Wykazano, że powiązanie podziału wątroby i podwiązania żyły wrotnej w przypadku etapowej hepatektomii (ALPPS) powoduje niezwykłą regenerację wątroby po kilku tygodniach od operacji pierwszego etapu. Modele zwierzęce, które przeszły ALPPS, zostały opracowane w celu zbadania potencjalnej zdolności regeneracji wątroby i osiągnięcia korzystnych wyników klinicznych.

Mysi model skojarzonej partycji wątroby i podwiązania żyły wrotnej do etapowego zabiegu hepatektomii wspomaganego mikroskopią

Tutaj opisujemy platformę, która umożliwia nieinwazyjne obrazowanie in vivo sferoidów wątroby wszczepionych do przedniej komory oka myszy. Przebieg pracy obejmuje zarówno generowanie sferoid z pierwotnych komórek wątroby, jak i przeszczep do oka myszy oraz obrazowanie in vivo w rozdzielczości komórkowej za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Obrazowanie in vivo sferoid wątroby wszczepionych do przedniej komory oka myszy

Opisany tutaj protokół heterotopowego pomocniczego przeszczepu wątroby u szczurów stanowi praktyczne narzędzie badawcze do badania mechanizmów odrzucania alloprzeszczepu wątrobowego. Model ten pomaga złagodzić przeszkody chirurgiczne i stres zwierząt związany z ortotopowym przeszczepem wątroby u szczurów.

Heterotopowy pomocniczy model przeszczepu szczura całej wątroby z wykorzystaniem hepaticoureterostomii do badań odrzucenia przeszczepu allogenicznego

Poznaj nową technikę chirurgiczną perfuzji płata wątroby in vivo u szczurów jako podstawę częściowej inżynierii wątroby. Metoda zapewnia długoterminowe przeżycie i utrzymanie funkcji wątroby.

Nowatorska technika chirurgiczna jako podstawa częściowej inżynierii wątroby in vivo u szczurów

Przeglądaj więcej filmów