Name: In vitro Różnicowanie mysich komórek T Helper (THGM) wytwarzających czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów makrofagów (GM-CSF) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Poznaj metodę różnicowania mysich komórek T H GM produkujących GM-CSF z naiwnych komórek CD4+. Protokół ten generuje ponad 50% komórek ekspresujących GM-CSF, zapewniając wartościowe źródło komórkowe do badań immunologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez granty z National University Health System of Singapore (T1-2014 Oct-12 i T1-2015 Sep-10).

Wszystkie myszy użyte w tym protokole były na tle genetycznym C57BL/6 i trzymane w określonych warunkach wolnych od patogenów na Narodowym Uniwersytecie Singapuru. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono przy użyciu protokołów zatwierdzonych przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Narodowego Uniwersytetu Singapuru.
1. Przygotowanie odczynnika i materiału
<ol>
	<li>Przygotować 500 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) zawierającej 2% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA). 
	UWAGA: Utrzymuj bufor na lodzie przez cały czas trwania procedury, aby uzyskać optymalne wyniki.</li>
	<li>Przygotuj 50 ml kompletnej pożywki RPMI zawierającej RPMI 1640, 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny. Do różnicowania komórek THGM Użyj kompletnych pożywek RPMI zawierających 50 μM β-merkaptoetanolu. Dodaj β-merkaptoetanol do dygestoria.</li>
	<li>Przygotować 7,5 ml mieszaniny przeciwciał anty-CD3e, rozcieńczając skoncentrowany zapas anty-CD3e do 3 μg/ml w PBS. Pokryć płytki 48-dołkowe, dodając 150 μl mieszaniny przeciwciał do każdej studzienki i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę lub w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
	<li>Wysterylizuj nożyczki i kleszcze i przechowuj je w 70% etanolu między sekcjami.</li>
</ol>
2. Przygotowanie mysich splenocytów
<ol>
	<li>Poddaj mysz eutanazji myszy (w wieku 6-8 tygodni) za pomocą instytucjonalnie zatwierdzonego uduszenia CO2 lub zwichnięcia szyjki macicy. Spryskaj mysz 70% etanolem i zamontuj ją na bloku styropianowym z tyłu. Przenieś mysz do szafy bezpieczeństwa biologicznego, aby wykonać następujące kroki.</li>
	<li>Przytrzymaj skórę za pomocą kleszczy i przetnij skórę poniżej klatki piersiowej po lewej stronie na około 4 cm, używając nożyczek. Otwórz worek otrzewnowy, aby odsłonić śledzionę i użyj sterylnych kleszczy, aby usunąć śledzionę.</li>
	<li>Umieść sitko o pojemności 70 μm na probówce o pojemności 50 ml i wstępnie zwilż je 2 ml buforu. Umieść śledziony na sitku do komórek (2-3 śledziony na jedno sitko do komórek) i zmaceruj je za pomocą końcówki tłoka strzykawki o pojemności 5 ml.</li>
	<li>Przepłucz sitko i probówkę kilka razy 1–2 ml buforu do izolacji komórek, aż wszystkie komórki zostaną wypłukane do probówki. Odrzucić sitko do komórek i odwirowywać komórki przy sile 350 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy z 5 ml zimnego (4 °C) buforu lizującego chlorek amonu i potasu (ACK) (150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM Na2EDTA; pH 7,2–7,4) i delikatnie mieszać przez 2 minuty. Dodać 10 ml kompletnej pożywki RPMI, aby zneutralizować bufor ACK i natychmiast odwirować komórki przy 350 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Wyrzucić supernatant po wirowania.</li>
</ol>
3. Izolacja limfocytów T CD4+ za pomocą magnetycznych mikrokulek CD4 i kolumny do separacji komórek
<ol>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 5 ml buforu do izolacji komórek. Przefiltruj zawiesinę komórek za pomocą filtra wstępnej separacji (30 μm) do nowej probówki o pojemności 15 ml, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia.</li>
	<li>Pobrać 10 μl zawiesiny komórek i rozcieńczyć 10x, dodając 90 μl buforu. Pobrać 10 μl rozcieńczonej zawiesiny komórek i wymieszać ją z 10 μl błękitu trypanowego w celu zliczenia komórek. Policz komórki w hemocytometrze, aby określić wydajność żywotnych komórek.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 350 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 90 μl buforu na 10-7 komórek. Dodaj 10 μl magnetycznych mikrokulek CD4 na 107 komórek. Inkubować komórki przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Aby uzyskać optymalne wyniki, delikatnie mieszaj zawiesinę komórkową co 5 minut podczas inkubacji.</li>
	<li>Podczas inkubacji komórek umieść kolumnę separacyjną na stojaku magnetycznym. Wstępnie zwilżyć kolumnę 2 ml buforu.</li>
	<li>Pod koniec inkubacji komórki/kulki przemyć komórki 5 ml buforu i odwirować je przy 350 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 1 ml buforu, załadować próbkę do kolumny separacji komórek i pozwolić jej przepłynąć. Użyj probówki wirówkowej o pojemności 15 ml, aby zebrać frakcję komórek CD4. Dodać 1 ml buforu, aby umyć zbiornik przed wyschnięciem. Powtórz krok prania 2x.</li>
	<li>Wyjmij kolumnę do separacji komórek ze stojaka magnetycznego i umieść ją na nowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml. Dodać 2 ml buforu do izolacji komórek do kolumny do separacji komórek i mocno przyłożyć tłok, aby wypchnąć komórki z kolumny.</li>
	<li>Odwirować frakcję o sile 350 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu uzyskania komórek CD4+. Odrzucić supernatant.</li>
</ol>
4. Oczyszczanie naiwnych limfocytów T CD4+ (CD4+CD25-CD44loCD62Lhi) przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją i różnicowanie THGM
<ol>
	<li>Otrzymany osad komórek CD4+ zawiesić ponownie w 500 μl buforu. Wymieszaj komórki z mieszaniną przeciwciał sprzężonych z fluorescencją zawierającą CD4-PerCp (2,8 μg/ml), CD44-APC (2,4 μg/ml), CD25-PE (2 μg/ml) i CD62L-FITC (10 μg/ml) (Tabela 1). Inkubuj komórki na lodzie przez 20–30 minut, chroniąc je przed światłem. 
	UWAGA: Stężenia przeciwciał zostały wcześniej zoptymalizowane w laboratorium. Podana liczba przeciwciał dotyczy komórek od 1 do 2 myszy.</li>
	<li>Po inkubacji przemyć komórki 5 ml buforu i odwirować komórki przy 350 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 500 μl buforu. Ponownie przefiltruj komórki za pomocą nylonowej siatki.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę komórek do probówki FACS w celu sortowania komórek. Wstępnie pokryj probówki z kolekcją FACS 500 μl buforu.</li>
	<li>Uzyskaj populacjęhi CD4 + CD25-CD44loCD62L (naiwnych limfocytów T CD4 +) przez sortowanie FACS. Najpierw należy wziąć bramkę na CD4 + CD25-, a następnie wybrać komórkihi CD44loCD62L z tej populacji.</li>
	<li>Zbierz naiwne frakcje limfocytów T CD4 + do nowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Odwirować komórki przy 350 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Ponownie zawiesić naiwne limfocyty T CD4 + w stężeniu 106 komórek/ml w kompletnym pożywce RPMI zawierającej 50 μM β-merkaptoetanolu.</li>
	<li>Odessać przeciwciała anty-CD3e używane do wstępnego powlekania w płytce 48-dołkowej. Zasiaj 0,25 miliona (250 μl) komórek w każdym dołku z IL-7 (2 ng / ml), anty-CD28 (1 μg / ml) i anty-IFNγ (10 μg / ml) (tabela 1). 
	UWAGA: Stężenia cytokin i przeciwciał zostały wcześniej zoptymalizowane w laboratorium pod kątem różnicowania komórekT HGM.</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 3 dni. Nie zmieniaj pożywki podczas inkubacji.</li>
</ol>
5. Analiza mysich komórek G G wygenerowanych in vitro
<ol>
	<li>Za pomocą mikroskopu sprawdź różnicowanie komórek 3 dni po różnicowaniu. Zebrać komórki i odwirować je przy 350 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Umyć komórki 2x za pomocą kompletnej pożywki RPMI. 
	UWAGA: Zróżnicowane komórki są większe niż naiwne limfocyty T CD4 +.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 1 ml kompletnego podłoża RPMI. Weź 10 μl zawiesiny komórek i dobrze wymieszaj ją z 10 μl błękitu trypanowego, aby określić liczbę komórek za pomocą hemocytometru. Podziel zróżnicowane komórki na trzy mikstury w celu ponownej stymulacji i analizy. 
	UWAGA: Barwienie cytokin wewnątrzkomórkowych i testy ELISA wymagają ≥0,5 miliona komórek, a analiza qPCR wymaga ≥ 1 miliona komórek.</li>
	<li>W celu barwienia cytokin wewnątrzkomórkowych należy ponownie stymulować komórki 12-mirystynianem 13-octanu forbolu (PMA) (100 ng/ml) i jonomycyną (1 μg/ml) w obecności inhibitora transportu białek (1 μl/ml) przez 4–6 godzin.
	<ol>
		<li>Zbierz komórki i wybarwić je przeciwciałem anty-CD4 (sprzężonym z PerCP, 0,2 mg/ml, rozcieńczenie 1:100; lub sprzężonym z FITC, 0,5 mg/ml, rozcieńczenie 1:100) przez 30 minut.</li>
		<li>Utrwalić komórki za pomocą 200 μl buforu utrwalającego przez 20–60 minut. Po utrwaleniu przemyć komórki 2x 1 ml buforu do permeabilizacji.</li>
		<li>Wykonaj barwienie wewnątrzkomórkowe przeciwciałami przeciwko GM-CSF (sprzężony z PE, 0,2 mg/ml, rozcieńczenie 1:100), IL-17A (sprzężony z FITC, 0,5 mg/ml, rozcieńczenie 1:100; APC-sprzężony, 0,2 mg/ml, rozcieńczenie 1:100), IL-4 (sprzężony APC, 0,2 mg/ml, rozcieńczenie 1:100) i IFNγ (sprzężony APC, 0,2 mg/ml, rozcieńczenie 1:100; PE-sprzężony, 0,2 mg/ml, rozcieńczenie 1:100) przez 30 minut w ciemności.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W celu analizy qPCR ekspresji genu cytokin przez zróżnicowane komórki, aktywuj komórki za pomocą związanego z płytką anty-CD3e (3 μg/ml) (wstępnie powlekając płytkę, jak opisano w kroku 1.3). Po 3 godzinach od stymulacji zbierz komórki, aby wyizolować całkowite RNA za pomocą odczynnika do ekstrakcji fenolowego RNA w celu przygotowania cDNA do qPCR. Startery i program używane do qPCR są wymienione odpowiednio w tabelach 2 i 3.</li>
	<li>W celu analizy wydzielania białka cytokiny przez zróżnicowane komórki, należy ponownie stymulować komórki za pomocą związanego z płytką anty-CD3e (3 μg/ml) przez 24 godziny (wstępne powlekanie płytki zgodnie z opisem w kroku 1.3). Pobrać supernatant hodowli komórkowej dla IL-17 i GM-CSF ELISA, aby określić ich stężenia.</li>
</ol>

<ol><li>Zhu, J., Paul, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4+T+cells%3A+fates%2C+functions%2C+and+faults%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD4 T cells: fates, functions, and faults.</a> Blood. 112, 1557-1569 (2008).</li>
<li>Kara, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailored+immune+responses%3A+novel+effector+helper+T+cell+subsets+in+protective+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Tailored immune responses: novel effector helper T cell subsets in protective immunity.</a> PLoS Pathogens. 10, e1003905(2014).</li>
<li>Bou Nasser Eddine, F., Ramia, E., Tosi, G., Forlani, G., Accolla, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Immunology+meets...Immunology%3A+Modified+cancer+cells+as+professional+APC+for+priming+naive+tumor-specific+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Tumor Immunology meets...Immunology: Modified cancer cells as professional APC for priming naive tumor-specific CD4+ T cells.</a> Oncoimmunology. 6, e1356149(2017).</li>
<li>Dong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TH17+cells+in+development%3A+an+updated+view+of+their+molecular+identity+and+genetic+programming%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">TH17 cells in development: an updated view of their molecular identity and genetic programming.</a> Nature Reviews. Immunology. 8, 337-348 (2008).</li>
<li>Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-17+and+Th17+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">IL-17 and Th17 Cells.</a> Annual Review of Immunology. 27, 485-517 (2009).</li>
<li>Sheng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT5+programs+a+distinct+subset+of+GM-CSF-producing+T+helper+cells+that+is+essential+for+autoimmune+neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">STAT5 programs a distinct subset of GM-CSF-producing T helper cells that is essential for autoimmune neuroinflammation.</a> Cell Research. 24, 1387-1402 (2014).</li>
<li>Codarri, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RORgammat+drives+production+of+the+cytokine+GM-CSF+in+helper+T+cells%2C+which+is+essential+for+the+effector+phase+of+autoimmune+neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">RORgammat drives production of the cytokine GM-CSF in helper T cells, which is essential for the effector phase of autoimmune neuroinflammation.</a> Nature Immunology. 12, 560-567 (2011).</li>
<li>El-Behi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+encephalitogenicity+of+T%28H%2917+cells+is+dependent+on+IL-1-+and+IL-23-induced+production+of+the+cytokine+GM-CSF%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">The encephalitogenicity of T(H)17 cells is dependent on IL-1- and IL-23-induced production of the cytokine GM-CSF.</a> Nature Immunology. 12, 568-575 (2011).</li>
<li>Ivanov, I. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+orphan+nuclear+receptor+RORgammat+directs+the+differentiation+program+of+proinflammatory+IL-17%2B+T+helper+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells.</a> Cell. 126, 1121-1133 (2006).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+subset+of+helper+T+cells+promotes+immune+responses+by+secreting+GM-CSF%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">A novel subset of helper T cells promotes immune responses by secreting GM-CSF.</a> Cell Death and Differentiation. 20, 1731-1741 (2013).</li>
<li>Croxford, A. L., Spath, S., Becher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF+in+Neuroinflammation%3A+Licensing+Myeloid+Cells+for+Tissue+Damage%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">GM-CSF in Neuroinflammation: Licensing Myeloid Cells for Tissue Damage.</a> Trends in Immunology. 36, 651-662 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Tutaj opisaliśmy protokół różnicowania in vitro THGM z naiwnych komórek CD4 + myszy, a następnie analizę zróżnicowanych komórek w celu walidacji metody. Warto zauważyć, że zarówno śledziona, jak i węzły chłonne mogą być wykorzystywane do naiwnego oczyszczania limfocytów T CD4 + i różnicowania THGM. Ekspresja cytokin określona przez wewnątrzkomórkowe barwienie cytokin w połączeniu z cytometrią przepływową wykazała, że około 55% komórek zostało nakłonionych do stania się komórkami wyrażającym...

Komórki pomocnicze T (TH) CD4+ są niezbędnymi składnikami układu odpornościowego, pełniąc kluczową rolę w obronie gospodarza przed patogenami bakteryjnymi, w nadzorze nad rakiem i w autoimmunizacji1,2,3. Po aktywacji receptora limfocytów T (TCR) naiwne limfocyty T CD4 + mogą różnicować się w limfocyty TH1,T H2, TH 17 lub regulatorowe komórki T (Treg) pod wpływem różnych środowisk cytokin2,4,5. Niedawno zidentyfikowano nowy podzbiór komórek TH, który głównie wytwarza GM-CSF, i nazwano go THGM6. Różnicowanie komórekT HGM jest napędzane przez IL-7 poprzez aktywację przetwornika sygnału i aktywatora transkrypcji 5 (STAT5). Komórki te wyrażają dużą ilość GM-CSF, mając jednocześnie niską ekspresję innych cytokin sygnaturowych limfocytówT H, takich jak IFNγ i IL-176. Stwierdzono, że GM-CSF odgrywa kluczową rolę w rozwoju zapalenia nerwów za pośrednictwem limfocytów T CD4 +7,8. W porównaniu z autoreaktywnymi limfocytami T z ekspresją IFNγ lub IL-17, limfocyty T z ekspresją GM-CSF przeniesione do myszy typu dzikiego (WT) powodowały wcześniejszy początek choroby i większe nasilenie choroby. Ponadto limfocyty T Csf2-/- nie indukowały eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE) po adoptywnym przeniesieniu do biorców WT, podczas gdy limfocyty T pozbawione IFNγ lub IL-17A zachowały zdolność do pośredniczenia w EAE7. Co więcej, blokada GM-CSF za pomocą przeciwciał neutralizujących złagodziła nasilenie choroby EAE8. Co więcej, niedobór STAT5 w limfocytach T u myszy skutkował zmniejszonym wytwarzaniem THGM, a co za tym idzie, odpornością myszy na rozwój EAE6. Odkrycia te podkreślają znaczenie limfocytówT H eksprymujących GM-CSF w autoimmunologicznej chorobie neurozapalnej. W związku z tym ustalenie metody różnicowania limfocytówT H wykazujących ekspresję GM-CSF od naiwnych limfocytów T CD4 + byłoby ważne w badaniu patogenezy autoimmunologicznego zapalenia nerwów i odpowiedzi immunologicznych za pośrednictwem limfocytów T. Jednak nie ustalono protokołu, który skutecznie generuje komórkiT HGM z mysich naiwnych CD4 +.
Tutaj prezentujemy metodę, która odróżnia mysie komórki THGM od naiwnych limfocytów T CD4+. Protokół ten opisuje całą procedurę, w tym ekstrakcję śledziony od myszy, przygotowanie zawiesiny jednokomórkowej, selekcję CD4 dodatnią, sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) oraz różnicowanie i analizę komórekTH. Zróżnicowane limfocyty pomocnicze T analizuje się za pomocą barwienia cytokin wewnątrzkomórkowych w połączeniu z cytometrią przepływową w celu określenia ekspresji cytokin na poziomie pojedynczej komórki, ilościowego PCR w czasie rzeczywistym w celu określenia ekspresji cytokin na poziomie mRNA oraz ELISA w celu oceny ekspresji cytokin na poziomie białka. Metoda ta może być stosowana do badań biologii komórek THGM w różnych warunkach, takich jak EAE, gdzie GM-CSF odgrywa ważną rolę w patogenezie.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Biowest</td><td>L0500-500</td><td></td></tr><tr><td>FBS Inaktywowany termicznie</td><td>Koziorożec</td><td>FBS-HI-12A</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>1. baza</td><td>BUF-2040-10</td><td>Rozcieńczony do 1x PBS w sterylnej wodzie</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>1. baza</td><td>BUF-1053-100ml-pH8.0</td><td></td></tr><tr><td>10x bufor</td> <td>ACKBiolegend</td><td>420301</td><td>rozcieńczony w sterylnej wodzie</td></tr><tr><td>Sitko do komórek</td><td>SPL Nauki Przyrodnicze</td><td>93070</td><td></td></tr><tr><td>Mikrogranulki CD4</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-049-201</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna LS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>stojak magnetyczny</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 1 ml</td> Wirówka <td>Terumo</td><td>SS+01T</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>Eppendorf 5810R</td><td></td></tr><tr><td>Sortownik komórek Sony SY3200</td><td></td> Sortownik <td></td><td>komórek Sony Sony SY3200</td></tr><tr><td>Stożkowa probówka wirówkowa 50 ml Stożkowa probówka</td> wirówkowa <td>Greiner Bio-One</td><td>210261</td><td></td></tr><tr><td>15 ml</td> Probówka <td></td><td></td> Greiner Bio-One 188271 <td></td></tr><tr><td>FACS</td><td>Corning</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka do hodowli komórkowej</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>anty-mysi CD4 PerCP-eFluor 710</td><td>eBioscience</td><td>46-0041-82</td><td></td></tr><tr><td>PE sprzężona anty-mysia CD25 (IL-2Ra, p55)</td><td>eBioscience</td><td>12-0251-82</td><td></td></tr><tr><td>anty-człowiek/mysz CD44 APC</td><td>eBioscience</td><td>17-0441-82</td><td></td></tr><tr><td>anty-mysz CD62L FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0621-85</td><td></td></tr><tr><td>Ulepszona przez Neubauera komora licząca</td><td>Marienfeld</td><td>640010</td><td></td></tr><tr><td>Hyclon Trypan Blue Solution</td><td>GE healthcare Nauki przyrodnicze</td><td>SV30084.01</td><td></td></tr><tr><td></td><td>mikroskop Nikon</td><td>Nikon Elipse TS100</td><td></td></tr><tr><td>Oczyszczony&nbsp; anty-mysz CD3e&nbsp; przeciwciało</td><td>Biolegend</td><td>100314</td><td></td></tr><tr><td>Oczyszczony chomik anty-mysz CD28</td><td>BD Biosciences</td><td>553295</td><td></td></tr><tr><td>Oczyszczony szczur&nbsp; anty-mysie IFN&gamma; &nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>16-7312-85</td><td></td></tr><tr><td>Oczyszczone przeciwciało anty-mysie IL-4</td><td>Biolegend</td><td>504102</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowane mysie białko IL-7</td><td>R& System D</td><td>407-ML</td><td></td></tr><tr><td>rekombinowany ludzki TGF-beta</td><td>R& System D</td><td>240-B-010</td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td>Merck Millipore</td><td>19-144</td><td></td></tr><tr><td>Jonomycyna</td><td>Sigma</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor transportu białek GolgiPlug</td><td>BD Biosciences</td><td>51-2301KZ</td><td></td></tr><tr><td>Utrwalanie wewnątrzkomórkowe i Zestaw permeabilizacji</td><td>eBioscience</td><td>88-8824-00</td><td></td></tr><tr><td>anty-mysi GM-CSF PE</td><td>eBioscience</td><td>12-7331-82</td><td></td></tr><tr><td>FITC anty-mysie IL-17A</td><td>Biolegend</td><td>506908</td><td></td></tr><tr><td>APC anty-mysie IFN-gamma</td><td>Biolegend</td><td>505810</td><td></td></tr><tr><td>GO Taq qPCR master mix</td><td>Mysz Promega</td><td>A6002</td><td></td></tr><tr><td>GM-CSF ELISA Ready-SET-Go!</td><td>invitrogen</td><td>88-7334-88</td><td></td></tr><tr><td>Mysz IL-17A Uncouted ELISA</td><td>invitrogen</td><td>88-7371-22</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro różnicowanie mysich komórek t helper (thgm) wytwarzających czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów makrofagów (gm-csf)

In Vitro Differentiation of Mouse Granulocyte-macrophage-colony-stimulating Factor (GM-CSF)-producing T Helper (THGM) Cells

Komórka T (THGM) wytwarzająca czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF) jest nowo zidentyfikowanym podzbiorem komórek pomocniczych T, który głównie wydziela GM-CSF bez wytwarzania interferonu (IFN)γ lub interleukiny (IL)-17 i odgrywa istotną rolę w autoimmunologicznym zapaleniu nerwów. Metoda izolacji naiwnych limfocytów T CD4 + z jednokomórkowej zawiesiny splenocytów i wytwarzania komórekT HGM z naiwnych limfocytów T CD4 + byłaby przydatną techniką w badaniu odporności za pośrednictwem limfocytów T i chorób autoimmunologicznych. Tutaj opisujemy metodę, która różnicuje naiwne mysie limfocyty T CD4 + w komórki THGM promowane przez IL-7. Wynik różnicowania oceniono poprzez analizę ekspresji cytokin przy użyciu różnych technik, w tym wewnątrzkomórkowego barwienia cytokin w połączeniu z cytometrią przepływową, ilościową reakcją łańcuchową polimerazy w czasie rzeczywistym (PCR) oraz testami immunoenzymatycznym (ELISA). Korzystając z opisanego tutaj protokołu różnicowaniaGM, około 55% komórek wykazywało ekspresję GM-CSF przy minimalnej ekspresji IFNα lub IL-17. Dominująca ekspresja GM-CSF przez komórki THGM została dodatkowo potwierdzona przez analizę ekspresji GM-CSF, IFNα i IL-17 zarówno na poziomie mRNA, jak i białka. W związku z tym metoda ta może być stosowana do różnicowania naiwnych limfocytów T CD4 + do komórek TH GM in vitro, co będzie przydatne w badaniu biologii komórek THGM.

Naiwne limfocyty T CD4+ wyizolowane z dwóch 8-tygodniowych samców myszy C57BL/6 podzielono na trzy części. Jedną część komórek zróżnicowano do komórek THGM zgodnie z opisanym protokołem. Inną część hodowano w warunkach różnicowania do THGM w obecności przeciwciała anty-IL-4 (10 µg/mL), aby zbadać wpływ blokady IL-4 na różnicowanie THGM. Ostatnią część hodowano w warunkach różnicowania do TH17 (3 µg/mL anty-CD3e, 1 µg/mL anty-CD28, 10 ng/mL TGFβ,...

Tutaj prezentujemy protokół różnicowania mysich komórek T pomocniczych (THGM) granulocytów, makrofagów, czynników stymulujących tworzenie kolonii od naiwnych limfocytów T CD4+, w tym izolację naiwnych limfocytów T CD4+, różnicowanie THGM i analizę zróżnicowanych komórek THGM. Metoda ta może być stosowana do badań nad regulacją i funkcją komórek THGM.

In vitro Różnicowanie mysich komórek T Helper (THGM) wytwarzających czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów makrofagów (GM-CSF)

The granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor (GM-CSF)-producing T helper (THGM) cell is a newly identified T helper cell subset that predominantly ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie limfocytów T CD4, takie jak to, który podzbiór komórek pomocniczych T jest głównym źródłem GM-CSF w patogenezie chorób zapalnych, takich jak stwardnienie rozsiane. Główną zaletą tej techniki jest to, że generuje ona ponad 50% komórek T z ekspresją GM-CSF z naiwnych limfocytów T CD4 bez lub z kilkoma interferującymi komórkami ekspresyjnymi gamma OI17, które stanowią niezbędne źródło komórkowe do badania regresji i funkcji THGM, nowego podzbioru komórek pomocniczych T. Procedurę zademonstruje Yi Lu, doktorant z mojego laboratorium.Zacznij od użycia kleszczy, aby unieść skórę nad brzuchem myszy w wieku od sześciu do ośmiu tygodni i wykonać około czterocentymetrowe nacięcie poniżej klatki piersiowej po lewej stronie zwierzęcia. Otwórz worek otrzewnowy, aby odsłonić śledzionę i użyj sterylnych kleszczy, aby przenieść śledzionę na sitko o średnicy 70 mikrometrów, wstępnie zwilżone dwoma mililitrami buforu do izolacji komórek. Po pobraniu dwóch do trzech śledzion, użyj końcówki pięciomililitrowej strzykawki do maceracji tkanki śledziony i przepłucz sitko kilka razy jednym do dwóch mililitrów buforu do izolacji komórek, aż

in-vitro-differentiation-mouse-granulocyte-macrophage-colony

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film pokazuje proces wstępowania pierwotnych monocytów do makrofagów. Pierwotne ludzkie monocyty można wyizolować i zróżnicować do fenotypu prozapalnego podobnego do M1 przy użyciu czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów-makrofagów (GM-CSF) lub do fenotypu przeciwzapalnego podobnego do M2 za pomocą czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF).

Hodowla in vitro i różnicowanie pierwotnych monocytów do makrofagów

Ten film pokazuje in vitro różnicowanie czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów, makrofagów lub komórek pomocniczych T G (THGM). Wyizolowane naiwne limfocyty T są stymulowane do różnicowania się w THGM, co potwierdza się poprzez wykrycie wysokiej wewnątrzkomórkowej produkcji GM-CSF i niskiej ekspresji innych cytokin specyficznych dla komórek T pomocniczych.

Technika in vitro do różnicowania komórek T pomocniczych wytwarzających GM-CSF od naiwnych limfocytów T

Mysie embrionalne komórki macierzyste mogą być różnicowane do limfocytów T in vitro za pomocą systemu kohodowli OP9-DL1. Powodzenie tej procedury wymaga zwrócenia szczególnej uwagi na konserwację odczynnika/ogniwa oraz kluczowych kroków wrażliwych na technikę. W tym miejscu omawiamy te krytyczne parametry i przedstawiamy szczegółowy protokół, aby zachęcić do przyjęcia tej technologii.

Wyprowadzanie limfocytów T in vitro z embrionalnych komórek macierzystych myszy

Naiwne limfocyty T CD4+ polaryzują się na różne podzbiory w zależności od środowiska w momencie aktywacji.  Różnicowanie naiwnych limfocytów T CD4 + do różnych podzbiorów efektorowych można osiągnąć in vitro poprzez dodanie bodźców receptora limfocytów T i specyficznych sygnałów cytokin.

Naiwna izolacja mysich limfocytów T CD4 + i różnicowanie in vitro w podzbiory limfocytów T

Komórki szpiku kostnego hodowane za pomocą czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów granulocytów (GM-CSF) generują heterogeniczną hodowlę zawierającą makrofagi i komórki dendrytyczne (DC). Metoda ta kładzie nacisk na wykorzystanie wiązania MHCII i hialuronianu (HA) w celu odróżnienia makrofagów od DC w kulturze GM-CSF. Makrofagi w tej kulturze mają wiele podobieństw do makrofagów pęcherzykowych.

Generowanie i identyfikacja makrofagów i komórek dendrytycznych pochodzących z GM-CSF

Przedstawiono protokół dla hodowli komórkowej makrofagów makrofagów stymulujących tworzenie kolonii (M-CSF) zróżnicowanych ludzkich makrocytów pochodzących z monocytów. Protokół wykorzystuje krioprezerwację monocytów w połączeniu z ich masowym różnicowaniem do makrofagów. Następnie zebrane makrofagi można następnie wysiać w studzienkach hodowlanych o wymaganej gęstości komórek do przeprowadzenia eksperymentów.

Posiew czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów Zróżnicowane ludzkie makrofagi pochodzące z monocytów

Tutaj przedstawiono szczegółowe protokoły hodowli mysiego prekursora mieloidu linii komórkowej 32D/G-CSF-R, przeprowadzania infekcji wirusowych oraz przeprowadzania testów proliferacji i różnicowania. Ta linia komórkowa nadaje się do badania rozwoju komórek szpikowych oraz roli genów będących przedmiotem zainteresowania we wzroście komórek szpikowych i różnicowaniu neutrofilów.

Proliferacja i różnicowanie mysich komórek prekursorowych mieloidu 32D/G-CSF-R

Tutaj udostępniamy metodę identyfikacji i izolowania dużej liczby komórek szpikowych sterowanych przez GM-CSF za pomocą szybkiego sortowania komórek. Na podstawie ekspresji Ly6C i CD115 można zidentyfikować pięć odrębnych populacji (pospolite przodki szpiku, progenitorzy granulocytów/makrofagów, monocyty, makrofagi pochodzące z monocytów i DC pochodzące z monocytów).

Generowanie dużej liczby progenitorów szpiku i prekursorów komórek dendrytycznych z mysiego szpiku kostnego przy użyciu nowej strategii sortowania komórek

To badanie opisuje metodę izolowania z embrionalnych komórek macierzystych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wzbogaconych egzosomami przenoszących czynniki stymulujące tworzenie kolonii granulocytów makrofagów granulocytów.

Izolacja wzbogaconych egzosomami pęcherzyków zewnątrzkomórkowych przenoszących czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów z embrionalnych komórek macierzystych

Ten protokół opisuje solidne generowanie makrofagów z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych oraz metody ich późniejszej charakterystyki. Ekspresja markerów powierzchniowych komórek, ekspresja genów i testy funkcjonalne są wykorzystywane do oceny fenotypu i funkcji tych makrofagów pochodzących z iPSC.

Produkcja i charakterystyka ludzkich makrofagów z pluripotencjalnych komórek macierzystych

Poznaj metodę różnicowania mysich komórek T H GM produkujących GM-CSF z naiwnych komórek CD4+. Protokół ten generuje ponad 50% komórek ekspresujących GM-CSF, zapewniając wartościowe źródło komórkowe do badań immunologicznych.

In vitro Różnicowanie mysich komórek T Helper (THGM) wytwarzających czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów makrofagów (GM-CSF) (Wideo) | JoVE Journal

In vitro Różnicowanie mysich komórek T Helper (T_HGM) wytwarzających czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów makrofagów (GM-CSF)

Przeglądaj więcej filmów