Name: Ilościowa biologia komórki neurodegeneracji u Drosophila poprzez bezstronną analizę białek znakowanych fluorescencyjnie za pomocą ImageJ (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Poznaj metodę ilościowej analizy białek znakowanych fluorescencyjnie w modelach neurodegeneracji Drosophila przy użyciu ImageJ. To półautomatyczne podejście minimalizuje stronniczość selekcji i maksymalizuje moc próby.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest wspierana przez Sheila and David Fuente Neuropathic Pain Research Program Graduate Fellowship (dla J.M.B.), Lois Pope LIFE Fellows Program (dla C.L., Y.Z. i J.M.B.), stypendium Predoctoral Fellowship Fundacji Snydera-Robinsona (dla C.L.), Fundację Dr. Johna T. Macdonalda (dla C.L.), kontrakty, granty z National Institutes of Health (NIH) HHSN268201300038C, R21GM119018 i R56NS095893 (do R.G.Z.) oraz przez Taishan Scholar Project (prowincja Shandong, Chińska Republika Ludowa) (do R.G.Z.).

<ol><li>Erkkinen, M. G., Kim, M. -O., Geschwind, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Neurology+and+Epidemiology+of+the+Major+Neurodegenerative+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+perspectives+in+biology%22%5BJournal%5D)">Clinical Neurology and Epidemiology of the Major Neurodegenerative Diseases.</a> Cold Spring Harbor perspectives in biology. , a033118(2017).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature methods. 9 (7), 671(2012).</li>
<li>Mauvezin, C., Ayala, C., Braden, C. R., Kim, J., Neufeld, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assays+to+monitor+autophagy+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Assays to monitor autophagy in Drosophila.</a> Methods. 68 (1), 134-139 (2014).</li>
<li>Weiss, K. R., Kimura, Y., Lee, W. -C. M., Littleton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+aggregation+kinetics+and+their+pathological+role+in+a+Drosophila+Huntington%27s+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Huntingtin aggregation kinetics and their pathological role in a Drosophila Huntington's disease model.</a> Genetics. 190 (2), 581-600 (2012).</li>
<li>Babcock, D. T., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcellular+spreading+of+huntingtin+aggregates+in+the+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Transcellular spreading of huntingtin aggregates in the Drosophila brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (39), E5427-E5433 (2015).</li>
<li>DeVorkin, L., Gorski, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+autophagy+in+Drosophila+using+fluorescent+reporters+in+the+UAS-GAL4+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Monitoring autophagy in Drosophila using fluorescent reporters in the UAS-GAL4 system.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (9), (2014).</li>
<li>Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+developing+and+adult+Drosophila+brains+and+retinae+for+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (37), (2010).</li>
<li>Sweeney, S. T., Hidalgo, A., de Belle, J. S., Keshishian, H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22135655">Dissection of adult Drosophila brains.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2011).</li>
<li>Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3894502">Formaldehyde fixation.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 845-853 (1985).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+%28MARCM%29+for+Drosophila+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+neurosciences%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development.</a> Trends in neurosciences. 24 (5), 251-254 (2001).</li>
<li>Fischbach, K. -F., Dittrich, A. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF00218858">The optic lobe of Drosophila melanogaster. I. A Golgi analysis of wild-type structure.</a> Cell and tissue research. 258 (3), 441-475 (1989).</li>
<li>Ruan, K., Zhu, Y., Li, C., Brazill, J. M., Zhai, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+of+Drosophila+Nmnat+functions+as+a+switch+to+enhance+neuroprotection+under+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing of Drosophila Nmnat functions as a switch to enhance neuroprotection under stress.</a> Nature Communications. 6, 10057(2015).</li>
<li>Zhai, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NAD+synthase+NMNAT+acts+as+a+chaperone+to+protect+against+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">NAD synthase NMNAT acts as a chaperone to protect against neurodegeneration.</a> Nature. 452 (7189), 887(2008).</li>
<li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spermine+synthase+deficiency+causes+lysosomal+dysfunction+and+oxidative+stress+in+models+of+Snyder-Robinson+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Spermine synthase deficiency causes lysosomal dysfunction and oxidative stress in models of Snyder-Robinson syndrome.</a> Nat Commun. 8 (1), 1257(2017).</li>
<li>Prokop, A., Meinertzhagen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+structure+of+synaptic+contacts+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Development and structure of synaptic contacts in Drosophila.</a> Semin Cell Dev Biol. 17 (1), 20-30 (2006).</li>
<li>Maday, S., Holzbaur, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagosome+biogenesis+in+primary+neurons+follows+an+ordered+and+spatially+regulated+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Autophagosome biogenesis in primary neurons follows an ordered and spatially regulated pathway.</a> Dev Cell. 30 (1), 71-85 (2014).</li>
<li>Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+autophagy+in+response+to+nutrient+starvation+using+transgenic+mice+expressing+a+fluorescent+autophagosome+marker%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker.</a> Molecular biology of the cell. 15 (3), 1101-1111 (2004).</li>
<li>Lee, S., Sato, Y., Nixon, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+lysosomal+dysfunction+causes+cargo-specific+deficits+of+axonal+transport+leading+to+Alzheimer-like+neuritic+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Primary lysosomal dysfunction causes cargo-specific deficits of axonal transport leading to Alzheimer-like neuritic dystrophy.</a> Autophagy. 7 (12), 1562-1563 (2011).</li>
<li>Vincent, L., Soille, P. <a target="_blank" href="https://pdfs.semanticscholar.org/a381/9dda9a5f00dbb8cd3413ca7422e37a0d5794.pdf">Watersheds in digital spaces: an efficient algorithm based on immersion simulations.</a> IEEE Transactions on Pattern Analysis & Machine Intelligence. (6), 583-598 (1991).</li>
<li>Najman, L., Schmitt, M. <a target="_blank" href="https://ieeexplore.ieee.org/document/546254/">Geodesic saliency of watershed contours and hierarchical segmentation.</a> IEEE Transactions on pattern analysis and machine intelligence. 18 (12), 1163-1173 (1996).</li>
<li>Shiber, A., Breuer, W., Ravid, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+quantification+and+characterization+of+intracellular+protein+aggregates+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric quantification and characterization of intracellular protein aggregates in yeast.</a> Prion. 8 (3), 276-284 (2014).</li>
<li>Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. <a target="_blank" href="https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(10)00063-2">Methods in mammalian autophagy research.</a> Cell. 140 (3), 313-326 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiony tutaj protokół może być wykorzystany do solidnego i powtarzalnego ilościowego oznaczania procesów biologicznych komórek wizualizowanych za pomocą obrazowania opartego na fluorescencji. Kontekst biologiczny i ograniczenia techniczne muszą być starannie rozważone, aby ukierunkować projekt eksperymentalny. Markery fluorescencyjne interesujących struktur subkomórkowych, niezależnie od tego, czy są immunohistochemiczne, oparte na barwniku, czy wyrażane genetycznie, muszą być odróżnialne od tła pod względem morfo...

Choroby neurodegeneracyjne dotykają miliony ludzi każdego roku, a częstość ich występowania wzrasta wraz ze starzeniem się populacji1. Chociaż każda choroba neurodegeneracyjna ma unikalną etiologię, agregacja nieprawidłowo sfałdowanych białek i rozpad sieci proteostazy są powszechnymi patologicznymi cechami charakterystycznymi wielu z tych chorób. Wyjaśnienie, w jaki sposób zakłócenia tych podstawowych i wzajemnie powiązanych procesów przebiegają nieprawidłowo, przyczyniając się do dysfunkcji neuronów i śmierci komórek, ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia chorób neurodegeneracyjnych, a także dla kierowania interwencjami terapeutycznymi. Obrazowanie oparte na fluorescencji pozwala na badanie tych złożonych i dynamicznych procesów zachodzących w neuronach i w znacznym stopniu przyczyniło się do naszego zrozumienia biologii komórek neuronalnych. Analiza białek znakowanych fluorescencyjnie jest wyzwaniem, szczególnie gdy eksperymenty są przeprowadzane in vivo, ze względu na bardzo zwarte tkanki, różnorodne typy komórek i niejednorodność morfologiczną. Kwantyfikacja wspomagana ręcznie jest niedroga i prosta, ale często jest czasochłonna i podatna na stronniczość człowieka. W związku z tym istnieje potrzeba bezstronnych, powtarzalnych i dostępnych podejść do ekstrakcji wymiernych danych z badań obrazowych.
Opisaliśmy prosty i elastyczny przepływ pracy przy użyciu Fiji/ImageJ, potężnego i swobodnie dostępnego oprogramowania do przetwarzania obrazów2,3, aby wyodrębnić dane ilościowe z badań obrazowania fluorescencyjnego w eksperymentalnych modelach neurodegeneracji z użyciem Drosophila. Postępując zgodnie z tym protokołem w celu ilościowego określenia agregacji białek i strumienia autofagicznego – dwóch cech biologicznych komórek, które są bardzo istotne dla patologii chorób neurodegeneracyjnych – wykazaliśmy czułość i powtarzalność tego podejścia. Analiza znakowanych fluorescencyjnie zmutowanych białek huntingtyny (Htt) w płacie wzrokowym Drosophila ujawniła liczbę, rozmiar i intensywność agregatów białkowych. Zobrazowaliśmy tandemowy fluorescencyjny reporter strumienia autofagicznego w układzie wzrokowym Drosophila, który wyświetla różne sygnały emisyjne w zależności od środowiska kompartmentowego4. Analiza ratiometryczna reportera tandemowego pozwoliła na ilościowe i kompleksowe spojrzenie na przepływ autofagii i lizosomów od powstawania, dojrzewania i transportu autofagosomu do degradacji w lizosomie, a dodatkowo uwypukliła wrażliwe przedziały zakłócone w stanach neurodegeneracyjnych. Co ważne, w obu analizach wdrożyliśmy w naszym protokole półautomatyczne progowanie i segmentację, aby zminimalizować nieświadome uprzedzenia, zwiększyć moc próbkowania i zapewnić standard ułatwiający porównania między podobnymi badaniami. Prosty przepływ pracy ma na celu uczynienie potężnych wtyczek Fiji/ImageJ (opracowanych przez informatyków w oparciu o algorytmy matematyczne) bardziej dostępnymi dla neurobiologów i całej społeczności nauk przyrodniczych.

<table><tbody><tr><td>SYLGARD(R) 184 Zestaw elastomerów silikonowych</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>PF184250</td><td>Naczynie preparacyjne</td></tr><tr><td>Falcon 35 mm Nie z powłoką TC Bakteriologiczna szalka Petriego</td><td>Corning</td><td>351008</td><td>Naczynie preparacyjne</td></tr><tr><td>Dumont #5 Kleszcze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td>Narzędzie do preparacji</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Roztwór</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Sigma S3014 PBSFosforan sodu dwuzasadowy&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S5136</td><td>PBS roztwór</td></tr><tr><td>Fosforan potasu Monobasic</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td>PBS roztwór</td></tr><tr><td>Triton&nbsp; X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td>Roztwór do przemywania i inkubacytacji przeciwciał.&nbsp;</td></tr><tr><td>37% formaldehydu</td><td>VWR</td><td>10790-710</td><td>Jednorazowe</td></tr><tr><td>probówki wirówkowe do utrwalania (0,5 ml, niebieskie)</td><td>VWR</td><td>89000-022</td><td>Utrwalanie, mycie i inkubacja przeciwciał.&nbsp;</td></tr><tr><td>Gładkie i matowe mikroszkiełka (25 razy; 75mm)</td><td>VWR</td><td>48312-004</td><td>Szkiełka do obrazowania konfokalnego</td></tr><tr><td>Okulary Micro Cover Glass, prostokątne (22 razy; 40mm)</td><td>VWR</td><td>48393-172</td><td>Szkiełka do obrazowania konfokalnego</td></tr><tr><td>Rubber Cement</td><td>Slime</td><td>1051-A</td><td>Montaż</td></tr><tr><td>VECTASHIELD Antifade Montaż Medium</td><td>Vector Laboratories, Inc.</td><td>H-1000</td><td>Taśma montażowa</td></tr><tr><td>Scotch Magic 810 Invisible Tape (19mm&; 25,4 m)</td> <td>3M Company</td><td>810</td><td>Montaż</td></tr><tr><td>normalnej surowicy koziej</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PCN5000</td><td>Przeciwciało inkubatonu</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamidyn-2-fenyloindol, dichlorowodorek)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td>Barwienie kwasami nukleinowymi. Rozpuścić w wodzie dejonizowanej, aby uzyskać roztwór podstawowy o stężeniu 5 mg/ml i przechowywać w temperaturze -80&deg;C. Rozcieńczyć do stężenia roboczego 10-20 &mu; g/ml w PBTx.</td></tr><tr><td>3,5X-90X Stereo Zoom Inspekcja Mikroskop przemysłowy</td><td>AmScope</td><td>SM-1BNZ</td><td>Luneta preparacyjna. Wyposażony w 6W LED Dual Gooseneck Illuminator</td></tr><tr><td>ImageJ/Fiji</td><td>NIH</td><td>v1.51u</td><td>Z SCF_MPI_CBG wtyczkami (wersja 1.1.2)</td></tr><tr><td>FV1000-IX81 Mikroskop skaningowy z laserem ogniskowym</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Construct</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>BL37749</td><td></td></tr></tbody></table>

ilościowa biologia komórki neurodegeneracji u drosophila poprzez bezstronną analizę białek znakowanych fluorescencyjnie za pomocą imagej

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

Wraz z rosnącym rozpowszechnieniem chorób neurodegeneracyjnych, coraz ważniejsze staje się zrozumienie podstawowej patofizjologii, która prowadzi do dysfunkcji i utraty neuronów. Narzędzia i technologie obrazowania oparte na fluorescencji umożliwiają bezprecedensową analizę subkomórkowych procesów neurobiologicznych, jednak nadal istnieje zapotrzebowanie na bezstronne, powtarzalne i dostępne podejścia do ekstrakcji wymiernych danych z badań obrazowych. Opracowaliśmy prosty i elastyczny przepływ pracy w celu wyodrębnienia danych ilościowych z badań obrazowych opartych na fluorescencji przy użyciu modeli neurodegeneracji Drosophila. W szczególności opisujemy łatwe do naśladowania, półautomatyczne podejście wykorzystujące Fiji/ImageJ do analizy dwóch procesów komórkowych: po pierwsze, określamy ilościowo zawartość i profil zagregowanych białek w płacie wzrokowym Drosophila za pomocą znakowanych fluorescencyjnie zmutowanych białek huntingtyny; a po drugie, oceniamy strumień autofagii-lizosomów w układzie wzrokowym Drosophila za pomocą ratiometrycznej kwantyfikacji tandemowego fluorescencyjnego reportera autofagii. Co ważne, przedstawiony tutaj protokół obejmuje półautomatyczny etap segmentacji, aby zapewnić, że wszystkie struktury fluorescencyjne są analizowane w celu zminimalizowania błędu selekcji i zwiększenia rozdzielczości subtelnych porównań. Podejście to można rozszerzyć o analizę innych struktur biologicznych komórek i procesów związanych z neurodegeneracją, takich jak puncta białkowe (granulki stresu i kompleksy synaptyczne), a także przedziały związane z błoną (mitochondria i pęcherzyki transportujące błonę). Metoda ta zapewnia ustandaryzowany, a jednocześnie adaptowalny punkt odniesienia do analizy obrazu i kwantyfikacji, a także może ułatwić niezawodność i odtwarzalność w całej dziedzinie, a ostatecznie zwiększyć mechanistyczne zrozumienie neurodegeneracji.

Kwantyfikacja liczby, powierzchni i intensywności agregatów zmutowanego białka Htt znakowanych fluorescencyjnie w płacie wzrokowym Drosophila
Aby zbadać agregację błędnie sfałdowanych białek w ośrodkowym układzie nerwowym modelu choroby Huntingtona u Drosophila, zmodyfikowane ludzkie białko Htt znakowane RFP z niepatologiczną (UAS-RFP-hHttQ15) lub patologiczną ekspansją (UAS-RFP-hHttQ138) oraz me...

Opracowaliśmy prosty i elastyczny przepływ pracy do ekstrakcji danych ilościowych z badań biologicznych komórek opartych na obrazowaniu fluorescencyjnym agregacji białek i przepływu autofagicznego w ośrodkowym układzie nerwowym modeli neurodegeneracji Drosophila.

Ilościowa biologia komórki neurodegeneracji u Drosophila poprzez bezstronną analizę białek znakowanych fluorescencyjnie za pomocą ImageJ

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal ...

Opracowaliśmy tę metodę, aby wyodrębnić dane ilościowe z badań obrazowych opartych na fluorescencji w celu wyodrębnienia złożonych i dynamicznych procesów biologicznych komórek w modelach neurodegeneracji Drosophila. Główną zaletą tej techniki jest elastyczny, częściowo zautomatyzowany proces analizy obrazu w celu zminimalizowania błędu systematycznego selekcji, maksymalizacji mocy próbkowania i osiągnięcia odtwarzalności w całym terenie. Podejście to można rozszerzyć o analizę innych punktów białkowych i przedziałów związanych z błoną, które są zaangażowane w neurodegenerację, co ostatecznie poprawi nasze mechanistyczne zrozumienie chorób neurodegeneracyjnych.Aby zachować blaszkę w stanie nienaruszonym podczas sekcji pod mikroskopem stereoskopowym, wsuń dwa kleszcze pod siatkówkę i delikatnie przeerwij środek oka, aby usunąć siatkówkę. Trzymając kleszcze równolegle do powierzchni blaszki, odciągnij pozostałą tkankę siatkówki przyczepioną do blaszki. Wypreparuj od trzech do pięciu mózgów dla każdej grupy i przenieś je do probówki mikrowirówki zawierającej odpowiedni utrwalacz na 15 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym kołysaniem.Po trzech 15-minutowych płukaniach PBS plus Triton X-100 lub PBTx, zastąp ostatnie płukanie głównym przeciwciałem będącym przedmiotem zainteresowania rozcieńczonym w PBTx z 5% normalną surowicą kozią do całonocnej inkubacji w podwielokrotnym mieszalniku w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego ranka usuń nadmiar przeciwciała za pomocą trzech 15-minutowych płukań w PBTx i inkubuj mózgi w odpowiednim przeciwciałie drugorzędowym rozcieńczonym w PBTx z 5% normalną surowicą kozią przez godzinę w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji umyj mózgi trzy razy, jak pokazano, i umieść kroplę pożywki montażowej między dwoma kawałkami przezroczystej taśmy na środku jednego szkiełka mikroskopowego na próbkę tkanki.Umieść mózgi w podłożu montażowym na jedną do dwóch minut. Gdy chusteczki staną się przezroczyste, użyj pipety, aby ostrożnie usunąć podłoże mocujące z każdej strony. Aby zobrazować poplamione tkanki, nałóż kroplę świeżego podłoża mocującego na mózgi i ostrożnie nałóż próbki na szkło nakrywkowe.Uszczelnij krawędzie szkła nakrywkowego cementem gumowym i susz szkiełka na powietrzu przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Następnie wyświetl próbkę pod mikroskopem i dostosuj elementy sterujące detektora obrazu w mikroskopie fluorescencyjnym, aby uchwycić najwyższy stosunek sygnału do szumu w najwyższym zakresie dynamiki próbki. Po zoptymalizowaniu ustawień wyświetl próbkę z innej grupy, aby upewnić się, że ustawienia będą odpowiednie w całym eksperymencie.Pierwszą próbkę można następnie zobrazować, dbając o zapisanie obrazu jako typu pliku, który może zachować metadane, takie jak parametry akwizycji i kalibracja przestrzenna. Aby przeanalizować obrazy, otwórz obraz na Fidżi, wybierz opcję Wyświetl stos z Hyperstackiem w oknie dialogowym Opcje importu formatów biologicznych i ustaw tryb kolorów na Skala szarości. Zidentyfikuj obszar na podstawie kanałów znaczników, który może być używany jako znormalizowany obszar zainteresowania w próbkach, używając paska przewijania C, aby wyświetlić kanały i paska przewijania Z, aby poruszać się po płaszczyznach ogniskowych.Aby uprościć analizę obrazu, wygeneruj nowy obraz zawierający kanały i płaszczyzny ogniskowania, a następnie wybierz opcję Obraz i Duplikuj. Ustaw żądane kanały i plasterki, a następnie zmień nazwę pliku, aby odzwierciedlić wybór. Ręcznie wybierz ustandaryzowany obszar zainteresowania za pomocą narzędzia wyboru na podstawie wcześniej określonych kryteriów wyboru.Kliknij Analizuj, Narzędzia, Menedżer regionu zainteresowań i Dodaj, aby dodać region zainteresowania do Menedżera obszaru zainteresowania. Następnie kliknij Więcej i Zapisz i nazwij plik, aby odzwierciedlić obszar zainteresowania. Aby wstępnie przetworzyć obrazy, kliknij przycisk Przetwarzaj w obszarze Filtry i wybierz odpowiedni filtr.W tym miejscu wybierz ustawienia filtra, które redukują szumy, zachowując krawędzie, aby pomóc w wykrywaniu interesujących struktur podczas segmentacji. Gdy wstępnie przetworzony obraz jest aktywny na Fidżi, kliknij SCF, Etykietowanie i H_Watershed interaktywne. Na panelu sterowania dostosuj dynamikę nasion, próg intensywności i szczytowe zalanie, aby zoptymalizować segmentację.Po zoptymalizowaniu wyników segmentacji wybierz opcje Eksportuj regiony, Maskuj i Eksportuj, aby wygenerować binarny obraz wyników zlewni. Otwórz zapisany ustandaryzowany obszar zainteresowania. W Menedżerze obszaru zainteresowania wybierz identyfikator regionu zainteresowania, aby ograniczyć wyodrębnianie obiektów do ustandaryzowanego obszaru zainteresowania na obrazie.Gdy obszar zainteresowania jest aktywny w binarnej masce działu wodnego, wybierz opcje Analizuj, Analizuj cząstki i Dodaj do menedżera, aby wyodrębnić obiekty i dodać identyfikator cząstek dla każdej struktury wyznaczonej podczas segmentacji do menedżera obszaru zainteresowania. Następnie zapisz dodane cząstki, uważając, że identyfikatory są odznaczone i że wszystkie cząstki są zapisane w pliku zip. Teraz otwórz wstępnie przetworzony obraz RAW i przewiń do kanału używanego do przechwytywania interesujących Cię struktur.Otwórz cząstki uzyskane w wyniku wyodrębniania obiektów i wybierz opcję Pokaż wszystko w Menedżerze obszaru zainteresowania, aby nałożyć kontur każdej cząstki na obraz. Kliknij przycisk Analizuj i ustaw pomiary, a następnie ustaw odpowiednie pomiary eksperymentalne. Następnie z Managera Regionu Zainteresowań wybierz Mierz i skopiuj i wklej wyniki do odpowiedniego programu do arkusza kalkulacyjnego w celu kompilacji i dalszych obliczeń.Kwantyfikacja liczby półautomatycznie segmentowanych agregatów huntingtyny RFP ze standaryzowanych płaszczyzn ogniskowych przez płat wzrokowy Drosophila ujawnia rozproszoną ekspresję niepatogennej ekspansji Q15 Huntingtona w akumulacji agregatów białkowych przez powodującą chorobę ekspansję Huntingtona Q138. Profile wielkości i intensywności wszystkich agregatów ze znormalizowanej płaszczyzny ogniskowej pięciu różnych płatów optycznych wyrażających Huntingtona Q138 ilustrują solidność i powtarzalność tego przepływu pracy. Gdy agregaty są prześwietlone podczas akwizycji obrazu, kwantyfikacja wielkości i liczby zagregowań jest porównywalna z agregacjami uchwyconymi z idealną ekspozycją.Jednak intensywność prześwietlonych agregatów staje się funkcją rozmiaru, ponieważ nasycone piksele wykazują maksymalną wartość intensywności. Wizualizacja intensywności mCherry i GFP w kilku strukturach związanych z autofagią lub dodatnimi Atg8 ujawnia różnice w reporterze, w którym wysoka intensywność obu fluoroforów wskazuje na autofagosomy. Wysoki mCherry i niski GFP wskazują na fuzję z lizosomem, ponieważ GFP jest wygaszany w tym kwaśnym kompomencie.I wreszcie niski poziom mCherry odzwierciedla degradację w lizosomie. Wykres rozrzutu wygenerowany na podstawie średniej intensywności fluoroforu każdej półautomatycznie segmentowanej cząstki dodatniej mCherry Atg8 ilustruje przepływ przez szlak lizosomów autofagii, który można podzielić na dyskretne kroki za pomocą analizy kwadrantowej. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że parametry zdefiniowane przez użytkownika w krokach analizy obrazu są w dużym stopniu zależne od aplikacji.Dlatego należy zachować ostrożność, aby udokumentować przepływ pracy, aby zapewnić spójność i porównywalność między próbkami.

quantitative-cell-biology-neurodegeneration-drosophila-through

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Czynnikiem ograniczającym wykorzystanie oka dorosłych Drosophila w badaniach nad neurodegeneracją i biologią komórki jest trudność w obrazowaniu procesów wewnątrzkomórkowych. Opisujemy metodę preparowania pojedynczych ommatidiów w celu utworzenia właściwej pierwotnej hodowli komórek neuronalnych, która może być poddawana działaniu leków oraz zaawansowanemu obrazowaniu.

Disekcja i obrazowanie pojedynczego ommatidium Drosophila

Ten film demonstruje obrazowanie i kwantyfikację agregatów białkowych w genetycznie zmodyfikowanych mózgach Drosophila. Mózgi są naprawiane, myte i traktowane środkiem zapobiegającym blaknięciu przed zamontowaniem. Obrazy są rejestrowane za pomocą mikroskopu konfokalnego i oznaczane ilościowo w celu obserwacji transmisji zmutowanych agregatów białkowych.

Obrazowanie i kwantyfikacja agregatów białkowych w genetycznie zmodyfikowanych mózgach Drosophila

Drosophila jest powszechnie używana jako system modelowy do badania neurodegeneracji. Protokół ten opisuje metodę, za pomocą której można określić ilościowo zwyrodnienie, określone przez tworzenie się wakuoli w mózgu. Minimalizuje również efekty wynikające z procedury eksperymentalnej poprzez przetwarzanie i dzielenie much kontrolnych i eksperymentalnych jako jednej próbki.

Masowa histologia w celu ilościowego określenia neurodegeneracji u Drosophila

Tutaj pokazujemy, jak określić ilościowo liczbę i rozkład przestrzenny aktywnych stref synaptycznych w fotoreceptorach Drosophila melanogaster, wyróżnionych genetycznie zakodowanym markerem molekularnym, oraz ich modulację po długotrwałej ekspozycji na światło.

Analiza modulacji synaptycznej fotoreceptorów Drosophila melanogaster po ekspozycji na przedłużone światło

Ten protokół opisuje sekcję i barwienie immunologiczne tkanek mózgowych dorosłych Drosophila melanogaster. W szczególności protokół ten podkreśla wykorzystanie ciała grzyba Drosophila i neuronów fotoreceptorowych jako przykładowych podzbiorów neuronów, które można dokładnie wykorzystać do odkrycia ogólnych zasad leżących u podstaw wielu aspektów rozwoju neuronów.

Rozwarstwienie i barwienie immunofluorescencyjne neuronów ciała grzyba i fotoreceptorów w mózgach dorosłych Drosophila melanogaster

Coraz więcej dowodów potwierdza tezę, że patogenne agregaty białkowe związane z chorobami neurodegeneracyjnymi rozprzestrzeniają się między komórkami z właściwościami podobnymi do prionów. W tym miejscu opisano metodę, która umożliwia wizualizację rozprzestrzeniania się między komórkami agregatów podobnych do prionów w organizmie modelowym Drosophila melanogaster.

Monitorowanie transmisji między komórkami priopodobnych agregatów białkowych u Drosophila melanogaster

Ten protokół skupia się na ilościowej analizie złożoności neuronalnej arboryzacji dendrytycznej (NDAC) u Drosophila, która może być wykorzystana do badań morfogenezy dendrytycznej.

Analiza ilościowa złożoności neuronalnej arboryzacji dendrytycznej u Drosophila

Celem tej procedury jest wypreparowanie tkanki mięśnia podłużnego grzbietu (DLM) w celu oceny integralności strukturalnej połączeń nerwowo-mięśniowych DLM (NMJs) w modelach chorób neurodegeneracyjnych przy użyciu Drosophila melanogaster.

Wizualizacja zwyrodnienia synaptycznego u dorosłych Drosophila w związku z neurodegeneracją

Tutaj opisano nieinwazyjne metody lokalizacji białek błony fotoreceptorowej i oceny zwyrodnienia siatkówki w oku złożonym Drosophila za pomocą fluorescencji eGFP.

Badanie transportu białek błonowych w komórkach fotoreceptorowych Drosophila przy użyciu białek znakowanych eGFP

To badanie przedstawia uproszczony protokół przetwarzania tkanek obejmujący dekapitację, fiksację, kriosekcję, barwienie fluorescencyjne, barwienie immunologiczne i obrazowanie, który może być rozszerzony na obrazowanie konfokalne i wielofotonowe. Metoda zachowuje skuteczność porównywalną ze skomplikowanymi sekcjami, omijając potrzebę zaawansowanych umiejętności motorycznych. Ilościowa analiza obrazu daje szeroki potencjał badawczy.

Bezpośrednia kriosekcja głów Drosophila w celu wzmocnienia barwienia fluorescencyjnego mózgu i barwienia immunologicznego

Poznaj metodę ilościowej analizy białek znakowanych fluorescencyjnie w modelach neurodegeneracji Drosophila przy użyciu ImageJ. To półautomatyczne podejście minimalizuje stronniczość selekcji i maksymalizuje moc próby.

Ilościowa biologia komórki neurodegeneracji u Drosophila poprzez bezstronną analizę białek znakowanych fluorescencyjnie za pomocą ImageJ (Wideo) | JoVE Journal

Ilościowa biologia komórki neurodegeneracji u Drosophila poprzez bezstronną analizę białek znakowanych fluorescencyjnie za pomocą ImageJ

Przeglądaj więcej filmów