Name: In vitro Tworzenie zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili u psów: analiza dynamiczna i ilościowa za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-24T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Poznaj metodę izolacji neutrofili z krwi psów i wizualizacji tworzenia NET za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Technika umożliwia ilościową analizę citH3 w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autor korespondencyjny został ufundowany przez Morris Animal Foundation (D15CA-907). Badanie było wspierane przez fundusze Uniwersytetu Kalifornijskiego w Davis, Center for Equine Health i Center for Companion Animal Health (2016-24-F). Autorzy chcieliby podziękować Geenie Ng za pomoc przy figurkach oraz Nghi Nguyen za pomoc przy filmie.

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Kalifornijskim w Davis (numer protokołu: 18338).
1. Pobieranie krwi
<ol>
	<li>Pobrać 10 ml krwi z żyły głowowej lub szyjnej za pomocą igły 21 G za pomocą aspiracji strzykawki.</li>
	<li>Aby uniknąć nadmiernego naprężenia ścinającego, należy wyjąć igłę ze strzykawki przed przeniesieniem krwi do probówki (probówek) zawierającej heparynę sodową (75 USP). Delikatnie odwróć probówki kilka razy, aby zapewnić odpowiednie wymieszanie antykoagulantu i krwi. Przed umieszczeniem próbek na lodzie należy sprawdzić, czy nie ma śladów zakrzepów lub agregatów krwinek czerwonych.</li>
</ol>
2. Izolacja neutrofili
<ol>
	<li>Rozcieńczyć antykoagulowaną krew równą objętością lodowatego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dubecco (pH 7,4, bez kationów dwuwartościowych). Przenieść 8 ml rozcieńczonej krwi do 50 ml polipropylenowej probówki stożkowej zawierającej 25 ml 3% dekstranu (z Leuconostoc spp. rozpuszczonego w 0,9% roztworze chlorku sodu). Umieść probówkę pionowo w temperaturze pokojowej na 30 minut, aby umożliwić agregację i sedymentację erytrocytów.</li>
	<li>Ostrożnie ułóż 5 ml osocza bogatego w leukocyty (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1) na wierzchu 5 ml pożywki o gradiencie gęstości w 14 ml polipropylenowej probówce okrągłodennej. Uważaj, aby nie pomieszać 2 roztworów11.</li>
	<li>Odwirować probówki przy 400 x g z przyspieszeniem/opóźnieniem (A/D) ustawionym na 0 (brak hamulca) przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml zebrać warstwę komórek granulocytów, omijając warstwy komórek jednojądrzastych osocza i krwi obwodowej (PBMC) (<silna klasa = "xfig">Ryc. 1). Za każdym razem należy używać nowej pipety, aby zminimalizować zanieczyszczenie.</li>
	<li>Umieścić od 4 do 6 ml warstwy komórek polimorfonuklearnych (PMN) w stożkowej probówce polipropylenowej o pojemności 50 ml. Ponieważ niewielka ilość agregatów erytrocytów może być odessana wraz z warstwą PMN, należy użyć pipety serologicznej o pojemności 1 ml, aby delikatnie usunąć agregaty erytrocytów, które osadzają się na dnie probówki.</li>
	<li>Lizę pozostałych erytrocytów należy zalać 20 ml zimnej ultraczystej wody. Delikatnie odwróć probówkę wiele razy przez 30 do 60 sekund, aby zapewnić odpowiednią lizę przed dodaniem równej objętości lodowatego 1,8% roztworu chlorku sodu.</li>
	<li>Wirować przy 112 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, A/D ustawionej na 0.</li>
	<li>Powtórz etap lizy erytrocytów, jeśli ta osadka wydaje się czerwona. Ostrożnie odrzucić supernatant pipetą serologiczną i delikatnie zawiesić osad w 100 μl DPBS (5 mM dekstroza, 0,9 mM MgCl2, 1,9 mM CaCl2 i 1% albumina surowicy bydlęcej, pH 7,3). Połącz wszystkie zawieszone komórki i umieść na lodzie.</li>
	<li>Wykonaj zliczanie komórek za pomocą automatycznego analizatora komórek i zweryfikuj liczbę za pomocą hemocytometru. W razie potrzeby skoncentrować PMN na szkiełku za pomocą cytowirówki (1000 obr./min, 5 min) i określić procent neutrofili, licząc liczbę neutrofili w całkowitej liczbie komórek.</li>
	<li>Określ żywotność neutrofili, wykonując test wykluczenia błękitu trypanowego, jak opisano przez Strobera i wsp.12 Udana izolacja powinna przynieść żywotność od 95 do 100%, a neutrofile powinny być większe niż 95%.</li>
	<li>Określ stężenie neutrofili, mnożąc całkowitą liczbę komórek przez procent żywotności i procent neutrofili. Udana izolacja powinna dać stężenie neutrofili od 1,5 do 6 x 106/ml.</li>
	<li>Rozcieńczyć neutrofile do końcowego stężenia 1 x 106/ml za pomocą DPBS zawierającego 5 mM dekstrozy, 0,9 mM MgCl2, 1,9 mM CaCl2 i 1% albuminę surowicy bydlęcej o pH dostosowanym do 7,3.</li>
</ol>
3. Mikroskopia fluorescencyjna żywych neutrofili
<ol>
	<li>Umieścić od 200 do 400 μl neutrofili (1 x 106/ml) w każdym dołku 12-dołkowej płytki hodowlanej pokrytej poli-L-lizyną. Pozwolić, aby neutrofile przylegały do dna studzienek, inkubując komórki w temperaturze 37 °C przez 30 minut.</li>
	<li>Oznaczyć kwasy nukleinowe 1 μM jednym z dwóch barwników kwasu nukleinowego, jednego, który barwi komórki z nienaruszonymi błonami, a drugiego, który barwi komórki z przepuszczalnymi błonami (patrz tabela materiałów), przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Aktywuj neutrofile za pomocą 100 μg/ml lipopolisacharydu (LPS) (E. coli O55. B5), 100 nM 12-mirystynianu 13-octanu forbolu (PMA) jako kontroli dodatniej lub równoważnej objętości DPBS jako kontroli ujemnej przez 180 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Uzyskuj obrazy za pomocą kanałów GFP (wzbudzenie: 470/22 nm, emisja: 525/50 nm) i Texas Red (wzbudzenie: 585/29 nm, emisja: 628/32 nm) na mikroskopii fluorescencyjnej przy 40-krotnym powiększeniu w następujących punktach czasowych: 30, 90, 120 i 180 min.</li>
</ol>
4. Kwantyfikacja NET i wykrywanie składników NET za pomocą immunofluorescencji
<ol>
	<li>Ostrożnie umieścić szkiełka pokrywowe pokryte poli-D-lizyną o średnicy 18 mm w dołkach 12-dołkowej płytki hodowlanej. Odpowiednio oznacz studzienki.</li>
	<li>Wysiać 100–200 μl wyizolowanych neutrofili (1 x 106/ml) bezpośrednio na szkiełka nakrywkowe i pozwolić neutrofilom przylgnąć do szkiełek nakrywkowych poprzez inkubację komórek w temperaturze 37 °C przez 30 minut.</li>
	<li>Aktywować neutrofile zgodnie z opisem w ppkt 3.3. Hamować tworzenie NET poprzez wstępne traktowanie neutrofili 200 μΜ Cl-amidyną (15 min, 37 °C) przed aktywacją, jak opisano wcześniej przez Li i wsp.13 Upewnij się, że w eksperymencie uwzględniono właściwą kontrolę pojazdu (DMSO).</li>
	<li>Ostrożnie usuń szkiełka nakrywkowe za pomocą cienkich kleszczyków. Ułóż arkusz folii parafinowej na stojaku na probówkę, aby utworzyć płytkie studnie i umieść 2 do 3 kropli 4% PFA w każdej studzience10. Odpowiednio oznacz studzienki i delikatnie połóż szkiełka pokrywy do góry nogami na studzienkach wypełnionych PFA. Pozostaw komórki do utrwalenia w temperaturze pokojowej na 20 minut.</li>
	<li>Umyj komórki 3 razy w DPBS przez 5 minut, przenosząc je z jednego dołka do drugiego.</li>
	<li>Jeżeli znakowanie immunologiczne nie może być przeprowadzone wkrótce po aktywacji i utrwaleniu neutrofili, należy pozostawić szkiełka nakrywkowe do wysuszenia na powietrzu, umieszczając szkiełka nakrywkowe stroną zadrukowaną do góry na kawałku papieru absorpcyjnego. Szkiełka nakrywkowe można przechowywać do 1 tygodnia w postaci zadrukowanej do góry na znakowanej 12-dołkowej płytce hodowlanej w temperaturze 4 °C do czasu dalszej analizy. Umyć komórki 3 razy w DPBS przez 1 minutę, stosując tę samą technikę, jak opisano w ppkt 4.4 przed przejściem do następnego kroku.</li>
	<li>W celu przepuszczalności komórek należy delikatnie położyć szkiełko nakrywkowe do góry nogami na kropli 1% NP-40 na 1 minutę, stosując technikę opisaną w ppkt 4.4. Pierz 3 razy w DPBS przez 1 minutę na bujaku.</li>
	<li>Losowo przypisz każdą próbkę do liczby i użyj markera w kształcie rombu, aby odpowiednio oznaczyć szkiełka nakrywkowe.</li>
	<li>Przygotować i oznaczyć poszczególne szalki Petriego wyłożone folią parafinową i umieścić 100 do 200 μl 5% koziej surowicy na folii (bufor blokujący). Połóż szkiełka nakrywkowe do góry nogami na buforze blokującym. Umieścić na bujaku i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Prać 3 razy w DPBS przez 5 min na bujaku.</li>
	<li>Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe (poliklonalny antycytrulinowany histon H3 (citH3) królika w proporcji 1:400 w 5% surowicy koziej). Inkubować komórki na oznakowanych szalkach Petriego wyłożonych folią parafinową. Połóż każde szkiełko nakrywkowe do góry nogami na 50 do 100 μl rozcieńczonego roztworu przeciwciała. Umieścić na bujaku i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37°C.</li>
	<li>Prać 3 razy w DPBS przez 5 min na bujaku.</li>
	<li>Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe sprzężone z fluoroforem (1:200) w 5% surowicy koziej. Inkubować komórki na oznakowanych szalkach Petriego wyłożonych folią parafinową. Połóż każde szkiełko nakrywkowe do góry nogami na 50 do 100 μl rozcieńczonego roztworu przeciwciała. Umieścić na bujaku i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w ciemności.</li>
	<li>Prać 3 razy w DPBS przez 5 minut na bujaku w ciemności.</li>
	<li>W celu jednoczesnego wykrywania mieloperoksydazy (MPO) należy postępować zgodnie z poniższymi krokami w celu zmodyfikowanego protokołu podwójnego znakowania immunologicznego, zgodnie z opisem Li i wsp.13</li>
	<li>Inkubować komórki na oznakowanych szalkach Petriego wyłożonych folią parafinową. Połóż każde szkiełko nakrywkowe do góry nogami na 100 do 200 μl 10% surowicy króliczej pod delikatnym kołysaniem (przez noc, 4 °C, w ciemności).</li>
	<li>Prać 3 razy w DPBS przez 5 minut na bujaku w ciemności.</li>
	<li>Inkubować komórki w 50 μg/ml niesprzężonych kozich anty-króliczych fragmentach Fab przez 2 godziny w temperaturze pokojowej na kołysce w ciemności.</li>
	<li>Prać 3 razy w DPBS przez 5 minut na bujaku w ciemności.</li>
	<li>Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe (poliklonalne przeciwciało przeciw ludzkiemu MPO w stosunku 1:200) w 5% surowicy koziej. Inkubować komórki na oznakowanych szalkach Petriego wyłożonych folią parafinową. Połóż każde szkiełko nakrywkowe do góry nogami na 50 do 100 μl rozcieńczonego roztworu przeciwciała. Umieścić na bujaku i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37°C w ciemności.</li>
	<li>Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe sprzężone z fluoroforem w 5% surowicy koziej i inkubować zgodnie z opisem w 4.8</li>
	<li>Prać 3 razy w DPBS przez 5 minut na bujaku w ciemności.</li>
	<li>Kontrole interferencyjne powinny być przygotowane poprzez wykluczenie inkubacji z którymkolwiek z przeciwciał pierwszorzędowych na drugim etapie znakowania immunologicznego.</li>
	<li>Wybarwić DNA 300 nM dichlorowodorku 4',6-diamitiono-2-fenyloindolu (DAPI) przez 5 minut w ciemności w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Prać 3 razy w DPBS przez 1 minutę na bujaku w ciemności.</li>
	<li>Nanieś kroplę (~50 μl) antyblaknięcia na szkiełko podstawowe. Delikatnie postukaj krawędzią szkiełka nakrywkowego o chłonny papier, aby usunąć nadmiar bufora przed zamontowaniem szkiełka nakrywkowego z komórkami do góry nogami. Podłoże montażowe powinno tworzyć cienką warstwę między szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem. Aby usunąć pęcherzyki powietrza, bardzo delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe drobnymi kleszkami.</li>
	<li>Pozostawić próbki do utwardzenia przez noc w ciemności w temperaturze 4 °C. Podłoże montażowe powinno stwardnieć do analizy mikroskopowej za pomocą soczewek zanurzeniowych. Próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności.</li>
</ol>
5. Kwantyfikacja pułapki zewnątrzkomórkowej neutrofili
<ol>
	<li>Nie zwracać uwagi na warunki eksperymentalne operatora (operatorów) nabywającego i analizującego obrazy mikroskopowe.</li>
	<li>Używając mikroskopu fluorescencyjnego przy 40-krotnym powiększeniu, wykonaj losowo 10 obrazów z różnych obszarów każdego szkiełka nakrywkowego w eksperymencie pod odpowiednimi kanałami. Upewnij się, że czas ekspozycji, jasność i kontrast każdego kanału są spójne przez cały czas pozyskiwania obrazów.</li>
	<li>Analizuj obrazy za pomocą dostępnego oprogramowania, takiego jak ImageJ (NIH). Zidentyfikuj NET na podstawie kolokalizacji cfDNA, citH3 i MPO (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3A, B). Określ ilościowo liczbę NET i neutrofili w 10 losowych polach dla każdego warunku doświadczalnego. Liczba uwolnionych NET może być wyrażona jako stosunek (liczba NET: całkowita liczba neutrofili) dla każdego warunku doświadczalnego.</li>
	<li>Aby ocenić wpływ leczenia na wewnątrzkomórkową ekspresję citH3, policz liczbę neutrofili z wewnątrzkomórkowym citH3 i liczbę neutrofili bez wewnątrzkomórkowego citH3 w 10 losowych polach przy 40-krotnym powiększeniu pod odpowiednimi kanałami (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3, czerwone strzałki). Wewnątrzkomórkową ekspresję citH3 można wyrazić jako stosunek liczby neutrofili z wewnątrzkomórkowym citH3 do liczby neutrofili bez wewnątrzkomórkowego citH3.</li>
</ol>

<ol><li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+and+immunity%3A+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophils and immunity: challenges and opportunities.</a> Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).</li>
<li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beneficial+suicide%3A+why+neutrophils+die%2C+to+make+NETs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Beneficial suicide: why neutrophils die, to make NETs.</a> Nature Reviews Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).</li>
<li>Kaplan, M. J., Radic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps%3A+Double-edged+swords+of+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps: Double-edged swords of innate immunity.</a> The Journal of Immunology. 189 (6), 2689-2695 (2012).</li>
<li>Czaikoski, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+Extracellular+Traps+Induce+Organ+Damage+during+Experimental+and+Clinical+Sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Neutrophil Extracellular Traps Induce Organ Damage during Experimental and Clinical Sepsis.</a> PLoS One. 11 (2), e0148142(2016).</li>
<li>Dwivedi, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+utility+and+characterization+of+cell-free+DNA+in+patients+with+severe+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care%22%5BJournal%5D)">Prognostic utility and characterization of cell-free DNA in patients with severe sepsis.</a> Critical Care. 16 (4), R151(2012).</li>
<li>Mai, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+but+not+Early+Treatment+with+DNase+Reduces+Organ+Damage+and+Improves+Outcome+in+a+Murine+Model+of+Sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Delayed but not Early Treatment with DNase Reduces Organ Damage and Improves Outcome in a Murine Model of Sepsis.</a> Shock. 44 (2), 166-172 (2015).</li>
<li>Jeffery, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dogs+cast+NETs+too%3A+Canine+neutrophil+extracellular+traps+in+health+and+immune-mediated+hemolytic+anemia%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Immunology+and+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">Dogs cast NETs too: Canine neutrophil extracellular traps in health and immune-mediated hemolytic anemia.</a> Veterinary Immunology and Immunopathology. 168 (3-4), 262-268 (2015).</li>
<li>Letendre, J. A., Goggs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+plasma+cell-free+DNA+concentrations+in+dogs+with+sepsis%2C+trauma%2C+and+neoplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Veterinary+Emergency+and+Critical+Care%22%5BJournal%5D)">Measurement of plasma cell-free DNA concentrations in dogs with sepsis, trauma, and neoplasia.</a> Journal of Veterinary Emergency and Critical Care. 27 (3), 307-314 (2017).</li>
<li>Jeffery, U., Gray, R. D., LeVine, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Fluorescence+Assay+for+Quantification+of+Canine+Neutrophil+Extracellular+Trap+Release%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release.</a> J Vis Exp. (117), (2016).</li>
<li>Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps%3A+how+to+generate+and+visualize+them%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them.</a> Journal of Visualized Experiments. (36), (2010).</li>
<li>Oh, H., Siano, B., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+isolation+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Neutrophil isolation protocol.</a> Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+Blue+Exclusion+Test+of+Cell+Viability%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability.</a> Current Protocols in Immunology. 111, (2015).</li>
<li>Li, R. H. L., Ng, G., Tablin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide-induced+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+canine+neutrophils+is+dependent+on+histone+H3+citrullination+by+peptidylarginine+deiminase%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Immunology+and+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide-induced neutrophil extracellular trap formation in canine neutrophils is dependent on histone H3 citrullination by peptidylarginine deiminase.</a> Veterinary Immunology and Immunopathology. 193, 29-37 (2017).</li>
<li>Masuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NETosis+markers%3A+Quest+for+specific%2C+objective%2C+and+quantitative+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers.</a> Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).</li>
<li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAD4+is+essential+for+antibacterial+innate+immunity+mediated+by+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1853-1862 (2010).</li>
<li>Leshner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAD4+mediated+histone+hypercitrullination+induces+heterochromatin+decondensation+and+chromatin+unfolding+to+form+neutrophil+extracellular+trap-like+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">PAD4 mediated histone hypercitrullination induces heterochromatin decondensation and chromatin unfolding to form neutrophil extracellular trap-like structures.</a> Frontiers in Immunology. 3, 307(2012).</li>
<li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+and+inactivators+of+protein+arginine+deiminase+4%3A+functional+and+structural+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Inhibitors and inactivators of protein arginine deiminase 4: functional and structural characterization.</a> Biochemistry. 45 (39), 11727-11736 (2006).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiamy tutaj protokół obserwacji zmian w konformacji jąder i uwalnianiu cfDNA u żywych neutrofili psich przy użyciu zarówno barwnika przepuszczalnego dla komórki, jak i barwnika nieprzepuszczalnego dla komórki. Główną zaletą tego testu jest to, że pozwala na wykrywanie tworzenia NET w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopii o wysokiej rozdzielczości w żywych neutrofilach bez fiksacji komórek, zapewniając w ten sposób proste i cenne narzędzie do obserwacji powstawania NET in vitro . Ponieważ test ten nie...

Neutrofile to krótkotrwałe granulocyty odpowiedzialne za początkową obronę przed atakującymi patogenami. Neutrofile, rekrutowane do miejsca infekcji, eliminują mikroorganizmy poprzez fagocytozę, degranulację i wytwarzanie reaktywnych form tlenu (ROS)1. W obecności bakterii lub endotoksyn neutrofile uwalniają zewnątrzkomórkowe pułapki neutrofili (NET), składające się z zewnątrzkomórkowej chromatyny ozdobionej histonami i ziarnistymi białkami, takimi jak elastaza i mieloperoksydaza (MPO)2. Chociaż NET mają niezbędne właściwości przeciwdrobnoustrojowe, coraz więcej dowodów eksperymentalnych i klinicznych sugeruje, że nadgorliwe tworzenie NET podczas sepsy może prowadzić do dysfunkcji wielu narządów i śmierci3,4,5,6.
Ponieważ NET mogą odgrywać podobną patofizjologiczną rolę u psów, interwencje terapeutyczne, które zapobiegają lub zmniejszają powstawanie NET, mogą służyć jako nowe strategie leczenia u zwierząt septycznych. Z tego powodu istnieje zapotrzebowanie na wiarygodną technikę oceny i ilościowego określania składników NETosis i NET u psów. Składniki netto, w tym bezkomórkowe DNA (cfDNA) i nukleosomy, zostały wcześniej ocenione w neutrofilach i osoczu psów od psów klinicznych7,8,9. Korzystając z testów fluorescencyjnych, Goggs i Letendre odkryli, że psy z sepsem mają wyższy poziom cfDNA niż psy zdrowe8. Chociaż techniki te są wysoce obiektywne i ilościowe, pomiar cfDNA i nukleosomów jako markerów NETozy jest niespecyficzny, ponieważ można je uzyskać z komórek nekrotycznych innych niż neutrofile NETozing. W tym artykule opisujemy technikę, która wykorzystuje mikroskopię fluorescencyjną do badania zachowań żywych neutrofili NETosing. Szczegółowo opisujemy również zmodyfikowany protokół wykorzystujący podwójne znakowanie immunologiczne w celu subiektywnego ilościowego określenia NET i ich składników, takich jak MPO i citH3 w neutrofilach u psów10.

<table><tbody><tr><td>Dekstran z Leuconostoc spp.</td><td>Sigma</td><td>31392</td><td>Masa cząsteczkowa 450 000 &ndash; 650 000</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Nauki Przyrodnicze</td><td>17144002</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1285801</td><td>Z dwuwartościowymi kationami</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190136</td><td>Bez kationów dwuwartościowych</td></tr><tr><td>E. coli O55:B5</td><td>InvivoGen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Pomarańczowy fluorescencyjny barwnik kwasów nukleinowych</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S11368</td><td>5 mM w DMSO; barwienia w komórkach z przepuszczalnymi błonami</td></tr><tr><td>SYTO Green 16 Fluorescencyjne barwienie kwasem nukleinowym</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S7578</td><td>1 mM w DMSO; plamy w komórkach z nienaruszonymi błonami</td></tr><tr><td>Surface-Amps NP-40</td><td>Pierce</td><td>28324</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe powlekane poli-D-lizyną</td><td>neuVitro</td><td>H-12-pdl</td><td>o średnicy 12 mm</td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw cytrulinowanemu histonowi H3</td><td>Abcam</td><td>Ab5103</td><td></td></tr><tr><td>Niesprzężone kozie anty-królicze fragmenty Fab</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-007-003</td><td>Specyficzność: IgG (H+L)</td></tr> <tr><td>Przeciwciało anty-mieloperoksydazy</td><td>Dako</td><td>A0398</td><td></td></tr><tr><td>4,6-diamidyn-2-fenylina (DAPI)</td> <td>Life Technologies Corporation</td><td>D1306</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro tworzenie zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili u psów: analiza dynamiczna i ilościowa za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

W odpowiedzi na atakujące patogeny, neutrofile uwalniają zewnątrzkomórkowe pułapki neutrofili (NET), które są zewnątrzkomórkowymi sieciami DNA ozdobionymi histonami i białkami przeciwbakteryjnymi. Nadmierne tworzenie NET (NETosis) i uwalnianie citH3 podczas sepsy jest związane z dysfunkcją wielu narządów i śmiertelnością u myszy i ludzi, ale jego implikacje u psów są nieznane. W niniejszym artykule opisujemy technikę izolowania neutrofili u psów z krwi pełnej w celu obserwacji i ilościowego określenia NETozy. Osocze bogate w leukocyty, wytwarzane w wyniku sedymentacji dekstranu, jest rozdzielane przez dostępne na rynku pożywki separacyjne o gradiencie gęstości i granulocyty pobrane do badania liczby komórek i żywotności. Aby zaobserwować NETozę w czasie rzeczywistym w żywych neutrofilach, do neutrofili aktywowanych przez lipopolisacharyd (LPS) lub 13-octan forbolu (PMA) dodaje się fluorescencyjne barwniki kwasów nukleinowych przenikające komórki i nieprzepuszczalne dla komórek. Zmiany w morfologii jądra i tworzeniu NET obserwuje się w czasie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Metody in vitro NEToza charakteryzuje się ponadto kolokalizacją bezkomórkowego DNA (cfDNA), mieloperoksydazy (MPO) i cytrulinowanego histonu H3 (citH3) przy użyciu zmodyfikowanego protokołu podwójnego znakowania immunologicznego. Aby obiektywnie określić ilościowo tworzenie NET i ekspresję citH3 za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, NET i komórki citH3-dodatnie są oznaczane ilościowo w sposób zaślepiony przy użyciu dostępnego oprogramowania. Technika ta jest specyficznym testem służącym do oceny zdolności in vitro neutrofili u psów do poddania się NETozy.

Stosując ten protokół obrazowania żywych komórek, badacze mogą obserwować morfologię jądra komórkowego, integralność błony plazmatycznej oraz obecność cfDNA w żywych neutrofilach. Barwnik jądrowy nieprzenikający przez błony komórkowe barwi kwasy nukleinowe na czerwono w komórkach z uszkodzonymi błonami. Inny barwnik, przenikający przez błony, znakuje wewnątrzkomórkowe kwasy nukleinowe w żywych komórkach z nienaruszoną błoną plazmatyczną. Wszystkie nienaruszone neutrofile, niezależnie od z...

Opisujemy metody izolowania neutrofili u psów z krwi pełnej i wizualizacji powstawania NET w żywych neutrofilach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Opisano również protokoły ilościowego oznaczania powstawania NET i ekspresji cytrulinowanego histonu H3 (citH3) za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej.

In vitro Tworzenie zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili u psów: analiza dynamiczna i ilościowa za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące zewnątrzkomórkowej pułapki neutrofili lub tworzenia NET u psów lub innych gatunków. Do głównych zalet tych technik należy rzeczywiste wykrywanie tworzenia NET na żywo i identyfikacja składników NET, takich jak łagodna peroksydaza i cytrulinowany histon H3. Zacznij od uzyskania od 10 do 20 mililitrów krwi z żyły szyjnej zdrowego psiego dawcy, usuwając igłę ze strzykawki przed dozowaniem krwi do probówek z heparyną sodową, aby uniknąć nadmiernego udostępniania. Delikatnie odwróć probówki kilka razy, aby zapewnić odpowiednie wymieszanie krwi i antykoagulantu, a następnie sprawdź, czy nie ma skrzepów i agregatów krwinek czerwonych przed umieszczeniem próbek na lodzie.Rozcieńczyć antykoagulowaną krew równą objętością lodowatego PBS Dulbecco i przenieść osiem mililitrów rozcieńczonej krwi do 50-mililitrowej stożkowej probówki polipropylenowej zawierającej 25 mililitrów przefiltrowanego 3% dekstranu. Umieść probówkę pionowo na 30 minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić agregację i sedymentację erytrocytów. Następnie ostrożnie ułóż pięć mililitrów osocza bogatego w leukocyty na wierzchu pięciu mililitrów pożywki o gradiencie g

in-vitro-canine-neutrophil-extracellular-trap-formation-dynamic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Zewnątrzkomórkowe pułapki neutrofilowe (NETs) stanowią istotny mechanizm odporności wrodzonej służący do zwalczania patogennych bakterii, grzybów i pasożytów. W niniejszym opracowaniu opisujemy metody izolacji granulocytów neutrofilowych z krwi ludzkiej oraz ich aktywacji w celu tworzenia NETs. Przedstawiamy techniki przygotowania próbek umożliwiające wizualizację NETs w mikroskopii świetlnej i elektronowej.

Zewnątrzkomórkowe pułapki neutrofilowe: Jak je generować i wizualizować

Ten film demonstruje indukcję i wizualizację zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili lub NET w wstępnie oznakowanych neutrofilach przy użyciu surowicy pacjenta zawierającej przeciwciała cytoplazmatyczne anty-neutrofilowe. Co więcej, zastosowanie nieprzepuszczalnego barwnika DNA i mikroskopii fluorescencyjnej umożliwia wizualizację NET.

Indukcja i wizualizacja zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili we wstępnie znakowanych neutrofilach

Pułapki zewnątrzkomórkowe (NET) to sieci DNA, histonów i białek neutrofilowych. Chociaż jest to składnik wrodzonej odpowiedzi immunologicznej, NET są zaangażowane w autoimmunizację i zakrzepicę. Protokół ten opisuje prostą metodę izolacji neutrofili u psów i ilościowego oznaczania NET za pomocą testu fluorescencji mikropłytek.

Prosty test fluorescencyjny do ilościowego oznaczania uwalniania zewnątrzkomórkowej pułapki neutrofili u psów

Tutaj prezentujemy protokół do generowania zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili (NET) i obsługi NETQUANT, w pełni automatycznej opcji oprogramowania do ilościowego oznaczania NET w obrazach immunofluorescencyjnych.

Zautomatyzowana kwantyfikacja oparta na obrazie pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili przy użyciu NETQUANT

Ten protokół opisuje wysoce czuły i wysokoprzepustowy test pułapki zewnątrzkomórkowej neutrofili (NET) do półautomatycznego oznaczania ilościowego tworzenia ex vivo NET za pomocą immunofluorescencji trójwymiarowej mikroskopii konfokalnej. Protokół ten może być wykorzystany do oceny powstawania i degradacji NET po różnych bodźcach i może być wykorzystany do badania potencjalnych terapii ukierunkowanych na NET.

Wysokoprzepustowy test do oceny i ilościowego określania tworzenia pułapek zewnątrzkomórkowych w neutrofilach

Pułapki zewnątrzkomórkowe (NET) neutrofili to trójwymiarowe struktury generowane przez stymulowane granulocyty neutrofilowe. W ostatnich latach stało się jasne, że sieci NET są zaangażowane w wiele różnych chorób. Wykrywanie NET w tkance może mieć znaczenie diagnostyczne, dlatego wymagane są standardowe protokoły znakowania składników NET.

Znakowanie immunofluorescencyjne ludzkich i mysich pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili w tkance zatopionej w parafinie

Opisujemy metodę identyfikacji zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili (NET) w kardiogennych zakrzepach tętniczych kotów utrwalonych formaldehydem i parafinie, wykorzystując indukowane ciepłem pobieranie antygenu i protokół podwójnego znakowania immunologicznego.

Identyfikacja zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych w zatopionych w parafinie zakrzepach tętniczych kotów przy użyciu mikroskopii immunofluorescencyjnej

Prezentowany tutaj jest protokół do indukcji i analizy in vitro zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych (NET). Kwantyfikacja DNA, katelicydyny (LL37) i aktywności enzymów dostarczyła danych, które pokazują zmienność składu i morfologii NET indukowanych przez bodźce mikrobiologiczne i chemiczne w podobnie kontrolowanych warunkach.

Analiza morfologiczna i kompozycyjna pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili indukowanych bodźcami mikrobiologicznymi i chemicznymi

Pułapki zewnątrzkomórkowe (NET) neutrofili są związane z różnymi chorobami, a immunofluorescencja jest często używana do ich wizualizacji. Istnieją jednak różne protokoły barwienia, aw wielu przypadkach badany jest tylko jeden rodzaj tkanki. W tym miejscu ustalamy ogólnie stosowany protokół barwienia NET w tkankach mysich i ludzkich.

Obrazowanie immunofluorescencyjne zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych w tkankach ludzkich i mysich

Prezentujemy zautomatyzowaną, wysokoprzepustową metodę ilościowego oznaczania pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili (NET) przy użyciu systemu analizy żywych komórek, w połączeniu z zależnym od przepuszczalności błony metodą podwójnego barwnika.

Technika wysokoprzepustowa w czasie rzeczywistym do ilościowego określania tworzenia się pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili w ludzkich neutrofilach

Ten zdefiniowany protokół opisuje podejście do mikroskopii wysokoprzepustowej w czasie rzeczywistym w celu wizualizacji i ilościowego określenia uwalniania ludzkich neutrofili zewnątrzkomórkowych (NET) in vitro. Powtarzalna metoda pozwala na zbadanie charakterystyki i kinetyki uwalniania NET po stymulacji odrębnymi induktorami NETozy oraz umożliwia ocenę farmakologii antagonistów NETozy.

Wysokoprzepustowa, mikroskopowa kwantyfikacja uwalniania ludzkich neutrofili z zewnątrzkomórkowych pułapek i ocena farmakologii antagonistów w czasie rzeczywistym

Poznaj metodę izolacji neutrofili z krwi psów i wizualizacji tworzenia NET za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Technika umożliwia ilościową analizę citH3 w czasie rzeczywistym.

In vitro Tworzenie zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili u psów: analiza dynamiczna i ilościowa za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (Wideo) | JoVE Journal

In vitro Tworzenie zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili u psów: analiza dynamiczna i ilościowa za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Przeglądaj więcej filmów