Name: Kodowanie genetyczne niekanonicznego aminokwasu do wytwarzania koniugatów przeciwciało-lek w drodze szybkiej reakcji bioortogonalnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Naucz się modyfikować przeciwciała z wykorzystaniem pochodnej cyklopropenu lizyny do produkcji koniugatów przeciwciało-lek. Ta metoda zapewnia wysoką wydajność i stabilność wiązań w terapii celowanej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Radę Badań Medycznych w Wielkiej Brytanii. B.O.-S. posiada stypendium EMBO (ATLF 158-2016) i jest wdzięczny H. Pelhamowi i J.W. Chinowi za wsparcie, a także G. Kymowi, C. W. Morganowi i O. Perisicowi za pomoc i rady.

1. Wyprodukuj i scharakteryzuj przeciwciało
<ol>
	<li>Wyraź przeciwciało
	<ol>
		<li>Rozmrozić fiolkę z komórkami zawiesiny HEK w kolbie o pojemności 250 ml zawierającej 50 ml pożywki ekspresyjnej uzupełnionej o 100 jednostek/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i 250 ng/ml amfoterycyny B. Utrzymywać komórki w temperaturze 37 °C z 8% CO2 w nawilżanych inkubatorach wyposażonych w wytrząsarkę z prędkością 125 obr./min. Podziel komórki na 0,3-0,5 x 106 komórek/ml (co 2-3 dni) co najmniej 2 razy przed transfekcją.</li>
		<li>Po osiągnięciu gęstości 2,5 x 106 komórek/ml (2-3 dni po rozszczepieniu) przygotuj świeży roztwór 100 mM CypK. W tym celu odważyć 64 mg CypK, dodać 2,5 ml 0,1 wodorotlenku sodu, odwirować, odwirować, aby odzyskać wszystkie nierozpuszczone cząstki i sonikatować.</li>
		<li>Dodać 2,5 ml CypK (100 mM w 0,1 M NaOH) do 42,5 ml pożywki ekspresyjnej uzupełnionej antybiotykami. Dobrze wymieszaj, dodaj 250 μl 0,1 M HCl i wysterylizuj za pomocą filtra 0,22 μm.</li>
		<li>Rozcieńczyć 50 μg plazmidów HC i LC pKym1 21 do 2,5 ml zredukowaną pożywką surowicy. W oddzielnej probówce rozcieńczyć 135 μl odczynnika do transfekcji do 2,5 ml zredukowaną pożywką surowicy.</li>
		<li>Pięć minut po przygotowaniu roztworów wymieszać plazmidy i roztwór odczynnika do transfekcji i inkubować przez 20 minut, aby umożliwić utworzenie kompleksów między DNA a odczynnikiem do transfekcji.</li>
		<li>W międzyczasie odwirować 125 milionów komórek o gęstości docelowej przez 5 minut przy 500 x g, ponownie zawiesić z pożywką ekspresyjną zawierającą CypK i dodać mieszaninę odczynnika do transfekcji DNA. CypK można zakupić lub zsyntetyzować, jak zgłoszono wcześniej18.</li>
		<li>Po inkubacji komórek przez 20 godzin dodać 250 μl wzmacniaczy odczynników do transfekcji zawartych w zestawie.</li>
		<li>Przeciwciała należy pobrać z supernatantu 6-7 dni po dodaniu CypK (nie jest wymagana zmiana pożywki podczas odciągania). 
		*Alternatywnie, aby uzyskać wyższe i bardziej spójne plony, można wygenerować stabilną linię komórkową, jak opisano w Oller-Salvia i wsp. 201821. W tym przypadku trastuzumab(CypK)2 wyraża się po prostu przez dodanie CypK 5 mM do pożywki ekspresyjnej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyść przeciwciało
	<ol>
		<li>Odwirowywać komórki przez 15 minut przy 3000 x g.</li>
		<li>Przefiltrować supernatant za pomocą filtra 0,45 lub 0,22 μm. Jeśli filtr zostanie zasłonięty, wymień go na nowy i kontynuuj filtrowanie. Jeśli zdarzy się to już po kilku mililitrach, odwiruj supernatant przez dodatkowe 15 minut przy 7000 x g.</li>
		<li>Dodać żywicę białkową A (2 ml/100 ml supernatantu) do pustej kolumny do chromatografii polipropylenowej i zrównoważyć żywicę z co najmniej 5 objętościami buforu do przemywania kulek (0,1 M fosforanu sodu, 150 mM NaCl).</li>
		<li>Podzielić supernatant na dwie stożkowe probówki o pojemności 50 ml i dodać 5x bufor do płukania kulek (0,5 M fosforan sodu, 150 mM NaCl), a następnie wstępnie zrównoważoną żywicę białkową A. Umieścić stożkową rurkę na wałku na 3 godziny w temperaturze pokojowej, aby ściągnąć przeciwciało w supernatant. 
		Alternatywnie: Dodać supernatant na kolumnę z co najmniej dwukrotnie większą objętością żywicy niż zalecana i pozostawić do przepłynięcia. Upewnij się, że w supernatancie nie pozostała znaczna ilość przeciwciał za pomocą SDS-PAGE. Jeśli tak, należy ponownie wymyć supernatant przez żywicę.</li>
		<li>Przenieś żywicę białka A z supernatantem do kolumny i pozwól cieczy przepłynąć.</li>
		<li>Dodać 25 ml buforu do przemywania (lub co najmniej 10 objętości żywicy) i pozostawić do przepłynięcia.</li>
		<li>Eluować przeciwciało za pomocą 4 ml 0,1 M cytrynianu sodu o pH 3 na 1 ml 1 M buforu fosforanowego, 150 mM NaCl.</li>
		<li>Rozcieńczyć przeciwciało 10 ml PBS, stężyć do 0,5-1 ml przez filtrację odśrodkową i trzykrotnie wymienić bufor z PBS.</li>
		<li>Oczyść próbki za pomocą FPLC przy użyciu butylowej kolumny HIC o przepływie 0,5 ml/min i nachyleniu 0-100% w ciągu 30 minut buforu o niskiej zawartości soli (50 mM fosforan sodu o pH 7,0, 20% izopropanol) w buforze o wysokiej zawartości soli (1,5 M (NH4)2SO4, 50 mM fosforan sodu o pH 7,0, 5% izopropanolu). Zebrać wszystkie frakcje i monitorować elucję przy długości fali 280 nm. Niewielkie ilości (< 1 mg) mogą być oczyszczane za pomocą HPLC-HIC w warunkach opisanych w ppkt 2.4 w celu maksymalizacji wydajności i czystości.</li>
		<li>Zebrać frakcje zawierające przeciwciała, rozcieńczyć je do co najmniej 4 ml za pomocą PBS, zagęścić przez filtrację odśrodkową i trzykrotnie wymienić bufor z PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ilościowe określenie przeciwciała
	<ol>
		<li>Uzyskać przybliżone stężenie, mierząc absorbancję przy 280 nm za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego.</li>
		<li>Jeśli wymagany jest dokładny pomiar, użyj zestawu ELISA do pomiaru ludzkich IgG. Aby uzyskać przybliżoną wycenę, użyj SDS-PAGE z plamą na bazie Coomassie w następujący sposób:
		<ol>
			<li>Przygotować wzorce, rozcieńczając sześciokrotnie dwukrotnie wzorzec trastuzumabu oznaczony ilościowo metodą ELISA w dawce 1 mg/ml.</li>
			<li>Zagotować wzorce i próbki w stężeniu około 0,25 mg/ml w buforze redukującym.</li>
			<li>Uruchom je w 4-12% Bis-Tris SDS-PAGE za pomocą bufora MES-SDS i zabarwij barwnikiem na bazie Coomassie. Na koniec zmierz gęstość koloru pasma odpowiadającego łańcuchowi lekkiemu lub ciężkiemu za pomocą ImageJ i interpoluj sygnał z próbek w krzywej standardowej.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przechowywać przeciwciało w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
2. Sprzęgnij przeciwciało i scharakteryzuj ADC
<ol>
	<li>Sprzęgnij przeciwciało z cząsteczką zawierającą tetrazynę
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć 10 równoważników molowych tetrazyny-vcMMAE (4 μl, 3,4 mM w dimetylosulfotlenku (DMSO)) 20 μl acetonitrylu i 76 μl PBS w małej stożkowej probówce (np. probówce do PCR).</li>
		<li>Dodać 1 molowy odpowiednik trastuzumabu(CypK)2 (100 μL, 2 mg/ml w PBS), dokładnie wymieszać i pozostawić do reakcji przez 3 godziny w temperaturze pokojowej (25 °C) do wytworzenia trastuzumabu(MMAE)2, 
		Uwaga: Inne cząsteczki, takie jak tetrazyna-5-TAMRA, mogą być połączone z przeciwciałem zamiast tetrazyny-vcMMAE przy użyciu tego protokołu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyść ADC
	<ol>
		<li>Wstępnie zrównoważyć kolumnę wirową wykluczającą rozmiar z PBS zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Dodać całą objętość reakcji na wirową kolumnę i odwirować przy 1500 x g przez 1 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Określ ilościowo ADC i przeanalizuj koniugat za pomocą SDS-PAGE
	<ol>
		<li>Określić ilościowo ADC zgodnie z opisem w ppkt 1.3.2, mierząc gęstość barwy łańcucha świetlnego na SDS-PAGE przy użyciu niezmodyfikowanego przeciwciała dla krzywej wzorcowej.</li>
		<li>Ciężki łańcuch powinien się nieznacznie przesunąć, wykazując wzrost masy cząsteczkowej po koniugacji. 
		Uwaga: Jeśli przeciwciało jest modyfikowane fluoroforem, takim jak w trastuzumabie (TAMRA) 2, tylko pasmo odpowiadające łańcuchowi ciężkiemu powinno wykazywać fluorescencję w żelu przed barwieniem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analizuj sprzęgany za pomocą HPLC-HIC
	<ol>
		<li>Równoważyć kolumnę HPLC-HIC ze 100% buforem A (1,5 M (NH4)2SO4, 50 mM fosforan sodu pH 7,0, 5% izopropanol) przez 5 minut.</li>
		<li>Zmieszać 15 μl (67 pmol) roztworu trastuzumabu (CypK) o stężeniu 1 mg/ml2 z 15 μl 2 buforu A w fiolce. Następnie zaprogramować wstrzyknięcie 10 μl w HPLC.</li>
		<li>Eluować w izokratycznym przepływie 1 ml / min ze 100% buforem A przez 1 minutę, a następnie 15 minutowy gradient od 100 do 0% buforu A w B (50 mM fosforan sodu o pH 7,0, 20% izopropanol). Monitorować elucję przy długości fali 280 nm.</li>
		<li>Obliczyć DAR, całkując pik odpowiadający każdemu gatunkowi i wykorzystując otrzymane obszary w następującym równaniu: 
		DAR = (1x trastuzumab(MMAE) + 2x trastuzumab(MMAE)2) 
		/(trastuzumab(MMAE)0 + trastuzumab(MMAE)1 + trastuzumab(MMAE)2) 
		Przewidywany czas retencji dla trastuzumabu(CypK)2 wynosi 7,5-8,0 min, dla trastuzumabu(CypK, MMAE) 9,1-9,6 min, a dla trastuzumabu(MMAE)2 wynosi 10,5-11,0 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analizuj sprzężony przez LC-MS
	<ol>
		<li>Deglikozylan 30 μl 1 mg/ml ADC i niemodyfikowane przeciwciało w warunkach nieredukcyjnych przy użyciu 250 jednostek PNGazy F przez co najmniej 6 godzin w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Eluować przeciwciało do spektrometru mas w kolumnie C4 1-5 μm 1,0 x 100 mm, stosując 20-minutowy gradient od 2% do 80% acetonitrylu w wodzie. Pozyskiwanie danych w zakresie m/z 350-4000 w trybie jonów dodatnich przy napięciu stożka 150 V.</li>
		<li>Zdekonwolucjonizuj surowe dane za pomocą odpowiedniego oprogramowania. Obliczyć różnicę masy między zmodyfikowanymi i niezmodyfikowanymi przeciwciałami.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Test stabilności wiązania dihydropirydazyny w trastuzumabie(TAMRA)2 w surowicy
<ol>
	<li>Przefiltruj surowicę za pomocą filtra 0,22 μm w sterylnych warunkach. Możesz dodać 100 jednostek/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny.</li>
	<li>Napełnij wodą zewnętrzne studzienki 96-dołkowej płytki. W studzienkach centralnych wymieszać trzykrotnie 90 μl przefiltrowanej surowicy z 10 μl 1 mg/ml trastuzumabu(TAMRA)2 w PBS w końcowym stężeniu 0,1 mg/ml. Umieścić płytkę w inkubatorze nasyconym wilgocią o temperaturze 37 °C i 4-5% CO2 .</li>
	<li>Co 24 godziny przez 5 dni dokładnie odpipetować każdy studzienek w celu wymieszania, pobrać porcję 5 μl, błyskawicznie zamrozić ciekłym azotem i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Po zebraniu wszystkich próbek rozmrozić podwielokrotności i przeanalizować je za pomocą pośredniego testu ELISA, jak wcześniej podano12 z pewnymi modyfikacjami:
	<ol>
		<li>Pokryj 96-dołkową płytkę przez noc 0,25 μg/ml HER2 w temperaturze 4 °C. Wszystkie inne kroki są wykonywane w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Następnego dnia przemyć 5 razy PBS 0,05% tween (PBS-T) i zablokować 1% albuminą surowicy bydlęcej przez 1 godzinę.</li>
		<li>Przemyć i inkubować próbki w rozcieńczeniu 1:10000 w PBS przez 2 godziny.</li>
		<li>Przemyć i inkubować przeciwciało anty-TAMRA wyhodowane u myszy w rozcieńczeniu 1:2000 w PBS-T z 0,5% BSA przez 1 godzinę.</li>
		<li>Przemyć i inkubować koniugat HRP przeciwko myszom w stosunku 1:1000 w PBS-T z 0,5% BSA przez 1 godzinę.</li>
		<li>Dodaj TMB i pozwól zareagować 5-10 minut.</li>
		<li>Zatrzymać reakcję za pomocą 50 μLH2SO4 1 M i zmierzyć absorbancję przy 450 nm. Odejmij tło mierzone przy 570 nm.</li>
		<li>Dopasuj 4-parametrową krzywą regresji logistycznej do standardowych rozcieńczeń i interpoluj pomiary z próbek. 
		Uwaga: Stabilność trastuzumabu(MMAE)2 można ocenić przy użyciu tego samego protokołu, zmieniając test opisany w ppkt 3.3 dla dostępnego w handlu zestawu ELISA w celu pomiaru stężenia ADC.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Oceń cytotoksyczność ADC
Uwaga: Ten protokół jest oparty na wcześniej zgłoszonych testach23,26 z pewnymi modyfikacjami.
<ol>
	<li>Rozmrozić komórki SK-BR-3 i MCF-7 i pozwolić im osiąść w kolbach p25 zawierających kompletną pożywkę, tj. DMEM uzupełniony 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą, 100 jednostek/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny.</li>
	<li>Podziel komórki przy 80-90% zbiegu (co 3-4 dni) co najmniej 2 razy przed testem.</li>
	<li>Dwa dni przed badaniem napełnij wodą zewnętrzne studzienki 96-dołkowej płytki. Następnie podnieść komórki z 0,05% trypsyny w 0,5 mM EDTA, odwirować 3 minuty przy 250 x g, ponownie zawiesić w nowym podłożu i wysiać 3000 komórek w 100 μl na (pusty) dołek na 96-dołkowych płytkach.</li>
	<li>Dwa dni po wysianiu komórek należy przygotować 10 seryjnych rozcieńczeń wszystkich próbek w trzech powtórzeniach z 0,1% DMSO w kompletnym pożywce. Należy wziąć pod uwagę następujące próbki i kontrole: trastuzumab(MMAE)2, trastuzumab(CypK)2, trastuzumab typu dzikiego, tetrazyna-vcMMAE i MMAE.</li>
	<li>Dodać 100 μl każdej próbki do każdej studzienki i inkubować przez 5 dni w temperaturze 37 °C i 4-5% CO2 .</li>
	<li>W 5 dniu zmierz żywotność komórek. W tym celu należy użyć komercyjnego zestawu do lizy komórek i pomiaru uwolnionego ATP. Wykreślić procent sygnału w odniesieniu do komórek kontrolnych poddanych działaniu 0,1% DMSO. 
	Uwaga: ADC można inkubować przez 5 dni w surowicy i oznaczać cytotoksyczność w celu udowodnienia stabilności funkcjonalnej. 
	UWAGA: MMAE jest wysoce toksyczny. Dlatego podczas obchodzenia się z pochodnymi MMAE należy używać rękawic i okularów. Jeśli używasz niezmodyfikowanego MMAE jako kontroli w swoim eksperymencie, podczas przygotowywania roztworu podstawowego w DMSO, należy obchodzić się z produktem stałym w dygestorium.</li>
</ol>

<ol><li>Beck, A., Goetsch, L., Dumontet, C., Corvaia, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+and+challenges+for+the+next+generation+of+antibody-drug+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Strategies and challenges for the next generation of antibody-drug conjugates.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16 (5), 315-337 (2017).</li>
<li>Wakankar, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physicochemical+Stability+of+the+Antibody%E2%88%92Drug+Conjugate+Trastuzumab-DM1%3A+Changes+due+to+Modification+and+Conjugation+Processes%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Physicochemical Stability of the Antibody−Drug Conjugate Trastuzumab-DM1: Changes due to Modification and Conjugation Processes.</a> Bioconjugate Chemistry. 21 (9), 1588-1595 (2010).</li>
<li>Stan, A. C., Radu, D. L., Casares, S., Bona, C. A., Brumeanu, T. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antineoplastic+Efficacy+of+Doxorubicin+Enzymatically+Assembled+on+Galactose+Residues+of+a+Monoclonal+Antibody+Specific+for+the+Carcinoembryonic+Antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Antineoplastic Efficacy of Doxorubicin Enzymatically Assembled on Galactose Residues of a Monoclonal Antibody Specific for the Carcinoembryonic Antigen.</a> Cancer Research. 59 (1), 115-121 (1999).</li>
<li>Hamblett, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Drug+Loading+on+the+Antitumor+Activity+of+a+Monoclonal+Antibody+Drug+Conjugate%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Effects of Drug Loading on the Antitumor Activity of a Monoclonal Antibody Drug Conjugate.</a> Clinical Cancer Research. 10 (20), 7063-7070 (2004).</li>
<li>Chari, R. V. J., Miller, M. L., Widdison, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-Drug+Conjugates%3A+An+Emerging+Concept+in+Cancer+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Antibody-Drug Conjugates: An Emerging Concept in Cancer Therapy.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (15), 3796-3827 (2014).</li>
<li>Chin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+and+Reprogramming+the+Genetic+Code%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Expanding and Reprogramming the Genetic Code.</a> Nature. 550 (7674), 53-60 (2017).</li>
<li>Axup, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+Site-Specific+Antibody-Drug+Conjugates+Using+Unnatural+Amino+Acids%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Synthesis of Site-Specific Antibody-Drug Conjugates Using Unnatural Amino Acids.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (40), 16101-16106 (2012).</li>
<li>Hallam, T. J., Wold, E., Wahl, A., Smider, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+Conjugates+with+Unnatural+Amino+Acids%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Antibody Conjugates with Unnatural Amino Acids.</a> Molecular Pharmaceutics. 12 (6), 1848-1862 (2015).</li>
<li>Tian, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+General+Approach+to+Site-Specific+Antibody+Drug+Conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A General Approach to Site-Specific Antibody Drug Conjugates.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (5), 1766-1771 (2014).</li>
<li>Kern, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+Pyrophosphate+Diesters+as+Tunable%2C+Soluble%2C+and+Bioorthogonal+Linkers+for+Site-Specific+Antibody-Drug+Conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Discovery of Pyrophosphate Diesters as Tunable, Soluble, and Bioorthogonal Linkers for Site-Specific Antibody-Drug Conjugates.</a> Journal of the American Chemical Society. 138 (4), 1430-1445 (2016).</li>
<li>Zimmerman, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Site-Specific+Antibody-Drug+Conjugates+Using+Optimized+Non-Natural+Amino+Acids+in+a+Cell-Free+Expression+System%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Production of Site-Specific Antibody-Drug Conjugates Using Optimized Non-Natural Amino Acids in a Cell-Free Expression System.</a> Bioconjugate Chemistry. 25 (2), 351-361 (2014).</li>
<li>VanBrunt, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+Encoded+Azide+Containing+Amino+Acid+in+Mammalian+Cells+Enables+Site-Specific+Antibody-Drug+Conjugates+Using+Click+Cycloaddition+Chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Genetically Encoded Azide Containing Amino Acid in Mammalian Cells Enables Site-Specific Antibody-Drug Conjugates Using Click Cycloaddition Chemistry.</a> Bioconjugate Chemistry. 26 (11), 2249-2260 (2015).</li>
<li>Xiao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Incorporation+of+Multiple+Unnatural+Amino+Acids+into+Proteins+in+Mammalian+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Genetic Incorporation of Multiple Unnatural Amino Acids into Proteins in Mammalian Cells.</a> Angewandte Chemie International Edition. 52 (52), 14080-14083 (2013).</li>
<li>Milles, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+Strategies+for+Single-Molecule+Protein+Fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Click Strategies for Single-Molecule Protein Fluorescence.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (11), 5187-5195 (2012).</li>
<li>Lallana, E., Riguera, R., Fernandez-Megia, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliable+and+Efficient+Procedures+for+the+Conjugation+of+Biomolecules+through+Huisgen+Azide-Alkyne+Cycloadditions%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Reliable and Efficient Procedures for the Conjugation of Biomolecules through Huisgen Azide-Alkyne Cycloadditions.</a> Angewandte Chemie International Edition. 50 (38), 8794-8804 (2011).</li>
<li>Koehler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Code+Expansion+for+Multiprotein+Complex+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Genetic Code Expansion for Multiprotein Complex Engineering.</a> Nature Methods. 13 (12), 997-1000 (2016).</li>
<li>Lyon, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+Hydrophobicity+of+Homogeneous+Antibody-Drug+Conjugates+Improves+Pharmacokinetics+and+Therapeutic+Index%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Reducing Hydrophobicity of Homogeneous Antibody-Drug Conjugates Improves Pharmacokinetics and Therapeutic Index.</a> Nature Biotechnology. 33 (7), 733-735 (2015).</li>
<li>Elliott, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome+Labeling+and+Protein+Identification+in+Specific+Tissues+and+at+Specific+Developmental+Stages+in+an+Animal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Proteome Labeling and Protein Identification in Specific Tissues and at Specific Developmental Stages in an Animal.</a> Nature Biotechnology. 32, 465-472 (2014).</li>
<li>Ravasco, J. M. J. M., Monteiro, C. M., Trindade, A. F. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2017/qo/c7qo00054e">Cyclopropenes: A New Tool for the Study of Biological Systems.</a> Organic Chemistry Frontiers. 4 (6), 1167-1198 (2017).</li>
<li>Yang, J., Šečkutė, J., Cole, C. M., Devaraj, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-Cell+Imaging+of+Cyclopropene+Tags+with+Fluorogenic+Tetrazine+Cycloadditions%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Live-Cell Imaging of Cyclopropene Tags with Fluorogenic Tetrazine Cycloadditions.</a> Angewandte Chemie International Edition. 124 (30), 7594-7597 (2012).</li>
<li>Oller-Salvia, B., Kym, G., Chin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+Efficient+Generation+of+Stable+Antibody-Drug+Conjugates+via+an+Encoded+Cyclopropene+and+an+Inverse-Electron-Demand+Diels-Alder+Reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Rapid and Efficient Generation of Stable Antibody-Drug Conjugates via an Encoded Cyclopropene and an Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Reaction.</a> Angewandte Chemie International Edition. 57, 2831-2834 (2018).</li>
<li>Schmied, W. H., Elsässer, S. J., Uttamapinant, C., Chin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Multisite+Unnatural+Amino+Acid+Incorporation+in+Mammalian+Cells+via+Optimized+Pyrrolysyl+tRNA+Synthetase%2FtRNA+Expression+and+Engineered+eRF1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Efficient Multisite Unnatural Amino Acid Incorporation in Mammalian Cells via Optimized Pyrrolysyl tRNA Synthetase/tRNA Expression and Engineered eRF1.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (44), 15577-15583 (2014).</li>
<li>Junutula, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-Specific+Conjugation+of+a+Cytotoxic+Drug+to+an+Antibody+Improves+the+Therapeutic+Index%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Site-Specific Conjugation of a Cytotoxic Drug to an Antibody Improves the Therapeutic Index.</a> Nature Biotechnology. 26 (8), 925-932 (2008).</li>
<li>Junutula, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Identification+of+Reactive+Cysteine+Residues+for+Site-Specific+Labeling+of+Antibody-Fabs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid Identification of Reactive Cysteine Residues for Site-Specific Labeling of Antibody-Fabs.</a> Journal of Immunological Methods. 332 (1), 41-52 (2008).</li>
<li>Doronina, S. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+potent+monoclonal+antibody+auristatin+conjugates+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Development of potent monoclonal antibody auristatin conjugates for cancer therapy.</a> Nature Biotechnology. 21 (7), 778-784 (2003).</li>
<li>Shiraishi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Highly+Reactive+Cysteine+Residues+at+Less+Exposed+Positions+in+the+Fab+Constant+Region+for+Site-Specific+Conjugation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of Highly Reactive Cysteine Residues at Less Exposed Positions in the Fab Constant Region for Site-Specific Conjugation.</a> Bioconjugate Chemistry. 26 (6), 1032-1040 (2015).</li>
<li>Sabourin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+Antibody+Yield+and+Modulating+Final+Product+Quality+using+the+Freedom%28TM%29%5BTitle%5D)+AND+%22CHO-S%28TM%29+Production+Platform.+BMC+Proceedings%22%5BJournal%5D)">Increasing Antibody Yield and Modulating Final Product Quality using the Freedom(TM).</a> CHO-S(TM) Production Platform. BMC Proceedings. 5 (8), 102(2011).</li>
<li>Xiao, Y., Gao, X., Maragh, S., Telford, W. G., Tona, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Lines+as+Candidate+Reference+Materials+for+Quality+Control+of+ERBB2+Amplification+and+Expression+Assays+in+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cell Lines as Candidate Reference Materials for Quality Control of ERBB2 Amplification and Expression Assays in Breast Cancer.</a> Clinical Chemistry. 55 (7), 1307-1315 (2009).</li>
<li>Shinmi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-Step+Conjugation+Method+for+Site-Specific+Antibody-Drug+Conjugates+through+Reactive+Cysteine-Engineered+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">One-Step Conjugation Method for Site-Specific Antibody-Drug Conjugates through Reactive Cysteine-Engineered Antibodies.</a> Bioconjugate Chemistry. 27 (5), 1324-1331 (2016).</li>
<li>Badescu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bridging+Disulfides+for+Stable+and+Defined+Antibody+Drug+Conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Bridging Disulfides for Stable and Defined Antibody Drug Conjugates.</a> Bioconjugate Chemistry. 25 (6), 1124-1136 (2014).</li>
<li>Vazquez-Lombardi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+expression+of+human+antibodies+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Transient expression of human antibodies in mammalian cells.</a> Nature Protocols. 13 (1), 99-117 (2018).</li>
<li>Baldi, L., Hacker, D. L., Meerschman, C., Wurm, F. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBaldi%2C+L+%22Protein+Expression+in+Mammalian+Cells%3A+Methods+and+Protocols%22">Protein Expression in Mammalian Cells: Methods and Protocols</a>. Hartley, J. L. , Humana Press. 13-26 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Procedura ekspresji przejściowej w celu wytworzenia trastuzumabu(CypK)2 opisana w tym protokole jest prosta i pozwala na wysoką modułowość. Uzyskane plony mieszczą się w zakresie oczekiwanym w środowisku akademickim27 i można wygenerować stabilne linie komórkowe, aby jeszcze bardziej zwiększyć wydajność produkcji21. Podczas ekspresji stężenia CypK niższe niż 5 mM mogą skutkować mniejszą inkorporacją ncAA, a większe ilości mogą wpływać na wzrost komórek i zmniejszać wydajność przeciwciał. CypK jako wolny aminokwas ma niską rozpuszczalność w wodzie, dlatego należy go najpierw rozpuścić w 100 mM w 0,1 M NaOH, a następnie dodać do pożywki hodowlanej. Po rozcieńczeniu CypK w pożywce i przed dodaniem go do komórek, konieczne jest zneutralizowanie pożywki HCl i przefiltrowanie w celu sterylizacji. Następnie użycie odczynników do transfekcji określonych w niniejszym protokole i przestrzeganie czasów inkubacji zalecanych przez producenta jest ważne dla uzyskania wysokowydajnej ekspresji. Aby uzyskać więcej informacji na temat przejściowej ekspresji ludzkich przeciwciał, czytelnik jest odsyłany do innych opublikowanych protokołów31,32.
Gdy przeciwciało jest oczyszczane, wymagany jest duży nadmiar żywicy białkowej A, jak wskazano, aby zapewnić pełne pobranie przeciwciał z supernatantu. Aby zapobiec wytrącaniu się trastuzumabu podczas elucji, zaleca się stosowanie roztworu o dużej pojemności buforowej, natychmiastowe rozcieńczenie PBS i wymianę buforu, unikając nadmiernego stężenia. Zawsze utrzymuj przeciwciało <5 mg/ml.
Koniugacja trastuzumabu(CypK)2 z tetrazyną-vcMMAE jest szybsza niż większość reakcji zgłaszanych w przypadku innych bioortogonalnych uchwytów dla ADC. Co więcej, cykladdycja ta zachodzi w bardzo łagodnych warunkach: temperaturze pokojowej lub niższym i fizjologicznym pH. Ważne jest, aby rozcieńczyć roztwory podstawowe DMSO reagentów acetonitrylem przed dodaniem PBS i przeciwciała; W przeciwnym razie pochodne tetrazyny wytrącą się. Acetonitryl jest wymagany tylko ze względu na wysoką hydrofobowość MMAE i TAMRA, ale mniej hydrofobowe cząsteczki mogą nie wymagać dodawania współrozpuszczalnika. Alternatywnie, tetrazyna-vcMMAE może być sprzężona bez acetonitrylu i tylko 2 molowych odpowiedników tetrazyny-vcMMAE w ciągu 20 godzin. Ta niewielka ilość toksyny może wiązać się ze znacznym obniżeniem kosztów produkcji ADC w porównaniu z obecnymi technologiami opartymi na ncAA. Trastuzumab(CypK)2 jest w pełni reaktywny przez co najmniej 4 miesiące, gdy jest przechowywany w temperaturze 4 °C.
HPLC-HIC umożliwia dokładne oznaczenie DAR, ponieważ MMAE jest wysoce hydrofobowy i zapewnia doskonałą rozdzielczość pików odpowiadających koniugatom przeciwciał z toksynami 0, 1 i 2. Nieprzereagowany tetrazyna-vcMMAE wymywa się około 13,7 min i jest wykrywany przy 280 nm. Ta technika wymaga materiału wyjściowego o wysokiej czystości. Ponadto nie zaleca się wygaszania reakcji z innymi cząsteczkami reagującymi z tetrazyną, takimi jak BCN-OH, ponieważ mogą one zmieniać czas retencji i kształt pików. Istotne jest, aby stężenie soli w próbkach odpowiadało stężeniu w fazie ruchomej na początku gradientu, aby uzyskać dobrą separację, zwłaszcza jeśli wstrzykuje się więcej niż 10-20 μl.
Jeśli chodzi o analizę LC-MS, deglikozylacja próbek przeciwciał jest wymagana w celu uzyskania pojedynczego piku po dekonwolucji surowego widma. Dokładność całkowitej masy przeciwciał i ADC może się różnić w zależności od kalibracji instrumentu. Stąd, aby obliczyć masę do modyfikacji, odejmij masę uzyskaną dla niezmodyfikowanych przeciwciał od masy uzyskanej dla ADC. Nowoczesne spektrometry mas o wysokiej rozdzielczości powinny zapewniać błąd względny poniżej 1:10000. Chociaż LC-MS można również wykorzystać do obliczenia stosunku między różnymi gatunkami, wartość ta jest zwykle zawyżona, ponieważ modyfikacja może wpłynąć na zdolność jonizacji generowanych gatunków, a niewielkie ilości zanieczyszczeń mogą nie zostać wykryte.
Stabilność łącznika w ADC ma kluczowe znaczenie, ponieważ przedwczesne uwalnianie leku powoduje wyższą toksyczność i niższą skuteczność; Wolna cytotoksyna uszkadza zdrowe tkanki, a nagie przeciwciało konkuruje z uzbrojonym o docelowe miejsca wiązania na chorych komórkach. Należy spodziewać się uwolnienia poniżej 5%, co mieści się w zakresie zmienności testu stabilności.
Wreszcie, selektywność ADC ukierunkowanego na HER2, takiego jak trastuzumab (MMAE) 2 można ocenić, porównując cytotoksyczność w komórkach SK-BR-3 (wysoki HER2) i komórkach MCF-7 (niski HER2), ponieważ te ostatnie wyrażają 15 razy mniej receptorów HER2 niż pierwsze28. Oczekuje się, że immunokoniugat spowoduje, że żywotność komórki będzie co najmniej o 2 rzędy wielkości niższa w SK-BR-3 w porównaniu z MCF-7. EC50 w SK-BR-3 powinien znajdować się w dwucyfrowym zakresie nanomolowym, co odzwierciedla wysoką moc tego ADC29,30. Niezmodyfikowane przeciwciało, trastuzumab(MMAE)2 lub trastuzumab, nie powinno wykazywać toksyczności w tym teście. Tetrazyna-vcMMAE powinna mieć efekt o 3 rzędy wielkości mniejszy niż ADC, ponieważ łącznik usuwa aktywność toksyny peptydomimetycznej. I odwrotnie, ponieważ MMAE jest w stanie przenikać przez błonę komórkową30, powinien mieć podobną toksyczność do ADC, ale nie wykazywać dyskryminacji między liniami komórkowymi o wysokiej i niskiej zawartości HER2. Ponadto, jeśli test ten jest wykonywany po 5-dniowej inkubacji ADC w surowicy, można go użyć do dostarczenia funkcjonalnego dowodu stabilności łącznika: uwolnienie toksyny spowodowałoby albo spadek wydajności ADC w SK-BR-3, jeśli MMAE zostałby uwolniony wraz z częścią łącznika, albo zmniejszenie selektywności, gdyby łącznik został rozszczepiony w sposób bezśladowy.
Opisana w niniejszym dokumencie technologia ADC pozwala na skuteczne i specyficzne dla danego miejsca włączenie cyklopropenowej pochodnej lizyny do IgG1. Po łatwym oczyszczeniu przeciwciała mogą być szybko sprzężone z cząsteczkami zawierającymi tetrazynę, dając jednorodne produkty. Ze względu na mały rozmiar i wysoką reaktywność minimalnego uchwytu cyklopropenu, metoda ta powinna umożliwić koniugację ładunków z utrudnieniami sterycznymi. Powstałe immunokoniugaty są stabilne w surowicy i są bardzo silne i selektywne. Ogólnie rzecz biorąc, CypK umożliwia szybkie, specyficzne dla miejsca i stabilne wiązanie bioortogonalne dla przeciwciał i innych koniugatów białkowych, które można wykorzystać w terapii lub diagnostyce.

Koniugaty przeciwciało-lek (ADC) łączą w sobie selektywność bioterapeutyków i siłę działania małych cząsteczek cytotoksycznych. Większość ADC ma na celu zmniejszenie skutków ubocznych tradycyjnej chemioterapii poprzez ukierunkowanie leków wpływających na polimeryzację DNA lub mikrotubul na komórki nowotworowe1. ADC pierwszej generacji zatwierdzone przez Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) opierają się na modyfikacji lizyn i cystein, która generuje mieszaniny cząsteczek zmodyfikowanych w różnych pozycjach o obniżonych właściwościach farmakokinetycznych 2. W przeciwieństwie do tego, specyficzna dla miejsca koniugacja leków z przeciwciałami może generować związki o ulepszonych właściwościach terapeutycznych3,4. Próbując sprostać wyzwaniu, jakim jest produkcja jednorodnych ADC, zgłoszono kilka selektywnych modyfikacji chemicznych i enzymatycznych1,5. Jednak obecne metody mogą celować tylko w określoną pozycję na przeciwciałie, cierpieć z powodu niskiej ekspresji białka, zapewniać łączniki o niskiej stabilności lub polegać na powolnych i mało wydajnych reakcjach.
Włączenie aminokwasów niekanonicznych (ncAA) poprzez ekspansję kodu genetycznego umożliwia specyficzną dla danego miejsca instalację mnóstwa bioortogonalnych grup reaktywnych w białkach, potencjalnie pokonując ograniczenia innych metod używanych do generowania ADC. Kodowanie ncAA w odpowiedzi na kodon docelowy (stop) opiera się na parach syntetazy aminoacylo-tRNA/tRNA, które są ortogonalne do par endogennych, które zawierają aminokwasy kanoniczne6. Kilka ncAA zostało włączonych do przeciwciał w celu wytworzenia ADC. Jednak większość z nich cierpi z powodu różnych odpowiedzialności za zastosowania w koniugacji leków terapeutycznych. p-acetylofenyloalanina (pAcF)7,8 nie jest w pełni bioortogonalna, wymaga niskiego pH (4,5) i długiego czasu reakcji (> 60 h), podczas gdy azydki, takie jak p-azydofenyloalanina (pAzF)7,9,10, p-azydometylofenyloalanina (pAMF)11 oraz azydkowa pochodna lizyny (AzK)12,13 może być zredukowany w cell14, a miedź używana do katalizowania cykloaddycji Huisgen może indukować uszkodzenia oksydacyjne15.
Chociaż alternatywne ncAA oparte na trans-cyklooktenie (TCO), cyklooktynenie (SCO) i bicyklo[6.1.0]nonen (BCN) zostały ostatnio zakodowane w przeciwciałie do celów bioobrazowania, system ekspresji cierpi z powodu bardzo niskiej wydajności (0,5 mg/L)16. Co więcej, cyklookteny i cyklooktyny są dużymi i hydrofobowymi uchwytami, które mogą zwiększać podatność ADC na agregację -ładunki ADC są tradycyjnie hydrofobowe, a właściwości fizykochemiczne łącznika wykazały, że mają duży wpływ na farmakokinetykę i indeks terapeutyczny17. Natomiast cyklopropeny z podstawieniem 1,3-disubstytucji są małymi grupami reaktywnymi, które powinny powodować minimalne zmiany w strukturze białka i właściwościach fizykochemicznych18. Cyklopropeny selektywnie i szybko reagują z tetrazynami za pośrednictwem cykloaddycji Dielsa-Aldera o odwróconym zapotrzebowaniu na elektrony19. W tym protokole wykorzystujemy pochodną lizyny (CypK, <silna klasa="xfig">Rysunek 1b) zawierającą metylocyklopropen, który jest mniej podatny na przeszkody steryczne niż większe napięte cykle nienasycone i ma stałą szybkość reakcji rzędu 1-30 M-1 s-1 w środowisku wodnym18,20.
Niedawno informowaliśmy, jak włączyć CypK do przeciwciał w celu wytworzenia ADC, reagując tym minimalnym uchwytem bioortogonalnym z cząsteczkami zawierającymi tetrazynę21. Tutaj opisujemy bardziej szczegółowo procedurę przygotowania ADC, kładąc nacisk na najtrudniejsze kroki. Włączenie CypK jest kierowane za pomocą pary syntetazy pirolizylo-tRNA (PylRS) / tRNACUA (PylT) w odpowiedzi na bursztynowy kodon wprowadzony do łańcucha ciężkiego przeciwciała (HC) < klasa sup = "xref">22. Tutaj używamy dwóch plazmidów do transfekcji przejściowej (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1a), jeden kodujący ciężki łańcuch przeciwciała, a drugi kodujący łańcuch lekki (LC), oba zawierające kasetę PylRS / PylT. Alternatywnie, stabilna linia komórkowa, która umożliwia wyższą wydajność przeciwciał, może być wygenerowana za pomocą bardziej pracochłonnej procedury21.
Wyżej wymienione systemy ekspresji mogą wytwarzać terapeutyczny immunoglobulin 1 (IgG1) z CypK na podobnym poziomie jak przeciwciało typu dzikiego. Wybraliśmy pierwszą pozycję domeny CH1 na ciężkim łańcuchu do kodowania ncAA (HC-118TAG). Jest to najczęściej modyfikowana strona w ADCs23 i jest znana jako HC-118 (numeracja UE), ale jest również określana jako HC-121 (pozycja sekwencji) i HC-114 (numeracja Kabat)24. Ponieważ ta pozycja jest zachowana we wszystkich IgG1, te systemy ekspresji powinny być podatne na większość przeciwciał terapeutycznych.
Pokazujemy, że trastuzumab(CypK)2 może być łatwo oczyszczony przez białko A, a następnie przez szybką chromatografię cieczową białek z kolumną do interakcji hydrofobowej (FPLC-HIC). Następnie przeciwciało jest kowalencyjnie łączone w ciągu 3 godzin z inhibitorem polimeryzacji mikrotubul, monometyloaurystatyną E (MMAE), który jest stosowany w zatwierdzonym przez FDA ADC Adcetris. Tutaj używamy benzylo-tetrazynowej pochodnej MMAE (tetrazine-vcMMAE) z łącznikiem składającym się z przekładki glutaranu i składnika proteazy walinowo-cytrulinowej, a następnie jednostki samospalnej p-aminobenzylalkoholu; ten łącznik jest rozszczepiany przez katepsynę B w lizosomie po internalizacji ADC, co powoduje bezśladowe uwalnianie toksyny25. Aby ukazać szeroki zakres reakcji, przeciwciało jest również powiązane z fluoroforem tetrametylorodaminą (TAMRA). Wyjaśniamy, jak zweryfikować tożsamość koniugatu za pomocą chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią mas (LC-MS) oraz obliczyć stosunek leku do przeciwciał (DAR) za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej z kolumną oddziaływania hydrofobowego (HPLC-HIC).
Jako część charakterystyki działania przeciwciał, opisujemy, jak testować stabilność wiązania dihydropirydazyny w ludzkiej surowicy. Parametr ten jest łatwiejszy do oceny w przypadku trastuzumabu-TAMRA, ponieważ można go określić ilościowo za pomocą prostego testu ELISA, a interpretacja wyników nie jest skomplikowana ze względu na labilny składnik proteazy trastuzumabu(MMAE)2. Wreszcie, selektywność i siłę działania trastuzumabu (MMAE)2 ocenia się, porównując cytoksyczność ADC w liniach komórkowych wyrażających różne poziomy HER2. Test ten stanowi również funkcjonalny dowód stabilności ADC, gdy jest wykonywany po inkubacji immunokoniugatu w surowicy ludzkiej.

<table><tbody><tr><td>Expi293F</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A14527</td><td>HEK Zawiesina</td></tr><tr><td>Expi293 Expression Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1435101</td><td>Expression Pożywka</td></tr><tr><td>antybiotykowo-przeciwgrzybicza</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15240062</td><td>Penicylina-streptomycyna-amfoterycyna B</td></tr><tr><td>125 ml Poliwęglanowa kolba Erlenmeyera z nasadką odpowietrzającą</td><td>Corning</td><td>431143</td><td>Wstrząsnąć kolbami</td></tr><tr><td>Inkubator Brunswick S41i</td><td>Eppendorf</td><td>S41I230011</td><td>inkubator CO2 z wytrząsarką</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu 4 mol/l (4 N) w roztworze wodnym</td><td>VWR</td><td>191373M</td><td></td></tr><tr><td>Cyklopropen lizyna</td><td>Sichem</td><td>SC-8017</td><td>W tym badaniu zsyntetyzowano go zgodnie z opisem Elliota i wsp. 2014</td></tr><tr><td>Steriflip-GP, 0,22 i mikro; m, polieterosulfon, napromieniowany promieniami gamma</td><td>Merck Millipore</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM, Pożywka o obniżonej surowicy</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31985070</td><td>Zredukowana pożywka surowicy</td></tr><tr><td>Zestaw do transfekcji ExpiFectamine 293</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A14525</td><td>Odczynnik do transfekcji</td></tr><tr><td>5810 R</td><td>Eppendorf</td><td>5811000460</td><td></td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy Millex-GP, 0,22 i mikro; m, polieterosulfon, 33 mm, sterylizowany promieniami gamma</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Żywica białkowa A</td><td>Sino Biological</td><td>10600-P07E-RN-25</td><td></td></tr><tr><td>Kolumny chromatograficzne Poly-Prep, opakowanie 50</td><td>sztuk Bio-Rad</td><td>7311550</td><td>Kolumna chromatografii polipropylenowej</td></tr><tr><td>Lejek kolumnowy</td><td>Econo-Rad 7310003</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian sodu</td><td>Fluka</td><td>71635</td><td></td></tr><tr><td>&Auml; KTA explorer FPLC</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HiTrap HIC Zestaw selekcyjny</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4110-07</td><td>Zawiera HiTrap 1 mL Butyl HP</td></tr><tr><td>Siarczan amonu</td><td>VWR</td><td>2133.296</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Honywell</td><td>34863-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Tetrazyna-vcMMAE</td><td>ChemPartner</td><td>-</td><td>Costum syntetyzowany</td></tr><tr><td>Tetrazine-5-TAMRA</td><td>Jena Bioscience</td><td>CLK-017-05</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel 1,0 mm x 10 dołków</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>NP0321BOX</td><td></td></tr><tr><td>Xcell SureLock Mini-Cell</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>UltiMate 3000 HPLC</td><td>ThermoFisherScientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific MAbPac, HIC-20, 4,6 x 100 mm, 5 i mikro; m</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>088553</td><td></td></tr><tr><td>PNGase F</td><td>New England BioLabs</td><td>P0704S</td><td></td></tr><tr><td>NanoAcquity</td><td>Waters</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C4 BEH 1-5 & mikro; m Kolumna UPLC 1,0 x 100 mm&nbsp;</td><td>Wody</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe mikropłytki do hodowli komórkowych</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>156545</td><td></td></tr><tr><td>Surowica ludzka</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4522-20mL</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator CO2</td><td>Panasonic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HER2 ECD</td><td>Sino Biological</td><td>10004-HCCH</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TAMRA</td><td>Abcam</td><td>an171120</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2005</td><td></td></tr><tr><td>TMB</td><td>BioLengend</td><td>421101</td><td></td></tr><tr><td>Kwas siarkowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84727-500ML</td><td></td></tr><tr><td>PHERAstar FS</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td>Czytnik płytek</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5671-500ML</td><td></td></tr><tr><td>SK-BR-3</td><td>ATCC</td><td>HTB-30</td><td></td></tr><tr><td>MCF-7</td><td>ATCC</td><td>Test HTB-22</td><td></td></tr><tr><td>CellTiterGlo 2.0</td><td>Promega</td><td>G9242</td><td>Test żywotności komórek oparty na pomiarze ATP uwalnianego po lizie komórek. Sygnałem wyjściowym jest luminescencja.</td></tr><tr><td>Monomethyl Auristatin E</td><td>Cayman Chemical</td><td>16267</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>ThermoFisherScientific</td><td></td><td>Spektrofotometr mikroobjętościowy</td></tr><tr><td>Ludzka IgG ELISA Quantificaiton Set</td><td>Bethyl</td><td>E80-104</td><td></td></tr><tr><td>MaxEnt1 w wodach MassLynx</td><td>Aplikacja</td><td></td><td>programowa do dekonwolucji widma masowego</td></tr><tr><td>IntantBlue</td><td>Expedeon</td><td>ISB1L</td><td>Bejca na bazie Coomassie</td></tr><tr><td>Nienaruszony zestaw MMAE-ADC ELISA (test kanapkowy)</td><td>Epitope Diagnostics, Inc.</td><td>KTR 782</td><td></td></tr><tr><td>Rurka 50 mL, 114x28mm, PP</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td>Rurka stożkowa</td></tr><tr><td>Filtry odśrodkowe Amicon Ultra-15 50 000 NMWL</td><td>Merck</td><td>UFC905024</td><td>Koncentrator filtracji odśrodkowej (po wycofaniu białka A)</td></tr><tr><td>Filtry odśrodkowe Amicon Ultra-4 50 000 NMWL</td><td>Merck</td><td>UFC805024</td><td>Koncentratory filtracji odśrodkowej (po oczyszczeniu FPLC lub HPLC)</td></tr><tr><td>Kolumny odsalające Zeba Spin, 7K MWCO, 0,5 ml</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>89882</td><td>Wykluczające rozmiar kolumny wirowe</td></tr><tr><td>Probówka PCR 0,2 ml Płaska czapka</td><td>Thistle Scientific Ltd</td><td>Probówki do PCR AX-PCR-02-C-CS</td><td></td></tr><tr><td>Nunc MaxiSorp&ordf; płaskodenne</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>44-2404-21</td><td>Płytki do ELISA</td></tr></tbody></table>

kodowanie genetyczne niekanonicznego aminokwasu do wytwarzania koniugatów przeciwciało-lek w drodze szybkiej reakcji bioortogonalnej

Genetic Encoding of a Non-Canonical Amino Acid for the Generation of Antibody-Drug Conjugates Through a Fast Bioorthogonal Reaction

Koniugaty przeciwciało-lek (ADC) używane obecnie w praktyce klinicznej to mieszaniny cząsteczek przeciwciał połączonych z różną liczbą toksyn w różnych pozycjach. Badania przedkliniczne wykazały, że indeks terapeutyczny tych tradycyjnych ADC może być poprawiony przez specyficzne dla miejsca wiązanie toksyn. Jednak obecne podejścia do produkcji jednorodnych ADC mają kilka ograniczeń, takich jak niska ekspresja białka i powolna kinetyka reakcji. W tym protokole opisujemy, jak skonfigurować system ekspresji w celu włączenia pochodnej cyklopropenu lizyny (CypK) do przeciwciał za pomocą ekspansji kodu genetycznego. Ten minimalny bioortogonalny uchwyt umożliwia szybką koniugację pochodnych tetrazyny poprzez cykloaddycję Dielsa-Aldera o odwrotnym zapotrzebowaniu. Opisany tutaj system ekspresji umożliwia łatwą produkcję i oczyszczanie trastuzumabu zawierającego CypK w każdym z łańcuchów ciężkich. Wyjaśniamy, jak połączyć przeciwciało z toksyną monometyloaurystatyną E i scharakteryzować immunokoniugat za pomocą chromatografii oddziaływań hydrofobowych i spektrometrii mas. Na koniec opisujemy testy oceniające stabilność w ludzkiej surowicy wiązania dihydropirydazynowego wynikającego z koniugacji oraz testujące selektywną cytotoksyczność ADC dla komórek raka piersi z wysokimi poziomami receptora HER2.

Opisany system ekspresji przejściowej (Rysunek 1a) pozwala na uzyskanie 22 ± 2 mg trastuzumabu(CypK)2 na litr pożywki hodowlanej, co stanowi 2/3 ilości przeciwciała typu dzikiego produkowanego w tych samych warunkach (Rysunek 1c). Stabilna linia komórkowa może zwiększyć tę wydajność do 31 ± 2 mg/L21.
Trastuzumab(CypK)2 można koniugować z tetrazyną-vcMMAE, co pozwala na otrzymanie quasi-homogenicznego trastuzumabu(MMAE)2 w ciągu 3 h w temperaturze 25 °C (Rycina 2). Wysoka hydrofobowość tej cytotoksyny wymaga dodania 10% acetonitrylu, gdy stosowane są 5 lub więcej ekwiwalentów molowych toksyny na CypK. Alternatywnie, cykloaddycja kończy się również w ciągu 20 h przy użyciu 2 ekwiwalentów tetrazyny-vcMMAE bez dodatku acetonitrylu (Rycina 2c). Trastuzumab(CypK)2 reaguje z tetrazyną-TAMRA w ciągu 2 h w temperaturze 25 °C, natomiast przy obniżeniu temperatury do 4 °C wymagane jest od 3 do 6 h (Rycina 3c).
Oczekiwany DAR dla trastuzumab(MMAE)2 mierzony za pomocą HPLC-HIC wynosi 1,9 (Rysunek 2b). Pik początkowo obserwowany na chromatogramie w 8,0 min reprezentuje nie sprzężone przeciwciało (DAR 0) i powinien całkowicie zniknąć po zakończeniu reakcji. Frakcja o DAR 1 eluje w czasie 9,1-9,6 min i powinna mieć pole &lt; 10% po 3 h; natomiast produkt docelowy o DAR 2 ma czas retencji 10,5-11,0 z oczekiwanym polem &gt; 90%. Przesunięcie mobilności oraz fluorescencja w żelach SDS-PAGE potwierdzają wbudowanie TAMRA (Rysunek 3b), a tożsamość immunokoniugatów zostaje zweryfikowana za pomocą LC-MS (Rysunek 2d-e oraz Rysunek 3d).
Inkubacja trastuzumabu(TAMRA)2 przez 5 dni w ludzkiej surowicy i następująca po niej analiza metodą ELISA potwierdzają, że ładunek pozostaje przyłączony do przeciwciała (Rysunek 4b). W teście cytotoksyczności trastuzumab(MMAE)2 wykazuje wysoką aktywność w komórkach raka piersi SK-BR-3 (wysoka ekspresja HER2), z połową maksymalnego stężenia efektywnego (EC50) wynoszącą 55 ± 10 pM (Rysunek 4d). Trastuzumab(MMAE)2 zachowuje cytotoksyczność po 5 dniach inkubacji w ludzkiej surowicy (Rysunek 4c). Przeciwnie, gdy ADC jest testowany na komórkach MCF-7 (niska ekspresja HER2), wartość EC50 jest 200-krotnie niższa (Rysunek 4d). Przeciwciało typu dzikiego, trastuzumab(CypK)2 oraz tetrazyna-vcMMAE wykazują niezwykle niską toksyczność (Rysunki 4d i 4e), podczas gdy MMAE wykazuje wysoką nieselektywną cytotoksyczność w obu liniach komórkowych (Rysunek 4e).
<img alt="Schemat wektora ekspresji genów, struktura chemiczna, wykres słupkowy; porównanie ekspresji trastuzumabu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58066/58066fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rycina 1: System ekspresji przejściowej. A. Istotne regiony plazmidów wykorzystanych do transfekcji przejściowej w komórkach HEK293. CMV: promotor cytomegalowirusa, WPRE: posttranskrypcyjny element regulacyjny wirusa zapalenia wątroby świstaka, PylT: tRNA pyrrolizyny, U6: promotor specyficzny, PylRS: syntetaza tRNA pyrrolizyny. &gt; i &lt;kierunek transkrypcji. B. Nε-[((2-metylocykloprop-2-en-1-ylo)metoksy)karbonylo]-L-lizyna (CypK). C. Wydajność ekspresji trastuzumabu typu dzikiego (WT) oraz trastuzumabu(CypK)2 pomiar wykonano metodą western blot po oczyszczaniu za pomocą białka A. Słupki błędu reprezentują odchylenie standardowe trzech powtórzeń biologicznych. Rycina została zmodyfikowana za zgodą Oller-Salvia i wsp. 201821. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58066/58066fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ilustracji.</a>
<img alt="Synteza i analiza tetrazyny-vcMMAE; struktura chemiczna, profile HPLC, wykres konwersji w czasie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58066/58066fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Koniugacja trastuzumabu(CypK)2 z tetrazyną-vcMMAE. A. Cykloaddycja Dielsa-Aldera z odwróconym zapotrzebowaniem na elektrony między resztą CypK w przeciwciałe a pochodną tetrazyny MMAE. Grupy reagujące są zaznaczone na czerwono, alkohol p-aminobenzylowy przedstawiono na zielono, a dipetyd walina-cytrulina na niebiesko. B. Chromatogramy HPLC-HIC pokazujące przebieg koniugacji przeciwciała. C. Stopień konwersji w stosunku do maksymalnego DAR wynoszącego 1,9 przy użyciu różnych stężeń odczynników. D-E. Dekonwolucyjne spektra mas pełnowymiarowego przeciwciała przed i po koniugacji. Trastuzumab(CypK)2 otrzymano z wykorzystaniem stabilnej linii komórkowej. Rysunek został zmodyfikowany za zgodą Oller-Salvia et al. 201821. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58066/58066fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Reakcja chemiczna, analiza białek i wyniki danych: schemat syntezy, elektroforeza, wykres kinetyki." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58066/58066fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Koniugacja trastuzumabu(CypK)2 z tetrazyną-TAMRA. A. Cykloaddycja Dielsa-Aldera z odwróconym zapotrzebowaniem elektronowym pomiędzy resztą CypK w przeciwciałach a pochodną tetrazyny TAMRA. B. Żele SDS-PAGE wykazujące zmianę mobilności oraz fluorescencję w żelu wynikającą z koniugacji TAMRA. C. Kinetyka koniugacji w dwóch różnych temperaturach. D. Dekonwolucyjne widmo mas trastuzumabu(TAMRA)2. Trastuzumab(CypK)2 został otrzymany z wykorzystaniem stabilnej linii komórkowej. Rycina została zmodyfikowana za zgodą Oller-Salvia et al. 201821. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58066/58066fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres celowania w HER2, diagram przedstawiający skuteczność leku w odniesieniu do żywotności komórek nowotworowych w zależności od stężenia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58066/58066fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Stabilność w surowicy i cytotoksyczność koniugatów trastuzumabu. A. Schemat wyróżniający cechy pożądane w internalizującym ADC. B. Stabilność trastuzumab(TAMRA)2 w ludzkiej surowicy zmierzona za pomocą testu ELISA. C. Test żywotności komórek z zastosowaniem trastuzumab(MMAE)2 po 5 dniach w ludzkiej surowicy (+ serum, czarny). W tym samym teście uwzględniono próbkę kontrolną inkubowaną w PBS zamiast surowicy (- serum, czerwony). D. Test żywotności komórek z zastosowaniem świeżo rozcieńczonych próbek przeciwciał. E. Test żywotności komórek z zastosowaniem świeżo rozcieńczonych pochodnych MMAE. Słupki błędów reprezentują błąd standardowy średniej z 3 niezależnych eksperymentów. Rycina została zmodyfikowana za zgodą Oller-Salvia et al. 201821. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58066/58066fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Włączenie pochodnej cyklopropenu lizyny do przeciwciał pozwala na specyficzne dla miejsca, szybkie i efektywne połączenie cząsteczek zawierających tetrazynę w celu wytworzenia koniugatów przeciwciało-lek.

Kodowanie genetyczne niekanonicznego aminokwasu do wytwarzania koniugatów przeciwciało-lek w drodze szybkiej reakcji bioortogonalnej

Antibody-drug conjugates (ADCs) used nowadays in clinical practice are mixtures of antibody molecules linked to a varying number of toxins at different ...

Metoda ta stanowi ważne narzędzie w dziedzinie modyfikacji białek, umożliwiając łatwe i wydajne wytwarzanie koniugatów przeciwciał z lekami. Głównymi zaletami tej techniki są łatwość obsługi, wysoka wydajność produkcji przeciwciał, szybkość reakcji psychodyzyjnej i stabilność utworzonego wiązania. Rozpocznij tę procedurę od wyhodowania komórek zawiesiny HEK zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Po osiągnięciu gęstości 2,5 miliona komórek na mililitr należy przygotować świeży roztwór cyklopropenowej pochodnej lizyny lub CpK w 1 molowym wodorotlenku sodu. Dodaj 2,5 mililitra CpK do pożywki ekspresyjnej uzupełnionej antybiotykami. Dobrze wymieszaj roztwór i dodaj 250 mikrolitrów jednego molowego HCl, a następnie wysterylizuj roztwór za pomocą filtra 22 mikronów.Teraz odwiruj 125 milionów komórek o docelowej gęstości przez pięć minut przy 500 x g. Po odwirowaniu dodać mieszaninę odczynnika do transfekcji DNA do pożywki ekspresyjnej zawierającej CpK i użyć tej pożywki do ponownego zawieszenia komórek. Sześć do siedmiu dni po dodaniu CpK należy pobrać trastuzumab zawierający przeciwciała CpK z supernatantu, odwirowując komórki przez 15 minut w temperaturze 3 000 x g.Następnie przefiltruj supernatant. Teraz dodaj 5x bufor do płukania kulek w 250 mililitrowych stożkowych probówkach i wymieszaj z supernatantem i dodaj wstępnie zrównoważoną żywicę białkową A. Umieścić stożkową rurkę na wałku na trzy godziny w temperaturze pokojowej, aby ściągnąć przeciwciało i supernatant.Po inkubacji przenieść żywicę białka A z supernatantem do kolumny i pozwolić cieczy przepłynąć. Następnie dodaj 25 mililitrów buforu do mycia i pozwól mu przepłynąć. Dodać jeden mililitr jednego molowego buforu fosforanowego, 150 milimolowy chlorek sodu do probówki zbiorczej i wymyć przeciwciało czterema mililitrami 1 molowego cytrynianu sodu o pH 3.Kwaśny roztwór jest natychmiast neutralizowany po opuszczeniu kolumny przez roztwór zasadowy już obecny w probówce zbiorczej. Następnie rozcieńczyć przeciwciało 10 mililitrami PBS. Stężyć przeciwciało do 5 do jednego mililitra przez filtrację odśrodkową i trzykrotnie wymienić bufor na PBS.Oczyść próbki za pomocą FPLC przy użyciu kolumny do oddziaływania butylohydrofobowego z gradientem od zera do 100% buforu o niskiej zawartości soli w buforze o wysokiej zawartości soli przez 30 minut. Zbierz wszystkie frakcje i monitoruj elucję przy 280 nanometrach. Zagęścić frakcje zawierające przeciwciało przez filtrację odśrodkową i trzykrotnie wymienić bufor na PBS.Przeciwciało może być następnie przechowywane w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Monometyloaurystatyna E lub MMAE jest wysoce toksyczna. Dlatego podczas obchodzenia się z pochodnymi MMAE należy używać rękawic i okularów.W przypadku stosowania niemodyfikowanego MMAE jako kontroli, podczas przygotowywania roztworu podstawowego w MSO należy obchodzić się z produktem stałym w dygestorium. Aby sprzęgnąć przeciwciało z cząsteczką zawierającą tetrazynę, rozcieńczyć 10 molowych równoważników tetrazyny MMAE na przeciwciało za pomocą 20 mikrolitrów acetonitrylu i 76 mikrolitrów PBS w małej stożkowej probówce. Dodać jeden molowy odpowiednik trastuzumabu z łożyskiem CPK.Dokładnie wymieszać i pozostawić na trzy godziny w reakcji w temperaturze pokojowej, aby wytworzyć trastuzumab połączony z MMAE. Cząsteczki inne niż MMAE, potencjalnie większe i bardziej utrudnione sterycznie, można połączyć z przeciwciałem za pomocą tego protokołu. Dodać całą objętość reakcji do kolumny wirowej i odwirować przy 1500 x g przez jedną minutę.Aby przeanalizować koniugate, należy zrównoważyć kolumnę HPLC HIC ze 100% buforem o wysokiej zawartości soli przez pięć minut. Następnie wymieszaj 15 mikrolitrów jednego miligrama na mililitr roztworu trastuzumabu połączonego z MMAE z 15 mikrolitrami buforu 2X o wysokiej zawartości soli w fiolce. Wstrzyknąć mieszaninę do kolumny HPLC.Elucja w izokratycznym przepływie jednego mililitra na minutę ze 100% buforem o wysokiej zawartości soli przez jedną minutę. Następnie wykonaj 15-minutowy gradient od 100 do zera procent buforu o wysokiej zawartości soli w buforze o niskiej zawartości soli. Monitoruj elucję przy 280 nanometrach.Zintegrować piki na chromatogramie o czasach retencji 7,5, 9,2 i 11,5 minuty, które odpowiadają trastuzumabowi odpowiednio z zerem, jednym i dwoma sprzężonymi toksynami. Teraz oblicz DAR, sumując obszary szczytów w 9,2 minuty, co ma wagę jeden, i 10,5 minuty, która ma wagę dwóch, i podziel przez całkowitą powierzchnię trzech szczytów. Aby przeanalizować koniugat za pomocą LC-MS, najpierw odglikozyluj 30 mikrolitrów jednego miligrama na mililitr ADC i niezmodyfikowane przeciwciało w warunkach nieredukcyjnych, używając 250 jednostek PNGazy F przez co najmniej sześć godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Rozmrozić serum i przefiltrować je przez filtr o grubości 22 mikronów. Następnie napełnij wodą zewnętrzne studzienki 96-dołkowej płytki. W studzienkach centralnych wymieszać trzykrotnie 90 mikrolitrów surowicy z 10 mikrolitrami jednego miligrama na mililitr trastuzumabu tetrametylorodaminy w PBS w końcowym stężeniu 1 miligrama na mililitr.Umieść płytkę w inkubatorze nasyconym wilgocią o temperaturze 37 stopni Celsjusza i czterema procentami CO2. Co 24 godziny przez pięć dni dokładnie odpipetować każdą studzienkę, aby wymieszać i pobrać porcję o pojemności pięciu mikrolitrów. Błyskawiczne zamrożenie podwielokrotności ciekłym azotem i przechowywanie w temperaturze 80 stopni Celsjusza.Po zebraniu wszystkich próbek rozmrozić podwielokrotności i przeanalizować je za pomocą pośredniego testu ELISA, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Alternatywnie do pomiaru stężenia ADC można użyć komercyjnego zestawu ELISA. Dwa dni przed badaniem napełnij wodą zewnętrzne studzienki 96-dołkowej płytki.Następnie podnieś komórki za pomocą 05% trypsyny w 5-milimolowym EDTA. Odwirować komórki przez trzy minuty przy 250 x g i ponownie zawiesić w nowym podłożu. Następnie wysiewaj 3 000 komórek w 100 mikrolitrach na studzienkę na 96-dołkowych płytkach i umieść je z powrotem w inkubatorze.Dwa dni po wysianiu komórek należy przygotować seryjne rozcieńczenia wszystkich próbek w trzech egzemplarzach z 1% DMSO w kompletnym pożywce. Teraz dodaj 100 mikrolitrów każdej próbki do każdej studzienki i inkubuj przez pięć dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza i czterech procentach CO2. Piątego dnia zmierz żywotność komórek.W tym celu należy użyć komercyjnego zestawu do lizy komórek i pomiaru uwolnionego ATP. Wykreślić procent sygnału w odniesieniu do komórek kontrolnych traktowanych 1% DMSO. ADC można inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć dni w surowicy i oznaczać cytotoksyczność w celu udowodnienia stabilności funkcjonalnej.Przeciwciało z uchwytem cykloprofenowym można uzyskać przy użyciu tej procedury z wydajnością powyżej 20 miligramów na litr po oczyszczeniu białka A. Wytworzone przeciwciało może być szybko i swoiście skoncentrowanego na miejscu sprzężone z toksyną zawierającą tetrazynę. Po sprzężeniu przeciwciała z toksyną średni stosunek leku do przeciwciała jest większy niż 1,9, mierzony za pomocą chromatografii oddziaływań hydrofobowych.Tożsamość ADC potwierdza się za pomocą spektrometrii mas. Powstałe wiązanie dihydropirydyzenu jest stabilne w ludzkiej surowicy przez ponad pięć dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Koniugat przeciwciała jest silny i selektywnie zabija komórki z wysokim poziomem HER2, a nie komórki z niskim poziomem HER2.Ponadto przeciwciało bez toksyny i toksyna zmodyfikowana łącznikiem tetrazyny mają bardzo niską toksyczność. Sama toksyna wykazuje toksyczność niezależną od HER2, co podkreśla potrzebę celowania w celu osiągnięcia selektywności. Po tej procedurze możemy szybko i sprawnie przygotować koniugaty przeciwciał z lekami do leczenia nowotworów.Potencjalnie każdy lek funkcjonalizowany tetrazyną może być powiązany z dowolnym przeciwciałem skierowanym przeciwko biomarkerowi komórki rakowej. Implikacje tej techniki rozciągają się na każdy koniugat białkowy przeznaczony do terapii lub diagnozy.

genetic-encoding-non-canonical-amino-acid-for-generation-antibody

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Ten film demonstruje hydrofobową charakterystykę koniugatów przeciwciało-lek opartą na chromatografii cieczowej. Korzystając z kolumny chromatograficznej opartej na ligandzie butylowym, koniugaty przeciwciało-lek są charakteryzowane poprzez oddziaływania hydrofobowe z ligandem.

Chromatografia cieczowa oddziaływań hydrofobowych zależnych od butylu: technika charakteryzowania koniugatów przeciwciało-lek na podstawie oddziaływań hydrofobowych

Kodujemy genetycznie nienaturalny aminokwas, p-azydo-L-fenyloalaninę w różnych docelowych miejscach w GPCR i pokazujemy wszechstronność grupy azydologicznej w różnych zastosowaniach. Obejmują one ukierunkowaną technologię fotosieciowania w celu identyfikacji reszt w kieszeni wiążącej ligand GPCR oraz specyficzną dla miejsca bioortogonalną modyfikację GPCR za pomocą znacznika peptydowo-epitopowego lub sondy fluorescencyjnej.

Genetycznie kodowane sondy molekularne do badania receptorów sprzężonych z białkiem G

Tutaj przedstawiono procedurę selektywnej aktywacji białka neuronalnego za pomocą krótkiego impulsu światła poprzez genetyczne kodowanie fotoreaktywnego nienaturalnego aminokwasu do docelowego białka neuronalnego wyrażanego w neuronach w hodowli lub in vivo.

Optyczna kontrola białka neuronalnego za pomocą genetycznie kodowanego nienaturalnego aminokwasu w neuronach

Łatwy w użyciu, bezkomórkowy protokół ekspresji do specyficznego dla reszty włączania niekanonicznych analogów aminokwasów do białek, w tym dalszej analizy, jest prezentowany do badań medycznych, farmaceutycznych, strukturalnych i funkcjonalnych.

Specyficzne dla reszt włączenie aminokwasów niekanonicznych do białek modelowych przy użyciu bezkomórkowego systemu transkrypcyjno-translacyjnego Escherichia coli

Tutaj prezentujemy protokół specyficznego dla danego miejsca wprowadzania sond chemicznych do fragmentu przeciwciała poprzez genetyczne włączenie aminokwasu zawierającego azydek, a następnie sprzężenie azydu z sondą chemiczną za pomocą promowanej przez szczep cykloaddycji azydkowo-alkinowej (SPAAC).

Skuteczne i specyficzne dla miejsca znakowanie przeciwciał przez cykloaddycję azydowo-alkinową promowaną przez szczep

Biologia syntetyczna umożliwia inżynierię białek o niespotykanych dotąd właściwościach przy użyciu kotranslacyjnej insercji aminokwasów niekanonicznych. Tutaj przedstawiliśmy, w jaki sposób spektralnie przesunięty ku czerwieni wariant fluoroforu typu GFP o nowych właściwościach spektroskopowych fluorescencji, określany jako "złote" białko fluorescencyjne (GdFP), jest wytwarzany w E. coli poprzez selektywne włączenie ciśnienia (SPI).

Inżynieria "złotej" fluorescencji poprzez selektywne wprowadzanie ciśnieniowe aminokwasów niekanonicznych oraz analiza białek za pomocą spektrometrii mas i fluorescencji

Przedstawiono łatwy test fluorescencyjny w celu oceny skuteczności par syntetazy amino-acyl-tRNA/tRNA zawierających niekanoniczne aminokwasy (ncAA) do białek ulegających ekspresji w komórkach ssaków. Opisano zastosowanie ncAA do badania receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR), w tym fotosieciowanie miejsc wiązania i bioortogonalne znakowanie GPCR na żywych komórkach.

Optymalizacja genetycznego włączenia sond chemicznych do GPCR w celu mapowania fotosieciowania i chemii bioortogonalnej w żywych komórkach ssaków

Tutaj prezentujemy protokół genetycznej inkorporacji L-dihydroksyfenyloalaniny zsyntetyzowanej z prostych materiałów wyjściowych i jej zastosowania do koniugacji białek.

Genetyczna inkorporacja biosyntetyzowanej L-dihydroksyfenyloalaniny (DOPA) i jej zastosowanie do koniugacji białek

W tym protokole opiszemy syntezę PODS, odczynnika na bazie fenyoksadiazolylu metylosulfonu do selektywnego przyłączania ładunków do tioli biomolekuł, szczególnie przeciwciał. Ponadto opiszemy syntezę i charakterystykę dwufunkcyjnego chelatora nośnego POD oraz jego koniugację z modelowym przeciwciałem.

Synteza i biokoniugacja odczynników tiolowo-reaktywnych do tworzenia immunokoniugatów modyfikowanych selektywnie

Rozszerzenie kodu genetycznego jest stosowane do wprowadzenia nienaturalnego aminokwasu posiadającego biorthogonalną grupę funkcyjną na białku nośnikowym w określonym miejscu. Funkcja biortogalna jest dalej wykorzystywana do selektywnego sprzęgania antygenu węglowodanowego w celu uzyskania jednorodnej szczepionki skoniugowanej glikokoniugatem.

Jednorodny glikokoniugat wytwarzany przez połączenie nienaturalnej inkorporacji aminokwasów i chemii kliknięć do celów szczepionkowych

Naucz się modyfikować przeciwciała z wykorzystaniem pochodnej cyklopropenu lizyny do produkcji koniugatów przeciwciało-lek. Ta metoda zapewnia wysoką wydajność i stabilność wiązań w terapii celowanej.

Kodowanie genetyczne niekanonicznego aminokwasu do wytwarzania koniugatów przeciwciało-lek w drodze szybkiej reakcji bioortogonalnej (Wideo) | JoVE Journal

Kodowanie genetyczne niekanonicznego aminokwasu do wytwarzania koniugatów przeciwciało-lek w drodze szybkiej reakcji bioortogonalnej

Przeglądaj więcej filmów