Charakterystyka pęknięcia błony plazmatycznej za pośrednictwem MLKL w nekroptozie

Metody te mogą pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące roli pseudokinazy o mieszanej linii, takiej jak domena kinazy lub MLKL w nekroptozie, takiej jak translokacja błony i przepuszczalność w wiązaniu lipidów. Główną zaletą tych technik jest to, że bezpośrednio sugerują one MLKL jako wykonawcę pęknięcia błony plazmatycznej w nekroptozie. Obrazowanie żywych komórek zrewolucjonizowało dziedzinę badań nad śmiercią komórkową, zwłaszcza w przypadku nekroptozy za pośrednictwem MLKL.

Magnetyczny rezonans jądrowy jest potężną techniką monitorowania wiązania lipidów z białkami, jak pokazano tutaj dla MLKL. Zacznij od posiewu pięć razy 10 do czwartego nokautującego mysich fibroblastów embrionalnych MLKL lub MEF wyrażających domenę katową MLKL połączonej z kasetą oligomeryzacyjną i Wenus w jednym mililitrze uzupełnionego DMEM na 24-dołkowych płytkach do ich nocnej inkubacji w inkubatorze do hodowli komórek. Następnego ranka potraktuj komórki doksycykliną przez 12 godzin, aby indukować ekspresję transgenu, a następnie dodaj standardowy DMEM uzupełniony dimeryzatorem białka wiążącego FK506 i nieprzepuszczalnym dla błony zielonym barwnikiem fluorescencyjnym w celu wywołania nekroptozy.

Aby monitorować śmierć komórki, należy umieścić płytkę w odpowiednim urządzeniu do obrazowania umieszczonym w inkubatorze do hodowli tkanek ssaków i otworzyć oprogramowanie systemu obrazowania. Wybierz kartę Zaplanuj nadchodzące skanowania, a następnie wybierz tacę, naczynie, typy skanowania i wzór skanowania na karcie Układ fizyczny. Wybierz szybką fluorescencję w zakładce Właściwości i kliknij okno Oś czasu oraz całkowitą liczbę punktów czasowych i częstotliwość akwizycji, aby dodać czas skanowania.

Następnie kliknij przycisk Zastosuj, aby rozpocząć pobieranie obrazu. Aby określić ilościowo nekroptozę, wybierz okienko Zadania i umieść kursor myszy na tle kilku obrazów, aby ustawić nową analizę zliczania obiektów ze stałym progiem segmentacji powyżej poziomu tła. Następnie wybierz opcję Podgląd, aby sprawdzić obiekty fluorescencyjne na bieżącym obrazie i w razie potrzeby dostosować poziomy progowe.

Staranny dobór progu można przeprowadzić, obserwując wiele dołków na płycie i korzystając z funkcji Podgląd w oprogramowaniu. Pamiętaj tylko, aby użyć tego samego ustawienia progu dla wszystkich dołków w płycie. Aby zintegrować zliczenia zielonej fluorescencji, na karcie Uruchom nową analizę wybierz zakres czasu i studnie do analizy, a następnie wprowadź nazwę zadania analizy.

Następnie kliknij przycisk OK i kliknij dwukrotnie nazwę zadania, aby wyeksportować dane do dodatkowej analizy w odpowiednim oprogramowaniu do tworzenia wykresów. W celu wiązania lipidowego MLKL za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego lub NMR, należy użyć hermetycznych strzykawek do porcjowania jednego miligrama na mililitr badanych fosfolipidów do czystych szklanych fiolek do poszczególnych serii miareczkowania NMR i umieścić fiolki pod strumieniem gazowym argonu lub azotu na pięć do 30 minut. Dozowanie lipidów z lotnych rozpuszczalników, takich jak chloroform lub metanol, musi odbywać się szybko z zapasów przechowywanych na suchym lodzie, aby zminimalizować niespójności w stężeniach lipidów między próbkami spowodowane odparowaniem rozpuszczalnika.

Pod koniec okresu parowania należy użyć dużej pęsety, aby ułożyć fiolki na dnie kolby Buchnera. Uszczelnić kolbę gumowym korkiem i podłączyć plastikową rurkę podłączoną do przewodu podciśnieniowego w celu opróżnienia zawartości fiolki pod łagodnym podciśnieniem przez noc w celu usunięcia wszelkich pozostałości substancji organicznych. Następnego ranka do każdej szklanej fiolki z filmem lipidowym dodać bufor NMR uzupełniony detergentem o odpowiednim stężeniu eksperymentalnym i sonikować fiolkę w łaźni wodnej przez okres do 30 minut, zatrzymując sonikację co 10 minut, aby sprawdzić rozpuszczalność filmu lipidowego.

Pod koniec sonikacji pozostawić fiolki do ostygnięcia przez 15 minut i przeprowadzić seryjne rozcieńczanie miceli lipidowo-detergentowych w buforze NMR z dodatnim detergentem, sonikując mieszaniny 1:1 dla pożądanej serii stężeń. Przygotować kontrolne i referencyjne próbki NMR białka i dodatków odpowiednio w NMR ujemnych i dodatnich pod względem detergentu, dodając białko i dodatki do każdego rozcieńczenia lipidów w buforze dodatnim pod względem detergentu. Następnie przenieś odpowiednią objętość próbek do probówek NMR o odpowiedniej wielkości i załaduj próbki do przyrządu do NMR.

Całkowitą nekroptozę MEF z nokautem MLKL można zaobserwować w ciągu jednej godziny od oligomeryzacji wstępnie inkubowanych komórek doksycykliny wykazujących ekspresję skondensowanego transgenu za pośrednictwem dimerów. Ta szybka nekroptoza kinetyczna potwierdza rolę MLKL jako domniemanego wykonawcy pęknięcia błony plazmatycznej, co skutkuje wytwarzaniem Venus puncta związanej z błoną plazmatyczną w ciągu jednej do dwóch minut od leczenia dimerem i kodowaniem Wenus na obrzeżach komórki i stopniowym zaokrąglaniem komórek w ciągu dwóch do trzech minut. W wyniku szybkiej nekroptozy komórki zmieniają morfologię z normalnego wydłużonego kształtu na zaokrąglone i spuchnięte w ciągu pięciu minut od oligomeryzacji, częściowo pęknięte po 10 minutach i w znacznym stopniu rozebrane za pomocą znikającego cytozolu po 20 minutach.

Eksperymenty wiązania lipidów in vitro monitorowane za pomocą spektroskopii NMR ujawniają główne zmiany strukturalne w białku domeny egzekutora MLKL po wiązaniu lipidów w celu przemieszczenia regionu klamry hamującej z zamkniętej N-helisy do otwartej i wewnętrznie nieuporządkowanej konformacji, a także informacje o pozostałościach w mieszaninach obu konformerów. Procentowa zawartość zamkniętych i otwartych konformerów w danej próbce może być również monitorowana, co dostarcza dowodów potwierdzających interakcję domeny egzekucyjnej MLKL z fosfolipidami i sugeruje bezpośredni związek między MLKL a błoną plazmatyczną. Tak więc, próbując określić ilościowo śmierć komórki za pomocą tej procedury, ważne jest, aby wiedzieć i pamiętać, że barwnik wiążący DNA ma wyższy próg fluorescencji niż normalnie genetycznie kodowane białko fluorescencyjne.

Z tego powodu mogą być używane równolegle. Należy również pamiętać, że lipidy micelarne są wrażliwe na temperaturę i dlatego temperatura próbki NMR może wymagać optymalizacji. Tak więc, zgodnie z tą procedurą, można zastosować inne techniki, takie jak mikroskopia całkowitego wewnętrznego odbicia i elektromikroskopia, aby określić, jak szybko dochodzi do pęknięcia komórek na komórkach poddawanych nekroptozie i gdzie pęknięcie jest zlokalizowane na błonie plazmatycznej.

Ponadto można przeprowadzić termoforezę w mikroskali w celu ortogonalnej walidacji wiązania MLKL z lipidami micelarnymi. Techniki opisane w tym filmie utorowały drogę naukowcom zajmującym się nekroptozą do zbadania roli MLKL jako wykonawcy pęknięcia błony plazmatycznej. Nie zapominaj, że praca z chloroformem może być bardzo niebezpieczna i że podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek i praca w dobrze wentylowanym pomieszczeniu.