In vitro Różnicowanie mysich komórek T Helper (T_HGM) wytwarzających czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów makrofagów (GM-CSF)

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie limfocytów T CD4, takie jak to, który podzbiór komórek pomocniczych T jest głównym źródłem GM-CSF w patogenezie chorób zapalnych, takich jak stwardnienie rozsiane. Główną zaletą tej techniki jest to, że generuje ona ponad 50% komórek T z ekspresją GM-CSF z naiwnych limfocytów T CD4 bez lub z kilkoma interferującymi komórkami ekspresyjnymi gamma OI17, które stanowią niezbędne źródło komórkowe do badania regresji i funkcji THGM, nowego podzbioru komórek pomocniczych T. Procedurę zademonstruje Yi Lu, doktorant z mojego laboratorium.

Zacznij od użycia kleszczy, aby unieść skórę nad brzuchem myszy w wieku od sześciu do ośmiu tygodni i wykonać około czterocentymetrowe nacięcie poniżej klatki piersiowej po lewej stronie zwierzęcia. Otwórz worek otrzewnowy, aby odsłonić śledzionę i użyj sterylnych kleszczy, aby przenieść śledzionę na sitko o średnicy 70 mikrometrów, wstępnie zwilżone dwoma mililitrami buforu do izolacji komórek. Po pobraniu dwóch do trzech śledzion, użyj końcówki pięciomililitrowej strzykawki do maceracji tkanki śledziony i przepłucz sitko kilka razy jednym do dwóch mililitrów buforu do izolacji komórek, aż wszystkie komórki zostaną przepłukane do probówki.

Zebrać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach buforu do lizy potasu z chlorkiem amonu o temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po dwóch minutach delikatnego mieszania przerwij lizę za pomocą 10 mililitrów kompletnej pożywki RPMI i natychmiast odwiruj komórki. Aby wyizolować limfocyty T CD4-dodatnie, ponownie zawieś osad białych krwinek w pięciu mililitrach bufora do izolacji komórek i przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko o średnicy 30 mikrometrów do nowej rurki o pojemności 15 mililitrów, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia.

Po zliczeniu ponownie zawiesić komórki w ilości od 10 do siódmych komórek na 90 mikrolitrów stężenia buforu i dodać 10 mikrolitrów sprzężonych kulek magnetycznych anty-CD4 na jeden razy 10 do siódmych komórek na 15-minutową inkubację w temperaturze czterech stopni Celsjusza z mieszaniem co pięć minut. Podczas inkubacji komórek umieść kolumnę separacyjną na stojaku magnetycznym i wstępnie zwilż kolumnę dwoma mililitrami buforu. Następnie przemyj komórki pięcioma mililitrami buforu i ponownie zawieś osad w jednym mililitrze buforu.

Załaduj próbkę do kolumny i zbierz frakcję ujemną CD4 w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów. Gdy wszystkie komórki przejdą przez kolumnę, umyj zbiornik trzy razy jednym mililitrem buforu na popłuczynie, zanim wyschnie. Po ostatnim płukaniu przenieś kolumnę do nowej 15-mililitrowej rurki stożkowej i zanurz kolumnę w dwóch mililitrach buforu do izolacji komórek, aby usunąć dodatnią frakcję kulkową.

Następnie zbierz komórki CD4-dodatnie przez odwirowanie. W celu aktywowanego fluorescencją sortowania komórek naiwnych limfocytów T, należy ponownie zawiesić posortowaną kulkami osadkę komórek CD4 dodatnich w 500 mikrolitrach buforu i wymieszać komórki z odpowiednim koktajlem przeciwciał sprzężonych z fluorescencją. Po 20 do 30 minutach na lodzie chronionym przed światłem, umyj komórki w pięciu mililitrach świeżego buforu i ponownie zawieś osad w 500 mikrolitrach świeżego buforu.

Przefiltruj komórki przez nylonową siatkę i przenieś komórki do probówki FACS wstępnie pokrytej 500 mikrolitrami buforu. Bramka do wyboru CD4 dodatnich, CD25 ujemnych i CD44 niskich ligów CD62 i wysokich populacji komórek. Następnie posortuj naiwne CD4 dodatnie CD25 ujemne CD44 o niskiej zawartości ligu CD62 i wysokie frakcje limfocytów T do nowej 15-mililitrowej probówki wirówkowej i osadzaj izolowane naiwne limfocyty T CD4 dodatnie przez wirowanie.

W celu różnicowania komórek T-pomocniczych makrofagów granulocytów lub GM-CSF należy ponownie zawiesić posortowane limfocyty T w stężeniu od jednego razy 10 do szóstego na mililitr w kompletnej pożywce RPMI zawierającej 50 mikromolowy beta-merkaptoetanol i odessać przeciwciało anty-CD3 epsilon z każdej studzienki wstępnie pokrytej 48-dołkowej płytki. Następnie wysiewaj 2,5 razy 10 do piątej komórki do każdej studzienki wraz z IL7, anty-CD28 i anty-IFN gamma i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 przez trzy dni. W trzecim dniu hodowli użyj mikroskopu, aby sprawdzić różnicowanie komórek i zbierz komórki do odwirowania.

Ponownie zawiesić osad w świeżej pożywce complete RPMI na dwa prania, ponownie zawieszając komórki w jednym mililitrze świeżej kompletnej pożywki po drugim praniu w celu zliczenia. Podziel komórki na trzy równe objętości i ponownie stymuluj pierwszą porcję komórek PMA i jonomycyną w obecności inhibitora transportu białek przez cztery do sześciu godzin. Pod koniec stymulacji zbierz komórki do barwienia przeciwciałem anty-CD4.

Po 30 minutach utrwalić komórki za pomocą 200 mikrolitrów buforu utrwalającego przez 20 do 60 minut, a następnie dwa płukania w jednym mililitrze buforu przepuszczalnego na pranie. Następnie barwić pod kątem ekspresji cytokin wewnątrzkomórkowych przez 30 minut w ciemności. W celu ilościowej analizy PCR ekspresji genów cytokin w komórkach zróżnicowanych, aktywuj komórki za pomocą epsilonu anty-CD3 związanego z płytką przez trzy godziny.

Następnie użyj odczynnika do ekstrakcji fenolowego RNA, aby wyizolować całkowite RNA, aby umożliwić przygotowanie cDNA do ilościowego PCR. Aby ocenić wydzielanie białka cytokiny przez zróżnicowane komórki, należy ponownie stymulować komórki epsilonem anty-CD3 związanym z płytką przez 24 godziny i analizować supernatanty hodowlane pod kątem IL17 i GM-CSF za pomocą testu ELISA. Około 55% komórek hodowanych w warunkach różnicowania komórek T-pomocniczych GM-CSF wykazywało ekspresję GM-CSF, podczas gdy tylko około 2% komórek zróżnicowanych w warunkach T-helper 17 wyrażało tę cytokinę.

W porównaniu z warunkami różnicowania T-helper 17, które powodują wytwarzanie IL17 przez około 8% komórek, warunki różnicowania komórek T-pomocniczych GM-CSF indukowały ekspresję IL17 tylko w około 1% komórek. Warto zauważyć, że tylko frakcja komórek wykazuje ekspresję IFN gamma lub IL4 w obu warunkach hodowli. Zróżnicowane komórki T-pomocnicze GM-CSF wykazują znacznie wyższą ekspresję mRNA CSF2, ale znacznie niższą ekspresję IL17 w porównaniu z komórkami T-helper 17.

Koreluje to z ekspresją białka GM-CSF obserwowaną w supernatantach hodowlanych z komórek T-helper GM-CSF i T-helper 17, z trzykrotnie większym stężeniem cytokiny wykrytym w hodowlach komórkowych T-helper GM-CSF i bez mierzalnej IL17 w ogóle. Komórki T-pomocnicze GM-CSF wykazują również nieco niższą ekspresję Rorc, wyższą ekspresję Stat5 i nieco niższą ekspresję Stat3 niż komórki T-pomocnicze 17, co wskazuje, że chociaż różnicowanie GM-CSF i IL17 komórek T-pomocniczych jest regulowane przez różne czynniki transkrypcyjne, mogą mieć pewne wspólne cechy. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o wykonaniu wszystkich czynności w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby komórki i odczynniki były sterylne.

Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak analiza transkryptomu, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak: jakie są ważne geny wyrażane przez komórki THGM? Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie immunologii do zbadania, w jaki sposób GM-CSF pochodzący z komórek T przyczynia się do stanu zapalnego u gryzoni. Nie zapominaj, że praca z beta-merkaptoetanolem i odczynnikiem do ekstrakcji RNA może być niezwykle niebezpieczna i podczas korzystania z tych odczynników należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak używanie dygestoriów.