Name: Ocena funkcjonalna szlaków węchowych u żyjących kijanek ksenopusa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Poznaj metody oceny funkcjonalnej szlaków węchowych u żyjących kijanek Xenopus w badaniach neurobiologicznych. Techniki obrazowania in vivo pozwalają analizować przetwarzanie informacji węchowej i reakcje behawioralne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez granty od El Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO; SAF2015-63568-R) współfinansowane przez Europejski Fundusz Rozwoju Regionalnego (EFRR), konkurencyjne nagrody badawcze z M. G. F. Fuortes Memorial Fellowship, Stephen W. Kuffler Fellowship Fund, Laura and Arthur Colwin Endowed Summer Research Fellowship Fund, Fischbach Fellowship oraz Great Generation Fund of the Marine Biological Laboratory i National Xenopus Resource RRID: SCR_013731 (Woods Hole, MA), gdzie przeprowadzono część tych prac. Dziękujemy również programowi CERCA / Generalitat de Catalunya za wsparcie instytucjonalne. A.L. jest stypendystą Serra Húnter.

<ol><li>Hellsten, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+of+the+Western+clawed+frog+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis.</a> Science. 328 (5978), 633-636 (2010).</li>
<li>Session, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+evolution+in+the+allotetraploid+frog+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome evolution in the allotetraploid frog Xenopus laevis.</a> Nature. 538 (7625), 336-343 (2016).</li>
<li>Zhang, L. I., Tao, H. W., Holt, C. E., Harris, W. A., Poo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+window+for+cooperation+and+competition+among+developing+retinotectal+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A critical window for cooperation and competition among developing retinotectal synapses.</a> Nature. 395 (6697), 37-44 (1998).</li>
<li>Li, J., Erisir, A., Cline, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+time-lapse+imaging+and+serial+section+electron+microscopy+reveal+developmental+synaptic+rearrangements%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">In vivo time-lapse imaging and serial section electron microscopy reveal developmental synaptic rearrangements.</a> Neuron. 69 (2), 273-286 (2011).</li>
<li>Dietrich, H., Glasauer, S., Straka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Organization+of+Vestibulo-Ocular+Responses+in+Abducens+Motoneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Functional Organization of Vestibulo-Ocular Responses in Abducens Motoneurons.</a> Journal of Neuroscience. 37 (15), 4032-4045 (2017).</li>
<li>Buhl, E., Roberts, A., Soffe, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+a+trigeminal+sensory+nucleus+in+the+initiation+of+locomotion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The role of a trigeminal sensory nucleus in the initiation of locomotion.</a> Journal of Physiology. 590, Pt 10 2453-2469 (2012).</li>
<li>Junek, S., Kludt, E., Wolf, F., Schild, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+coding+with+patterns+of+response+latencies%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Olfactory coding with patterns of response latencies.</a> Neuron. 67 (5), 872-884 (2010).</li>
<li>Stout, R. P., Graziadei, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+the+olfactory+placode+on+the+development+of+the+brain+in+Xenopus+laevis+%28Daudin%29.+I.+Axonal+growth+and+connections+of+the+transplanted+olfactory+placode%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Influence of the olfactory placode on the development of the brain in Xenopus laevis (Daudin). I. Axonal growth and connections of the transplanted olfactory placode.</a> Neuroscience. 5 (12), 2175-2186 (1980).</li>
<li>Yoshino, J., Tochinai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+regeneration+of+the+olfactory+bulb+requires+reconnection+to+the+olfactory+nerve+in+Xenopus+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Development%2C+Growth+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Functional regeneration of the olfactory bulb requires reconnection to the olfactory nerve in Xenopus larvae.</a> Development, Growth & Differentiation. 48 (1), 15-24 (2006).</li>
<li>Terni, B., Pacciolla, P., Masanas, H., Gorostiza, P., Llobet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+temporal+coupling+between+synaptic+rewiring+of+olfactory+glomeruli+and+the+emergence+of+odor-guided+behavior+in+Xenopus+tadpoles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Tight temporal coupling between synaptic rewiring of olfactory glomeruli and the emergence of odor-guided behavior in Xenopus tadpoles.</a> Journal of Comparative Neurology. 525 (17), 3769-3783 (2017).</li>
<li>Goda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+screens+for+mutations+affecting+development+of+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic screens for mutations affecting development of Xenopus tropicalis.</a> PLOS Genetics. 2 (6), 91(2006).</li>
<li>Nakayama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+efficient+CRISPR%2FCas9-mediated+targeted+mutagenesis+in+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis.</a> Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).</li>
<li>Jafkins, A., Abu-Daya, A., Noble, A., Zimmerman, L. B., Guille, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Husbandry+of+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Husbandry of Xenopus tropicalis.</a> Methods in Molecular Biology. 917, 17-31 (2012).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="https://www.journals.uchicago.edu/doi/10.1086/393914">Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).</li>
<li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="https://searchworks.stanford.edu/view/2945881">Normal table of Xenopus laevis (Daudin). A systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis</a>. , North-Holland Publishing Company. Amsterdam. (1956).</li>
<li>Xu, H., Dude, C. M., Baker, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine-grained+fate+maps+for+the+ophthalmic+and+maxillomandibular+trigeminal+placodes+in+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Fine-grained fate maps for the ophthalmic and maxillomandibular trigeminal placodes in the chick embryo.</a> Developmental Biology. 317 (1), 174-186 (2008).</li>
<li>Friedrich, R. W., Korsching, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+and+chemotopic+odorant+coding+in+the+zebrafish+olfactory+bulb+visualized+by+optical+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Combinatorial and chemotopic odorant coding in the zebrafish olfactory bulb visualized by optical imaging.</a> Neuron. 18 (5), 737-752 (1997).</li>
<li>Ishibashi, S., Cliffe, R., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+bi-allelic+mutation+rates+using+TALENs+in+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Highly efficient bi-allelic mutation rates using TALENs in Xenopus tropicalis.</a> Biology Open. 1 (12), 1273-1276 (2012).</li>
<li>Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+cell+and+particle+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Methods for cell and particle tracking.</a> Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).</li>
<li>Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+the+spreading+and+toxicity+of+prion-like+proteins+using+the+metazoan+model+organism+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Journalof+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism C. elegans.</a> Journalof Visualized Experiments. (95), e52321(2015).</li>
<li>Koide, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+neural+circuitry+for+attraction+to+amino+acids+revealed+by+transposon-mediated+gene+trap+approach+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Olfactory neural circuitry for attraction to amino acids revealed by transposon-mediated gene trap approach in zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (24), 9884-9889 (2009).</li>
<li>Love, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pTransgenesis%3A+a+cross-species%2C+modular+transgenesis+resource%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">pTransgenesis: a cross-species, modular transgenesis resource.</a> Development. 138 (24), 5451-5458 (2011).</li>
<li>Tandon, P., Conlon, F., Furlow, J. D., Horb, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+genetic+toolkit+in+Xenopus%3A+Approaches+and+opportunities+for+human+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Expanding the genetic toolkit in Xenopus: Approaches and opportunities for human disease modeling.</a> Developmental Biology. 426 (2), 325-335 (2017).</li>
<li>Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+human+neurodevelopmental+disorders+in+the+Xenopus+tadpole%3A+from+mechanisms+to+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets.</a> Disease Models & Mechanisms. 6 (5), 1057-1065 (2013).</li>
<li>Truszkowski, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fragile+X+mental+retardation+protein+knockdown+in+the+developing+Xenopus+tadpole+optic+tectum+results+in+enhanced+feedforward+inhibition+and+behavioral+deficits%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Development%22%5BJournal%5D)">Fragile X mental retardation protein knockdown in the developing Xenopus tadpole optic tectum results in enhanced feedforward inhibition and behavioral deficits.</a> Neural Development. 11 (1), 14(2016).</li>
<li>Hassenklöver, T., Manzini, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+wiring+logic+in+amphibians+challenges+the+basic+assumptions+of+the+unbranched+axon+concept%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Olfactory wiring logic in amphibians challenges the basic assumptions of the unbranched axon concept.</a> Journal of Neuroscience. 33 (44), 17247-17252 (2013).</li>
<li>Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+electroporation+for+gene+transfer+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Single-cell electroporation for gene transfer in vivo.</a> Neuron. 29 (3), 583-591 (2001).</li>
<li>Sild, M., Van Horn, M. R., Schohl, A., Jia, D., Ruthazer, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+Activity-Dependent+Regulation+of+Radial+Glial+Filopodial+Motility+Is+Mediated+by+Glial+cGMP-Dependent+Protein+Kinase+1+and+Contributes+to+Synapse+Maturation+in+the+Developing+Visual+System%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neural Activity-Dependent Regulation of Radial Glial Filopodial Motility Is Mediated by Glial cGMP-Dependent Protein Kinase 1 and Contributes to Synapse Maturation in the Developing Visual System.</a> Journal of Neuroscience. 36 (19), 5279-5288 (2016).</li>
<li>McDiarmid, R., Altig, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMcDiarmid%2C+R+%22Tadpoles%3A+The+biology+of+anuran+larvae%22">Tadpoles: The biology of anuran larvae</a>. , The University of Chicago Press. 149-169 (1999).</li>
<li>Heerema, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+and+molecular+analyses+of+olfaction-mediated+avoidance+responses+of+Rana+%28Lithobates%29+catesbeiana+tadpoles%3A+Sensitivity+to+thyroid+hormones%2C+estrogen%2C+and+treated+municipal+wastewater+effluent%5BTitle%5D)+AND+%22Hormones+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">Behavioral and molecular analyses of olfaction-mediated avoidance responses of Rana (Lithobates) catesbeiana tadpoles: Sensitivity to thyroid hormones, estrogen, and treated municipal wastewater effluent.</a> Hormones and Behavior. 101, 85-93 (2018).</li>
<li>Gaudin, A., Gascuel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+atlas+describing+the+ontogenic+evolution+of+the+primary+olfactory+projections+in+the+olfactory+bulb+of+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">3D atlas describing the ontogenic evolution of the primary olfactory projections in the olfactory bulb of Xenopus laevis.</a> Journal of Comparative Neurology. 489 (4), 403-424 (2005).</li>
<li>Scheidweiler, U., Nezlin, L., Rabba, J., Müller, B., Schild, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slice+culture+of+the+olfactory+bulb+of+Xenopus+laevis+tadpoles%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Senses%22%5BJournal%5D)">Slice culture of the olfactory bulb of Xenopus laevis tadpoles.</a> Chemical Senses. 26 (4), 399-407 (2001).</li>
<li>Manzini, I., Schild, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classes+and+narrowing+selectivity+of+olfactory+receptor+neurons+of+Xenopus+laevis+tadpoles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Classes and narrowing selectivity of olfactory receptor neurons of Xenopus laevis tadpoles.</a> Journal of General Physiology. 123 (2), 99-107 (2004).</li>
<li>Kludt, E., Okom, C., Brinkmann, A., Schild, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+temperature+with+odor+processing+in+the+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Integrating temperature with odor processing in the olfactory bulb.</a> Journal of Neuroscience. 35 (20), 7892-7902 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W artykule opisano techniki, które są przydatne do badania funkcjonalności szlaków węchowych u żyjących kijanek Xenopus. Obecny protokół jest szczególnie przydatny dla tych laboratoriów, które pracują lub mają dostęp do Xenopus; Jest to jednak również interesujące dla tych badaczy, którzy badają komórkowe i molekularne podstawy regeneracji i naprawy neuronów. Wyniki uzyskane w ramach projektu Xenopus można połączyć z danymi zebranymi w innych modelach kręgowców w celu zidentyfikowania zachowany...

Kijanki Xenopus stanowią doskonały model zwierzęcy do badania normalnej funkcji układu nerwowego. Przezroczystość, w pełni zsekwencjonowany genom1,2, oraz dostępność do technik chirurgicznych, elektrofizjologicznych i obrazowania to unikalne właściwości larw Xenopus, które pozwalają badać funkcje neuronalne in vivo3. Niektóre z wielu możliwości eksperymentalnych tego modelu zwierzęcego są zilustrowane przez dokładne badania przeprowadzone na systemach sensorycznych i motorycznych kijanki4,5,6. Szczególnie dobrze nadającym się obwodem neuronalnym do badania wielu aspektów przetwarzania informacji na poziomie synaps jest system węchowy kijanki Xenopus7. Po pierwsze, jego łączność synaptyczna jest dobrze zdefiniowana: neurony receptorów węchowych (ORN) rzutują na opuszkę węchową i nawiązują kontakty synaptyczne z dendrytami komórek mitralnych / kępkowych w kłębuszkach nerkowych w celu wygenerowania map zapachowych. Po drugie, jego ORN są stale generowane przez neurogenezę przez całe życie, aby utrzymać funkcjonalność szlaków węchowych8. I po trzecie, ponieważ układ węchowy wykazuje duże zdolności regeneracyjne, kijanki Xenopus są w stanie całkowicie zreformować swoją opuszkę węchową po ablacji9.
W tym artykule opisujemy podejścia łączące obrazowanie kłębuszków węchowych u żywych kijanek z eksperymentami behawioralnymi w celu zbadania funkcjonalności szlaków węchowych. Opisane tutaj metody zostały wykorzystane do zbadania funkcjonalnego odzyskiwania połączenia kłębuszkowego w opuszce węchowej po transsekcji nerwu węchowego10. Dane uzyskane w kijankach Xenopus są reprezentatywne dla kręgowców, ponieważ przetwarzanie węchowe jest ewolucyjnie zachowane.
Opisane metody są zilustrowane przy użyciu X. tropicalis, ale można je łatwo zaimplementować w X. Laevis. Pomimo większych rozmiarów dorosłego osobnika X. laevis, oba gatunki są niezwykle podobne w stadiach kijanki. Główne różnice występują na poziomie genomu. X. laevis wykazuje słabą podatność genetyczną, determinowaną głównie przez genom allotetraploidalny i długi czas generacji (około 1 roku). Natomiast X. tropicalis jest bardziej podatny na modyfikacje genetyczne ze względu na krótszy czas generacji (5-8 miesięcy) i diploidalny genom. Reprezentatywne doświadczenia zilustrowano dla zwierząt typu dzikiego i trzech różnych linii transgenicznych: Hb9:GFP (X. tropicalis), NBT:GFP (X. tropicalis) i tubb2:GFP (X. laevis).
Metodologie przedstawione w obecnej pracy powinny być brane pod uwagę równolegle z postępem genetycznym w dziedzinie Xenopus. Prostota i łatwa implementacja przedstawionych technik sprawia, że są one szczególnie przydatne do oceny już opisanych mutantów11, a także linii Xenopus generowanych przez technologię CRISPR-Cas912. Opisujemy również zabieg chirurgiczny stosowany do transektu nerwów węchowych, który może być wdrożony w każdym laboratorium mającym dostęp do kijanek Xenopus. Podejścia stosowane do oceny presynaptycznych odpowiedzi wapniowych i zachowań sterowanych węchem wymagają specjalnego sprzętu, aczkolwiek dostępnego po umiarkowanych kosztach. Metodologie są przedstawione w prostej formie, aby promować ich stosowanie w grupach badawczych i mogą stanowić podstawę dla bardziej złożonych testów poprzez wdrażanie ulepszeń lub powiązanie z innymi technikami, tj. podejściami histologicznymi lub genetycznymi.

<table><tbody><tr><td>Sole do akwariów (Instant Ocean Salt)</td><td>Tecniplast</td><td>XPSIO25R</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine (metanosulfonian 3-aminobenzoesanu etylu)</td><td>Pęseta Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>#5 (końcówka 0,025 x 0,005 mm)</td><td>World Precision Instruments</td><td>501985</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Nożyczki (końcówka 0,015 x 0,015)</td><td>World Precision Instruments</td><td>501778</td><td></td></tr><tr><td>Whatman jakościowa bibuła filtracyjna</td><td>Fisher Scientific</td><td>WH3030917</td><td></td></tr><tr><td>X. laevis tubb2-GFP</td><td>National Xenopus Resource (NXR), RRID:SCR_013731</td><td>NXR_0.0035</td><td></td></tr><tr><td>X.tropicalis NBT-GFP</td><td>Europejskie Centrum Zasobów Xenopus (EXRC) RRID:SCR_007164</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellTracker CM-DiI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C-7001</td><td></td></tr><tr><td>Dekstran Calcium Green, sól potasowa, 10 000 MW, Anionowe</td> kapilary <td>borokrzemianowe ThermoFisher Scientific</td><td>C-3713</td><td></td></tr><tr><td>do mikroiniekcji</td><td>Sutter Instrument</td><td>B100-75-10</td><td>O.D.=1,0 mm., ID=0,75 mm.</td></tr><tr><td>Ściągacz</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowtryskiwacz</td><td>Parker Instruments</td><td>Picospritzer III</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard-184</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>761028-5EA</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipety World</td><td>Precision Instruments</td><td>MF28G-5</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop pionowy</td><td>Stymulator Zeiss</td><td>AxioImager-A1</td><td></td></tr><tr><td>Master-8</td><td>A.M.P.I.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kamera CCD</td><td>Hamamatsu</td><td>Image EM</td><td></td></tr><tr><td>Zawory elektromagnetyczne</td><td>Warner Instruments</td><td>VC-6 System sześciokanałowy</td> Dow Corning High Vacuum <td></td></tr><tr><td>Grease</td><td>VWR Scientific</td><td>636082B</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek tubokuraryny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2379</td><td></td></tr><tr><td>Kamera CCD</td><td>Zeiss</td><td>MRC-5 Kamera</td><td>sterowana przez Zen oprogramowanie</td></tr><tr><td>obiektywu aparatu</td><td>Thorlabs</td><td>MVL8ML3</td><td>Istnieje wiele możliwości, które należy dostosować do zastosowanego modelu kamery</td></tr><tr><td>Żywica epoksydowa</td><td>RS Komponenty</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kolektor</td><td></td><td>perfuzyjny</td><td>Warner Instruments</td> MP-6</tr><tr><td>Mikromanipulator do lokalnego dostarczania roztworów</td><td>Narishige</td><td>MN-153</td><td></td></tr><tr><td>Mini zaciski magnetyczne</td><td>Warner Instruments</td><td>MAG-7, MAG-6</td><td></td></tr><tr><td>Rurka polietylenowa</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0755</td><td>OD=1,57 mm., ID = 1,14 mm.</td></tr></tbody></table>

ocena funkcjonalna szlaków węchowych u żyjących kijanek ksenopusa

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Kijanki Xenopus oferują unikalną platformę do badania funkcji układu nerwowego. Zapewniają one wiele korzyści eksperymentalnych, takich jak dostęp do wielu metod obrazowania, technik elektrofizjologicznych i testów behawioralnych. Układ węchowy kijanki Xenopus jest szczególnie dobrze przystosowany do badania funkcji synaps powstałych podczas normalnego rozwoju lub zreformowanych po urazie. W tym miejscu opisujemy metodologie oceny przetwarzania informacji węchowych u żywych larw Xenopus. Przedstawiamy połączenie pomiarów in vivo presynaptycznych odpowiedzi wapniowych w kłębuszkach nerkowych opuszki węchowej z testami zachowania sterowanymi węchem. Metody można łączyć z przecięciem nerwów węchowych w celu zbadania ponownego okablowania połączeń synaptycznych. Eksperymenty przedstawiono na zwierzętach zarówno typu dzikiego, jak i modyfikowanych genetycznie wykazujących ekspresję reporterów GFP w komórkach ośrodkowego układu nerwowego. Zastosowanie opisanych podejść do genetycznie zmodyfikowanych kijanek może być przydatne do rozwikłania zasad molekularnych, które definiują zachowanie kręgowców.

W niniejszej pracy przedstawiamy połączenie dwóch komplementarnych podejść do badania in vivo funkcjonalności układu węchowego kijanek Xenopus: i) metody obrazowania zmian presynaptycznego stężenia Ca2+ w kłębuszkach żywych kijanek przy użyciu fluorescencyjnego wskaźnika wapnia oraz ii) behawioralnego testu sterowanego zapachami, który może być wykorzystany do zbadania reakcji na konkretne wodne substancje zapachowe. Ponieważ podejścia te zostały zastosowane d...

Kijanki Xenopus oferują unikalną platformę do badania funkcji układu nerwowego in vivo. Opisano metodologie oceny przetwarzania informacji węchowych u żywych larw Xenopus w normalnych warunkach chowu lub po urazie.

Ocena funkcjonalna szlaków węchowych u żyjących kijanek ksenopusa

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system. They provide multiple experimental advantages, such as ...

Metoda ta może być przydatna do udzielenia odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinach neurobiologii, takie jak funkcjonowanie zakończeń presynaptycznych in vivo. Główną zaletą tego zestawu technik jest to, że pokazujemy uzupełniające się podejścia do oceny funkcji szlaków węchowych przy użyciu kijanek Xenopus jako modelu zwierzęcego. Tę procedurę zademonstruję ja, Beatrice Terni i Paolo Pacciolla.Procedurę przecięcia należy rozpocząć od zwilżenia dwóch kawałków jakościowej bibuły filtracyjnej z celulozy w 0,02% roztworze znieczulającym, MS2 22 i umieszczeniu ich pod lunetą sekcyjną. Następnie wybierz kijankę ze zbiornika i zanurz ją w naczyniu z roztworem znieczulającym. Kijanka powinna przestać pływać w ciągu dwóch do czterech minut.Sprawdź, czy znieczulenie jest prawidłowe, przy braku reakcji na bodźce mechaniczne zaaplikowane na poziomie ogona za pomocą pęsety. Umieść znieczuloną kijankę na bibule filtracyjnej pod lunetą. Ustaw zwierzę stroną grzbietową skierowaną do góry, aby można było uwidocznić struktury mózgu.W przypadku eksperymentów behawioralnych użyj nożyczek do żyły, aby przeciąć oba nerwy, aby stłumić wszystkie informacje o zapachu docierające do opuszki węchowej. Z

functional-evaluation-of-olfactory-pathways-in-living-xenopus-tadpoles

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Pokazujemy różne warianty techniki wewnątrzkomórkowego zapisu wielojednostkowego, aby scharakteryzować reakcje wywołane zapachem w pierwszych trzech etapach szlaku węchowego bezkręgowców. Techniki te można łatwo zaadaptować do badania aktywności zespołu również w innych systemach neuronowych.

Wielojednostkowe metody rejestracji w celu scharakteryzowania aktywności neuronalnej w obwodach węchowych szarańczy (Schistocerca americana)

Dodatkowa opuszka węchowa myszy (AOB) była trudna do zbadania w kontekście kodowania sensorycznego. Tutaj demonstrujemy sekcję, w wyniku której powstaje preparat ex vivo, w którym neurony AOB pozostają funkcjonalnie połączone ze swoimi obwodowymi wejściami, ułatwiając badania nad przetwarzaniem informacji o mysich feromonach i kairomonach.

Ex vivo Preparaty nienaruszonego narządu lemieszowo-nosowego i dodatkowej opuszki węchowej

Opisujemy protokół znakowania in vivo węchowych neuronów czuciowych za pomocą elektroporacji, a następnie konfokalnego skanowania laserowego lub mikroskopii wielofotonowej w celu wizualizacji morfologii neuronów i ich rozwoju w czasie.

Układ węchowy jako model do badania wzorców wzrostu i morfologii aksonów in vivo

Analiza fizjologicznych właściwości węchowych neuronów czuciowych nadal napotyka na techniczne ograniczenia. Tutaj rejestrujemy je przez perforowany patch-clamp w nienaruszonym preparowaniu nabłonka węchowego u myszy ukierunkowanych na geny. Technika ta pozwala na scharakteryzowanie właściwości błony i odpowiedzi na określone ligandy neuronów wyrażających określone receptory węchowe.

Perforowany zapis patch-clamp węchowych węchowych neuronów czuciowych myszy w nienaruszonym neuroepithelium: analiza funkcjonalna neuronów wyrażających zidentyfikowany receptor zapachowy

Tutaj opisujemy protokół pomiaru i analizy reakcji na temperaturę w opuszce węchowej Xenopus laevis. Neurony receptorów węchowych i komórki mitralne są barwione różnicowo, po czym rejestrowane są zmiany wapnia, odzwierciedlające wrażliwość niektórych sieci neuronowych w bańce na spadki temperatury wywołane w nosie.

Rejestrowanie aktywności neuronalnej wywołanej temperaturą poprzez monitorowanie zmian wapnia w opuszce węchowej Xenopus laevis

Ten protokół analizuje zachowanie nawigacyjne larwy Drosophila w odpowiedzi na jednoczesną optogenetyczną stymulację jej neuronów węchowych. Światło o długości fali 630 nm służy do aktywacji pojedynczych neuronów węchowych wyrażających rodopsynę z przesuniętym ku czerwieni kanałem. Ruch larw jest jednocześnie śledzony, rejestrowany cyfrowo i analizowany za pomocą specjalnie napisanego oprogramowania.

Śledzenie zachowań larw Drosophila w odpowiedzi na optogenetyczną stymulację neuronów węchowych

Ten protokół ma na celu pokazanie, jak mikrowstrzykiwać mieszaninę DNA/DOTAP do pąków ocznych jednodniowych zarodków Xenopus laevis, oraz jak obrazować i rekonstruować indywidualne zielone białko fluorescencyjne (GFP) wyrażające aksonalne trzpienie wzrokowe w tektalnych śródmózgowiu nienaruszonych, żyjących kijanek Xenopus.

Mikroiniekcja DNA do zawiązków ocznych w zarodkach Xenopus laevis i obrazowanie GFP wyrażającego altanki aksonalne wzrokowe w nienaruszonych, żywych kijankach Xenopus

Zewnątrzkomórkowy zapis wielopunktowy z nerwu węchowego jest czułą, solidną i powtarzalną metodą oceny wrażliwości węchowej u ryb morskich. Rejestruje pierwotne bodźce sensoryczne i jest niezależny od zewnętrznego zasolenia.

Zewnątrzkomórkowy zapis wielojednostkowy z nerwu węchowego teleostów

Ten protokół opisuje procedurę preparacji, warunki hodowli i obrazowanie na żywo systemu eksplantacji czułków-mózgu do badania zespołu obwodów węchowych.

System eksplantatów do badań obrazowania poklatkowego zespołu obwodów węchowych u Drosophila

Opisujemy tutaj metody indukowania i analizowania zależnej od doświadczenia węchowego przebudowy synaptycznych kłębuszków nerkowych płata czułkowego w mózgu młodocianych Drosophila.

Zależna od doświadczenia przebudowa połączeń synaptycznych neuronów czuciowych młodzieńczych neuronów czuciowych we wczesnym okresie życia

Poznaj metody oceny funkcjonalnej szlaków węchowych u żyjących kijanek Xenopus w badaniach neurobiologicznych. Techniki obrazowania in vivo pozwalają analizować przetwarzanie informacji węchowej i reakcje behawioralne.

Ocena funkcjonalna szlaków węchowych u żyjących kijanek ksenopusa

Przeglądaj więcej filmów