Ocena funkcjonalna szlaków węchowych u żyjących kijanek ksenopusa

Metoda ta może być przydatna do udzielenia odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinach neurobiologii, takie jak funkcjonowanie zakończeń presynaptycznych in vivo. Główną zaletą tego zestawu technik jest to, że pokazujemy uzupełniające się podejścia do oceny funkcji szlaków węchowych przy użyciu kijanek Xenopus jako modelu zwierzęcego. Tę procedurę zademonstruję ja, Beatrice Terni i Paolo Pacciolla.

Procedurę przecięcia należy rozpocząć od zwilżenia dwóch kawałków jakościowej bibuły filtracyjnej z celulozy w 0,02% roztworze znieczulającym, MS2 22 i umieszczeniu ich pod lunetą sekcyjną. Następnie wybierz kijankę ze zbiornika i zanurz ją w naczyniu z roztworem znieczulającym. Kijanka powinna przestać pływać w ciągu dwóch do czterech minut.

Sprawdź, czy znieczulenie jest prawidłowe, przy braku reakcji na bodźce mechaniczne zaaplikowane na poziomie ogona za pomocą pęsety. Umieść znieczuloną kijankę na bibule filtracyjnej pod lunetą. Ustaw zwierzę stroną grzbietową skierowaną do góry, aby można było uwidocznić struktury mózgu.

W przypadku eksperymentów behawioralnych użyj nożyczek do żyły, aby przeciąć oba nerwy, aby stłumić wszystkie informacje o zapachu docierające do opuszki węchowej. Załaduj szklaną pipetę z dwoma mikrolitrami zielonego wapnia i roztworu dekstryny i umieść ją w mikrowtryskiwaczu. Umieść znieczuloną kijankę pod mikroskopem preparacyjnym na bibule filtracyjnej, a następnie przesuń końcówkę pipety do głównej jamy torebki nosowej i podaj od 0,15 do 0,3 mikrolitra barwnika.

Pozostaw kijankę na miejscu na dwie do trzech minut. Za pomocą pipety Pasteura wlej 0,02% roztwór MS2 22 na bardziej rozpieszczone części zwierzęcia, aby uniknąć wysuszenia. Przenieś zwierzę do zbiornika rekonwalescencyjnego, w którym kijanka powinna odzyskać normalne pływanie w ciągu około 10 minut.

Obserwuj kwitnienie na poziomie warstwy kłębuszkowej opuszki węchowej następnego dnia po wstrzyknięciu. Przygotuj znieczuloną kijankę do obrazowania, najpierw usuwając skórę powyżej opuszki węchowej. Za pomocą nożyczek do żyły wykonaj boczne nacięcie na skórze kijanki na krawędzi ośrodkowego układu nerwowego na poziomie opuszki węchowej.

Unikaj przedłużania cięcia do tectum, które można łatwo zidentyfikować po położeniu nerwu wzrokowego. Utrzymuj zwierzę w stanie wilgotnym, aplikując krople 0,02%roztworu MS2 22 za pomocą pipety Pasteura, a następnie uszczypnij przeciętą skórę za pomocą pęsety i przeciągnij ją po układzie nerwowym. Sprawdź pomyślne usunięcie przez brak melanocytów powyżej opuszki węchowej.

Umieść kijankę w studzience naczynia pokrytego osłoną komórki. Umieść szklane szkiełko nakrywkowe pokryte smarem o wysokiej próżni, aby przykryć górną część tectum do końca ogona. Upewnij się, że opuszka węchowa i plakody pozostają wystawione na działanie podłoża zewnątrzkomórkowego.

Napełnij miskę pitri roztworem Xenopus Ringera zawierającym 100 mikromolowych tubokuraryny, aby zapobiec skurczom mięśni. Umieść naczynie trzymające kijankę pod pionowym mikroskopem. Połączyć zbiornik zawierający roztwór Xenopus Ringera z naczyniem za pomocą rurki polietylenowej w celu ciągłego obfitowania roztworu Xenopus Ringera.

Rozpocznij perfuzję roztworu Xenopus Ringer. Utrzymuj stały poziom roztworu w naczyniu przez cały czas trwania eksperymentu. Stale oceniaj żywotność kijanki, obserwując krążenie krwi w naczyniach.

Rozpocznij obrazowanie na żywo, używając obiektywu o małym powiększeniu, aby uwidocznić kijankę. Przesuń oś mikromanipulatora, aby umieścić kapilar dostarczający roztwór zapachowy na wierzchu jednej kapsułki nosowej, tworząc kąt 90 stopni z nerwem węchowym. Znajdź opuszkę węchową znajdującą się ipsilateralnie do torebki nosowej.

Przełącz się na obiektyw wodny o dużym powiększeniu i dużej odległości roboczej. Sprawdź, czy emisja kwiatostanu przez I. Struktury kłębuszkowe powinny być oczywiste. Zacznij od odpipetowania 20 mililitrów świeżego roztworu aminokwasów do podwyższonego zbiornika.

Następnie weź sześć pozbawionych pożywienia kijanek ze zbiornika mieszkalnego i umieść je w dwóch litrach czystej wody z kijankami, aby zminimalizować narażenie na substancje zapachowe. Umieść zmodyfikowaną miskę z sześcioma dołkami na białym transiluminatorze LED. Napełnij każdą studzienkę 10 mililitrami wody z kijanki.

Umieść jedną kijankę w studzience, a następnie odstaw na co najmniej trzy minuty. Rozpocznij akwizycję obrazu i uzyskaj filmy, które zawierają okresy podstawowe, bodźce i rekonwalescencji. Atrakcyjną reakcją może być ruch w kierunku dyszy dostarczającej roztwór aminokwasów.

Przywróć zwierzęta do ich zbiornika po obrazowaniu. Śledzenie pozycji głów kijanek na obszarze 35 milimetrów na 35 milimetrów lub równoważnego rozmiaru w pikselach pozwala na ilościową analizę zachowań kierowanych węchem. Linia przerywana reprezentuje obszar proksymalny do wlotu roztworu zapachowego.

Poszczególne wykresy ruchów kijanek konstruowane są przy użyciu współrzędnych X Y uzyskanych w wyniku analizy obrazu. Wyodrębnione wykresy ruchliwości muszą wiernie odwzorowywać obrazy wideo. Obszar zainteresowania o promieniu 8,75 milimetra wyśrodkowany na wlocie roztworu służy do klasyfikowania bliskości zwierząt do źródła nawaniania.

Więcej czasu spędzonego w pobliżu dyszy nawaniacza wskazuje na pozytywny tropizm. Czas spędzony przez kijanki w pobliżu dyszy w określonych okresach, na przykład w odstępach 15 sekundowych, pozwala na identyfikację zdolności do wykrywania roztworów aminokwasów. Ogólne zachowanie populacji kijanek można uzyskać, wykreślając rozkład poszczególnych danych.

Tropizm dodatni można wykryć, gdy roztwór aminokwasu jest przygotowany w jednym milimolowym lub 160 mikromolowym. Zwierzęta nie reagują na podlewanie. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak techniki histologiczne lub elektrofizjologia, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak zmiana właściwości synaptycznych po urazie.

Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom z dziedziny neurobiologii do zbadania przetwarzania informacji węchowych w kijance Xenopus.