Name: Nieniszczące monitorowanie rozwoju naczyń krwionośnych opartych na degradowalnych rusztowaniach za pomocą optycznej koherentnej tomografii (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Odkryj nieniszczącą metodę monitorowania przebudowy naczyń krwionośnych i degradacji rusztowań PGA za pomocą optycznej koherentnej tomografii w inżynierii tkankowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Projektowi Planowania Nauki i Technologii prowincji Guangdong w Chinach (2016B070701007) za wsparcie tej pracy.

1. Degradowalna hodowla naczyń krwionośnych na bazie rusztowań PGA
<ol>
	<li>Produkcja rusztowań PGA
	<ol>
		<li>Zszyj siatkę PGA (o średnicy 19 mm i grubości 1 mm) wokół rurki silikonowej sterylizowanej tlenkiem etylenu (długość 17 cm, średnica 5,0 mm i grubość 0,3 mm) za pomocą szwu 5-0.</li>
		<li>Zszyć politetrafluoroetylen (ePTFE, długość 1 cm) szwem 4-0 na każdym końcu siatki PGA i zachodzić na 2 mm.</li>
		<li>Zanurz rusztowania PGA ręką w 1 mol/l NaOH na 1 minutę, aby dostosować strukturę przestrzenną siatki i zanurz je w wodzie klasy kulturowej tkankowej trzy razy przez 2 minuty każde. Za każdym razem delikatnie osuszaj rusztowanie bibułą. Następnie wysuszyć rusztowania w kapturze z dmuchawą przez 1 godzinę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Montaż bioreaktora i złącza Y do obrazowania OCT
	<ol>
		<li>Namocz samodzielnie opracowany szklany cylindryczny bioreaktor (10 cm średnicy i 11,7 cm wysokości z czterema wargami wewnątrz i czterema bocznymi ramionami na zewnątrz reaktora, jak pokazano na <silna klasa="xfig">Rysunek 1), rusztowania PGA, rurkę silikonową (średnica zewnętrzna 5 mm, grubość 0,3 mm), biokompatybilne rurki, łączniki, mieszadło i sprzęt do montażu w zbiorniku na 95% etanolu przez 2 godziny.</li>
		<li>Przeciągnij rusztowanie PGA przez boczne ramiona bioreaktora połączone z jednej strony za pomocą złącza, a z drugiej strony za pomocą złącza Y służącego do doprowadzenia przewodu prowadzącego OCT. W ten sam sposób zamontuj kolejne rusztowanie PGA w bioreaktorze. Proszę zapoznać się z Rysunek 1.</li>
		<li>Dopasuj ePTFE do warg bioreaktora, zaciskając szwy 4-0.</li>
		<li>Ponownie umieść bioreaktor w zbiorniku etanolu na 1 godzinę i wysusz przez noc w okapie z włączoną dmuchawą.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wysiew HUASMC i kondycjonowanie statyczne w bioreaktorze
	<ol>
		<li>Wyizolować HUASMC z ludzkich tętnic pępowinowych za pomocą standardowych technik eksplantacji.</li>
		<li>Rozwijaj i utrzymuj komórki w pożywce do wzrostu komórek mięśni gładkich składającej się z pożywki DMEM, 20% płodowej surowicy bydlęcej, 2,36 mg / ml HEPES, 100 U / ml penicyliny G, 50 μg / ml proliny, 20 μg / ml alaniny, 50 μg / ml glicyny, 1,5 μg / ml CuSO4, 50 μg / ml kwasu askorbinowego, 10 ng / ml zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów i 10 ng / ml płytkowego czynnika wzrostu.</li>
		<li>Wysiewać HUASMC w stężeniu 5×106 komórek/ml w powyższej pożywce hodowlanej na rusztowania PGA.</li>
		<li>Umieść mieszadło (o długości 1,5 cm) w bioreaktorze. Włóż jedną rurkę zasilającą (średnica 5 mm, długość 15 cm) i trzy krótkie segmenty rurki (średnica 5 mm, długość 7 cm) w celu wymiany gazu przez silikonową pokrywę korka.</li>
		<li>Podłącz filtry PTFE 0,22 μm do każdej rurki wymiany powietrza i jedną nasadkę heparyny do rurki zasilającej. Wyreguluj mieszadło z prędkością mieszania 13 rund na minutę. Zamontuj szklany bioreaktor, silikonową pokrywę korka i rusztowanie PGA w systemie hodowli.</li>
		<li>Pozwól HUASMC przylegać przez 45 minut, przechylając bioreaktor co 15 minut ze stojakiem, w lewo i w prawo. Porty i złącza reaktora są uszczelnione folią parafinową.</li>
		<li>Podłącz pompę Luo-Ye, worek PBS, sterownik z biokompatybilnymi rurkami jako system perfuzyjny. Otwórz napęd, aby napełnić probówki PBS.</li>
		<li>Umieścić cały bioreaktor w nawilżonym inkubatorze z 5% stężeniemCO2 w temperaturze 37 °C. Napełnić komorę hodowlaną 450 ml pożywki hodowlanej HUASMCs.</li>
		<li>Naciśnij przycisk stop i wyłącz zasilanie urządzenia napędowego. Uprawiaj rusztowania z nasionami w kulturze statycznej przez tydzień.</li>
		<li>Pożywkę należy zmieniać co 3-4 dni, zasysając połowę starej pożywki przez rurkę zasilającą i ponownie napełniając reaktor równoważną ilością świeżej pożywki hodowlanej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie systemu perfuzyjnego do obrazowania OCT
	<ol>
		<li>Pompuj płyny w worku PBS, aby krążyły przez biokompatybilne rurki i wróciły do worka.</li>
		<li>Otwórz moc sterownika i reguluj ustawienie pompy z częstotliwością 60 uderzeń na minutę i wyjściowym ciśnieniem skurczowym 120 mmHg. Dostosuj parametry mechaniczne do potrzeb hodowli naczyniowej w inżynierii tkankowej.</li>
		<li>Kliknij przycisk uruchom, aby system perfuzyjny działał. Zapewnij powyższą stałą stymulację pulsacyjną naczyń przez 3 tygodnie, iteracyjnie zwiększając ciśnienie w biokompatybilnych rurkach10,12 po 1 tygodniu hodowli statycznej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Wykonywanie obrazowania optycznego za pomocą OCT
<ol>
	<li>Użyj źródła światła, aby zapewnić rozdzielczość osiową 10-20 μm i głębokość obrazu 1-2 mm, aby zidentyfikować strukturę TEBV na podstawie systemu obrazowania wewnątrznaczyniowego OCT w dziedzinie częstotliwości9.</li>
	<li>Włącz wyłącznik zasilania i otwórz oprogramowanie do przechwytywania obrazu.</li>
	<li>Podłącz światłowodowy cewnik do obrazowania do silnika napędowego i sterownika optycznego (DOC) z funkcją automatycznego wycofywania cewnika.</li>
	<li>Ustaw parametry szybkości akwizycji obrazu na 10 klatek na sekundę z automatyczną prędkością cofania 10 mm/s.</li>
	<li>Przymocuj cewnik do obrazowania do złącza Y za pomocą nasadki heparyny z igłą 18G.</li>
	<li>Umieść cewnik w silikonowej rurce i określ szczelność szwów siatki PGA przed załadowaniem rusztowania PGA do bioreaktora.</li>
	<li>Umieść końcówkę cewnika w obszarze zainteresowania. Dostosuj urządzenie odciągające i sprawdź jakość obrazu8.</li>
	<li>Uzyskuj obrazy po 1, 4, 7, 10, 14, 17, 21, 28 dniach hodowli dla każdego pojedynczego TEBV i zapisuj sekwencyjnie dzięki obserwacji mikrostruktury TEBV w czasie rzeczywistym, w tym morfologii powierzchni, struktury wewnętrznej i składu.</li>
	<li>Powtórz pomiar 3 razy, aby za każdym razem uzyskać wiarygodny pomiar naczyń inżynieryjnych. Uchwyć serię obrazów podczas testów za pomocą oprogramowania do przechwytywania obrazów.</li>
</ol>
3. Analiza obrazowa
<ol>
	<li>Użyj oprogramowania do analizy obrazu, aby zmierzyć grubość ścianki TEBV. Wybierz obraz, który ma zostać przeanalizowany. Kliknij narzędzie do śledzenia, aby automatycznie zidentyfikować wewnętrzną stronę TEBV przez oprogramowanie i ręcznie naszkicować zewnętrzną stronę. Na ekranie pojawi się wykres grubości.</li>
	<li>Powtórz pomiar 5 razy, aby uzyskać wiarygodny pomiar konstrukcji. Analiza OCT została przeprowadzona przez dwóch niezależnych badaczy, którzy nie zwrócili uwagi na uzyskane informacje.</li>
</ol>
4. Zbiór TEBV i przetwarzanie tkanek
<ol>
	<li>Otwórz silikonową pokrywkę korka umieszczoną nad bioreaktorem po zakończeniu hodowli i wyrzuć pożywkę hodowlaną. Poluzuj ePTFE z warg bioreaktora i odetnij silikonowe rurki od zewnętrznej strony ePTFE nożyczkami. Zebrać TEBV z bioreaktora i pociąć na sekcje w celu badania za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej.</li>
	<li>Wyjmij resztę TEBV i pokrój na odcinki o grubości 4 μm. Wyciągnij podtrzymującą rurkę silikonową i przymocuj sekcje 4% paraformaldehydu. Wykonaj rutynowe barwienie histologiczne trichromu Massona i czerwieni Syriusza, aby zbadać morfologię kolagenu i PGA10,13,14.</li>
	<li>Aby ocenić zawartość PGA i składnika kolagenu, obserwuj próbki histologiczne z czerwonym zabarwieniem Sirius za pomocą mikroskopu spolaryzowanego. Pozostałości PGA są wyraźnie odgraniczone przez dwójłomność, a obszar pozostałości można określić ilościowo na podstawie pola przekroju poprzecznego10.</li>
</ol>

<ol><li>Chan-Park, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+control+of+vascular+smooth+muscle+cell+morphology+and+phenotype+for+functional+tissue-engineered+small-diameter+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">Biomimetic control of vascular smooth muscle cell morphology and phenotype for functional tissue-engineered small-diameter blood vessels.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 88, 1104-1121 (2009).</li>
<li>Ballyns, J. J., Bonassar, L. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2935622/">Image-guided tissue engineering.</a> Journal of Cellular & Molecular Medicine. 13, 1428-1436 (2009).</li>
<li>Smith, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+imaging+methodologies+for+3D+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+%26+Technique%22%5BJournal%5D)">A comparison of imaging methodologies for 3D tissue engineering.</a> Microscopy Research & Technique. 73, 1123-1133 (2010).</li>
<li>Chang, W. G., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+short+discourse+on+vascular+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">A short discourse on vascular tissue engineering.</a> NPJ Regenerative Medicine. 2, (2017).</li>
<li>Appel, A. A., Anastasio, M. A., Larson, J. C., Brey, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+challenges+in+biomaterials+and+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Imaging challenges in biomaterials and tissue engineering.</a> Biomaterials. 34, 6615-6630 (2013).</li>
<li>Rice, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+characterization+of+structure+and+morphology+of+silk+fibroin+biomaterials+using+non-linear+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Non-invasive characterization of structure and morphology of silk fibroin biomaterials using non-linear microscopy.</a> Biomaterials. 29, 2015-2024 (2008).</li>
<li>Niklason, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enabling+tools+for+engineering+collagenous+tissues+integrating+bioreactors%2C+intravital+imaging%2C+and+biomechanical+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Enabling tools for engineering collagenous tissues integrating bioreactors, intravital imaging, and biomechanical modeling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 3335-3339 (2010).</li>
<li>Zheng, K., Rupnick, M. A., Liu, B., Brezinski, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+Dimensional+OCT+in+the+Engineering+of+Tissue+Constructs%3A+A+Potentially+Powerful+Tool+for+Assessing+Optimal+Scaffold+Structure%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Tissue+Engineering+%26+Regenerative+Medicine+Journal%22%5BJournal%5D)">Three Dimensional OCT in the Engineering of Tissue Constructs: A Potentially Powerful Tool for Assessing Optimal Scaffold Structure.</a> Open Tissue Engineering & Regenerative Medicine Journal. 2, 8-13 (2009).</li>
<li>Gurjarpadhye, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+and+characterization+of+bioengineered+blood+vessels+within+a+bioreactor+using+free-space+and+catheter-based+OCT%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+in+Surgery+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Imaging and characterization of bioengineered blood vessels within a bioreactor using free-space and catheter-based OCT.</a> Lasers in Surgery and Medicine. 45, 391-400 (2013).</li>
<li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+remodeling+and+structural+characterization+of+degradable+polymer+scaffold-based+tissue-engineered+vascular+grafts+using+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+%26+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">In vitro remodeling and structural characterization of degradable polymer scaffold-based tissue-engineered vascular grafts using optical coherence tomography.</a> Cell & Tissue Research. 370, 417-426 (2017).</li>
<li>Naito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+natural+history+of+extracellular+matrix+production+in+tissue-engineered+vascular+grafts+during+neovessel+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cells+Tissues+Organs%22%5BJournal%5D)">Characterization of the natural history of extracellular matrix production in tissue-engineered vascular grafts during neovessel formation.</a> Cells Tissues Organs. 195, 60-72 (2012).</li>
<li>Ye, C., et al. <a target="_blank" href="https://scholar.google.com/scholar?hl=en&as_sdt=0%2C22&q=The+design+conception+and+realization+of+pulsatile+ventricular+assist+devices-from+Spiral-Vortex+pump+to+Luo-Ye+pump+&btnG=">The design conception and realization of pulsatile ventricular assist devices-from Spiral-Vortex pump to Luo-Ye pump.</a> Chinese Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 9, 35-40 (2002).</li>
<li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="https://scholar.google.com/scholar?hl=en&as_sdt=0%2C22&q=Application+of+optical+coherence+tomography+in+tissue+engineered+blood+vessel+culture+based+on+Luo-Ye+pump&btnG=">Application of optical coherence tomography in tissue engineered blood vessel culture based on Luo-Ye pump.</a> Chinese Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 31, 687-690 (2015).</li>
<li>Pickering, J. G., Boughner, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+the+age+of+fibrotic+lesions+using+polarized+light+microscopy+and+digital+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of the age of fibrotic lesions using polarized light microscopy and digital image analysis.</a> American Journal of Pathology. 138, 1225-1231 (1991).</li>
<li>Martinho, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependence+of+optical+attenuation+coefficient+and+mechanical+tension+of+irradiated+human+cartilage+measured+by+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Bank%22%5BJournal%5D)">Dependence of optical attenuation coefficient and mechanical tension of irradiated human cartilage measured by optical coherence tomography.</a> Cell Tissue Bank. 16, 47-53 (2015).</li>
<li>Poirierquinot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+1.5-Tesla+magnetic+resonance+imaging+for+tissue-engineered+constructs%3A+a+noninvasive+tool+to+assess+three-dimensional+scaffold+architecture+and+cell+seeding%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">High-resolution 1.5-Tesla magnetic resonance imaging for tissue-engineered constructs: a noninvasive tool to assess three-dimensional scaffold architecture and cell seeding.</a> Tissue Engineering Part C Methods. 16, 185-200 (2010).</li>
<li>Naito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+burst+pressure%3A+initial+evaluation+of+the+natural+history+of+the+biaxial+mechanical+properties+of+tissue-engineered+vascular+grafts+in+the+venous+circulation+using+a+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Beyond burst pressure: initial evaluation of the natural history of the biaxial mechanical properties of tissue-engineered vascular grafts in the venous circulation using a murine model.</a> Tissue Engineering Part A. 20, 346-355 (2014).</li>
<li>Smart, N., Dube, K. N., Riley, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+vessel+development+and+insight+towards+neovascular+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Clinical+and+Experimental+Pathology%22%5BJournal%5D)">Coronary vessel development and insight towards neovascular therapy.</a> International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 90, 262-283 (2009).</li>
</ol>

Autorzy deklarują, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Generowanie zmodyfikowanych naczyń o właściwościach strukturalnych i mechanicznych podobnych do natywnych naczyń krwionośnych może prowadzić do skrócenia czasu stosowania klinicznego i jest ostatecznym celem inżynierii naczyniowej. Techniki obrazowania optycznego umożliwiają wizualizację specyficznych składników naczyniowych inżynierii tkankowej, które nie mogą monitorować poszczególnych konstruktów w trakcie hodowli i ekspozycji przeszczepów na środowisko hodowli bez uszczerbku dla sterylności7. ...

Naczynia krwionośne inżynierii tkankowej (TEBV) są najbardziej obiecującym materiałem jako idealny przeszczep naczyniowy1. W celu opracowania przeszczepów, które będą klinicznie użyteczne o podobnych właściwościach strukturalnych i funkcjonalnych jak naczynia natywne, zaprojektowano wiele technik utrzymania funkcji naczyń krwionośnych2,3. Chociaż podczas implantacji i badania klinicznego fazy III wynaleziono naczynia o akceptowalnych wskaźnikach drożności< klasie sup = 'xref'>4, jednak długotrwała hodowla i wysokie koszty również wskazują na konieczność monitorowania rozwoju TEBV. Zrozumienie procesów wzrostu, przebudowy i adaptacji macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) w TEBV w biomimetycznym środowisku chemo-mechanicznym może dostarczyć kluczowych informacji dla rozwoju inżynierii tkanek naczyniowych.
Idealna strategia do śledzenia rozwoju statków inżynieryjnych o małej średnicy5 powinna być nieniszcząca, sterylna, podłużna, trójwymiarowa i ilościowa. TEBV w różnych warunkach hodowli można ocenić za pomocą tej metody obrazowania, nawet z uwzględnieniem zmian przed i po przeszczepie naczyń. Potrzebne są strategie opisujące cechy żywych statków inżynieryjnych. Techniki obrazowania optycznego umożliwiają wizualizację i kwantyfikację osadzania tkanek i biomateriałów. Inne zalety to możliwość umożliwienia obrazowania głębokich tkanek i bez znaczników z wysoką rozdzielczością6,7. Jednak cząsteczki specyficzne dla obrazu i trudniej dostępny sprzęt optyczny do monitorowania w czasie rzeczywistym stanowią istotną przeszkodę praktyczną, która ograniczyła szerokie zastosowanie nieliniowej mikroskopii optycznej. Optyczna koherentna tomografia (OCT) to podejście optyczne z modalnością obrazowania wewnątrznaczyniowego jako szeroko stosowanym narzędziem klinicznym do kierowania terapią interwencyjną serca8. W literaturze metoda OCT została opisana jako sposób oceny grubości ścianek TEBVs9,10, w połączeniu z afirmatywnymi metodami obrazowania do badań nad inżynierią tkanki naczyniowej. Natomiast nie zaobserwowano dynamiki inżynieryjnego wzrostu i przebudowy naczyń krwionośnych.
W tym manuskrypcie szczegółowo opisujemy przygotowanie biodegradowalnych polimerowych rusztowań TEBV do czterotygodniowej hodowli. Ludzkie tętnice pępowinowe, komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych (HUASMC) są ekspandowane i wysiewane w porowatych, degradowalnych rusztowaniach kwasu poliglikolowego (PGA) w bioreaktorze. Polimery biodegradowalne odgrywają rolę tymczasowego podłoża dla inżynierii tkankowej i mają określony współczynnik degradacji11. Aby zapewnić odpowiednie dopasowanie między degradacją rusztowania a powstawaniem tkanek nowotworowych, rusztowania ECM i PGA są kluczowymi czynnikami skutecznej przebudowy naczyń krwionośnych. System perfuzyjny symuluje biomechaniczne mikrośrodowisko natywnych naczyń i utrzymuje stałe odkształcenie pod wpływem stymulacji ciśnieniowej. 
Celem prezentowanego protokołu jest opisanie stosunkowo prostej i nieniszczącej strategii obrazowania TEBV i długoterminowego monitorowania hodowli. Protokół ten może być wykorzystany do wizualizacji zmian morfologicznych i pomiarów grubości naczyń inżynieryjnych w różnych warunkach hodowli. Dodatkowo w celu identyfikacji można przeprowadzić analizy degradacji materiałów na bazie polimerów w rusztowaniach inżynierii tkankowej. Łącząc metody skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM) i mikroskopu spolaryzowanego stosowane w tym protokole, można uzyskać korelację i kwantyfikację rozkładu macierzy zewnątrzkomórkowej i degradacji PGA, co może ułatwić ocenę degradacji rusztowania w połączeniu z obrazowaniem OCT.

<table><tbody><tr><td>Siatka PGA</td><td>Rurka silikonowa Synthecon</td><td></td><td></td></tr> Złącze <tr><td></td><td>Cole Parmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> Wewnątrznaczyniowy system OCT Cole Parmer <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>St. Jude Medical, Inc</td><td>ILUMIEN&trade; OPTIS&handel; SYSTEM</td><td></td></tr><tr><td>skaningowy mikroskop elektronowy</td><td>Philips</td><td>FEI Philips XL-30</td><td></td></tr><tr>mikroskop<td>polaryzacyjny</td><td>Olympus</td><td>Olympus BX51</td><td></td></tr><tr><td>szwy</td><td>Johnson & Pompa</td> pulsacyjna Johnson <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Guangdong Instytut Sercowo-Naczyniowy LightLab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do obrazowania</td><td>St. Jude Medical, Inc</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

nieniszczące monitorowanie rozwoju naczyń krwionośnych opartych na degradowalnych rusztowaniach za pomocą optycznej koherentnej tomografii

Nondestructive Monitoring of Degradable Scaffold-Based Tissue-Engineered Blood Vessel Development Using Optical Coherence Tomography

Zmodyfikowane przeszczepy naczyniowe o właściwościach strukturalnych i mechanicznych zbliżonych do naturalnych naczyń krwionośnych mają sprostać rosnącemu zapotrzebowaniu na bypassy tętnicze. Charakterystyka dynamiki wzrostu i procesu przebudowy degradowalnych naczyń krwionośnych opartych na rusztowaniach polimerowych (TEBV) ze stymulacją pulsacyjną ma kluczowe znaczenie dla inżynierii tkanki naczyniowej. Techniki obrazowania optycznego wyróżniają się jako potężne narzędzia do monitorowania unaczynienia tkanek inżynieryjnych, umożliwiające obrazowanie w wysokiej rozdzielczości w hodowli w czasie rzeczywistym. W artykule przedstawiono nieniszczącą i szybką strategię obrazowania w czasie rzeczywistym w celu monitorowania wzrostu i przebudowy TEBV w hodowli długoterminowej za pomocą optycznej tomografii koherentnej (OCT). Oceniana jest morfologia geometryczna, w tym proces przebudowy naczyń krwionośnych, grubość ścianek oraz porównanie grubości TEBV w różnych punktach czasowych hodowli i obecność stymulacji pulsacyjnej. Wreszcie, OCT zapewnia praktyczne możliwości obserwacji degradacji polimeru w czasie rzeczywistym w rekonstruowanych tkankach pod wpływem stymulacji pulsacyjnej lub bez niej oraz w każdym segmencie naczynia, w porównaniu z oceną degradacji polimeru przy użyciu skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM) i mikroskopu spolaryzowanego.

Trójwymiarowy system hodowlany składał się z komory hodowlanej w bioreaktorze oraz systemu perfuzyjnego z zamkniętym obiegiem płynu10,13 (Rysunek 1). Cewnik do obrazowania OCT wprowadzono do dystalnego końca złącza w kształcie litery Y, a następnie wycofywano wewnątrz rurki silikonowej w celu wykonania obrazowania. Obrazowanie OCT wykorzystano w pierwszej kolejności do określenia charakterystyki struk...

Opisano tutaj krok po kroku protokół do nieniszczącego i długoterminowego monitorowania procesu przebudowy naczyń krwionośnych i degradacji rusztowań w czasie rzeczywistym biodegradowalnych naczyń krwionośnych opartych na polimerowych rusztowaniach z pulsacyjną stymulacją za pomocą optycznej koherentnej tomografii.

Nieniszczące monitorowanie rozwoju naczyń krwionośnych opartych na degradowalnych rusztowaniach za pomocą optycznej koherentnej tomografii

Engineered vascular grafts with structural and mechanical properties similar to natural blood vessels are expected to meet the growing demand for arterial ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie inżynierii tkanek naczyniowych, takie jak monitorowanie dynamiki wzrostu naczyń i przebudowy naczyń podczas długotrwałej hodowli. Główną zaletą stosowania optycznej tomografii koherentnej (OCT) jest to, że jest to łatwo dostępna, nieniszcząca strategia obrazowania w czasie rzeczywistym w celu scharakteryzowania cech strukturalnych i procesu przebudowy statków inżynieryjnych. Procedurę zademonstrują również Shangmin Liu i Wentao Ma, technicy z mojego laboratorium.Aby rozpocząć tę procedurę, należy wytworzyć rusztowanie PGA zgodnie z opisem w protokole tekstowym Zanurz rusztowania PGA w jednym wodorotlenku sodu o mol na litr przez jedną minutę, aby dostosować strukturę przestrzenną siatki. Następnie namocz rusztowania w wodzie klasy kulturowej trzy razy przez dwie minuty każde. Za każdym razem delikatnie osusz rusztowanie bibułą.Następnie wysuszyć rusztowania w kapturze z dmuchawą przez godzinę. Aby zmontować bioreaktor i złącze Y do obrazowania OCT, najpierw namocz samodzielnie opracowany szklany cylindryczny bioreaktor, rusztowania PGA, rurkę silikonową, rurki biokompatybilne, złącza, mieszadło i sprzęt do montażu w zbiorniku etanolu o zawartości 95% na dwie godziny. Przeciągnąć rusztowanie PGA przez boczne ramiona bioreaktora połączone z jednej strony za pomocą złącza, a także z drugiej strony za pomocą złącza Y służącego do doprowadzenia przewodu doprowadzającego OCT.W ten sam sposób zamontuj kolejne rusztowanie PGA w bioreaktorze. Dopasuj politetrafluoroetylen do warg bioreaktora, zaciskając go szwami 4-0. Umieść bioreaktor ponownie w zbiorniku etanolu na godzinę przed wysuszeniem go przez noc w okapie z włączoną dmuchawą.Teraz wyizoluj ludzkie komórki mięśni gładkich tętnicy pępowinowej od ludzkich tętnic pępowinowych za pomocą standardowych technik eksplantacji W celu uratowania komórek w rusztowaniach PGA, unikaj kapania zawiesiny komórkowej na dno bioreaktora. Przykryj również bioreaktor silikonową pokrywką tak szybko, jak to możliwe po osadzeniu ogniwa, aby zapobiec zanieczyszczeniu. Rozszerzaj i utrzymuj komórki w pożywce wzrostu mięśni gładkich.Wysiewaj ludzkie komórki mięśni gładkich tętnicy pępowinowej w stężeniu 5 milionów komórek na mililitr w powyższej pożywce hodowlanej na rusztowaniach PGA. Po umieszczeniu pręta sir w bioreaktorze przykryj go silikonową pokrywką korka, która ma jedną rurkę zasilającą i trzy krótkie segmenty rurki włożone do wymiany gazu. Podłącz filtry PTFE 0,22 mikrona do każdej rurki wymiany powietrza i przymocuj jedną nasadkę heparyny do rurki zasilającej.Dostosuj mieszadło z prędkością mieszania 13 rund na minutę. Następnie zmontuj szklany bioreaktor, silikonową pokrywkę korka i rusztowanie PGA w systemie hodowli. Pozwól komórkom przylegać przez 45 minut, pochylając bioreaktor co 15 minut ze stojakiem w lewo i w prawo.Teraz połącz pompę LOO-OH-YEE, worek z solą fizjologiczną buforowaną fosforanami i sterownik z biokompatybilnymi rurkami, aby stworzyć system obfitości. Otwórz sterownik, aby napełnić probówki PBS. Umieść cały bioreaktor w nawilżonym inkubatorze z 5 procentami CO2 w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Napełnij komorę hodowlaną 450 mililitrami pożywki hodowlanej. Hodować rusztowania z nasionami w kulturze statycznej przez jeden tydzień, zmieniając pożywkę co trzy do czterech dni, zasysając połowę starej pożywki przez rurkę zasilającą i ponownie napełniając reaktor równoważną ilością świeżej pożywki hodowlanej. Aby przygotować system profuzji do obrazowania OCT, należy pompować płyny w worku PBS, aby przepuścić je przez biokompatybilne rurki i z powrotem do worka.Otwórz zasilanie sterownika i reguluj ustawienie pompy z częstotliwością 60 uderzeń na minutę i wyjściowym ciśnieniem skurczowym 120 milimetrów słupa rtęci. Dostosuj parametry mechaniczne do potrzeb hodowli naczyniowej w inżynierii tkankowej. Kliknij przycisk uruchom, aby system obfitości działał.Zapewnij stałą symulację pulsacyjną naczyń przez trzy tygodnie, iteracyjnie zwiększając ciśnienie w biokompatybilnych probówkach po tygodniu hodowli statycznej. Użyj źródła światła, aby zapewnić rozdzielczość osiową od dziesięciu do dwudziestu mikronów i głębokość obrazu od jednego do dwóch milimetrów, aby zidentyfikować strukturę naczyń krwionośnych inżynierii tkankowej (TEVB) w oparciu o system obrazowania wewnątrznaczyniowego OCT w dziedzinie częstotliwości. Włącz wyłącznik zasilania i otwórz oprogramowanie do przechwytywania obrazu Podłącz światłowodowy cewnik do obrazowania z silnikiem napędowym i sterownikiem optycznym z funkcją automatycznego wycofywania cewnika.Ustaw parametry szybkości akwizycji obrazu na dziesięć klatek na sekundę, z automatyczną prędkością cofania wynoszącą dziesięć milimetrów na sekundę. Teraz przymocuj cewnik do obrazowania do złącza Y za pomocą nasadki heparyny za pomocą igły o rozmiarze 18. Umieść cewnik w silikonowej rurce i zidentyfikuj szczelność struktury siatki PGA przed załadowaniem rusztowania PGA do bioreaktora.Teraz umieść końcówkę cewnika nad obszarem zainteresowania. Wyreguluj urządzenie odciągające i sprawdź jakość obrazu. Zdobądź obrazy po jednym, czterech, siedmiu, dziesięciu, 14, 17, 21 i 28 dniach w kulturze dla każdego indywidualnego TEBV.Zapisuj te obrazy sekwencyjnie z obserwacją mikrostruktury TEBV w czasie rzeczywistym, w tym morfologii powierzchni, struktury wewnętrznej i składu. Powtórz pomiar trzy razy, aby za każdym razem uzyskać wiarygodny pomiar zaprojektowanych naczyń. Uchwyć serię obrazów podczas testów za pomocą oprogramowania do przechwytywania obrazu.Aby użyć oprogramowania do analizy obrazu do pomiaru grubości ścianki naczynia krwionośnego za pomocą inżynierii tkankowej, najpierw wybierz obraz, który ma być analizowany. Następnie kliknij narzędzie do śledzenia, aby automatycznie zidentyfikować wewnętrzną stronę naczynia krwionośnego inżynierii tkankowej za pomocą oprogramowania i ręcznie naszkicować zewnętrzną stronę. Na ekranie pojawi się wykres grubości.Powtórz pomiar pięć razy, aby uzyskać wiarygodny pomiar konstrukcji. Rozważ skorzystanie z usług dwóch niezależnych badaczy zobowiązanych do uzyskania informacji. Otwórz silikonową pokrywkę korka umieszczoną nad bioreaktorem po zakończeniu hodowli i wyrzuć pożywkę hodowlaną.Poluzuj politetrafluoroetylen z warg bioreaktora i odetnij nożyczkami silikonowe rurki od zewnętrznej strony politetrafluoroetylenu. Zbierz TEBV z bioreaktora i pokrój je na sekcje w celu zbadania za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej. Wyciągnij podtrzymującą rurkę silikonową i przymocuj sekcje 4-procentowym formaldehydem.Wykonaj rutynowe barwienie histologiczne za pomocą trichromu Massona i sirious red, aby zbadać morfologię kolagenu i PGA. Aby ocenić zawartość PGA i składnik kolagenu, obserwuj próbki histologiczne z silnym czerwonym zabarwieniem przez mikroskop spolaryzowany. Obrazy OCT porównuje się z wynikami histopatologicznymi TEBV po czterech tygodniach posiewu.Obraz OCT pokazuje zwartą mikrostrukturę i specyficzne składniki w porównaniu z oceną histologiczną. Widoczna jest pożywka hodowlana, rurka silikonowa, TEBV i fragment PGA. Barwienie trichromowe Massona pokazuje włókna kolagenowe rozmieszczone w określonym kierunku, wraz z pozostałościami PGA w warstwie mediów zaprojektowanych naczyń.Czerwone zabarwienie Syriusza ujawnia pozostałości PGA i składnik kolagenu przy użyciu mikroskopu spolaryzowanego. Skaningowe mikrofotografie elektronowe naczyń inżynieryjnych wykazują zwartą mikrostrukturę. Tymczasem ta metoda obrazowania śródświetlnego przyjmuje nieniszczące i łatwe monitorowanie TEBV, w tym proces przebudowy i morfologii wizualnej in situ w długotrwałej hodowli.Jak pokazano tutaj, przebudowa następuje wcześniej, a zmiany morfologiczne manifestują się bardziej wyraźnie w grupie dynamicznej poprzez porównanie grubości TEBV. Technika ta toruje drogę naukowcom zajmującym się inżynierią tkanek naczyniowych do badania cech struktury i długoterminowego procesu przebudowy naczyń krwionośnych. Wyraźne wyświetlanie pozostałości polimerowych za pomocą mikroskopii spolaryzowanej w połączeniu z obrazowaniem OCT może być przydatne do oceny degradacji rusztowania.

nondestructive-monitoring-degradable-scaffold-based-tissue-engineered

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Nasz zespół opracował system hodowli w bioreaktorze, który naśladuje fizjologiczne naprężenia pulsacyjne układu sercowo-naczyniowego w celu regeneracji wszczepialnych zastążek naczyniowych o małej średnicy.

Projektowanie biologicznych przeszczepów naczyniowych z wykorzystaniem bioreaktora pulsacyjnego

Źródło: Huang, Y. et. al., Podłużne monitorowanie morfologiczne i fizjologiczne trójwymiarowych sferoid nowotworowych za pomocą optycznej tomografii koherentnej. J. Vis. Exp. (2019)Ten film demonstruje zastosowanie koherencji optycznej tomografia (OCT) do monitorowania sferoid guza w płytce wielodołkowej poprzez przechwytywanie obrazów przekroju poprzecznego o wysokiej rozdzielczości. Analizując odbicia światła od struktur komórkowych, OCT konstruuje modele 3D w celu oceny cech morfologicznych,...

Monitorowanie morfologiczne i fizjologiczne sferoid nowotworowych za pomocą optycznej koherentnej tomografii 

Unaczynienie jest kluczem do skutecznego podejścia do inżynierii tkankowej. W związku z tym potrzebne są niezawodne technologie do oceny rozwoju sieci naczyniowych w konstruktach tkankowych. Tutaj przedstawiamy prostą i opłacalną metodę wizualizacji i ilościowego określania unaczynienia in vivo.

Pełny model ubytku skóry do oceny unaczynienia biomateriałów in vivo

Implantacja autologicznych i allogenicznych przeszczepów kostnych stanowi akceptowane metody leczenia dużych ubytków kości twarzoczaszki. Jednak wpływ składu przeszczepu na wzajemne oddziaływanie między neowaskularyzacją, różnicowaniem komórek i tworzeniem kości jest niejasny. Przedstawiamy protokół obrazowania multimodalnego, którego celem jest wyjaśnienie współzależności angiogenezy i osteogenezy w pobliżu przeszczepu.

Tomografia komputerowa i obrazowanie optyczne sprzężenia osteogeneza-angiogeneza w celu oceny integracji autoprzeszczepów kości czaszki i alloprzeszczepów

Tutaj prezentujemy protokół wizualizacji tworzenia naczyń krwionośnych in vivo i w czasie rzeczywistym na rusztowaniach 3D za pomocą mikroskopii wielofotonowej. Angiogenezę w genetycznie zmodyfikowanych rusztowaniach badano w mysim modelu krytycznego ubytku kości kalwarycznej. W grupie leczonej wykryto więcej nowych naczyń krwionośnych niż w grupie kontrolnej.

Wizualizacja angiogenezy za pomocą mikroskopii wielofotonowej in vivo w genetycznie zmodyfikowanym rusztowaniu 3D-PLGA/nHAp do naprawy krytycznego ubytku kości calowej

Opisujemy użycie pełnej koherentnej mikroskopii optycznej jako metody wysokiej jakości oceny zrębu dawcy rogówki. Protokół ten może być stosowany do identyfikacji cech wskazujących na zdrowie lub chorobę i ma na celu poprawę badań przesiewowych i selekcji tkanek dawcy, a tym samym wyników keratoplastyki.

Pełnopolowa optyczna mikroskopia koherentna do histologicznej analizy cech zrębu w przeszczepach rogówki

Optyczna tomografia koherentna (OCT), technologia obrazowania trójwymiarowego, została wykorzystana do monitorowania i charakteryzowania kinetyki wzrostu sferoid wielokomórkowych guzów. Wykazano precyzyjną wolumetryczną kwantyfikację sferoid guza przy użyciu metody liczenia wokseli oraz bezznacznikowe wykrywanie martwych tkanek w sferoidach w oparciu o wewnętrzny kontrast tłumienia optycznego.

Podłużne monitorowanie morfologiczne i fizjologiczne trójwymiarowych sferoid nowotworowych za pomocą optycznej koherentnej tomografii

Biofilmy mikrobiologiczne tworzą złożone architektury na skrzyżowaniach i rozwijają się w wysoce zależne od skali wzorce przestrzenne. W tym miejscu przedstawiamy eksperymentalny system (sprzętowy i programowy) do automatycznego pozyskiwania zestawów danych optycznej tomografii koherentnej (OCT) 3D. Ten zestaw narzędzi pozwala na nieinwazyjną i wieloskalową charakterystykę morfogenezy biofilmu w przestrzeni i czasie.

Zautomatyzowana optyczna tomografia koherentna 3D w celu wyjaśnienia morfogenezy biofilmu w dużych skalach przestrzennych

Ten artykuł opisuje metodę pomiaru reaktywności naczyń krwionośnych siatkówki in vivo u ludzi przy użyciu techniki prowokacji oddechowej gazem w celu dostarczania bodźców wazoaktywnych podczas pozyskiwania obrazów siatkówki.

Reaktywność naczyniowa siatkówki oceniana za pomocą angiografii optycznej koherentnej tomografii

Zmodyfikowane tkanki w dużym stopniu polegają na odpowiednich sieciach naczyniowych, które dostarczają niezbędnych składników odżywczych i gazów oraz usuwają odpady metaboliczne. W tej pracy protokół stopniowego wysiewu komórek śródbłonka i komórek podporowych tworzy wysoce zorganizowane sieci naczyniowe na wysokoprzepustowej platformie do badania rozwijającego się zachowania naczyń w kontrolowanym środowisku 3D.

Stopniowe wysiewanie komórek na mozaikowych rusztowaniach w celu zbadania kiełkujących naczyń krwionośnych

Odkryj nieniszczącą metodę monitorowania przebudowy naczyń krwionośnych i degradacji rusztowań PGA za pomocą optycznej koherentnej tomografii w inżynierii tkankowej.

Nieniszczące monitorowanie rozwoju naczyń krwionośnych opartych na degradowalnych rusztowaniach za pomocą optycznej koherentnej tomografii (Wideo) | JoVE Journal

Nieniszczące monitorowanie rozwoju naczyń krwionośnych opartych na degradowalnych rusztowaniach za pomocą optycznej koherentnej tomografii

Przeglądaj więcej filmów