Name: Amplifikacja prowirusów HIV-1 o niemal pełnej długości do sekwencjonowania nowej generacji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Poznaj metodę FLIPS do amplifikacji i sekwencjonowania pojedynczych prowirusów HIV-1 z komórek zakażonych. Technika ta pozwala identyfikować genetycznie intakcyjne i potencjalnie zdolne do replikacji prowirusy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Delaney AIDS Research Enterprise (DARE) w celu znalezienia lekarstwa (1U19AI096109 i 1UM1AI126611-01); grant na wspólne badania amfAR Research Consortium on HIV Eradication (ARCHE) od Fundacji Badań nad AIDS (amfAR 108074-50-RGRL); Australijskie Centrum Badań nad Wirusologią HIV i Wirusowym Zapaleniem Wątroby (ACH2); UCSF-GIVI Centrum Badań nad AIDS (P30 AI027763); oraz Australijska Narodowa Rada ds. Zdrowia i Badań Medycznych (AAP1061681). Chcielibyśmy podziękować dr Joeyowi Lai, kierownikowi zakładu genomiki w Instytucie Badań Medycznych Westmead za szkolenie w zakresie przygotowania biblioteki i korzystania z jego obiektu, a także Centrum Genomiki Ramaciotti (Uniwersytet Nowej Południowej Walii, Sydney, Australia) za przeprowadzenie sekwencjonowania. Z wdzięcznością dziękujemy uczestnikom, którzy przekazali próbki do tego badania.

<ol><li>Bruner, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+proviruses+rapidly+accumulate+during+acute+HIV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Defective proviruses rapidly accumulate during acute HIV-1 infection.</a> Nature Medicine. 22 (9), 1043-1049 (2016).</li>
<li>Hiener, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Genetically+Intact+HIV-1+Proviruses+in+Specific+CD4%28%2B%29+T+Cells+from+Effectively+Treated+Participants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of Genetically Intact HIV-1 Proviruses in Specific CD4(+) T Cells from Effectively Treated Participants.</a> Cell Reports. 21 (3), 813-822 (2017).</li>
<li>Abram, M. E., Ferris, A. L., Shao, W., Alvord, W. G., Hughes, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nature%2C+position%2C+and+frequency+of+mutations+made+in+a+single+cycle+of+HIV-1+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Nature, position, and frequency of mutations made in a single cycle of HIV-1 replication.</a> Journal of Virology. 84 (19), 9864-9878 (2010).</li>
<li>Ho, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-competent+noninduced+proviruses+in+the+latent+reservoir+increase+barrier+to+HIV-1+cure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Replication-competent noninduced proviruses in the latent reservoir increase barrier to HIV-1 cure.</a> Cell. 155 (3), 540-551 (2013).</li>
<li>Harris, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+deamination+mediates+innate+immunity+to+retroviral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DNA deamination mediates innate immunity to retroviral infection.</a> Cell. 113 (6), 803-809 (2003).</li>
<li>Lecossier, D., Bouchonnet, F., Clavel, F., Hance, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypermutation+of+HIV-1+DNA+in+the+absence+of+the+Vif+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hypermutation of HIV-1 DNA in the absence of the Vif protein.</a> Science. 300 (5622), 1112(2003).</li>
<li>Chun, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rebound+of+plasma+viremia+following+cessation+of+antiretroviral+therapy+despite+profoundly+low+levels+of+HIV+reservoir%3A+implications+for+eradication%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Rebound of plasma viremia following cessation of antiretroviral therapy despite profoundly low levels of HIV reservoir: implications for eradication.</a> AIDS. 24 (18), 2803-2808 (2010).</li>
<li>Chomont, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+reservoir+size+and+persistence+are+driven+by+T+cell+survival+and+homeostatic+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">HIV reservoir size and persistence are driven by T cell survival and homeostatic proliferation.</a> Nature Medicine. 15 (8), 893-900 (2009).</li>
<li>Soriano-Sarabia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+replication-competent+HIV-1+in+populations+of+resting+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Quantitation of replication-competent HIV-1 in populations of resting CD4+ T cells.</a> Journal of Virology. 88 (24), 14070-14077 (2014).</li>
<li>Josefsson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HIV-1+reservoir+in+eight+patients+on+long-term+suppressive+antiretroviral+therapy+is+stable+with+few+genetic+changes+over+time%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">The HIV-1 reservoir in eight patients on long-term suppressive antiretroviral therapy is stable with few genetic changes over time.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 110 (51), E4987-E4996 (2013).</li>
<li>Evering, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+HIV-1+evolution+in+the+gut-associated+lymphoid+tissue+from+patients+on+combination+antiviral+therapy+initiated+during+primary+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Library+of+Science+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Absence of HIV-1 evolution in the gut-associated lymphoid tissue from patients on combination antiviral therapy initiated during primary infection.</a> Public Library of Science Pathogens. 8 (2), e1002506(2012).</li>
<li>von Stockenstrom, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+Genetic+Characterization+Reveals+That+Cell+Proliferation+Maintains+a+Persistent+HIV+Type+1+DNA+Pool+During+Effective+HIV+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Longitudinal Genetic Characterization Reveals That Cell Proliferation Maintains a Persistent HIV Type 1 DNA Pool During Effective HIV Therapy.</a> Journal of Infectious Diseases. 212 (4), 596-607 (2015).</li>
<li>Palmer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple%2C+linked+human+immunodeficiency+virus+type+1+drug+resistance+mutations+in+treatment-experienced+patients+are+missed+by+standard+genotype+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Multiple, linked human immunodeficiency virus type 1 drug resistance mutations in treatment-experienced patients are missed by standard genotype analysis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 43 (1), 406-413 (2005).</li>
<li>Qiagen. CLC Genomics Version 10. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.qiagenbioinformatics.com/products/clc-genomics-workbench ">https://www.qiagenbioinformatics.com/products/clc-genomics-workbench </a> (2018).</li>
<li>Andrews, S. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2010).</li>
<li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimmomatic%3A+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://journal.embnet.org/index.php/embnetjournal/article/view/200">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), (2011).</li>
<li>Magoc, T., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLASH%3A+fast+length+adjustment+of+short+reads+to+improve+genome+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">FLASH: fast length adjustment of short reads to improve genome assemblies.</a> Bioinformatics. 27 (21), 2957-2963 (2011).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li>
<li>Bankevich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPAdes%3A+a+new+genome+assembly+algorithm+and+its+applications+to+single-cell+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">SPAdes: a new genome assembly algorithm and its applications to single-cell sequencing.</a> Journal of Computational Biology. 19 (5), 455-477 (2012).</li>
<li>Kumar, S., Stecher, G., Tamura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEGA7%3A+Molecular+Evolutionary+Genetics+Analysis+Version+7.0+for+Bigger+Datasets%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 7.0 for Bigger Datasets.</a> Molecular Biology and Evolution. 33 (7), 1870-1874 (2016).</li>
<li>Katoh, K., Standley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAFFT+multiple+sequence+alignment+software+version+7%3A+improvements+in+performance+and+usability%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">MAFFT multiple sequence alignment software version 7: improvements in performance and usability.</a> Molecular Biology and Evolution. 30 (4), 772-780 (2013).</li>
<li>Laboratory, L. A. N. HIV Sequence Database - Gene Cutter tool. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/GENE_CUTTER/cutter.html ">https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/GENE_CUTTER/cutter.html </a> (2018).</li>
<li>Foster, J. L., Garcia, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Nef+in+HIV-1+replication+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Role of Nef in HIV-1 replication and pathogenesis.</a> Advances in Pharmacology. 55, 389-409 (2007).</li>
<li>Laboratory, L. A. N. HIV Sequence Database - Consensus Maker tool. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/CONSENSUS/consensus.html">https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/CONSENSUS/consensus.html</a> (2018).</li>
<li>Laboratory, L. A. N. HIV Sequence Database - Hypermut tool. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HYPERMUT/hypermut.html">https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HYPERMUT/hypermut.html</a> (2018).</li>
<li>Yu, G., Smith, D. K., Zhu, H., Guan, Y., Lam, T. T. Y. <a target="_blank" href="https://besjournals.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/2041-210X.12628">ggtree: an r package for visualization and annotation of phylogenetic trees with their covariates and other associated data.</a> Methods in Ecology and Evolution. , (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Test FLIPS jest wydajną i wysokoprzepustową metodą amplifikacji i sekwencjonowania pojedynczych, prawie pełnowymiarowych prowirusów HIV-1. Zidentyfikowano wiele czynników i krytycznych etapów w protokole, które wpływają na liczbę i jakość uzyskanych sekwencji. Po pierwsze, liczba komórek i częstotliwość zakażeń HIV-1 w populacji komórek wpływają na liczbę amplifikowanych prowirusów. Na przykład w poprzedniej publikacji uzyskano o około połowę mniej sekwencji z tej samej liczby naiwnych limfocytów T CD4 + w porównaniu z limfocytami T CD4 + pamięci efektorowej. Dzieje się tak, ponieważ komórki naiwne mają zazwyczaj niższą częstotliwość infekcji niż komórki pamięci efektorowej2. Po drugie, liza komórek jest lepsza niż metody ekstrakcji oparte na kolumnach w celu uzyskania genomowego DNA, ponieważ nie ma ryzyka utraty DNA w procesie ekstrakcji. Wreszcie, podobnie jak w przypadku każdego testu opartego na PCR, zapobieganie zanieczyszczeniu ma kluczowe znaczenie. Wydzielone obszary czyste powinny być wyznaczone do przygotowania mieszanek wzorcowych, obchodzenia się z genomowym DNA, dodawania kontroli pozytywnych, oczyszczania i kwantyfikacji DNA oraz przygotowania biblioteki. Jest to szczególnie ważne w przypadku testów jednokopiowych, takich jak ten przedstawiony tutaj.
Wdrożenie testu FLIPS powinno najpierw obejmować przeprowadzenie kontroli pozytywnej, takiej jak plazmidy pNL4-3, a nie próbki uczestników. Pozwoli to na rozwiązywanie wszelkich problemów przed użyciem komórek HIV-1 dodatnich, ponieważ uzyskane sekwencje można porównać z dostępnymi sekwencjami referencyjnymi dla tych plazmidów. Podczas korzystania z komórek HIV-1 dodatnich ważne jest, aby wziąć pod uwagę podtyp HIV-1 (startery przeznaczone dla FLIPS są specyficzne dla podtypu B) oraz częstotliwość infekcji w populacji komórek, jeśli amplifikowane są niewielkie lub żadne prowirusy. Sekwencje podkładowe mogą być modyfikowane/przeprojektowywane, aby pasowały do innych podtypów. Dodatkowo, studzienka zawierająca kontrolę dodatnią powinna być dołączona do każdego wykonanego PCR.
Projekt FLIPS przezwyciężył ograniczenia poprzednich testów sekwencjonowania, w tym SPS. Poprzez amplifikację i sekwencjonowanie prowirusów HIV-1 o niemal pełnej długości, projekt FLIPS może określić potencjalną zdolność replikacyjną prowirusów HIV-1. Nie było to możliwe przy użyciu SPS, który sekwencjonował tylko regiony subgenomowe, a zatem wybierał sekwencje z nienaruszonymi miejscami wiązania starterów. Co więcej, FLIPS pokonuje ograniczenia związane z wykorzystaniem wielu starterów amplifikacji i sekwencjonowania, jak to miało miejsce w poprzednich testach sekwencjonowania o pełnej długości 1,4. Dzięki dwóm rundom PCR ukierunkowanym na regiony LTR HIV-1 w połączeniu z NGS, FLIPS zmniejsza liczbę i złożoność wymaganych starterów. FLIPS jest zatem mniej podatny na konsekwencje niedopasowania starterów, a mianowicie błędną identyfikację wadliwych prowirusów i niezdolność do amplifikacji niektórych prowirusów w populacji. Protokół FLIPS jest również bardziej wydajny i pozwala na większą przepustowość sekwencjonowania niż poprzednie metody.
Ewidentnie FLIPS zapewnia przewagę nad istniejącymi metodami, które określają skład genetyczny prowirusów HIV-1. Jednak ważne jest, aby pamiętać o ograniczeniach FLIPS. Po pierwsze, test FLIPS nie został opracowany jako narzędzie do pomiaru wielkości utajonego rezerwuaru HIV-1, ponieważ nie zakończono analiz mających na celu określenie, czy FLIPS amplifikuje każdy prowirus HIV-1 obecny w populacji komórek. FLIPS jest natomiast przydatny do dokonywania względnych porównań składu rezerwuaru między różnymi populacjami komórek2. Po drugie, kompetencja replikacyjna nienaruszonych prowirusów HIV-1 nie może być określona z całą pewnością bez analiz in vivo , takich jak te przeprowadzone przez Ho i wsp.4. Po trzecie, FLIPS nie jest przeznaczony do określania miejsca integracji prowirusów HIV-1.
Drobne zmiany w protokole FLIPS mogą zwiększyć jego zastosowanie. Na przykład zmiany w sekwencjach starterów mogą pozwolić na amplifikację i sekwencjonowanie różnych i wielu podtypów HIV-1. Sekwencjonowanie wirionów HIV-1 w osoczu jest możliwe dzięki dodaniu syntezy cDNA przed zagnieżdżonym PCR. Przyszłe wykorzystanie metod sekwencjonowania pojedynczych cząsteczek wyeliminuje potrzebę składania de novo .
Sekwencjonowanie genetyczne zintegrowanych prowirusów HIV-1 poszerzyło naszą wiedzę na temat utajonego rezerwuaru HIV-1. FLIPS jest ważnym narzędziem dla przyszłych badań wyjaśniających skład i rozmieszczenie utajonego zbiornika. Jednak zastosowanie FLIPS może wykraczać poza zbiornik. Przyszłe badania mogą wykorzystywać FLIPS do określenia konkretnych celów dla technologii CRISPR-Cas lub pomóc w identyfikacji regionów kodujących i niekodujących, które sprawiają, że wirus jest bardziej wrażliwy na czynniki odwracające latencję. Rekombinację wirusową można lepiej zrozumieć, przyglądając się miejscom połączeń dużych delecji wewnętrznych.

Charakterystyka genetyczna latentnego rezerwuaru HIV-1, który utrzymuje się u osób przyjmujących długotrwałą terapię antyretrowirusową (ART), miała kluczowe znaczenie dla zrozumienia, że większość zintegrowanych prowirusów jest wadliwych i niezdolnych do replikacji1,2. Podczas procesu odwrotnej transkrypcji do zintegrowanej sekwencji prowiralnej wprowadzane są błędy. Mechanizmy generujące wadliwe sekwencje prowiralne obejmują m.in. podatną na błędy odwrotną transkryptazę HIV-13, przeskakiwanie matrycy4 oraz/lub hipermutację indukowaną przez APOBEC5,6. Dwa niedawne badania wykazały, że około 5% prowirusów HIV-1 wyizolowanych od osób na długotrwałej ART jest genetycznie nienaruszonych i potencjalnie zdolnych do replikacji, co może przyczyniać się do szybkiego wzrostu poziomu HIV-1 w osoczu po zaprzestaniu ART1,2,7. Wcześniejsze badania wykazały, że zdolne do replikacji prowirusy HIV-1 utrzymują się w naiwnych oraz spoczywających podzbiorach komórek T pamięci CD4+ (w tym w komórkach T pamięci centralnej, przejściowej i efektorowej), co wskazuje na znaczenie celowania w te komórki w przyszłych strategiach eradykacji2,8,9.
Wczesne informacje na temat rozmieszczenia, dynamiki i utrzymywania się latentnego rezerwuaru HIV-1 uzyskano dzięki zastosowaniu metod sekwencjonowania pojedynczych prowirusów (SPS), które genetycznie charakteryzują regiony subgenomowe genomu HIV-110,11,12,13. SPS jest wszechstronnym narzędziem, umożliwiającym sekwencjonowanie pojedynczego prowirusa HIV-1 z jednej zainfekowanej komórki. Jednakże SPS nie pozwala na określenie zdolności prowirusów do replikacji, ponieważ sekwencjonuje jedynie regiony subgenomowe i pomija prowirusy zawierające duże delecje w miejscach wiązania starterów. Wcześniejsze badanie wykazało, że SPS zawyża wielkość rezerwuaru zdolnego do replikacji od 13 do 17 razy poprzez selektywne sekwencjonowanie nienaruszonych regionów subgenomowych2.
Aby rozwiązać ograniczenia metody SPS, Ho et al.4 oraz Bruner et al.1 opracowali testy służące do sekwencjonowania niemal pełnej długości prowirusów HIV-1. Pozwoliło to na określenie częstości występowania genetycznie nienaruszonych i potencjalnie zdolnych do replikacji prowirusów HIV-1 u osób przyjmujących długoterminową terapię ART. W testach tych amplifikowano i sekwencjonowano (metodą Sangera) regiony subgenomowe, które następnie składano w celu uzyskania sekwencji (nienaruszonego lub wadliwego) prowirusa HIV-1. Trzema ograniczeniami tego podejścia są: 1) stosowanie wielu starterów do sekwencjonowania zwiększa ryzyko niezamierzonego wprowadzenia defektów do sekwencji prowiralnej, 2) niedopasowania starterów mogą uniemożliwić amplifikację konkretnych prowirusów, a 3) często nie można zrekonstruować całej sekwencji prowiralnej ze względu na kwestie techniczne tych metod.
Aby przezwyciężyć ograniczenia istniejących testów sekwencjonowania pełnych prowirusów HIV-1, opracowaliśmy test Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS). FLIPS jest testem opartym na sekwencjonowaniu następnej generacji (NGS), który w sposób wydajny i wysokoprzepustowy amplifikuje i sekwencjonuje niemal pełne (nienaruszone lub wadliwe) prowirusy HIV-1. FLIPS oferuje zalety w porównaniu z poprzednimi testami, ponieważ ogranicza liczbę wykorzystywanych starterów; w związku z tym zmniejsza ryzyko niedopasowania starterów, co mogłoby ograniczyć populację wychwyconych prowirusów lub nieumyślnie wprowadzić defekty do sekwencji wirusowej. FLIPS jest również mniej wymagający technicznie niż poprzednie metody i obejmuje 6 głównych etapów: 1) lizę komórek zainfekowanych HIV-1, 2) amplifikację pojedynczych prowirusów HIV-1 za pomocą zagnieżdżonej PCR przeprowadzonej przy ograniczonym rozcieńczeniu z użyciem starterów specyficznych dla wysoce konserwowanego regionu 5' i 3' U5 LTR HIV-1 (Ryc. 1A), 3) oczyszczanie i ilościowe oznaczenie produktów amplifikacji, 4) przygotowanie biblioteki amplifikowanych prowirusów do NGS, 5) NGS oraz 6) montaż de novo zsekwencjonowanych prowirusów w celu uzyskania kontigów każdego pojedynczego prowirusa.
Sekwencje wygenerowane przez metodę FLIPS mogą zostać poddane rygorystycznemu procesowi eliminacji w celu zidentyfikowania tych, które są nienaruszone genetycznie i potencjalnie zdolne do replikacji (Rycina 1C)2. Genetycznie nienaruszone prowirusy są pozbawione wszystkich znanych defektów, które prowadzą do powstania prowirusa niezdolnego do replikacji. Defekty te obejmują: sekwencje inwersyjne, duże delecje wewnętrzne, hipermutacje/szkodliwe kodony stop, przesunięcia ramki odczytu lub mutacje w sygnale pakowania 5' bądź w głównym miejscu donora splicingu (MSD).
<img alt="Wykres analizy prowirusa HIV, mapowanie PCR, test rozcieńczeń, schemat blokowy procesu wykrywania mutacji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58016/58016fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Kluczowe etapy testu sekwencjonowania pełnej długości pojedynczych prowirusów (FLIPS). (A) Genom DNA HIV-1 z miejsc wiązania starterów w regionach 5' i 3' U5 LTR wykorzystywanych w metodzie FLIPS do amplifikacji prawie pełnych (defektywnych i nienaruszonych) prowirusów HIV-1 za pomocą nested PCR. (B) Układ 96-dołkowej płytki PCR zawierającej 80 dołków z próbkami (20 dołków dla każdego rozcieńczenia), 4 dołki kontroli negatywnej i 1 dołek kontroli pozytywnej. (C) Proces eliminacji stosowany w celu identyfikacji genetycznie nienaruszonych i potencjalnie zdolnych do replikacji prowirusów HIV-1. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Hiener et al.2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58016/58016fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>

<table><tbody><tr><td>UltraPure 1 M Tris-HCI, pH 8,0</td><td>Invitrogen</td><td>15568025</td><td>Rozcieńczony do 5 mM do zagnieżdżonego PCR</td></tr><tr><td>Nonidet P 40 Roztwór zastępczy</td><td>Sigma</td><td>98379</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór proteinazy K (20 mg / ml)</td><td>Termocykler</td><td></td> Promega AM2548 <td></td></tr><tr><td>96 dołków</td><td>Można użyć dowolnego termocyklera 96-dołkowego</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity</td><td>Invitrogen</td><td>11304011</td><td></td></tr><tr><td>10x bufor wysokiej wierności [600 mM Tris-SO4 (pH 8,9), 180 mM (NH4)2SO4]</td><td>Invitrogen</td><td>11304011</td><td></td></tr><tr><td>50 mM MgSO4</td><td>Invitrogen</td><td>11304011</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanka nukleotydów PCR, 10 mM</td><td>Promega</td><td>C1141</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure H2O</td><td>Invitrogen</td><td>10977023</td><td></td></tr><tr><td>startery</td><td></td><td></td> PCR1 i PCR2 <td>odsolone. Rozcieńczyć do (100 &mikro; M) Z płytką H2O</td></tr><tr><td>PCR 96 dołków, półspódnica, narożnik z pojedynczym nacięciem, przezroczysta</td><td>Axygen</td><td>PCR-96M2-HS-C</td><td></td></tr><tr><td>Microseal 'B' Uszczelki samoprzylepne</td><td>BioRad</td><td>MSB1001</td><td>Wymagane do uszczelnienia 96-dołkowych płytek PCR</td></tr><tr><td>HIV-1 NL4-3 Zakaźny klon molekularny (pNL4-3)</td><td>Następujący odczynnik został uzyskany za pośrednictwem NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: HIV-1 NL4-3 Infectious Molecular Clone (pNL4-3) od dr Malcolma Martina (Cat# 114).</td><td></td><td>Rozcieńczony do 105 kopii/ml i stosowany jako</td></tr><tr><td>wirówka płytkowa do PCR</td> do kontroli pozytywnej E-GEL <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>48 1% Agaroza</td><td>Invitrogen</td><td>G800801</td><td>Prefabrykowane 1% żele agarozowe (dwa żele używane na płytkę 96-dołkową). Można zastąpić dowolny 1% żel agarozowy. Zawiera bromek etydyny.</td></tr><tr><td>Marker DNA DirectLoad Wide Range</td><td>Sigma</td><td>D7058</td><td>Można zastąpić dowolną drabiną o zasięgu do 10 kb</td></tr><tr><td>Urządzenie Mother E-Base</td><td>Invitrogen</td><td>EBM03</td><td>Wymagane do uruchamiania prefabrykowanych 48-dołkowych żeli agarozowych 1%</td></tr><tr><td>Żel Doc EZ System Dokumentacji Żelu</td><td>BioRad</td><td>1708270</td><td>Można zastosować dowolny system wizualizacji żeli agarozowych zawierających bromek etydyny</td></tr><tr><td>Zgrzewanie</td> <td>termiczne PlateMaxAxygen</td><td>HS-200</td><td>Folia termozgrzewalna do długotrwałego przechowywania</td></tr><tr><td>96 Well 0,8 mL Płyta do przechowywania</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AB0765</td><td>0,8 mL 96-dołkowa płytka wymagana do oczyszczania PCR na bazie kulek magnetycznych</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP (zestaw do oczyszczania PCR)</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>Zestaw do oczyszczania PCR na bazie kulek magnetycznych. Tutaj można zastąpić inne zestawy do oczyszczania PCR (np. Zestaw do oczyszczania QIAquick PCR (Qiagen Cat#28106)</td></tr><tr><td>Alkohol etylowy, czysty. 200 proof, dla biologii molekularnej</td><td>Sigma</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Stand-96</td><td>Invitrogen</td><td>AM10027</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka</td><td></td><td></td> do mikropłytek <td>Opcjonalny</td></tr><tr><td>bufor EB</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td>Bufor elucyjny</td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Zestaw testowy</td><td>Invitrogen</td><td>P11496</td><td>Barwnik fluorescencyjny do pomiaru stężenia dsDNA</td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek Zestaw</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>do przygotowania biblioteki DNA Nextera XT</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1096</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw indeksów Nextera XT</td><td>Illumina</td><td>FC-131-2001</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki PCR z twardą skorupą</td><td>Biorad</td><td>HSP9601</td><td>Wymagane dla zestawu do przygotowania biblioteki DNA Nextera XT</td></tr><tr><td>Zestaw do kwantyfikacji biblioteki - Illumina/Universal</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK4824</td><td>Inne zestawy do kwantyfikacji biblioteki mogą być podstawione (np. Zestaw do kwantyfikacji biblioteki DNA JetSeq Lo-Rox (Bioline Cat#BIO-68029)</td></tr><tr><td>2100 Bioanalizator</td><td>Agilent Technology</td><td></td><td>Zautomatyzowany system elektroforezy . Używaj w połączeniu z zestawem DNA o wysokiej czułości</td></tr><tr><td>Zestaw DNA o wysokiej czułości</td><td>Agilent Technology</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Platforma Illumina MiSeq</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

amplifikacja prowirusów hiv-1 o niemal pełnej długości do sekwencjonowania nowej generacji

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

Test Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) jest efektywną i wysokoprzepustową metodą przeznaczoną do amplifikacji i sekwencjonowania pojedynczych, prawie pełnej długości (nienaruszonych i uszkodzonych) prowirusów HIV-1. FLIPS umożliwia określenie składu genetycznego zintegrowanego wirusa HIV-1 w populacji komórek. Poprzez identyfikację defektów w sekwencjach prowirusa HIV-1, które powstają podczas odwrotnej transkrypcji, takich jak duże delecje wewnętrzne, szkodliwe kodony stop/hipermutacje, mutacje przesunięcia ramki odczytu oraz mutacje/delecje w elementach cispłciowych wymaganych do dojrzewania wirionu, FLIPS może zidentyfikować zintegrowane prowirusy niezdolne do replikacji. Test FLIPS może być wykorzystany do identyfikacji prowirusów HIV-1, które nie mają tych defektów, a zatem są potencjalnie zdolne do replikacji. Protokół FLIPS obejmuje: lizę komórek zakażonych wirusem HIV-1, zagnieżdżony PCR prowirusów HIV-1 o niemal pełnej długości (przy użyciu starterów ukierunkowanych na LTR HIV-1 5' i 3'), oczyszczanie i kwantyfikację DNA, przygotowanie biblioteki do sekwencjonowania nowej generacji (NGS), NGS, składanie de novo kontigów prowirusowych oraz prosty proces eliminacji w celu identyfikacji prowirusów kompetentnych do replikacji. FLIPS zapewnia przewagę nad tradycyjnymi metodami zaprojektowanymi do sekwencjonowania zintegrowanych prowirusów HIV-1, takimi jak sekwencjonowanie pojedynczego wirusa. FLIPS amplifikuje i sekwencjonuje prawie pełnowymiarowe prowirusy, umożliwiając określenie kompetencji replikacyjnych, a także wykorzystuje mniej starterów amplifikacyjnych, zapobiegając konsekwencjom niedopasowania starterów. FLIPS jest użytecznym narzędziem do zrozumienia genetycznego krajobrazu zintegrowanych prowirusów HIV-1, zwłaszcza w obrębie utajonego rezerwuaru, jednak jego wykorzystanie może rozszerzyć się na każde zastosowanie, w którym wymagany jest skład genetyczny zintegrowanego HIV-1.

Test FLIPS służy do amplifikacji i sekwencjonowania pojedynczych, niemal pełnowymiarowych prowirusów HIV-1. Protokół obejmuje 6 etapów pozwalających na uzyskanie niemal pełnowymiarowych sekwencji prowirusowych. Etapy te obejmują: lizę zakażonych komórek, zagnieżdżoną PCR pełnowymiarowych (nienaruszonych i wadliwych) prowirusów HIV-1, oczyszczanie i kwantyfikację DNA, przygotowanie biblioteki do sekwencjonowania, NGS oraz składanie de novo zsekwencjonowanych prowirusów. Zakończenie każdego etapu można uznać za punkt kontrolny, w którym można ocenić jakość produktu (np. amplifikowanego DNA, oczyszczonego DNA, biblioteki sekwencjonowania lub sekwencji) przed przejściem do kolejnego kroku. Poniżej przedstawiono przegląd oceny przeprowadzanej na koniec każdego etapu oraz oczekiwane wyniki.
Po przeprowadzeniu zagnieżdżonej reakcji PCR, produkty amplifikacji są rozdzielane w 1% żelu agarozowym (Rysunek 3). Początkową jakość PCR można określić poprzez analizę kontroli negatywnych i pozytywnych. Obecność produktu amplifikacji w dołkach kontroli negatywnej wskazuje na kontaminację, natomiast brak produktu w dołkach kontroli pozytywnej świadczy o niewystarczającej amplifikacji. Następnie do sekwencjonowania wybierane są dołki zawierające produkt amplifikacji. Aby uniknąć dołków zawierających mieszaniny wielu amplifikowanych prowirusów, do sekwencjonowania bierze się pod uwagę wyłącznie dołki z produktem amplifikacji uzyskanym przy rozcieńczeniu końcowym. Zgodnie z rozkładem Poissona, rozcieńczenie końcowe zostaje osiągnięte, gdy 30% dołków daje wynik pozytywny pod kątem produktu amplifikacji. Przy takim rozcieńczeniu istnieje 80% prawdopodobieństwa, że dołki te zawierają pojedynczy amplifikowany prowirus. Ponadto na tym etapie można zidentyfikować dołki zawierające wiele amplifikowanych prowirusów o różnych długościach, gdyż w żelu pojawią się wówczas wielokrotne prążki. Takich dołków nie należy wybierać do sekwencjonowania (Rysunek 3).
Po oczyszczaniu amplifikowanych prowirusów wybranych do sekwencjonowania przeprowadza się kwantyfikację, aby upewnić się, że podczas etapu oczyszczania nie utracono prowiralnego DNA. Jeśli stężenie DNA w amplifikowanym prowirusie wynosi &lt;0.2 ng/µL, można oczyścić pozostałą próbkę z płytki PCR2. Podobny punkt kontrolny występuje po przygotowaniu biblioteki, podczas którego kwantyfikowana jest każda poszczególna biblioteka. Gwarantuje to, że poszczególne prowirusy zostały odpowiednio pofragmentowane, otagowane i amplifikowane przed sekwencjonowaniem. Poszczególne biblioteki prowiralne są łączone w ilościach ekimolarnych do końcowego stężenia biblioteki 4 nM (lub zgodnie ze specyfikacją dostawcy usługi sekwencjonowania). Jeśli stężenie pojedynczej biblioteki prowiralnej jest zbyt niskie, można ją wykluczyć z puli bibliotek do sekwencjonowania lub ponownie przygotować daną bibliotekę. Przed sekwencjonowaniem przeprowadza się końcową kontrolę stężenia połączonej biblioteki oraz potwierdzenie średniej długości fragmentów.
Kroki kontroli jakości przed etapem składania de novo zapewniają wysoką jakość odczytów wykorzystywanych do zmontowania końcowego kontigu prowirusowego. Kroki te obejmują: usunięcie sekwencji adapterów, przycinanie nukleotydów z końców 5' i 3', zastosowanie rygorystycznego limitu jakości oraz odrzucenie krótkich odczytów. Program CLC Genomics Workbench umożliwia generowanie raportów kontroli jakości, które mogą służyć najpierw do oceny początkowej jakości odczytów i doboru ustawień przycinania, a następnie do ustalenia, czy przycinanie było wystarczające do usunięcia regionów o niskiej jakości. Ponadto, w przypadku składania de novo, jakość zmontowanych kontigów można ocenić pod kątem wystarczającej głębokości (&gt;1000X) i równomierności pokrycia (Rycina 4A). Na tym etapie można również zidentyfikować populacje mieszane. Mieszaniny wielu pełnowymiarowych (~9 kb) prowirusów rozpoznaje się po obecności wielu SNP o częstotliwości powyżej 40%, natomiast mieszaniny prowirusów krótkich (zawierających dużą delecję wewnętrzną) i pełnowymiarowych można zidentyfikować poprzez nierównomierne pokrycie odczytami po mapowaniu do pełnowymiarowej sekwencji referencyjnej od tego samego uczestnika (Rycina 4B).
W zależności od zastosowania, końcowe dopasowanie można zwizualizować przy użyciu narzędzi takich jak ggtree, dostępnego jako pakiet w "R: A language and environment for statistical computing"27. W niedawnym badaniu metoda FLIPS została wykorzystana do sekwencjonowania prowirusów HIV-1 z naiwnych, centralnych, przejściowych i efektorowych limfocytów T CD4+ pamięci, wyizolowanych od osób przyjmujących długotrwale ART, w celu ustalenia, czy konkretne subpopulacje komórek wykazują wyższe proporcje genetycznie nienaruszonych i potencjalnie zdolnych do replikacji HIV-12. Tutaj przedstawiono wizualną reprezentację sekwencji wyizolowanych od jednego uczestnika tego badania (uczestnik 2026) (Rysunek 5). U tego uczestnika większość (97%) sekwencji była wadliwa, a sekwencje nienaruszone znaleziono w efektorowych i przejściowych limfocytach T CD4+ pamięci. To narzędzie wizualizacji jest przydatne do pokazania liczby sekwencji z dużymi delecjami wewnętrznymi oraz ich pozycji w genomie. Można je dodatkowo adnotować, aby wskazać sekwencje z szkodliwymi kodonami stop, mutacjami przesunięcia ramki odczytu oraz delecjami/mutacjami w miejscu MSD i/lub sygnale pakowania.
Jednym z zastosowań testu FLIPS jest identyfikacja genetycznie nienaruszonych i potencjalnie zdolnych do replikacji prowirusów HIV-1. W niedawnym badaniu 531 sekwencji wyizolowanych z limfocytów T CD4+ od 6 uczestników przyjmujących długoterminową terapię ART zidentyfikowano 26 (5%) genetycznie nienaruszonych prowirusów HIV-12. Pozostałe wadliwe prowirusy obejmowały te z sekwencjami inwersyjnymi (6%), dużymi delecjami wewnętrznymi (68%), szkodliwymi kodonami stop/hipermutacją (9%), mutacjami przesunięcia ramki odczytu (1%) oraz defektami w sygnale pakowania i/lub mutacjami w miejscu MSD (11%).
<img alt="Schemat kontroli jakości i składania odczytów sekwencyjnych z łączeniem par nakładających się oraz detekcją SNP." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58016/58016fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Przegląd schematu postępowania dla składania de novo prowirusów HIV-1. Główne etapy schematu obejmują: 1) kontrolę jakości odczytów sekwencyjnych, 2) łączenie par nakładających się, 3) składanie de novo oraz 4) ponowne mapowanie i budowanie konsensusu, które zostały odpowiednio oznaczone kolorami czerwonym, niebieskim, zielonym i pomarańczowym. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie pracy Hiener et al.2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58016/58016fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wynik elektroforezy żelowej; rozdzielenie DNA; ścieżki z markerami; wielkości prążków w parach zasad; analiza eksperymentu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58016/58016fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Przykład żelu agarozowego z amplifikowanymi metodą PCR prowirusami HIV-1. Do studni 1, 2, 3, 6, 9 i 10 naniesiono amplifikowane prowirusy HIV-1. Studnia 10 zawiera prowirus z dużą delecją wewnętrzną, studnia 2 zawiera koamplifikację dwóch prowirusów HIV-1 o różnych długościach (mieszanina), a studnia 12 zawiera kontrolę dodatnią. Należy zauważyć, że odsetek studni zawierających amplifikowany produkt wynosi 60%, co przekracza wartość wymaganą do izolacji pojedynczych matryc. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58016/58016fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykresy pokrycia odczytów w funkcji długości kontigu; porównanie wyników sekwencjonowania DNA; analiza danych genomicznych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58016/58016fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Przykładowy wynik mapowania odczytów. (A) Przykład wykazujący równomierne pokrycie wynikające z amplifikacji pojedynczego, pełnowymiarowego prowirusa HIV-1. Po asemblacji de novo wszystkie odczyty są mapowane do zmontowanego kontigu w celu uzyskania sekwencji konsensusowej. Platforma programistyczna umożliwia sprawdzenie zmapowanych odczytów pod kątem wystarczającego i równomiernego pokrycia. (B) Przykład wykazujący koamplifikację dwóch prowirusów HIV-1 o różnych długościach (mieszanina). W celu wykrycia mieszanin odczyty mapuje się do pełnowymiarowej (~9 kb) sekwencji referencyjnej od tego samego uczestnika, a następnie analizuje mapowanie odczytów. Obecność nierównomiernego pokrycia wskazuje na mieszaninę. Rycina ta została powielona za zgodą firmy Qiagen14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58016/58016fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat genomu HIV z segmentami genów i wykres limfocytów T pamięci pokazujący nienaruszenie genetyczne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58016/58016fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Przykładowa wizualizacja sekwencji prowirusowych HIV-1 wyizolowanych z subpopulacji limfocytów T CD4+ u osoby w długotrwałej terapii ART. Pojedyncze sekwencje prowirusowe HIV-1 przedstawiono w formie linii poziomych. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Hiener et al.2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58016/58016fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Indywidualne sekwencjonowanie prowirusowe o pełnej długości (FLIPS) zapewnia efektywną i wysokoprzepustową metodę amplifikacji i sekwencjonowania pojedynczych, prawie pełnej długości (nienaruszonych i wadliwych) prowirusów HIV-1 i pozwala na określenie ich potencjalnej zdolności replikacyjnej. Projekt FLIPS pozwala przezwyciężyć ograniczenia poprzednich testów zaprojektowanych do sekwencjonowania utajonego rezerwuaru HIV-1.

Amplifikacja prowirusów HIV-1 o niemal pełnej długości do sekwencjonowania nowej generacji

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie HIV, takie jak określenie składu genetycznego prowirusów HIV i różnych typów komórek. Zwłaszcza identyfikując te, które są genetycznie nienaruszone i potencjalnie zdolne do replikacji. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala nam ona na amplifikację prawie pełnej długości prowirusów HIV z pojedynczych komórek zakażonych wirusem HIV, a następnie sekwencjonowanie ich za pomocą sekwencjonowania nowej generacji.Na początek przygotuj wszystkie zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Uzyskaj osad komórkowy i dodaj sto mikrolitrów buforu do lizy na milion komórek. Mieszać, pipetując w górę i w dół.Poddaj komórki lizie przez inkubację w termocyklerze w temperaturze 55 stopni Celsjusza przez godzinę, a następnie dodaj 85 stopni Celsjusza przez 15 minut. Aby rozpocząć amplifikację pojedynczych prowirusów DNA HIV-1, należy wymieszać odczynniki do pierwszej rundy PCR, jak podano w tabeli pierwszej protokołu tekstowego. Dodaj 38 mikrolitrów do 85 dołków w 96-dołkowej płytce PCR i oznacz tę płytkę jako PCR 1.Następnie przenieść płytkę PCR 1 do czystego miejsca przeznaczonego do dodania genomowego DNA. Za pomocą chlorowodorku tris seryjnie rozcieńcz genomowe DNA w stosunku od jednego do trzech w stosunku od jednego do 81, upewniając się, że przygotowałeś 45 mikrolitrów każdego rozcieńczenia. Dodać dwa mikrolitry rozcieńczonego genomowego DNA do każdej studzienki na próbkę i dwa mikrolitry chlorowodorku tris do każdej studzienki kontroli ujemnej.Uszczelnić całą płytkę z wyjątkiem studzienki kontroli dodatniej. Następnie przejdź do obszaru wyznaczonego do dodania kontroli dodatniej. Dodaj dwa mikrolitry kontroli pozytywnej do odpowiedniej studzienki, a następnie całkowicie uszczelnij płytkę.Użyj wirówki do płytek PCR, aby krótko obrócić płytkę PRC 1 i ściągnąć pozostałą zawartość z boków dołków. Uruchom płytkę PCR 1 w termocyklerze zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie wymieszaj odczynniki do drugiej rundy PCR, jak podano w tabeli pierwszej.Dodaj 28 mikrolitrów tej mieszanki PCR 2 do 85 dołków nowej 96-dołkowej płytki PCR. Oznacz tę płytkę jako PCR 2. Za pomocą wirówki do płytek krótko obróć płytkę PCR 1, aby ściągnąć resztki zawartości z boków dołków.Dodaj 80 mikrolitrów chlorowodorku tris do każdej studzienki tej płytki. Następnie użyj pipety wielokanałowej, aby przenieść dwa mikrolitry z każdej studzienki płytki PCR 1 do odpowiednich dołków w płytce PCR 2. Uszczelnij płytkę PCR 2 przezroczystą folią samoprzylepną.Krótko obróć płytkę PCR 2 w wirówce do płytek. W międzyczasie uszczelnij płytkę PCR 1 folią termozgrzewalną do długotrwałego przechowywania w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Uruchom płytkę PCR 2 w termocyklerze, jak opisano w protokole tekstowym.Następnie krótko obróć płytkę PCR 2, aby ściągnąć resztki zawartości z boków studzienek. Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 60 mikrolitrów chlorowodorku tris do każdej studzienki. Następnie uruchom 15 mikrolitrów każdej studzienki na dwóch 48-dołkowych prefabrykowanych jednoprocentowych żelach agarozowych, które zawierają bromek etydyny.Zidentyfikuj studzienki zawierające amplifikowany produkt i ich przybliżone rozmiary, a następnie zapisz obraz żelu. Następnie należy określić rozcieńczenie, w którym nie więcej niż 30 procent studzienek jest dodatnich dla amplifikowanego produktu. Najpierw użyj wirówki do płytek, aby krótko obrócić płytkę PCR 2 i ściągnąć pozostałą zawartość z boków dołków.Przenieść 40 mikrolitrów z dołków zawierających amplifikowany produkt do odpowiednich studzienek nowej 96-dołkowej płytki midi. Następnie przygotuj zestaw do oczyszczania oparty na karmie magnetycznej, upewniając się, że kulki magnetyczne osiągnęły temperaturę pokojową i przygotuj świeży roztwór 80-procentowego etanolu. Gdy kulki osiągną temperaturę pokojową, należy je wymieszać, aby upewnić się, że są dokładnie zawieszone.Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 40 mikrolitrów kulek do 40 mikrolitrów amplifikowanego produktu w każdym dołku płytki midi. Wymieszaj, delikatnie pipetując w górę i w dół 10 razy. Inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut.Następnie przenieś talerz na podstawkę magnetyczną i pozwól mu odpocząć przez dwie minuty. Następnie usunąć i wyrzucić supernatant. Trzymając talerz nadal na stojaku, umyj koraliki, dodając dwieście mikrolitrów 80-procentowego roztworu etanolu do każdej studzienki.Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 sekund, a następnie usunąć i wyrzucić supernatant. Powtórz ten proces mycia jeden raz, od dodania etanolu do wyrzucenia supernatantu. Za pomocą pipety wielokanałowej usuń nadmiar etanolu.Pozostaw koraliki do wyschnięcia na powietrzu przez 15 minut. Następnie zdejmij płytkę ze stojaka. Dodaj 30 mikrolitrów buforu elucyjnego do każdej studzienki i wymieszaj, delikatnie pipetując w górę iw dół 10 razy.Inkubować w temperaturze pokojowej przez dwie minuty. Umieść talerz z powrotem na stojaku magnetycznym i pozwól mu odpocząć przez dwie minuty. Za pomocą pipety wielokanałowej przenieś 25 mikrolitrów supernatantu do odpowiednich dołków nowej 96-dołkowej płytki PCR.Następnie użyj fotometru widmowego, aby określić i zarejestrować przybliżone stężenie każdego amplifikowanego produktu DNA. Przygotuj zestaw do oznaczania ilościowego dwuniciowego DNA i rozcieńcz bufor do jednego razu w sterylnej wodzie wolnej od DNA. Dodać 99 mikrolitrów buforu do odpowiedniej liczby pustych studzienek na płaskiej płytce do hodowli tkankowej.Następnie dodaj sto mikrolitrów buforu do trzech ślepych studzienek. Dla każdego amplifikowanego produktu, który ma być mierzony, dodać jeden mikrolitr oczyszczonego DNA w trzech egzemplarzach do każdego dołka zawierającego bufor. Rozcieńczyć dwuniciowe DNA lambda 10-krotnie z dwóch nanogramów na mikrolitr do punktu zero nanogramów na mikrolitr, aby przygotować wzorce.Dodaj sto mikrolitrów każdego dwuniciowego wzorca DNA do trzech studzienek. Rozcieńczyć barwnik kwiatostanowy od 1 do dwustu buforem. Szybko dodaj sto mikrolitrów do każdej studzienki zawierającej próbkę, ślepą próbę lub wzorzec i mieszaj, pipetując w górę iw dół.Następnie przykryj płytkę folią, aby uniknąć kontaktu ze światłem. Za pomocą czytnika mikropłytek zapisz emisję fluorescencji. Użyj zarejestrowanych pomiarów, aby określić stężenie dwuniciowego DNA w każdej próbce.Następnie każdy oczyszczony produkt rozcieńczyć wodą do stężenia punktu zerowego dwóch nanogramów na mikrolitr. Po zagnieżdżonym PCR amplifikowane produkty są uruchamiane na jednoprocentowym żelu agarozowym. Początkową jakość PCR można określić, sprawdzając kontrole.Ponieważ kontrole ujemne zawierające amplifikowany produkt wskazują na zanieczyszczenie, a kontrole dodatnie bez amplifikowanego produktu wskazują na niewystarczającą amplifikację. Do sekwencjonowania brane są pod uwagę tylko studzienki uruchomione w końcowym rozcieńczeniu, które zawierają pojedyncze amplifikowane prowirusy. Chociaż na tym etapie można wizualizować studzienki zawierające wiele amplifikowanych prowirusów o różnej długości, nie należy ich wybierać do sekwencjonowania.W przypadku montażu de novo można ocenić jakość zmontowanych kontigów pod kątem wystarczającej głębokości i równomierności pokrycia. Populacje mieszane można również zidentyfikować na tym etapie po obecności nierównomiernego pokrycia. Wizualna reprezentacja sekwencji wyizolowanych od jednego uczestnika ujawnia, że 97 procent ich sekwencji jest wadliwych.Z nienaruszonymi sekwencjami znajdującymi się w efektorowych i przejściowych limfocytach T CD4 dodatnich. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że tylko amplifikowane produkty uzyskane w rozcieńczeniu granicznym, czyli gdy nie więcej niż 30 procent studzienek jest dodatnich, zawierają pojedynczy prowirus. Po tej procedurze można sekwencjonować amplifikowane produkty w celu określenia składu genetycznego prowirusów HIV.Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się HIV do zbadania rozmieszczenia genetycznie nienaruszonych prowirusów HIV i różnych typów komórek u pacjentów poddawanych terapii w celu określenia, gdzie ukrywają się genetycznie nienaruszone i potencjalnie kompetentne do replikacji prowirusy. Nie zapominaj, że praca z komórkami zakażonymi wirusem HIV może być niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie odpowiednich środków ochrony osobistej i praca w certyfikowanym laboratorium.

amplification-near-full-length-hiv-1-proviruses-for-next-generation

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Tropizm HIV można wywnioskować z regionu V3 otoczki wirusa. Region V3 jest amplifikowany w trzech powtórzeniach metodą zagnieżdżonej RT-PCR, sekwencjonowany, a następnie interpretowany przy użyciu oprogramowania bioinformatycznego. Próbki zawierające jedną lub więcej sekwencji z niskimi wartościami g2P są klasyfikowane jako wirusy non-R5.

Genotypowe wnioskowanie o tropizmie HIV-1 z wykorzystaniem sekwencjonowania populacyjnego pętli V3

Ilościowe oznaczenie poziomu RNA HIV-1 w osoczu oraz sekwencjonowanie pojedynczych genomów HIV-1 u osób z wiremią poniżej granicy wykrywalności (50-75 kopii/ml) jest trudne. W niniejszym materiale opisujemy sposób izolacji i oznaczania ilościowego wirusowego RNA z osocza przy użyciu testu real-time PCR, który wiarygodnie mierzy poziom RNA HIV-1 aż do 0,3 kopii/ml, a także metodę amplifikacji genomów wirusowych poprzez sekwencjonowanie pojedynczych genomów z próbek o bardzo niskiej ładunku...

Amplifikacja i kwantyfikacja RNA HIV-1 u osób zakażonych HIV z ładunkiem wirusowym poniżej granicy wykrywalności standardowych testów klinicznych

Genomika pojedynczych wirusów (SVG) to metoda izolacji i amplifikacji genomów pojedynczych wirionów. Zawiesiny wirusowe mieszaniny różnych szczepów są sortowane za pomocą cytometrii przepływowej na preparat mikroskopowy z osobnymi studzienkami zawierającymi agarozę, co pozwala na przechwycenie wirionu i ograniczenie fragmentacji genomu podczas dalszej obróbki. Amplifikacja całego genomu jest przeprowadzana za pomocą wielokrotnej amplifikacji z wypieraniem (MDA), w wyniku czego otrzymuje się...

Izolacja i analiza genomu pojedynczych wirionów z wykorzystaniem metody „Single Virus Genomics”

Testy oporności na leki dla osób zakażonych wirusem HIV-1, u których nie powiodła się terapia antyretrowirusowa (ART), mogą ukierunkować przyszłe terapie i poprawić wyniki leczenia. Optymalizacja indywidualnych i populacyjnych wyników zdrowotnych w warunkach wysokiego rozpowszechnienia HIV, ale ograniczonych zasobów, będzie ostatecznie wymagała przystępnych cenowo i dostępnych metod genotypowania i interpretacji oporności na leki.

Przystępna cenowo metoda monitorowania oporności na leki HIV-1 w warunkach ograniczonych zasobów

Konkurencja wzrostu między prawie izogenicznymi wirusami dostarcza czułego pomiaru do określenia względnej zdolności replikacji. Opisane tutaj protokoły obejmują budowę rekombinowanych klonów HIV-1, rozmnażanie wirusa i konkurencję wzrostu oraz metody analizy zoptymalizowane w celu uzyskania czułych i spójnych wyników.

Test konkurencji wzrostu parami do określania zdolności replikacji ludzkich wirusów niedoboru odporności

Opisujemy protokół amplifikacji miejsc integracji retrowirusowej z genomowego DNA zakażonych komórek, sekwencjonowania amplifikowanych połączeń wirus-gospodarz, a następnie mapowania tych sekwencji do genomu referencyjnego. Opisujemy również techniki ilościowego określania rozmieszczenia miejsc integracji w odniesieniu do różnych adnotacji genomowych za pomocą BEDTools.

Amplifikacja, sekwencjonowanie nowej generacji i mapowanie genomowego DNA miejsc integracji retrowirusowej

Tutaj opisujemy protokół mapowania całego genomu miejsc integracji wektorów retrowirusowych opartych na wirusie mysiej białaczki Moloneya w komórkach ludzkich.

Skanowanie retrowirusowe: mapowanie miejsc integracji MLV w celu zdefiniowania regionów regulatorowych specyficznych dla komórki

Tutaj prezentujemy podejście do głębokiego sekwencjonowania, które zapewnia bezstronne określenie powstających 3'-końców, jak również profili mutacyjnych jednoniciowych cząsteczek DNA. Głównym zastosowaniem jest charakterystyka powstających retrowirusowych komplementarnych DNA (cDNA), produktów pośrednich powstających w procesie retrowirusowej odwrotnej transkrypcji.

Oznaczanie 3'-końców i sekwencji powstających jednoniciowych cząsteczek wirusowego DNA podczas odwrotnej transkrypcji HIV-1 w zakażonych komórkach

Wcześniej sprawdziliśmy protokół sekwencjonowania całego genomu wirusa Usutu (USUV) opartego na amplikonie na platformie sekwencjonowania nanoporowego. W tym miejscu bardziej szczegółowo opisujemy stosowane metody i określamy poziom błędu nanoporowej celi przepływowej R10.

Walidacja sekwencjonowania nanoporowego całego genomu na przykładzie wirusa Usutu

Protokół opisuje metodę wprowadzania kontrolowanej różnorodności genetycznej w genomie wirusa zapalenia wątroby typu C poprzez połączenie pełnej długości syntezy zmutowanego RNA za pomocą podatnego na błędy PCR i genetyki odwrotnej. Metoda ta stanowi model selekcji fenotypu i może być stosowana do 10 kb długich genomów wirusa RNA o dodatnim sensie.

Genetyka odwrotna w celu inżynierii wariantów wirusa RNA o pozytywnym wyczuwaniu

Poznaj metodę FLIPS do amplifikacji i sekwencjonowania pojedynczych prowirusów HIV-1 z komórek zakażonych. Technika ta pozwala identyfikować genetycznie intakcyjne i potencjalnie zdolne do replikacji prowirusy.

Amplifikacja prowirusów HIV-1 o niemal pełnej długości do sekwencjonowania nowej generacji

Przeglądaj więcej filmów