Name: In vitro Różnicowanie mysich komórek T Helper (THGM) wytwarzających czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów makrofagów (GM-CSF) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Poznaj metodę różnicowania mysich komórek T H GM produkujących GM-CSF z naiwnych komórek CD4+. Protokół ten generuje ponad 50% komórek ekspresujących GM-CSF, zapewniając wartościowe źródło komórkowe do badań immunologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez granty z National University Health System of Singapore (T1-2014 Oct-12 i T1-2015 Sep-10).

Wszystkie myszy użyte w tym protokole były na tle genetycznym C57BL/6 i trzymane w określonych warunkach wolnych od patogenów na Narodowym Uniwersytecie Singapuru. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono przy użyciu protokołów zatwierdzonych przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Narodowego Uniwersytetu Singapuru.
1. Przygotowanie odczynnika i materiału
<ol>
	<li>Przygotować 500 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) zawierającej 2% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA). 
	UWAGA: Utrzymuj bufor na lodzie przez cały czas trwania procedury, aby uzyskać optymalne wyniki.</li>
	<li>Przygotuj 50 ml kompletnej pożywki RPMI zawierającej RPMI 1640, 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny. Do różnicowania komórek THGM Użyj kompletnych pożywek RPMI zawierających 50 μM β-merkaptoetanolu. Dodaj β-merkaptoetanol do dygestoria.</li>
	<li>Przygotować 7,5 ml mieszaniny przeciwciał anty-CD3e, rozcieńczając skoncentrowany zapas anty-CD3e do 3 μg/ml w PBS. Pokryć płytki 48-dołkowe, dodając 150 μl mieszaniny przeciwciał do każdej studzienki i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę lub w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
	<li>Wysterylizuj nożyczki i kleszcze i przechowuj je w 70% etanolu między sekcjami.</li>
</ol>
2. Przygotowanie mysich splenocytów
<ol>
	<li>Poddaj mysz eutanazji myszy (w wieku 6-8 tygodni) za pomocą instytucjonalnie zatwierdzonego uduszenia CO2 lub zwichnięcia szyjki macicy. Spryskaj mysz 70% etanolem i zamontuj ją na bloku styropianowym z tyłu. Przenieś mysz do szafy bezpieczeństwa biologicznego, aby wykonać następujące kroki.</li>
	<li>Przytrzymaj skórę za pomocą kleszczy i przetnij skórę poniżej klatki piersiowej po lewej stronie na około 4 cm, używając nożyczek. Otwórz worek otrzewnowy, aby odsłonić śledzionę i użyj sterylnych kleszczy, aby usunąć śledzionę.</li>
	<li>Umieść sitko o pojemności 70 μm na probówce o pojemności 50 ml i wstępnie zwilż je 2 ml buforu. Umieść śledziony na sitku do komórek (2-3 śledziony na jedno sitko do komórek) i zmaceruj je za pomocą końcówki tłoka strzykawki o pojemności 5 ml.</li>
	<li>Przepłucz sitko i probówkę kilka razy 1–2 ml buforu do izolacji komórek, aż wszystkie komórki zostaną wypłukane do probówki. Odrzucić sitko do komórek i odwirowywać komórki przy sile 350 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy z 5 ml zimnego (4 °C) buforu lizującego chlorek amonu i potasu (ACK) (150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM Na2EDTA; pH 7,2–7,4) i delikatnie mieszać przez 2 minuty. Dodać 10 ml kompletnej pożywki RPMI, aby zneutralizować bufor ACK i natychmiast odwirować komórki przy 350 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Wyrzucić supernatant po wirowania.</li>
</ol>
3. Izolacja limfocytów T CD4+ za pomocą magnetycznych mikrokulek CD4 i kolumny do separacji komórek
<ol>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 5 ml buforu do izolacji komórek. Przefiltruj zawiesinę komórek za pomocą filtra wstępnej separacji (30 μm) do nowej probówki o pojemności 15 ml, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia.</li>
	<li>Pobrać 10 μl zawiesiny komórek i rozcieńczyć 10x, dodając 90 μl buforu. Pobrać 10 μl rozcieńczonej zawiesiny komórek i wymieszać ją z 10 μl błękitu trypanowego w celu zliczenia komórek. Policz komórki w hemocytometrze, aby określić wydajność żywotnych komórek.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 350 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 90 μl buforu na 10-7 komórek. Dodaj 10 μl magnetycznych mikrokulek CD4 na 107 komórek. Inkubować komórki przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Aby uzyskać optymalne wyniki, delikatnie mieszaj zawiesinę komórkową co 5 minut podczas inkubacji.</li>
	<li>Podczas inkubacji komórek umieść kolumnę separacyjną na stojaku magnetycznym. Wstępnie zwilżyć kolumnę 2 ml buforu.</li>
	<li>Pod koniec inkubacji komórki/kulki przemyć komórki 5 ml buforu i odwirować je przy 350 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 1 ml buforu, załadować próbkę do kolumny separacji komórek i pozwolić jej przepłynąć. Użyj probówki wirówkowej o pojemności 15 ml, aby zebrać frakcję komórek CD4. Dodać 1 ml buforu, aby umyć zbiornik przed wyschnięciem. Powtórz krok prania 2x.</li>
	<li>Wyjmij kolumnę do separacji komórek ze stojaka magnetycznego i umieść ją na nowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml. Dodać 2 ml buforu do izolacji komórek do kolumny do separacji komórek i mocno przyłożyć tłok, aby wypchnąć komórki z kolumny.</li>
	<li>Odwirować frakcję o sile 350 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu uzyskania komórek CD4+. Odrzucić supernatant.</li>
</ol>
4. Oczyszczanie naiwnych limfocytów T CD4+ (CD4+CD25-CD44loCD62Lhi) przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją i różnicowanie THGM
<ol>
	<li>Otrzymany osad komórek CD4+ zawiesić ponownie w 500 μl buforu. Wymieszaj komórki z mieszaniną przeciwciał sprzężonych z fluorescencją zawierającą CD4-PerCp (2,8 μg/ml), CD44-APC (2,4 μg/ml), CD25-PE (2 μg/ml) i CD62L-FITC (10 μg/ml) (Tabela 1). Inkubuj komórki na lodzie przez 20–30 minut, chroniąc je przed światłem. 
	UWAGA: Stężenia przeciwciał zostały wcześniej zoptymalizowane w laboratorium. Podana liczba przeciwciał dotyczy komórek od 1 do 2 myszy.</li>
	<li>Po inkubacji przemyć komórki 5 ml buforu i odwirować komórki przy 350 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 500 μl buforu. Ponownie przefiltruj komórki za pomocą nylonowej siatki.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę komórek do probówki FACS w celu sortowania komórek. Wstępnie pokryj probówki z kolekcją FACS 500 μl buforu.</li>
	<li>Uzyskaj populacjęhi CD4 + CD25-CD44loCD62L (naiwnych limfocytów T CD4 +) przez sortowanie FACS. Najpierw należy wziąć bramkę na CD4 + CD25-, a następnie wybrać komórkihi CD44loCD62L z tej populacji.</li>
	<li>Zbierz naiwne frakcje limfocytów T CD4 + do nowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Odwirować komórki przy 350 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Ponownie zawiesić naiwne limfocyty T CD4 + w stężeniu 106 komórek/ml w kompletnym pożywce RPMI zawierającej 50 μM β-merkaptoetanolu.</li>
	<li>Odessać przeciwciała anty-CD3e używane do wstępnego powlekania w płytce 48-dołkowej. Zasiaj 0,25 miliona (250 μl) komórek w każdym dołku z IL-7 (2 ng / ml), anty-CD28 (1 μg / ml) i anty-IFNγ (10 μg / ml) (tabela 1). 
	UWAGA: Stężenia cytokin i przeciwciał zostały wcześniej zoptymalizowane w laboratorium pod kątem różnicowania komórekT HGM.</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 3 dni. Nie zmieniaj pożywki podczas inkubacji.</li>
</ol>
5. Analiza mysich komórek G G wygenerowanych in vitro
<ol>
	<li>Za pomocą mikroskopu sprawdź różnicowanie komórek 3 dni po różnicowaniu. Zebrać komórki i odwirować je przy 350 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Umyć komórki 2x za pomocą kompletnej pożywki RPMI. 
	UWAGA: Zróżnicowane komórki są większe niż naiwne limfocyty T CD4 +.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 1 ml kompletnego podłoża RPMI. Weź 10 μl zawiesiny komórek i dobrze wymieszaj ją z 10 μl błękitu trypanowego, aby określić liczbę komórek za pomocą hemocytometru. Podziel zróżnicowane komórki na trzy mikstury w celu ponownej stymulacji i analizy. 
	UWAGA: Barwienie cytokin wewnątrzkomórkowych i testy ELISA wymagają ≥0,5 miliona komórek, a analiza qPCR wymaga ≥ 1 miliona komórek.</li>
	<li>W celu barwienia cytokin wewnątrzkomórkowych należy ponownie stymulować komórki 12-mirystynianem 13-octanu forbolu (PMA) (100 ng/ml) i jonomycyną (1 μg/ml) w obecności inhibitora transportu białek (1 μl/ml) przez 4–6 godzin.
	<ol>
		<li>Zbierz komórki i wybarwić je przeciwciałem anty-CD4 (sprzężonym z PerCP, 0,2 mg/ml, rozcieńczenie 1:100; lub sprzężonym z FITC, 0,5 mg/ml, rozcieńczenie 1:100) przez 30 minut.</li>
		<li>Utrwalić komórki za pomocą 200 μl buforu utrwalającego przez 20–60 minut. Po utrwaleniu przemyć komórki 2x 1 ml buforu do permeabilizacji.</li>
		<li>Wykonaj barwienie wewnątrzkomórkowe przeciwciałami przeciwko GM-CSF (sprzężony z PE, 0,2 mg/ml, rozcieńczenie 1:100), IL-17A (sprzężony z FITC, 0,5 mg/ml, rozcieńczenie 1:100; APC-sprzężony, 0,2 mg/ml, rozcieńczenie 1:100), IL-4 (sprzężony APC, 0,2 mg/ml, rozcieńczenie 1:100) i IFNγ (sprzężony APC, 0,2 mg/ml, rozcieńczenie 1:100; PE-sprzężony, 0,2 mg/ml, rozcieńczenie 1:100) przez 30 minut w ciemności.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W celu analizy qPCR ekspresji genu cytokin przez zróżnicowane komórki, aktywuj komórki za pomocą związanego z płytką anty-CD3e (3 μg/ml) (wstępnie powlekając płytkę, jak opisano w kroku 1.3). Po 3 godzinach od stymulacji zbierz komórki, aby wyizolować całkowite RNA za pomocą odczynnika do ekstrakcji fenolowego RNA w celu przygotowania cDNA do qPCR. Startery i program używane do qPCR są wymienione odpowiednio w tabelach 2 i 3.</li>
	<li>W celu analizy wydzielania białka cytokiny przez zróżnicowane komórki, należy ponownie stymulować komórki za pomocą związanego z płytką anty-CD3e (3 μg/ml) przez 24 godziny (wstępne powlekanie płytki zgodnie z opisem w kroku 1.3). Pobrać supernatant hodowli komórkowej dla IL-17 i GM-CSF ELISA, aby określić ich stężenia.</li>
</ol>

<ol><li>Zhu, J., Paul, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4+T+cells%3A+fates%2C+functions%2C+and+faults%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD4 T cells: fates, functions, and faults.</a> Blood. 112, 1557-1569 (2008).</li>
<li>Kara, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailored+immune+responses%3A+novel+effector+helper+T+cell+subsets+in+protective+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Tailored immune responses: novel effector helper T cell subsets in protective immunity.</a> PLoS Pathogens. 10, e1003905(2014).</li>
<li>Bou Nasser Eddine, F., Ramia, E., Tosi, G., Forlani, G., Accolla, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Immunology+meets...Immunology%3A+Modified+cancer+cells+as+professional+APC+for+priming+naive+tumor-specific+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Tumor Immunology meets...Immunology: Modified cancer cells as professional APC for priming naive tumor-specific CD4+ T cells.</a> Oncoimmunology. 6, e1356149(2017).</li>
<li>Dong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TH17+cells+in+development%3A+an+updated+view+of+their+molecular+identity+and+genetic+programming%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">TH17 cells in development: an updated view of their molecular identity and genetic programming.</a> Nature Reviews. Immunology. 8, 337-348 (2008).</li>
<li>Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-17+and+Th17+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">IL-17 and Th17 Cells.</a> Annual Review of Immunology. 27, 485-517 (2009).</li>
<li>Sheng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT5+programs+a+distinct+subset+of+GM-CSF-producing+T+helper+cells+that+is+essential+for+autoimmune+neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">STAT5 programs a distinct subset of GM-CSF-producing T helper cells that is essential for autoimmune neuroinflammation.</a> Cell Research. 24, 1387-1402 (2014).</li>
<li>Codarri, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RORgammat+drives+production+of+the+cytokine+GM-CSF+in+helper+T+cells%2C+which+is+essential+for+the+effector+phase+of+autoimmune+neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">RORgammat drives production of the cytokine GM-CSF in helper T cells, which is essential for the effector phase of autoimmune neuroinflammation.</a> Nature Immunology. 12, 560-567 (2011).</li>
<li>El-Behi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+encephalitogenicity+of+T%28H%2917+cells+is+dependent+on+IL-1-+and+IL-23-induced+production+of+the+cytokine+GM-CSF%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">The encephalitogenicity of T(H)17 cells is dependent on IL-1- and IL-23-induced production of the cytokine GM-CSF.</a> Nature Immunology. 12, 568-575 (2011).</li>
<li>Ivanov, I. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+orphan+nuclear+receptor+RORgammat+directs+the+differentiation+program+of+proinflammatory+IL-17%2B+T+helper+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells.</a> Cell. 126, 1121-1133 (2006).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+subset+of+helper+T+cells+promotes+immune+responses+by+secreting+GM-CSF%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">A novel subset of helper T cells promotes immune responses by secreting GM-CSF.</a> Cell Death and Differentiation. 20, 1731-1741 (2013).</li>
<li>Croxford, A. L., Spath, S., Becher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF+in+Neuroinflammation%3A+Licensing+Myeloid+Cells+for+Tissue+Damage%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">GM-CSF in Neuroinflammation: Licensing Myeloid Cells for Tissue Damage.</a> Trends in Immunology. 36, 651-662 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Tutaj opisaliśmy protokół różnicowania in vitro THGM z naiwnych komórek CD4 + myszy, a następnie analizę zróżnicowanych komórek w celu walidacji metody. Warto zauważyć, że zarówno śledziona, jak i węzły chłonne mogą być wykorzystywane do naiwnego oczyszczania limfocytów T CD4 + i różnicowania THGM. Ekspresja cytokin określona przez wewnątrzkomórkowe barwienie cytokin w połączeniu z cytometrią przepływową wykazała, że około 55% komórek zostało nakłonionych do stania się komórkami wyrażającym...

Komórki pomocnicze T (TH) CD4+ są niezbędnymi składnikami układu odpornościowego, pełniąc kluczową rolę w obronie gospodarza przed patogenami bakteryjnymi, w nadzorze nad rakiem i w autoimmunizacji1,2,3. Po aktywacji receptora limfocytów T (TCR) naiwne limfocyty T CD4 + mogą różnicować się w limfocyty TH1,T H2, TH 17 lub regulatorowe komórki T (Treg) pod wpływem różnych środowisk cytokin2,4,5. Niedawno zidentyfikowano nowy podzbiór komórek TH, który głównie wytwarza GM-CSF, i nazwano go THGM6. Różnicowanie komórekT HGM jest napędzane przez IL-7 poprzez aktywację przetwornika sygnału i aktywatora transkrypcji 5 (STAT5). Komórki te wyrażają dużą ilość GM-CSF, mając jednocześnie niską ekspresję innych cytokin sygnaturowych limfocytówT H, takich jak IFNγ i IL-176. Stwierdzono, że GM-CSF odgrywa kluczową rolę w rozwoju zapalenia nerwów za pośrednictwem limfocytów T CD4 +7,8. W porównaniu z autoreaktywnymi limfocytami T z ekspresją IFNγ lub IL-17, limfocyty T z ekspresją GM-CSF przeniesione do myszy typu dzikiego (WT) powodowały wcześniejszy początek choroby i większe nasilenie choroby. Ponadto limfocyty T Csf2-/- nie indukowały eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE) po adoptywnym przeniesieniu do biorców WT, podczas gdy limfocyty T pozbawione IFNγ lub IL-17A zachowały zdolność do pośredniczenia w EAE7. Co więcej, blokada GM-CSF za pomocą przeciwciał neutralizujących złagodziła nasilenie choroby EAE8. Co więcej, niedobór STAT5 w limfocytach T u myszy skutkował zmniejszonym wytwarzaniem THGM, a co za tym idzie, odpornością myszy na rozwój EAE6. Odkrycia te podkreślają znaczenie limfocytówT H eksprymujących GM-CSF w autoimmunologicznej chorobie neurozapalnej. W związku z tym ustalenie metody różnicowania limfocytówT H wykazujących ekspresję GM-CSF od naiwnych limfocytów T CD4 + byłoby ważne w badaniu patogenezy autoimmunologicznego zapalenia nerwów i odpowiedzi immunologicznych za pośrednictwem limfocytów T. Jednak nie ustalono protokołu, który skutecznie generuje komórkiT HGM z mysich naiwnych CD4 +.
Tutaj prezentujemy metodę, która odróżnia mysie komórki THGM od naiwnych limfocytów T CD4+. Protokół ten opisuje całą procedurę, w tym ekstrakcję śledziony od myszy, przygotowanie zawiesiny jednokomórkowej, selekcję CD4 dodatnią, sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) oraz różnicowanie i analizę komórekTH. Zróżnicowane limfocyty pomocnicze T analizuje się za pomocą barwienia cytokin wewnątrzkomórkowych w połączeniu z cytometrią przepływową w celu określenia ekspresji cytokin na poziomie pojedynczej komórki, ilościowego PCR w czasie rzeczywistym w celu określenia ekspresji cytokin na poziomie mRNA oraz ELISA w celu oceny ekspresji cytokin na poziomie białka. Metoda ta może być stosowana do badań biologii komórek THGM w różnych warunkach, takich jak EAE, gdzie GM-CSF odgrywa ważną rolę w patogenezie.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Biowest</td><td>L0500-500</td><td></td></tr><tr><td>FBS Inaktywowany termicznie</td><td>Koziorożec</td><td>FBS-HI-12A</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>1. baza</td><td>BUF-2040-10</td><td>Rozcieńczony do 1x PBS w sterylnej wodzie</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>1. baza</td><td>BUF-1053-100ml-pH8.0</td><td></td></tr><tr><td>10x bufor</td> <td>ACKBiolegend</td><td>420301</td><td>rozcieńczony w sterylnej wodzie</td></tr><tr><td>Sitko do komórek</td><td>SPL Nauki Przyrodnicze</td><td>93070</td><td></td></tr><tr><td>Mikrogranulki CD4</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-049-201</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna LS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>stojak magnetyczny</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 1 ml</td> Wirówka <td>Terumo</td><td>SS+01T</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>Eppendorf 5810R</td><td></td></tr><tr><td>Sortownik komórek Sony SY3200</td><td></td> Sortownik <td></td><td>komórek Sony Sony SY3200</td></tr><tr><td>Stożkowa probówka wirówkowa 50 ml Stożkowa probówka</td> wirówkowa <td>Greiner Bio-One</td><td>210261</td><td></td></tr><tr><td>15 ml</td> Probówka <td></td><td></td> Greiner Bio-One 188271 <td></td></tr><tr><td>FACS</td><td>Corning</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka do hodowli komórkowej</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>anty-mysi CD4 PerCP-eFluor 710</td><td>eBioscience</td><td>46-0041-82</td><td></td></tr><tr><td>PE sprzężona anty-mysia CD25 (IL-2Ra, p55)</td><td>eBioscience</td><td>12-0251-82</td><td></td></tr><tr><td>anty-człowiek/mysz CD44 APC</td><td>eBioscience</td><td>17-0441-82</td><td></td></tr><tr><td>anty-mysz CD62L FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0621-85</td><td></td></tr><tr><td>Ulepszona przez Neubauera komora licząca</td><td>Marienfeld</td><td>640010</td><td></td></tr><tr><td>Hyclon Trypan Blue Solution</td><td>GE healthcare Nauki przyrodnicze</td><td>SV30084.01</td><td></td></tr><tr><td></td><td>mikroskop Nikon</td><td>Nikon Elipse TS100</td><td></td></tr><tr><td>Oczyszczony&nbsp; anty-mysz CD3e&nbsp; przeciwciało</td><td>Biolegend</td><td>100314</td><td></td></tr><tr><td>Oczyszczony chomik anty-mysz CD28</td><td>BD Biosciences</td><td>553295</td><td></td></tr><tr><td>Oczyszczony szczur&nbsp; anty-mysie IFN&gamma; &nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>16-7312-85</td><td></td></tr><tr><td>Oczyszczone przeciwciało anty-mysie IL-4</td><td>Biolegend</td><td>504102</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowane mysie białko IL-7</td><td>R& System D</td><td>407-ML</td><td></td></tr><tr><td>rekombinowany ludzki TGF-beta</td><td>R& System D</td><td>240-B-010</td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td>Merck Millipore</td><td>19-144</td><td></td></tr><tr><td>Jonomycyna</td><td>Sigma</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor transportu białek GolgiPlug</td><td>BD Biosciences</td><td>51-2301KZ</td><td></td></tr><tr><td>Utrwalanie wewnątrzkomórkowe i Zestaw permeabilizacji</td><td>eBioscience</td><td>88-8824-00</td><td></td></tr><tr><td>anty-mysi GM-CSF PE</td><td>eBioscience</td><td>12-7331-82</td><td></td></tr><tr><td>FITC anty-mysie IL-17A</td><td>Biolegend</td><td>506908</td><td></td></tr><tr><td>APC anty-mysie IFN-gamma</td><td>Biolegend</td><td>505810</td><td></td></tr><tr><td>GO Taq qPCR master mix</td><td>Mysz Promega</td><td>A6002</td><td></td></tr><tr><td>GM-CSF ELISA Ready-SET-Go!</td><td>invitrogen</td><td>88-7334-88</td><td></td></tr><tr><td>Mysz IL-17A Uncouted ELISA</td><td>invitrogen</td><td>88-7371-22</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro różnicowanie mysich komórek t helper (thgm) wytwarzających czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów makrofagów (gm-csf)

In Vitro Differentiation of Mouse Granulocyte-macrophage-colony-stimulating Factor (GM-CSF)-producing T Helper (THGM) Cells

Komórka T (THGM) wytwarzająca czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF) jest nowo zidentyfikowanym podzbiorem komórek pomocniczych T, który głównie wydziela GM-CSF bez wytwarzania interferonu (IFN)γ lub interleukiny (IL)-17 i odgrywa istotną rolę w autoimmunologicznym zapaleniu nerwów. Metoda izolacji naiwnych limfocytów T CD4 + z jednokomórkowej zawiesiny splenocytów i wytwarzania komórekT HGM z naiwnych limfocytów T CD4 + byłaby przydatną techniką w badaniu odporności za pośrednictwem limfocytów T i chorób autoimmunologicznych. Tutaj opisujemy metodę, która różnicuje naiwne mysie limfocyty T CD4 + w komórki THGM promowane przez IL-7. Wynik różnicowania oceniono poprzez analizę ekspresji cytokin przy użyciu różnych technik, w tym wewnątrzkomórkowego barwienia cytokin w połączeniu z cytometrią przepływową, ilościową reakcją łańcuchową polimerazy w czasie rzeczywistym (PCR) oraz testami immunoenzymatycznym (ELISA). Korzystając z opisanego tutaj protokołu różnicowaniaGM, około 55% komórek wykazywało ekspresję GM-CSF przy minimalnej ekspresji IFNα lub IL-17. Dominująca ekspresja GM-CSF przez komórki THGM została dodatkowo potwierdzona przez analizę ekspresji GM-CSF, IFNα i IL-17 zarówno na poziomie mRNA, jak i białka. W związku z tym metoda ta może być stosowana do różnicowania naiwnych limfocytów T CD4 + do komórek TH GM in vitro, co będzie przydatne w badaniu biologii komórek THGM.

Naiwne limfocyty T CD4+ wyizolowane z dwóch 8-tygodniowych samców myszy C57BL/6 podzielono na trzy części. Jedną część komórek zróżnicowano do komórek THGM zgodnie z opisanym protokołem. Inną część hodowano w warunkach różnicowania do THGM w obecności przeciwciała anty-IL-4 (10 µg/mL), aby zbadać wpływ blokady IL-4 na różnicowanie THGM. Ostatnią część hodowano w warunkach różnicowania do TH17 (3 µg/mL anty-CD3e, 1 µg/mL anty-CD28, 10 ng/mL TGFβ,...

Tutaj prezentujemy protokół różnicowania mysich komórek T pomocniczych (THGM) granulocytów, makrofagów, czynników stymulujących tworzenie kolonii od naiwnych limfocytów T CD4+, w tym izolację naiwnych limfocytów T CD4+, różnicowanie THGM i analizę zróżnicowanych komórek THGM. Metoda ta może być stosowana do badań nad regulacją i funkcją komórek THGM.

In vitro Różnicowanie mysich komórek T Helper (THGM) wytwarzających czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów makrofagów (GM-CSF)

The granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor (GM-CSF)-producing T helper (THGM) cell is a newly identified T helper cell subset that predominantly ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie limfocytów T CD4, takie jak to, który podzbiór komórek pomocniczych T jest głównym źródłem GM-CSF w patogenezie chorób zapalnych, takich jak stwardnienie rozsiane. Główną zaletą tej techniki jest to, że generuje ona ponad 50% komórek T z ekspresją GM-CSF z naiwnych limfocytów T CD4 bez lub z kilkoma interferującymi komórkami ekspresyjnymi gamma OI17, które stanowią niezbędne źródło komórkowe do badania regresji i funkcji THGM, nowego podzbioru komórek pomocniczych T. Procedurę zademonstruje Yi Lu, doktorant z mojego laboratorium.Zacznij od użycia kleszczy, aby unieść skórę nad brzuchem myszy w wieku od sześciu do ośmiu tygodni i wykonać około czterocentymetrowe nacięcie poniżej klatki piersiowej po lewej stronie zwierzęcia. Otwórz worek otrzewnowy, aby odsłonić śledzionę i użyj sterylnych kleszczy, aby przenieść śledzionę na sitko o średnicy 70 mikrometrów, wstępnie zwilżone dwoma mililitrami buforu do izolacji komórek. Po pobraniu dwóch do trzech śledzion, użyj końcówki pięciomililitrowej strzykawki do maceracji tkanki śledziony i przepłucz sitko kilka razy jednym do dwóch mililitrów buforu do izolacji komórek, aż wszystkie komórki zostaną przepłukane do probówki.Zebrać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach buforu do lizy potasu z chlorkiem amonu o temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po dwóch minutach delikatnego mieszania przerwij lizę za pomocą 10 mililitrów kompletnej pożywki RPMI i natychmiast odwiruj komórki. Aby wyizolować limfocyty T CD4-dodatnie, ponownie zawieś osad białych krwinek w pięciu mililitrach bufora do izolacji komórek i przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko o średnicy 30 mikrometrów do nowej rurki o pojemności 15 mililitrów, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia.Po zliczeniu ponownie zawiesić komórki w ilości od 10 do siódmych komórek na 90 mikrolitrów stężenia buforu i dodać 10 mikrolitrów sprzężonych kulek magnetycznych anty-CD4 na jeden razy 10 do siódmych komórek na 15-minutową inkubację w temperaturze czterech stopni Celsjusza z mieszaniem co pięć minut. Podczas inkubacji komórek umieść kolumnę separacyjną na stojaku magnetycznym i wstępnie zwilż kolumnę dwoma mililitrami buforu. Następnie przemyj komórki pięcioma mililitrami buforu i ponownie zawieś osad w jednym mililitrze buforu.Załaduj próbkę do kolumny i zbierz frakcję ujemną CD4 w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów. Gdy wszystkie komórki przejdą przez kolumnę, umyj zbiornik trzy razy jednym mililitrem buforu na popłuczynie, zanim wyschnie. Po ostatnim płukaniu przenieś kolumnę do nowej 15-mililitrowej rurki stożkowej i zanurz kolumnę w dwóch mililitrach buforu do izolacji komórek, aby usunąć dodatnią frakcję kulkową.Następnie zbierz komórki CD4-dodatnie przez odwirowanie. W celu aktywowanego fluorescencją sortowania komórek naiwnych limfocytów T, należy ponownie zawiesić posortowaną kulkami osadkę komórek CD4 dodatnich w 500 mikrolitrach buforu i wymieszać komórki z odpowiednim koktajlem przeciwciał sprzężonych z fluorescencją. Po 20 do 30 minutach na lodzie chronionym przed światłem, umyj komórki w pięciu mililitrach świeżego buforu i ponownie zawieś osad w 500 mikrolitrach świeżego buforu.Przefiltruj komórki przez nylonową siatkę i przenieś komórki do probówki FACS wstępnie pokrytej 500 mikrolitrami buforu. Bramka do wyboru CD4 dodatnich, CD25 ujemnych i CD44 niskich ligów CD62 i wysokich populacji komórek. Następnie posortuj naiwne CD4 dodatnie CD25 ujemne CD44 o niskiej zawartości ligu CD62 i wysokie frakcje limfocytów T do nowej 15-mililitrowej probówki wirówkowej i osadzaj izolowane naiwne limfocyty T CD4 dodatnie przez wirowanie.W celu różnicowania komórek T-pomocniczych makrofagów granulocytów lub GM-CSF należy ponownie zawiesić posortowane limfocyty T w stężeniu od jednego razy 10 do szóstego na mililitr w kompletnej pożywce RPMI zawierającej 50 mikromolowy beta-merkaptoetanol i odessać przeciwciało anty-CD3 epsilon z każdej studzienki wstępnie pokrytej 48-dołkowej płytki. Następnie wysiewaj 2,5 razy 10 do piątej komórki do każdej studzienki wraz z IL7, anty-CD28 i anty-IFN gamma i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 przez trzy dni. W trzecim dniu hodowli użyj mikroskopu, aby sprawdzić różnicowanie komórek i zbierz komórki do odwirowania.Ponownie zawiesić osad w świeżej pożywce complete RPMI na dwa prania, ponownie zawieszając komórki w jednym mililitrze świeżej kompletnej pożywki po drugim praniu w celu zliczenia. Podziel komórki na trzy równe objętości i ponownie stymuluj pierwszą porcję komórek PMA i jonomycyną w obecności inhibitora transportu białek przez cztery do sześciu godzin. Pod koniec stymulacji zbierz komórki do barwienia przeciwciałem anty-CD4.Po 30 minutach utrwalić komórki za pomocą 200 mikrolitrów buforu utrwalającego przez 20 do 60 minut, a następnie dwa płukania w jednym mililitrze buforu przepuszczalnego na pranie. Następnie barwić pod kątem ekspresji cytokin wewnątrzkomórkowych przez 30 minut w ciemności. W celu ilościowej analizy PCR ekspresji genów cytokin w komórkach zróżnicowanych, aktywuj komórki za pomocą epsilonu anty-CD3 związanego z płytką przez trzy godziny.Następnie użyj odczynnika do ekstrakcji fenolowego RNA, aby wyizolować całkowite RNA, aby umożliwić przygotowanie cDNA do ilościowego PCR. Aby ocenić wydzielanie białka cytokiny przez zróżnicowane komórki, należy ponownie stymulować komórki epsilonem anty-CD3 związanym z płytką przez 24 godziny i analizować supernatanty hodowlane pod kątem IL17 i GM-CSF za pomocą testu ELISA. Około 55% komórek hodowanych w warunkach różnicowania komórek T-pomocniczych GM-CSF wykazywało ekspresję GM-CSF, podczas gdy tylko około 2% komórek zróżnicowanych w warunkach T-helper 17 wyrażało tę cytokinę.W porównaniu z warunkami różnicowania T-helper 17, które powodują wytwarzanie IL17 przez około 8% komórek, warunki różnicowania komórek T-pomocniczych GM-CSF indukowały ekspresję IL17 tylko w około 1% komórek. Warto zauważyć, że tylko frakcja komórek wykazuje ekspresję IFN gamma lub IL4 w obu warunkach hodowli. Zróżnicowane komórki T-pomocnicze GM-CSF wykazują znacznie wyższą ekspresję mRNA CSF2, ale znacznie niższą ekspresję IL17 w porównaniu z komórkami T-helper 17.Koreluje to z ekspresją białka GM-CSF obserwowaną w supernatantach hodowlanych z komórek T-helper GM-CSF i T-helper 17, z trzykrotnie większym stężeniem cytokiny wykrytym w hodowlach komórkowych T-helper GM-CSF i bez mierzalnej IL17 w ogóle. Komórki T-pomocnicze GM-CSF wykazują również nieco niższą ekspresję Rorc, wyższą ekspresję Stat5 i nieco niższą ekspresję Stat3 niż komórki T-pomocnicze 17, co wskazuje, że chociaż różnicowanie GM-CSF i IL17 komórek T-pomocniczych jest regulowane przez różne czynniki transkrypcyjne, mogą mieć pewne wspólne cechy. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o wykonaniu wszystkich czynności w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby komórki i odczynniki były sterylne.Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak analiza transkryptomu, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak: jakie są ważne geny wyrażane przez komórki THGM? Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie immunologii do zbadania, w jaki sposób GM-CSF pochodzący z komórek T przyczynia się do stanu zapalnego u gryzoni. Nie zapominaj, że praca z beta-merkaptoetanolem i odczynnikiem do ekstrakcji RNA może być niezwykle niebezpieczna i podczas korzystania z tych odczynników należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak używanie dygestoriów.

in-vitro-differentiation-mouse-granulocyte-macrophage-colony

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film pokazuje proces wstępowania pierwotnych monocytów do makrofagów. Pierwotne ludzkie monocyty można wyizolować i zróżnicować do fenotypu prozapalnego podobnego do M1 przy użyciu czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów-makrofagów (GM-CSF) lub do fenotypu przeciwzapalnego podobnego do M2 za pomocą czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF).

Hodowla in vitro i różnicowanie pierwotnych monocytów do makrofagów

Ten film opisuje metodę in vitro do generowania makrofagów z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). Wytwarzanie makrofagów z iPSC zachodzi w trzech etapach: (i) agregacja iPSC w zawiesinie w celu utworzenia trójwymiarowych ciał zarodkowych (EB), które różnicują się w komórki mezodermalne, (ii) tworzenie komórek prekursorowych makrofagów ze zróżnicowanych EB oraz (iii) różnicowanie komórek prekursorowych makrofagów w dojrzałe, funkcjonalne makrofagi.

Różnicowanie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych w makrofagi

Ten film pokazuje in vitro różnicowanie czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów, makrofagów lub komórek pomocniczych T G (THGM). Wyizolowane naiwne limfocyty T są stymulowane do różnicowania się w THGM, co potwierdza się poprzez wykrycie wysokiej wewnątrzkomórkowej produkcji GM-CSF i niskiej ekspresji innych cytokin specyficznych dla komórek T pomocniczych.

Technika in vitro do różnicowania komórek T pomocniczych wytwarzających GM-CSF od naiwnych limfocytów T

Mysie embrionalne komórki macierzyste mogą być różnicowane do limfocytów T in vitro za pomocą systemu kohodowli OP9-DL1. Powodzenie tej procedury wymaga zwrócenia szczególnej uwagi na konserwację odczynnika/ogniwa oraz kluczowych kroków wrażliwych na technikę. W tym miejscu omawiamy te krytyczne parametry i przedstawiamy szczegółowy protokół, aby zachęcić do przyjęcia tej technologii.

Wyprowadzanie limfocytów T in vitro z embrionalnych komórek macierzystych myszy

Komórki szpiku kostnego hodowane za pomocą czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów granulocytów (GM-CSF) generują heterogeniczną hodowlę zawierającą makrofagi i komórki dendrytyczne (DC). Metoda ta kładzie nacisk na wykorzystanie wiązania MHCII i hialuronianu (HA) w celu odróżnienia makrofagów od DC w kulturze GM-CSF. Makrofagi w tej kulturze mają wiele podobieństw do makrofagów pęcherzykowych.

Generowanie i identyfikacja makrofagów i komórek dendrytycznych pochodzących z GM-CSF

Przedstawiono protokół dla hodowli komórkowej makrofagów makrofagów stymulujących tworzenie kolonii (M-CSF) zróżnicowanych ludzkich makrocytów pochodzących z monocytów. Protokół wykorzystuje krioprezerwację monocytów w połączeniu z ich masowym różnicowaniem do makrofagów. Następnie zebrane makrofagi można następnie wysiać w studzienkach hodowlanych o wymaganej gęstości komórek do przeprowadzenia eksperymentów.

Posiew czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów Zróżnicowane ludzkie makrofagi pochodzące z monocytów

Tutaj przedstawiono szczegółowe protokoły hodowli mysiego prekursora mieloidu linii komórkowej 32D/G-CSF-R, przeprowadzania infekcji wirusowych oraz przeprowadzania testów proliferacji i różnicowania. Ta linia komórkowa nadaje się do badania rozwoju komórek szpikowych oraz roli genów będących przedmiotem zainteresowania we wzroście komórek szpikowych i różnicowaniu neutrofilów.

Proliferacja i różnicowanie mysich komórek prekursorowych mieloidu 32D/G-CSF-R

W tym artykule przedstawiamy szczegółowy protokół ekspresji białek fuzyjnych fluorescencyjnych w komórkach dendrytycznych i makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego myszy. Metoda opiera się na transdukcji komórek progenitorowych szpiku kostnego za pomocą konstruktów retrowirusowych, a następnie różnicowaniu do makrofagów i komórek dendrytycznych in vitro.

Ekspresja fluorescencyjnych białek fuzyjnych w mysich komórkach dendrytycznych i makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego

To badanie opisuje metodę izolowania z embrionalnych komórek macierzystych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wzbogaconych egzosomami przenoszących czynniki stymulujące tworzenie kolonii granulocytów makrofagów granulocytów.

Izolacja wzbogaconych egzosomami pęcherzyków zewnątrzkomórkowych przenoszących czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów z embrionalnych komórek macierzystych

Ten protokół opisuje solidne generowanie makrofagów z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych oraz metody ich późniejszej charakterystyki. Ekspresja markerów powierzchniowych komórek, ekspresja genów i testy funkcjonalne są wykorzystywane do oceny fenotypu i funkcji tych makrofagów pochodzących z iPSC.

Produkcja i charakterystyka ludzkich makrofagów z pluripotencjalnych komórek macierzystych

Poznaj metodę różnicowania mysich komórek T H GM produkujących GM-CSF z naiwnych komórek CD4+. Protokół ten generuje ponad 50% komórek ekspresujących GM-CSF, zapewniając wartościowe źródło komórkowe do badań immunologicznych.

In vitro Różnicowanie mysich komórek T Helper (THGM) wytwarzających czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów makrofagów (GM-CSF) (Wideo) | JoVE Journal

In vitro Różnicowanie mysich komórek T Helper (T_HGM) wytwarzających czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów makrofagów (GM-CSF)

Przeglądaj więcej filmów