Name: Beztlenowy wzrost i utrzymanie linii komórkowych ssaków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: Poznaj metodę długoterminowej hodowli beztlenowej linii komórkowych ssaków do 17 dni. Technika ta umożliwia badanie fizjologii komórek w warunkach niedotlenienia oraz testowanie leków przeciwnowotworowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy dziękują Biuru Badań i Programów Sponsorowanych Uniwersytetu Środkowo-Zachodniego za wsparcie.

1. Przygotuj pożywkę do beztlenowej hodowli różnych linii komórkowych ssaków
<ol>
	<li>Przygotuj kompletną pożywkę PS-74656 do hodowli komórek beztlenowych25.
	<ol>
		<li>Przygotować sterylny roztwór podstawowy azotynów (5 M; 100x), rozpuszczając 17,25 g azotynów w 50 ml destylowanej wody dejonizowanej, a następnie przefiltrować w celu sterylizacji.</li>
		<li>Dodać 0,5 ml roztworu podstawowego azotynów na 50 ml DMEM o niskiej zawartości glukozy (1 g/l glukozy) z 110 mg/l L-glutaminy, 584 mg/l pirogronianu sodu i 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS; inaktywowanej termicznie). 
		UWAGA: Stosowanie stężeń FBS większych niż 10% jest toksyczne. Warto zauważyć, że jedna z testowanych linii komórek rakowych miała niską tolerancję na pożywki z azotynami (MDA-MB-231, linia komórkowa raka piersi), a zatem była hodowana przy braku azotynów. Ponadto, chociaż pożywka PS-74656 wspierała wzrost wszystkich badanych linii komórkowych (n = 9), niektóre linie komórkowe (np. komórki Vero) wykazywały wyższe stężenia komórek i wyższą żywotność w PS-74656 z wysokim poziomem glukozy (4,5 g / L) DMEM25.</li>
		<li>Umieścić 20 ml pożywki w sterylnej stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Nie dokręcaj nakrętki; Powinien być luźny.</li>
		<li>Odgazuj pożywkę, umieszczając rurkę w próżniowym dzbanku dzwonowym pod kątem około 45°, aby zmaksymalizować powierzchnię medium.</li>
		<li>Zastosuj próżnię za pomocą pompy próżniowej lub jej odpowiednika w temperaturze pokojowej. Utrzymuj próżnię, aż pęcherzyki przestaną być obserwowane (24–48 godzin).</li>
		<li>Wyjmij probówkę ze słoika i natychmiast zamknij nakrętkę, uszczelniając rurkę, aby zminimalizować wprowadzanie powietrza do medium.</li>
		<li>Umieść rurkę w komercyjnej komorze beztlenowej.</li>
		<li>Poluzować nasadkę probówki i pozwolić, aby atmosfera w probówce zrównoważyła się z atmosferą beztlenowej mieszaniny gazów w komorze przez co najmniej 24 godziny 
		UWAGA: Pożywka powinna pozostać w komorze do momentu jej zużycia. Aby przyspieszyć proces, przepłucz probówkę co najmniej 3 razy mieszaniną gazów beztlenowych za pomocą sterylnej pipety transferowej wypełnionej gazem bezanowym, który składa się zH2,CO2 iN2. </li>
		<li>Odgazować wszystkie probówki (10–15 min) umieszczone w komorze beztlenowej, jak opisano powyżej, przed uszczelnieniem rurki i umieszczeniem w komorze. Przed użyciem przepłukać go beztlenową mieszaniną gazów za pomocą 1,5–2 ml pipet transferowych lub końcówek do pipet, które zostały przepłukane gazem beztlenowym co najmniej 3 razy.</li>
		<li>Przebywając w komorze beztlenowej, pobrać 100 μl pożywki do sterylnej, odgazowanej mikroprobówki wirówkowej i przetestować ją na obecność rozpuszczonego tlenu za pomocą sondy tlenowej w komorze. 
		UWAGA: Elektroda tlenowa jest kalibrowana zgodnie z protokołem producenta przed użyciem. Odczyty prawidłowo odgazowanej i zbilansowanej beztlenowej mieszaniny gazowej wynoszą 0, 
		UWAGA: Jeśli odczyty przekraczają 0,3 ppm tlenu, kontynuuj inkubację pożywki w komorze beztlenowej, ponieważ potrzeba więcej czasu na zrównoważenie pożywki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Beztlenowa hodowla różnych linii komórkowych ssaków
<ol>
	<li>Wyznaczony dzień -1
	<ol>
		<li>Hoduj komórki (37 °C, 5% CO2) w kolbie T150 do 90% konfluencji w celu kontroli kultur beztlenowych i normoksycznych, aby zapewnić wystarczającą liczbę komórek na trzy płytki 24-dołkowe (konfluencja 80%). 
		UWAGA: W tym badaniu użyto komórek HeLa 229 i Vero. Protokół ten został również przetestowany i okazał się skuteczny w przypadku wzrostu i utrzymania siedmiu innych linii komórkowych25.</li>
		<li>Wyjąć pożywkę z kolby przez aspirację i przemyć ją 10 ml HBSS.</li>
		<li>Zastąp pożywkę 5 ml trypsyny. Mieszać kolbę, aż komórki wizualnie oderwą się od plastiku. Odessać większość trypsyny, a następnie postukać w kolbę, aby usunąć przylegające komórki. Dodaj 10-15 ml DMEM o wysokiej zawartości glukozy (4,5 g/l glukozy, 110 mg/l L-glutaminy, 10% FBS, 50 μg/ml gentamycyny), aby dezaktywować trypsynę.</li>
		<li>Rozcieraj komórki za pomocą pipety o pojemności 25 ml, aż wszystkie grudki komórek zostaną przerwane.</li>
		<li>Policzyć komórki i określić ich żywotność, używając standardowego hemocytometru i metody wykluczania barwnika błękitu trypanowego lub automatycznego odpowiednika.</li>
		<li>Zawieś komórki w DMEM o wysokim poziomie glukozy, jak wspomniano powyżej, do gęstości komórek 2,24 x 105 komórek/ml.</li>
		<li>Dodać 1 ml zawiesiny komórkowej do dołków 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej (2,24 x 105 komórek/dołek; 80% konfluencja). Wysiew 1 płytka dla kultury beztlenowej i druga dla kontrolnej kultury normoksycznej.</li>
		<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w warunkach normoksyjnych (5% CO2) przez 24 godziny 
		UWAGA: Ogniwa można platerować na różnych płytkach o dużej wielkości. Jednak wysiewanie komórek do wzrostu beztlenowego w kolbach wiąże się z ryzykiem wprowadzenia tlenu do systemu, chyba że zachowa się ostrożność w celu całkowitego wypłukania gazu atmosferycznego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyznaczony dzień 0
	<ol>
		<li>Po 24 godzinach inkubacji normoksycznej umieścić płytki do wzrostu beztlenowego w komorze beztlenowej (komora beztlenowa w handlu; <silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
		<li>Natychmiast zmienić pożywkę na odgazowaną pożywkę PS-74656 bez antybiotyków, która była aklimatyzowana przez 24 godziny do komory beztlenowej. Umieść talerz w pojemniku z wilgotnym ręcznikiem i luźno go zamknij, aby utrzymać wilgoć. 
		UWAGA: Z płytkami do wzrostu normoksycznego obchodzi się identycznie, z wyjątkiem tego, że wszystkie zabiegi są wykonywane w warunkach atmosferycznych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyznaczony dzień 1
	<ol>
		<li>Dzień 1 inkubacji beztlenowej rozpoczyna się po 24 godzinach inkubacji w handlowej komorze beztlenowej, która zawiera wzorcową mieszaninę gazów beztlenowych o stężeniach 10%H2, 10%CO2 i 80%N2.</li>
		<li>Inkubuj komórki przez różne okresy czasu.</li>
		<li>Monitoruj podłoże beztlenowe pod kątem zmiany koloru w czasie. 
		UWAGA: Zmiana koloru z czerwono-pomarańczowego na magenta sygnalizuje czas na zmianę nośnika. Może to potrwać do 2 tygodni. Zmiana koloru podłoża z czerwono-pomarańczowego na żółty wskazuje na obecność zanieczyszczenia bakteryjnego.</li>
		<li>Gdy podłoże zmieni kolor z czerwonego na purpurowy, usuń komórki runagate przez aspirację.</li>
		<li>Umieścić zasysaną zużytą pożywkę z komórkami runagatu w odgazowanych i beztlenowych probówkach do mikrofugowania z równowagą gazową, zamknąć probówki, upewniając się, że uszczelnienie jest bezpieczne, a następnie odwirować je (326 x g; w temperaturze pokojowej przez 10 min). Natychmiast zassłaniaj zasysaną pożywkę w studzience 1 ml nowej, odgazowanej pożywki PS-74656.</li>
		<li>Umieść probówkę do mikrofuge z granulowanymi komórkami w komorze beztlenowej przed jej otwarciem. Odessać zużytą pożywkę i zastąpić ją świeżą, odgazowaną pożywką PS-74656 do całkowitej objętości 1 ml w probówce do mikrofuge.</li>
		<li>Umieść komórki z probówki z powrotem w studzience w 24-dołkowej płytce do hodowli tkankowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Ocena fenotypowego różnicowania komórek za pomocą mikroskopii komórek hodowanych beztlenowo
<ol>
	<li>Przebywając w komorze beztlenowej, umieścić płytkę w zamykanym pudełku przepłukanym beztlenową mieszaniną gazów i zamknąć pudełko. 
	UWAGA: Pudełko musi zawierać wilgotny ręcznik papierowy, aby zapewnić wilgoć i zapobiec wysychaniu talerza. W przypadku mikroskopii najlepiej sprawdzają się torebki na kanapki, ponieważ są cienkie.
	<ol>
		<li>Aby obserwować komórki pod mikroskopem, całkowicie zamknij worek i wyjmij go z komory.</li>
		<li>Ostrożnie rozciągnij plastikową torbę na płytce, zbadaj komórki za pomocą mikroskopu z kontrastem odwróconym fazowym z nasadką kamery i wykonaj mikrofotografie w różnych powiększeniach.</li>
		<li>Umieścić płytkę z zamkniętego worka z powrotem w komorze i kontynuować inkubację zgodnie z opisem w kroku 2.3.3.</li>
		<li>Aby oddzielnie przeanalizować komórki runagate, które znajdują się w zawiesinie, wykonaj czynności opisane w kroku 2.3.5. 
		UWAGA: Komórki te mogą być następnie wykorzystane do testów tlenowych lub mogą zostać zwrócone do komory beztlenowej w celu przetestowania tej konkretnej populacji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Cummins, J., Tangney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteria+and+tumours%3A+causative+agents+or+opportunistic+inhabitants%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Infectious+Agents+and+Cancer%22%5BJournal%5D)">Bacteria and tumours: causative agents or opportunistic inhabitants?</a> Infectious Agents and Cancer. 8 (1), 11(2013).</li>
<li>Liao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+efficiency+of+generating+induced+pluripotent+stem+%28iPS%29+cells+from+human+somatic+cells+by+a+combination+of+six+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Enhanced efficiency of generating induced pluripotent stem (iPS) cells from human somatic cells by a combination of six transcription factors.</a> Cell Research. 18 (5), 600-603 (2008).</li>
<li>Park, I. H., Lerou, P. H., Zhao, R., Huo, H., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of human-induced pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 3 (7), 1180-1186 (2008).</li>
<li>Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIF-1%3A+mediator+of+physiological+and+pathophysiological+responses+to+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">HIF-1: mediator of physiological and pathophysiological responses to hypoxia.</a> Journal of Applied Physiology. 88 (4), 1474-1480 (2000).</li>
<li>Biedermann, L., Rogler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intestinal+microbiota%3A+its+role+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">The intestinal microbiota: its role in health and disease.</a> European Journal of Pediatrics. 174 (2), 151-167 (2015).</li>
<li>Cui, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+influences+stem+cell-like+properties+in+multidrug+resistant+K562+leukemic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cells%2C+Molecules%2C+and+Diseases%22%5BJournal%5D)">Hypoxia influences stem cell-like properties in multidrug resistant K562 leukemic cells.</a> Blood Cells, Molecules, and Diseases. 51 (3), 177-184 (2013).</li>
<li>Richter, A., Sanford, K. K., Evans, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+Oxygen+and+Culture+Media+on+Plating+Efficiency+of+Some+Mammalian+Tissue+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22JNCI%3A+Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Influence of Oxygen and Culture Media on Plating Efficiency of Some Mammalian Tissue Cells.</a> JNCI: Journal of the National Cancer Institute. 49 (6), 1705-1712 (1972).</li>
<li>Packer, L., Fuehr, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+oxygen+concentration+extends+the+lifespan+of+cultured+human+diploid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells.</a> Nature. 267, 423(1977).</li>
<li>Warburg, O. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/13298683">On the origin of cancer.</a> Science. 123 (3191), 309-314 (1956).</li>
<li>Döme, B., Hendrix, M. J. C., Paku, S., Tóvári, J., Tímár, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1762709/">Alternative Vascularization Mechanisms in Cancer.</a> The American Journal of Pathology. 170 (1), 1-15 (2007).</li>
<li>Jewell, U. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+HIF-1%CE%B1+in+response+to+hypoxia+is+instantaneous%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Induction of HIF-1α in response to hypoxia is instantaneous.</a> The FASEB Journal. 15 (7), 1312-1314 (2001).</li>
<li>Lee, J. W., Bae, S. H., Jeong, J. W., Kim, S. H., Kim, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-inducible+factor+%28HIF-1%29alpha%3A+its+protein+stability+and+biological+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+%26+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-inducible factor (HIF-1)alpha: its protein stability and biological functions.</a> Experimental & Molecular Medicine. 36 (1), 1-12 (2004).</li>
<li>Pagoulatos, D., Pharmakakis, N., Lakoumentas, J., Assimakopoulou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Etaypoxia-inducible+factor-1alpha%2C+von+Hippel-Lindau+protein%2C+and+heat+shock+protein+expression+in+ophthalmic+pterygium+and+normal+conjunctiva%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Etaypoxia-inducible factor-1alpha, von Hippel-Lindau protein, and heat shock protein expression in ophthalmic pterygium and normal conjunctiva.</a> Molecular Vision. 20, 441-457 (2014).</li>
<li>Park, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fructose-driven+glycolysis+supports+anoxia+resistance+in+the+naked+mole-rat%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fructose-driven glycolysis supports anoxia resistance in the naked mole-rat.</a> Science. 356 (6335), 307(2017).</li>
<li>Johnston, I. A., Bernard, L. M. <a target="_blank" href="http://jeb.biologists.org/content/104/1/73">Utilization of the Ethanol Pathway in Carp Following Exposure to Anoxia.</a> Journal of Experimental Biology. 104 (1), 73(1983).</li>
<li>Takahashi, E., Sato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anaerobic+respiration+sustains+mitochondrial+membrane+potential+in+a+prolyl+hydroxylase+pathway-activated+cancer+cell+line+in+a+hypoxic+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Anaerobic respiration sustains mitochondrial membrane potential in a prolyl hydroxylase pathway-activated cancer cell line in a hypoxic microenvironment.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 306 (4), C334-C342 (2014).</li>
<li>Mandziuk, S., et al. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/281718793_Effect_of_hypoxia_on_toxicity_induced_by_anticancer_agents_in_cardiomyocyte_culture">Effect of hypoxia on toxicity induced by anticancer agents in cardiomyocyte culture.</a> Medycyna Weterynaryjna. 70 (5), 287-291 (2014).</li>
<li>Arai, H., Kodama, T., Igarashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+nirQOP+genes+in+energy+conservation+during+anaerobic+growth+of+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience%2C+Biotechnology%2C+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The role of the nirQOP genes in energy conservation during anaerobic growth of Pseudomonas aeruginosa.</a> Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 62 (10), 1995-1999 (1998).</li>
<li>Müller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemistry+and+Evolution+of+Anaerobic+Energy+Metabolism+in+Eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Biochemistry and Evolution of Anaerobic Energy Metabolism in Eukaryotes.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 76 (2), 444-495 (2012).</li>
<li>Gupta, K. J., Igamberdiev, A. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anoxic+plant+mitochondrion+as+a+nitrite%3A+NO+reductase%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">The anoxic plant mitochondrion as a nitrite: NO reductase.</a> Mitochondrion. 11 (4), 537-543 (2011).</li>
<li>Gupta, K. J., Igamberdiev, A. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+Nitrogen+Species+in+Mitochondria+and+Their+Implications+in+Plant+Energy+Status+and+Hypoxic+Stress+Tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Reactive Nitrogen Species in Mitochondria and Their Implications in Plant Energy Status and Hypoxic Stress Tolerance.</a> Frontiers in Plant Science. 7 (369), (2016).</li>
<li>Kozlov, A. V., Staniek, K., Nohl, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrite+reductase+activity+is+a+novel+function+of+mammalian+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letters%22%5BJournal%5D)">Nitrite reductase activity is a novel function of mammalian mitochondria.</a> FEBS letters. 454 (1-2), 127-130 (1999).</li>
<li>Nohl, H., Staniek, K., Kozlov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+existence+and+significance+of+a+mitochondrial+nitrite+reductase%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Report%22%5BJournal%5D)">The existence and significance of a mitochondrial nitrite reductase.</a> Redox Report. 10 (6), 281-286 (2005).</li>
<li>Lawson, J. C., Blatch, G. L., Edkins, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+in+breast+cancer+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells in breast cancer and metastasis.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 118 (2), 241-254 (2009).</li>
<li>Plotkin, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+long-term+cultivation+of+mammalian+cells+in+the+absence+of+oxygen%3A+Characterization+of+cell+replication%2C+hypoxia-inducible+factor+expression+and+reactive+oxygen+species+production%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+and+Cell%22%5BJournal%5D)">A method for the long-term cultivation of mammalian cells in the absence of oxygen: Characterization of cell replication, hypoxia-inducible factor expression and reactive oxygen species production.</a> Tissue and Cell. 50 (Supplement C), 59-68 (2018).</li>
<li>Sarmento, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-based+in+vitro+models+for+predicting+drug+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Metabolism+%26+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Cell-based in vitro models for predicting drug permeability.</a> Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 8 (5), 607-621 (2012).</li>
<li>Collins, S. J., Gallo, R. C., Gallagher, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+growth+and+differentiation+of+human+myeloid+leukaemic+cells+in+suspension+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Continuous growth and differentiation of human myeloid leukaemic cells in suspension culture.</a> Nature. 270 (5635), 347-349 (1977).</li>
<li>Plotkin, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+long-term+cultivation+of+mammalian+cells+in+the+absence+of+oxygen%3A+Characterization+of+cell+replication%2C+hypoxia-inducible+factor+expression+and+reactive+oxygen+species+production%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+and+Cell%22%5BJournal%5D)">A method for the long-term cultivation of mammalian cells in the absence of oxygen: Characterization of cell replication, hypoxia-inducible factor expression and reactive oxygen species production.</a> Tissue and Cell. 50, 59-68 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Metoda ta obejmuje komórki ssaków po raz pierwszy, które były hodowane przez dłuższy czas przy braku tlenu. Na podstawie obecnych obserwacji, zdolność do wzrostu beztlenowego poprzez szlak niefermentacyjny wydaje się być uniwersalna wśród linii komórek ssaków28, w których wzrost beztlenowy spowodował dywergencję fenotypu. Zaobserwowano to dla wszystkich badanych linii komórkowych. Wraz z uprawą beztlenową coraz większe proporcje komórek stawały się zaokrąglone, rozwijały populację podobną...

Komórki z guzów litych, nisz komórek macierzystych i tych wyściełających powierzchnię błony śluzowej istnieją w środowiskach, w których występuje obniżony poziom tlenu, w tym anoksja1,2,3,4. W normalnych stanach fizjologicznych natlenienie waha się od hipoksji do anoksji (całkowitego braku tlenu)5,6. Uświadomienie sobie, że tlen atmosferyczny niekorzystnie wpływa na replikację komórek ssaków i że wzrost komórek in vitro można zoptymalizować w warunkach zubożonego tlenu, zostało zgłoszone na początku lat siedemdziesiątych. 7 wykazał, że 1-3% poziomu tlenu (hipoksja) zwiększa wydajność posiewu w porównaniu z tlenem atmosferycznym (20%). Długość życia ludzkich komórek diploidalnych jest również wydłużona w warunkach hodowli niedotlenionej8.
In vivo, warunki niedotlenienia występują, gdy zapasy tlenu są wyczerpane (np. podczas intensywnego wysiłku), w których produkcja ATP jest przełączana w mięśniach szkieletowych z oddychania tlenowego na fermentację (oddychanie beztlenowe) z produktem końcowym kwasu mlekowego9. Patologicznie w guzach nowotworowych wnętrze masy guza jest niedotlenione do beztlenowego z powodu słabego unaczynienia10. Wpływ ograniczonej perfuzji na wnętrza guza jest niezależnie weryfikowany przez wnętrza guza skolonizowane przez obligatoryjne beztlenowce1. Mechanistycznie uważa się, że przeżycie komórek nowotworowych w niedotlenieniu zależy wyłącznie od ekspresji genu czynnika 1-alfa indukowanego hipoksją (HIF1-alfa), który jest początkową spontaniczną reakcją na niedotlenienie4,11,12. HIF1-alfa jest indukowany w warunkach niedotlenienia przez białka szoku cieplnego, które wiążą promotor HIF1-alfa i zwiększają transkrypcję genu12. Uważa się, że te białka szoku cieplnego pomagają w indukcji różnych fenotypów obserwowanych w niedotlenionym mikrośrodowisku guza. Fenotypy te wykazują zwiększoną ekspresję transporterów glukozy w błonie komórkowej i szybkość glikolizy (efekt Warburga)13. Rezultatem jest przejście od mitochondrialnej fosforylacji oksydacyjnej do fermentacji mleczanowej.
Przetrwanie beztlenowe może również wykorzystywać alternatywy dla glukozy do wspierania zjawiska przeżycia14,15. Najlepiej zbadanym przykładem ssaków jest kretoszczur, który może przetrwać prawie 20 minut bez tlenu dzięki szlakowi fermentacji glikolitycznej napędzanemu fruktozą14. Alternatywna adaptacja występuje u niektórych ryb (np. karpia [Carassius sp.], który może przetrwać przez znacznie dłuższy czas, stosując glikolizę z etanolem jako końcowym produktem ubocznym)15. W obu przypadkach fermentacja napędza metabolizm, umożliwiając przetrwanie przy braku tlenu. Obecna hipoteza dotycząca przeżycia beztlenowego jest taka, że tak długo, jak HIF1-alfa jest aktywowany podczas niedotlenienia, oddychanie mitochondrialne, bez potrzeby tlenu, zachodzi w warunkach beztlenowych16. Ponadto postuluje się, że zastosowanie szlaku fermentacyjnego do przeżycia niedotlenienia/beztlenowego zwiększa przeżywalność guza, ponieważ komórki unikają stresu oksydacyjnego, który może okazać się szkodliwy dla przeżycia komórki17. Postulat ten jest poparty niedawnym badaniem, które pokazuje, że w kardiomiocytach niedotlenienie zmniejsza stres oksydacyjny wywierany na komórkę nowotworową17.
Do tej pory, zasadniczy charakter szlaku fermentacyjnego dla przetrwania komórek ssaków beztlenowych był zakorzeniony w literaturze, głównie z powodu niemożności hodowli komórek ssaków przy całkowitym braku tlenu przez ponad 3 dni. Jednak alternatywa dla glikolizy dla przetrwania beztlenowego występuje w bakteriach. U niektórych bakterii azot lub siarczan (wśród innych związków) może służyć jako końcowe akceptory elektronów dla systemu oksydazy cytochromowej przy braku tlenu18. Chociaż ewolucja bakterii i eukariotycznych zachodziła równolegle od czasu oddzielenia się od ostatniego uniwersalnego wspólnego przodka, szacuje się, że mitochondria dostarczały energię komórkom przez 1,542 miliona lat przed natlenieniem oceanów19. Ponieważ naukowcy wykazali, że izolowane mitochondria mogą wytwarzać ATP przy braku tlenu, z azotynem jako końcowym akceptorem elektronów, rozsądne jest założenie, że komórki mogą funkcjonować przez okres dłuższy niż 3 dni przy braku tlenu20,21,22,23. Metodologia opisana w tym badaniu ma zastosowanie w beztlenowym wzroście komórek ssaków wielu linii komórkowych.

<table><tbody><tr><td>Komora beztlenowa Whitney A35</td><td>Don Whitley Scientific&nbsp;</td><td>Microbiology International</td><td>Możliwość zdjęcia przedniej części komory ułatwia umieszczanie narzędzi w środku bez obaw o przedostanie się przez portale.</td></tr><tr><td>Inkubator CO2</td><td>Fisher Scientific</td><td>3531</td><td></td></tr><tr><td>Kaptur do hodowli tkanek</td><td>Labconco</td><td>DO55735</td><td></td></tr> Sterylne pipety transferowe <tr><td></td><td>Drummond</td><td>4-000-100</td><td></td></tr><tr><td>Santa</td><td>Cruz</td><td>sc-358867</td><td></td></tr><tr><td>50 cc sterylne stożkowe probówki wirówkowe</td><td>DOT</td><td>451-PG</td><td></td></tr><tr><td>słoik</td> <td>próżniowyNalgene 111410862889</td><td>BTA-Mall 5311-0250</td><td></td></tr><tr><td>DMEM wysoka zawartość glukozy (4,5 g/L)</td><td>CellGro</td><td>10-017-CM</td><td></td></tr><tr><td>DMEM niska glukoza (1 g/L)</td><td>CellGro</td><td>10-014-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>VWR</td><td>1500-500</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>VWR</td><td>20-021-CV</td><td></td></tr><tr><td>trypsyna</td><td>VWR</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>gentamycyna</td><td>Gibco</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>sterylne pipety</td><td>CellTreat</td><td>229210B, 229205B</td><td></td></tr><tr><td>Kolba do hodowli tkankowych (T75 lub T150)</td> <td>Santa Cruz</td><td>sc-200263, sc-200264</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowe naczynia poddane hodowli tkankowej</td><td>DOT</td><td>667124</td><td></td></tr><tr><td>glad torebki na kanapki z zamkiem błyskawicznym</td><td>Mikroskop</td> z odwróconymi fazami Ziploc <td>Costco</td><td></td></tr><tr><td>(10, 20 40x obiektywy z montażem kamery)</td><td>Nikon Eclipse</td><td>TS100</td><td></td></tr><tr><td>trypan niebieski</td><td>Hemocytometr Invitrogen</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>Countess Automatyczny licznik</td><td>komórek Technologie życia</td><td>AMQAF1000</td><td></td></tr><tr><td>Pipety do mikromiareczkowania Rainin Końcówki do mikromiareczkowania</td><td>Rainin Classic</td>, końcówki do mikromiareczkowania <td>PR-100</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Santa Cruz Biotechnologia</td><td>sc-213233 & sc-201717&nbsp;</td><td></td></tr> stojak na <tr><td>probówki (probówki 50cc)</td><td>Lab Depot</td><td>HS29050A</td><td></td></tr><tr><td>azotyn sodu</td><td>Sigma</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigald/237213?lang=en&region=US</td><td></td></tr><tr><td>przezroczyste pudełka z pokrywkami</td><td>Rosti Mepal</td> Gumowe ręczniki papierowe <td>dla pokojówek</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Skrobak do komórek w domu</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>CellTreat</td><td>229310</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td> Przygotowane <td></td><td></td><td>we własnym zakresie</td></tr> probówki do mikrowirówek <tr><td>Fisher Scientific</td><td>64-17-5</td><td></td>z<td>70% etanolem</td></tr><tr><td>sterylne</td><td>worki Santa Cruz</td><td>sc-200273</td><td></td></tr> z <tr><td>uchwytem (biurko)</td><td>Rękawice</td> nitrylowe Heathrow Scientific <td>HS10320</td><td></td></tr><tr><td>Elektroda</td><td></td><td></td> tlenowa VWR 89428 <td></td></tr><tr><td></td><td>eDAQ</td><td>EPO354</td><td></td></tr><tr><td>pH-metr</td><td>Jenway</td><td>3510</td><td></td></tr><tr><td>papier / pHydrion</td><td>Sigma Aldich</td><td>Z111813</td><td></td></tr></tbody></table>

beztlenowy wzrost i utrzymanie linii komórkowych ssaków

Anaerobic Growth and Maintenance of Mammalian Cell Lines

Większość powierzchni błony śluzowej wraz z punktami środkowymi w guzach i niszach komórek macierzystych to geograficzne obszary ciała, które są niedotlenione. Wcześniejsze badania wykazały, że inkubacja w warunkach normoksyjnych (5% CO2 w powietrzu) lub hipoksyjnych (niski poziom tlenu), po których następuje inkubacja beztlenowa (brak wolnego tlenu) powoduje ograniczoną żywotność (2-3 dni). Opracowano nowatorską metodologię, która umożliwia beztlenową hodowlę komórek (przez co najmniej 17 dni; maksymalny czas testowany). Najważniejszym aspektem tej metodologii jest zapewnienie, że do systemu nie zostanie wprowadzony tlen. Uzyskuje się to przez odgazowanie pożywek oraz przez przepłukanie probówek, szalek, kolb i pipet beztlenową mieszaniną gazów (H2, CO2, N2), a następnie umożliwienie materiałom zrównoważenia się ze środowiskiem beztlenowym (beztlenowym) przed użyciem. Podczas pozyskiwania mikrofotografii należy zachować szczególną ostrożność, aby upewnić się, że uzyskane mikrofotografie nie zawierają artefaktów. W przypadku braku tlenu morfologia komórek jest znacznie zmieniona. Dla wszystkich komórek hodowanych beztlenowo odnotowuje się dwa odrębne morfotypy. Zdolność do wzrostu i utrzymania komórek ssaków przy braku tlenu może być zastosowana do analizy fizjologii komórek, interakcji wielodrobnoustrojowych i charakterystyki szlaków biosyntezy w celu opracowania nowych leków przeciwnowotworowych.

Siła niniejszego protokołu tkwi w zapewnieniu długowieczności i wzrostu wielu linii komórkowych oraz w uznaniu faktu, że zachodzą głębokie zmiany i rozbieżności w morfologii komórek25. Najbardziej krytycznym elementem niniejszego badania jest przenoszenie i utrzymywanie komórek w warunkach ścisłej anaerobiozy. Wymaga to zastosowania komory beztlenowej zorganizowanej w sposób maksymalizujący efektywność protokołu (Rycina 1) oraz zapewni...

Tutaj opisujemy nową metodę, która umożliwia długotrwałą beztlenową hodowlę ustalonych linii komórkowych. Maksymalny czas przeżycia, który został przetestowany, wynosi 17 dni. Metoda ta nadaje się do badania czynników cytotoksycznych i badania fizjologii komórek replikujących się beztlenowo.

Beztlenowy wzrost i utrzymanie linii komórkowych ssaków

Most mucosal surfaces along with the midpoints in tumors and stem cell niches are geographic areas of the body that are anoxic. Previous studies show that ...

Metoda ta może być wykorzystana do scharakteryzowania fizjologii komórek beztlenowych i pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące interakcji patogenów gospodarza, różnicowania komórek macierzystych i przerzutów komórek nowotworowych oraz podatności terapeutycznej. Jest to pierwszy opisany protokół, który umożliwia długotrwałą hodowlę beztlenową komórek ssaków. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku ukierunkowanej, spersonalizowanej terapii raka i terapii odmładzającej, ponieważ ze względu na toksyczność tlenu wiele typów komórek preferuje do wzrostu środowiska o niskiej zawartości tlenu.Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w oddychanie beztlenowe i metabolizm komórek, może być również stosowana w innych systemach, takich jak hodowla komórek macierzystych. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności, ponieważ należy zachować szczególną ostrożność, aby zapobiec zanieczyszczeniu tlenem. Fizyczna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ ostrożność potrzebna do wykluczenia zanieczyszczenia tlenem nie jest intuicyjna.Na początek dodaj 0,5 mililitra roztworu podstawowego azotynów do DMEM o niskiej stęż

anaerobic-growth-and-maintenance-of-mammalian-cell-lines

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przedstawiono zmodyfikowany trójwymiarowy układ in vitro, w którym charakterystyka wzrostu kilku linii komórkowych nowotworu w zrekonstytuowanej błonie podstawnej koreluje z uśpionym lub proliferacyjnym zachowaniem komórek nowotworowych w wtórnym miejscu przerzutowym in vivo.

System In Vitro do badania uśpienia nowotworów i przejścia w wzrost przerzutny

Przedstawiono opis kalibracji zintegrowanych czujników biologicznych (FIBS) Förster Resonance Energy Transfer do profilowania metabolicznego in situ. FIBS może być używany do pomiaru wewnątrzkomórkowych poziomów metabolitów w sposób nieinwazyjny, pomagając w rozwoju modeli metabolicznych i wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych warunków bioprocesowych.

Nieinwazyjne profilowanie metaboliczne z wykorzystaniem FIBS

Tutaj prezentujemy protokół do rozmnażania komórek Homalodisca vitripennis i HoCV-1 in vitro. Pożywkę usunięto z kultur dodatnich w stosunku do HoCV-1 i ekstrahowano RNA co 24 godziny przez 168 godzin. Przeżywalność komórek określono ilościowo za pomocą barwienia błękitem trypanowym. Całe cząsteczki wirusa zostały wyekstrahowane po zakażeniu. Wyekstrahowany RNA oznaczono ilościowo metodą qRT-PCR.

Namnażanie wirusa Homalodisca coagulata-01 za pośrednictwem hodowli komórkowej Homalodisca vitripennis

Korzystając z bioreaktora pneumatycznego, demonstrujemy montaż, działanie i wydajność tego jednorazowego systemu bioreaktorów do wzrostu komórek ssaków.

Hodowla komórek ssaków przy użyciu systemu jednorazowego bioreaktora pneumatycznego

Regulacja składników odżywczych za pomocą ciągłego karmienia dostosowanego do wzrostu poprawia tempo wzrostu sferoid komórek ssaków w porównaniu do przerywanego karmienia partiami dla kultur w bioreaktorach z mieszaną zawiesiną.  Niniejsze badanie demonstruje metody wymagane do ustalenia prostych kultur karmionych o skorygowanej dawce.

Regulacja składników odżywczych poprzez ciągłe karmienie w celu ekspansji komórek ssaków w sferoidach na dużą skalę

Hodowlane pierwotne lub ustalone linie komórkowe są powszechnie używane do rozwiązywania podstawowych problemów biologicznych i mechanistycznych jako wstępne podejście przed użyciem modeli zwierzęcych. Protokół ten opisuje, w jaki sposób przygotować ekstrakty z całych komórek i frakcje subkomórkowe do badań (Zn) i innych pierwiastków śladowych za pomocą atomowej spektroskopii absorbancji.

Spektroskopia absorpcji atomowej do pomiaru wewnątrzkomórkowych rezerwuarów w komórkach ssaków

Tutaj opisujemy implementację i interpretację wyników ilościowego testu samoodnawiania mammosfery in vitro.

Kwantyfikacja samoodnowy w mysich kulturach mammosfery

Mięśnie szkieletowe składają się z wielu typów komórek, w tym rezydentnych komórek macierzystych, z których każda ma szczególny wkład w homeostazę i regenerację mięśni. W tym miejscu opisano hodowlę 2D komórek macierzystych mięśni i niszy komórek mięśniowych w warunkach ex vivo, które zachowują wiele cech fizjologicznych, in vivo i środowiskowych.

Niefrakcjonowana masowa hodowla mięśni szkieletowych myszy w celu podsumowania spoczynku niszy i komórek macierzystych

Protokół ten przedstawia metodę wytwarzania dwuwarstwowego chipa mikroprzepływowego i analizy wzrostu drobnoustrojów pod wpływem gwałtownych oscylacji tlenu. Wydajność urządzenia została potwierdzona za pomocą wykrywania tlenu w kanałach płynów i hodowli mikroorganizmów.

Tworzenie szybkich oscylacji tlenu w analizie wzrostu pojedynczych komórek drobnoustrojów przy użyciu dwuwarstwowego urządzenia mikroprzepływowego

Przedstawiamy protokół urządzenia do ciągłej kultury mikrofluidalnej (MCCD), które umożliwia uprawę populacji bakteryjnych w stałych warunkach niskiego pożywienia (aż do setek nanomolarnych stężeń) lub czasowych fluktuacji składników odżywczych w skali minut.

Urządzenie mikrofluidyczne do ciągłej hodowli przeznaczone do badania Escherichia coli w warunkach niskich i wahających się stężeń składników odżywczych

Poznaj metodę długoterminowej hodowli beztlenowej linii komórkowych ssaków do 17 dni. Technika ta umożliwia badanie fizjologii komórek w warunkach niedotlenienia oraz testowanie leków przeciwnowotworowych.

Beztlenowy wzrost i utrzymanie linii komórkowych ssaków

Przeglądaj więcej filmów