Name: Charakterystyka pęknięcia błony plazmatycznej za pośrednictwem MLKL w nekroptozie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Poznaj metody charakteryzacji pęknięcia błony plazmatycznej przez MLKL w nekroptozie. Wykorzystaj mikroskopię komórek żywych, SEM i NMR do badania mechanizmów śmierci komórkowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Weinlich, R., Oberst, A., Beere, H. M., Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Necroptosis+in+development%2C+inflammation+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Necroptosis in development, inflammation and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (2), 127-136 (2017).</li>
<li>Kaiser, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RIP3+mediates+the+embryonic+lethality+of+caspase-8-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RIP3 mediates the embryonic lethality of caspase-8-deficient mice.</a> Nature. 471 (7338), 368-372 (2011).</li>
<li>Murphy, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pseudokinase+MLKL+mediates+necroptosis+via+a+molecular+switch+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The pseudokinase MLKL mediates necroptosis via a molecular switch mechanism.</a> Immunity. 39 (3), 443-453 (2013).</li>
<li>Oberst, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalytic+activity+of+the+caspase-8-FLIP%28L%29+complex+inhibits+RIPK3-dependent+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Catalytic activity of the caspase-8-FLIP(L) complex inhibits RIPK3-dependent necrosis.</a> Nature. 471 (7338), 363-367 (2011).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+complementation+between+FADD+and+RIP1+in+embryos+and+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional complementation between FADD and RIP1 in embryos and lymphocytes.</a> Nature. 471 (7338), 373-376 (2011).</li>
<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+interacting+protein+kinase-3+determines+cellular+necrotic+response+to+TNF-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha.</a> Cell. 137 (6), 1100-1111 (2009).</li>
<li>Dondelinger, Y., Hulpiau, P., Saeys, Y., Bertrand, M. J. M., Vandenabeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evolutionary+perspective+on+the+necroptotic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">An evolutionary perspective on the necroptotic pathway.</a> Trends in Cell Biology. 26 (10), 721-732 (2016).</li>
<li>Newton, K., Manning, G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26865533">Necroptosis and Inflammation.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 743-763 (2016).</li>
<li>Kaiser, W. J., Upton, J. W., Mocarski, E. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23773332">Viral modulation of programmed necrosis.</a> Current Opinion in Virology. 3 (3), 296-306 (2013).</li>
<li>Newton, K., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27177019">RIPK3 deficiency or catalytically inactive RIPK1 provides greater benefit than MLKL deficiency in mouse models of inflammation and tissue injury.</a> Cell Death & Differentiation. 23 (9), 1565-1576 (2016).</li>
<li>Kearney, C. J., Martin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Inflammatory+Perspective+on+Necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">An Inflammatory Perspective on Necroptosis.</a> Molecular Cell. 65 (6), 965-973 (2017).</li>
<li>Pasparakis, M., Vandenabeele, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25592536">Necroptosis and its role in inflammation.</a> Nature. 517 (7534), 311-320 (2015).</li>
<li>Sun, L., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+kind+of+cell+suicide%3A+mechanisms+and+functions+of+programmed+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">A new kind of cell suicide: mechanisms and functions of programmed necrosis.</a> Trends in Biochemical Sciences. 39 (12), 587-593 (2014).</li>
<li>Grootjans, S., Vanden Berghe, T., Vandenabeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+and+execution+mechanisms+of+necroptosis%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Initiation and execution mechanisms of necroptosis: an overview.</a> Cell Death & Differentiation. 24 (7), 1184-1195 (2017).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+lineage+kinase+domain-like+protein+mediates+necrosis+signaling+downstream+of+RIP3+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase.</a> Cell. 148 (1-2), 213-227 (2012).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+lineage+kinase+domain-like+protein+MLKL+causes+necrotic+membrane+disruption+upon+phosphorylation+by+RIP3%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Mixed lineage kinase domain-like protein MLKL causes necrotic membrane disruption upon phosphorylation by RIP3.</a> Molecular Cell. 54 (1), 133-146 (2014).</li>
<li>Cai, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+translocation+of+trimerized+MLKL+protein+is+required+for+TNF-induced+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane translocation of trimerized MLKL protein is required for TNF-induced necroptosis.</a> Nature Cell Biology. 16 (1), 55-65 (2014).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+of+mixed+lineage+kinase+domain-like+protein+to+plasma+membrane+leads+to+necrotic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Translocation of mixed lineage kinase domain-like protein to plasma membrane leads to necrotic cell death.</a> Cell Research. 24 (1), 105-121 (2014).</li>
<li>Dillon, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RIPK1+blocks+early+postnatal+lethality+mediated+by+caspase-8+and+RIPK3%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RIPK1 blocks early postnatal lethality mediated by caspase-8 and RIPK3.</a> Cell. 157 (5), 1189-1202 (2014).</li>
<li>Rickard, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RIPK1+regulates+RIPK3-MLKL-driven+systemic+inflammation+and+emergency+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RIPK1 regulates RIPK3-MLKL-driven systemic inflammation and emergency hematopoiesis.</a> Cell. 157 (5), 1175-1188 (2014).</li>
<li>Kaiser, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+3-mediated+necrosis+via+TRIF%2C+RIP3%2C+and+MLKL%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor 3-mediated necrosis via TRIF, RIP3, and MLKL.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (43), 31268-31279 (2013).</li>
<li>Upton, J. W., Kaiser, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DAI+Another+Way%3A+Necroptotic+Control+of+Viral+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">DAI Another Way: Necroptotic Control of Viral Infection.</a> Cell Host & Microbe. 21 (3), 290-293 (2017).</li>
<li>Tanzer, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Necroptosis+signalling+is+tuned+by+phosphorylation+of+MLKL+residues+outside+the+pseudokinase+domain+activation+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Necroptosis signalling is tuned by phosphorylation of MLKL residues outside the pseudokinase domain activation loop.</a> Biochemical Journal. 471 (2), 255-265 (2015).</li>
<li>Quarato, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+Engagement+of+Distinct+MLKL+Phosphatidylinositol-Binding+Sites+Executes+Necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Sequential Engagement of Distinct MLKL Phosphatidylinositol-Binding Sites Executes Necroptosis.</a> Molecular Cell. 61 (4), 589-601 (2016).</li>
<li>Davies, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+brace+helices+of+MLKL+mediate+interdomain+communication+and+oligomerisation+to+regulate+cell+death+by+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">The brace helices of MLKL mediate interdomain communication and oligomerisation to regulate cell death by necroptosis.</a> Cell Death & Differentiation. , (2018).</li>
<li>Su, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+plug+release+mechanism+for+membrane+permeation+by+MLKL%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">A plug release mechanism for membrane permeation by MLKL.</a> Structure. 22 (10), 1489-1500 (2014).</li>
<li>Dondelinger, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MLKL+compromises+plasma+membrane+integrity+by+binding+to+phosphatidylinositol+phosphates%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">MLKL compromises plasma membrane integrity by binding to phosphatidylinositol phosphates.</a> Cell Reports. 7 (4), 971-981 (2014).</li>
<li>Llambi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BOK+Is+a+Non-canonical+BCL-2+Family+Effector+of+Apoptosis+Regulated+by+ER-Associated+Degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">BOK Is a Non-canonical BCL-2 Family Effector of Apoptosis Regulated by ER-Associated Degradation.</a> Cell. 165 (2), 421-433 (2016).</li>
<li>Malkani, N., Schmid, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+secrets+of+fluorescent+proteins%3A+distinct+bleaching+in+various+mounting+fluids+and+photoactivation+of+cyan+fluorescent+proteins+at+YFP-excitation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Some secrets of fluorescent proteins: distinct bleaching in various mounting fluids and photoactivation of cyan fluorescent proteins at YFP-excitation.</a> PLoS One. 6 (4), 18586(2011).</li>
<li>Perez, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+workflow+for+the+automatic+segmentation+of+organelles+in+electron+microscopy+image+stacks%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">A workflow for the automatic segmentation of organelles in electron microscopy image stacks.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 8, 126(2014).</li>
<li>Walton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lead+aspartate%2C+an+en+bloc+contrast+stain+particularly+useful+for+ultrastructural+enzymology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Lead aspartate, an en bloc contrast stain particularly useful for ultrastructural enzymology.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 27 (10), 1337-1342 (1979).</li>
<li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> PLoS Biology. 2 (11), 329(2004).</li>
<li>Rossi, P., Xia, Y., Khanra, N., Veglia, G., Kalodimos, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((15N+and+13C-+SOFAST-HMQC+editing+enhances+3D-NOESY+sensitivity+in+highly+deuterated%2C+selectively+%5B1H%2C13C%5D-labeled+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+NMR%22%5BJournal%5D)">15N and 13C- SOFAST-HMQC editing enhances 3D-NOESY sensitivity in highly deuterated, selectively [1H,13C]-labeled proteins.</a> Journal of Biomolecular NMR. 66 (4), 259-271 (2016).</li>
<li>Keller, R. <a target="_blank" href="http://cara.nmr-software.org/downloads/3-85600-112-3.pdf">The computer aided resonance assignment tutorial.</a> Cantina Verlag. , (2004).</li>
<li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+sequence+determinants+control+human+and+mouse+receptor+interacting+protein+3+%28RIP3%29+and+mixed+lineage+kinase+domain-like+%28MLKL%29+interaction+in+necroptotic+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Diverse sequence determinants control human and mouse receptor interacting protein 3 (RIP3) and mixed lineage kinase domain-like (MLKL) interaction in necroptotic signaling.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (23), 16247-16261 (2013).</li>
<li>Tanzer, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+divergence+of+the+necroptosis+effector+MLKL%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Evolutionary divergence of the necroptosis effector MLKL.</a> Cell Death & Differentiation. 23 (7), 1185-1197 (2016).</li>
</ol>

Dostarczamy protokoły dla technik, które połączyliśmy, aby zadomowić MLKL jako domniemanego wykonawcę pęknięcia błony plazmatycznej24. Oprócz rozszyfrowania sieci regulacyjnej, która reguluje nekroptozę, w której pośredniczy MLKL, techniki te mogą być stosowane niezależnie do scharakteryzowania innych odpowiednich systemów biologicznych. Praktycznie rzecz biorąc, techniki te są narzędziami do wykrywania o średniej i niskiej przepływności.
Rutynowo stosowaliśmy obrazowan...

Identyfikacja genetycznych składników nekroptozy ułatwiła wykorzystanie modeli zwierzęcych do testowania wpływu nekroptozy na fizjologię i choroby1,2,3,4,5. Nokaut RIPK3 lub MLKL u myszy miał minimalny wpływ na rozwój i homeostazę dorosłych, co sugeruje, że nekroptoza nie jest niezbędna do życia3,6. Co więcej, niektóre gatunki nie zawierają ani genów RIPK3, ani MLKL, co potwierdza nieistotną rolę nekroptozy u zwierząt7,8. Z drugiej strony, trudne modele zwierzęce z różnymi patologiami wywołanymi w laboratorium ujawniły ważną rolę nekroptozy w stanach zapalnych, odporności wrodzonej i infekcjach wirusowych9,10,11,12.
Nekroptoza może być aktywowana na kilka sposobów poprzez sygnalizację za pomocą różnych czujników odporności wrodzonej, z których wszystkie skutkują aktywacją RIPK31,13,14. Aktywny RIPK3 z kolei fosforyluje i aktywuje MLKL3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18. Najbardziej zbadany i być może najbardziej złożony sposób prowadzący do aktywacji RIPK3 obejmuje ligację receptora śmierci, która rozdziela się w zależności od dalszego składu kompleksów sygnałowych w celu wywołania apoptozy lub nekroptozy1. Nekroptoza następuje, gdy sygnalizacja przez RIPK1 jest faworyzowana i powoduje zaangażowanie RIPK319,20. Wynik ten jest łatwo korzystny po farmakologicznym zahamowaniu lub genetycznej delecji kaspazy 8, przypuszczalnego endogennego inhibitora nekroptozy, który utrzymuje nekroptozę na dystans. RIPK1 wiąże się z RIPK3 i aktywuje go. Innym sposobem aktywacji nekroptozy jest sygnalizacja TLR3/TLR4 receptorów Toll-podobnych, która angażuje i aktywuje RIPK3 poprzez infekcję interferonu indukującą β z adapterem (TRIF) zawierającą domenę TIR (TRIF)21. Jeszcze innym sposobem na śmierć w wyniku nekroptozy jest aktywacja czujnika DNA DAI, który bezpośrednio angażuje i aktywuje RIPK322.
MLKL to białko cytozolowe składające się z N-końcowej domeny wiązki helisy (NB) i C-końcowej domeny pseudokinazy (psKD) połączonych regionem nawiasu regulacyjnego3. W normalnych komórkach MLKL znajduje się w cytozolu, gdzie uważa się, że znajduje się w nieaktywnym kompleksie z RIPK314. Aktywacja nekroptozy wyzwala fosforylację MLKL RIPK3 w pętli aktywacji psKD i potencjalnie dodatkowych miejscach w klasie NB i brace<sup="xref">3,15,23. Fosforylacja indukuje zmianę konformacyjną w MLKL, która powoduje dysocjację od RIPK314. Słabo poznane zmiany konformacyjne zwalniają klamrę z klasy psKD<sup="xref">24. Klamra, która zawiera 2 helisy, pośredniczy w oligomeryzacji MLKL w przypuszczalnym trimerze przez C-końcowy helix25. N-końcowa helisa ortezy hamuje domenę NB, która jest niezbędna do przepuszczalności błony24,26. W izolacji, domena NB jest wystarczająca do wywołania przepuszczalności błony plazmatycznej i nekroptozy16,24,27. Aktywność pronekroptotyczną NB odtworzono w mysich fibroblastach embrionalnych z niedoborem MLKL (mlkl-/- MEF). NB jest domeną wiążącą lipidy, która preferencyjnie angażuje difosforan fosfolipidu fosfolipidowego fosfatydyloinozytolu (2). Zaproponowaliśmy krokowy mechanizm aktywacji MLKL, w którym oligomeryzacja klamry ułatwia rekrutację MLKL do błony plazmatycznej poprzez słabe oddziaływania NB z grupą głowy polarnej224. Na membranie NB jest poddawany regulowanej ekspozycji dodatkowego miejsca wiązania o wysokim powinowactwie do2, które jest maskowane przez ortezę w nieaktywnym MLKL. Ogólnie rzecz biorąc, wielokrotne interakcje NB z2 destabilizują błonę plazmatyczną, prowadząc do jej pęknięcia, chociaż mechanizm molekularny tych zdarzeń nie został wyjaśniony.
Tutaj ilustrujemy konkretne metody używane do scharakteryzowania funkcji MLKL jako wykonawcy nekroptozy24. W szczególności skupiamy się na najbardziej minimalnej domenie MLKL, NB i ortezie (NBB), która jest regulowana przez hamowanie aparatu ortodontycznego i może być aktywowana przez wymuszoną dimeryzację w celu wywołania pęknięcia błony plazmatycznej i nekroptozy. Opisujemy nasz indukowalny system ekspresji w połączeniu z wymuszoną dimeryzacją za pośrednictwem FKBP indukowaną lekiem do obrazowania żywych komórek oraz mikroskopią elektronową komórek poddawanych nekroptozie. Dodatkowo ilustrujemy naszą analizę NMR in vitro interakcji NBB z fosfatydyloinozytolami ().

<table><tbody><tr><td>Klonowanie i generowanie linii komórkowych</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pRetroX-TRE3G</td><td>Clontech</td><td>631188</td><td></td></tr><tr><td>Transaktywator Transaktywator Tet-On plazmid</td><td></td><td></td><td>Llambi et al., 2016</td></tr><tr><td>Fibroblasty embrionalne myszy (MEF) mlkl-/-Dillon</td><td></td><td></td> <td>et al., 2014</td></tr><tr><td>Chlorowodorek blastycydyny S</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP2647100 CAS # 3513-03-9</td><td></td></tr><tr><td> Kwantyfikacja śmierci komórek i mikroskopia żywych komórek</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Doxycycycline</td><td>Clontech</td><td>631311 CAS # 24390-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Homodimeryzator B / B AP20187</td><td>Takara</td><td>635059 CAS # 195514-80-8</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Zielony</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S7020</td><td></td></tr><tr><td>Syto16</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S7578</td><td></td></tr><tr><td>NMR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 N Chlorek amonu</td> Cambridge <td>Isotope Laboratories</td><td>NLM-467-10 CAS# 12125-02-9</td><td></td></tr><tr><td>Deuterowany DTT</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>DLM-2622-1</td><td></td></tr><tr><td>Tlenek deuteru</td><td>Sigma Aldrich</td><td>617385-1 CAS# 7789-20-0</td><td></td></tr><tr><td>n-dodecyl-&beta;-D-maltopiranozyd</td><td>Anatrace</td><td>D310 CAS # 69227-93-6</td><td></td></tr><tr><td>L-&alfa;-fosfatydyloinozytolo-4,5-bisfosforan (mózg, świnia) (sól amonowa)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840046X CAS # 383907-42-4</td><td></td></tr><tr><td>1,2-distearoilo-sn-glycero-3-fosfoinozytol (sól amonowa) (18:0 PI)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850143 CAS # 849412-67-5</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfo-(1'-mio-inozytol) (sól amonowa) (18:1)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850149 CAS # 799268-53-4</td><td></td></tr><tr><td>Specjalistyczny sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IncuCyte FLR lub ZOOM</td><td>Essen BioScience, Inc.</td><td></td><td>Obrazowanie mikroskopowe żywych komórek</td></tr><tr><td>Helios NanoLab 660 DualBeam&nbsp;</td>Mikroskop <td>elektronowy</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td></tr> <tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IncuCyte 2011A Rev2 v20111.3.4288 (FLR)</td><td>Essen BioScience, Inc.</td><td>http://www.essenbioscience.com</td><td>Analiza obrazowa</td></tr><tr><td>FEI MAPS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>https://www.fei.com/software/maps/</td> <td>EM analiza</td></tr><tr><td>TopSpin v3.2</td><td>Bruker BioSpin</td><td>http://www.bruker.com</td><td>Zbieranie danych NMR</td></tr><tr><td>CARA v1.9.1.7</td><td></td><td>http://cara.nmr.ch/&nbsp;</td><td>Analiza danych NMR</td></tr><tr><td>Slidebook</td><td>3i (Innowacje w zakresie inteligentnego obrazowania)</td><td>https://www.intelligent-imaging.com/slidebook</td><td>Mikroskopia konfokalna</td></tr></tbody></table>

charakterystyka pęknięcia błony plazmatycznej za pośrednictwem mlkl w nekroptozie

Characterization of MLKL-mediated Plasma Membrane Rupture in Necroptosis

Nekroptoza to zaprogramowany szlak śmierci komórki wywołany aktywacją kinazy białkowej 3 oddziałującej z receptorem (RIPK3), która fosforyluje i aktywuje pseudokinazę o mieszanej nazwie podobnej do kinazy, MLKL, w celu rozerwania lub przeniknięcia błony plazmatycznej. Nekroptoza jest szlakiem zapalnym związanym z wieloma patologiami, w tym autoimmunizacją, chorobami zakaźnymi i sercowo-naczyniowymi, udarem, neurodegeneracją i rakiem. W tym miejscu opisujemy protokoły, które można wykorzystać do scharakteryzowania MLKL jako wykonawcy pęknięcia błony plazmatycznej w nekroptozie. Wizualizujemy proces nekroptozy w komórkach za pomocą obrazowania żywych komórek za pomocą konwencjonalnej i konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej oraz w komórkach utrwalonych za pomocą mikroskopii elektronowej, które razem ujawniły redystrybucję MLKL z cytozolu do błony plazmatycznej przed indukcją dużych w błonie plazmatycznej. Przedstawiamy analizę magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) in vitro z wykorzystaniem lipidów w celu identyfikacji przypuszczalnych modulatorów nekroptozy za pośrednictwem MLKL. Na podstawie tej metody zidentyfikowaliśmy ilościowe preferencje wiązania lipidów i fosforany fosfatydylo-inozytolu () jako krytyczne spoiwa MLKL, które są wymagane do celowania w błonę plazmatyczną i przepuszczalności w nekroptozie.

Wizualizacja regulowanej egzekucji nekroptozy w żywych komórkach stała się możliwa dzięki indukcyjnej ekspresji minimalnego, skróconego konstruktu MLKL, NBB140-2xFV-Venus. Konstrukt ten zachowuje zdolność do indukowania permeabilizacji błony komórkowej i jest aktywowany poprzez indukowaną Dim oligomeryzację kasety FKBP (2xFV). Obserwujemy i kwantyfikujemy nekroptozę za pomocą obrazowania mikroskopowego żywych komórek, monitorując kinetycznie (co 5 min) pobór nieprzepuszczalnego...

Opisujemy metody charakterystyki pęknięcia błony plazmatycznej za pośrednictwem MLKL w nekroptozie, w tym konwencjonalne i konfokalne obrazowanie za pomocą mikroskopii żywych komórek, skaningową mikroskopię elektronową i wiązanie lipidów oparte na NMR.

Charakterystyka pęknięcia błony plazmatycznej za pośrednictwem MLKL w nekroptozie

Necroptosis is a programmed cell death pathway triggered by activation of receptor interacting protein kinase 3 (RIPK3), which phosphorylates and ...

Metody te mogą pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące roli pseudokinazy o mieszanej linii, takiej jak domena kinazy lub MLKL w nekroptozie, takiej jak translokacja błony i przepuszczalność w wiązaniu lipidów. Główną zaletą tych technik jest to, że bezpośrednio sugerują one MLKL jako wykonawcę pęknięcia błony plazmatycznej w nekroptozie. Obrazowanie żywych komórek zrewolucjonizowało dziedzinę badań nad śmiercią komórkową, zwłaszcza w przypadku nekroptozy za pośrednictwem MLKL.Magnetyczny rezonans jądrowy jest potężną techniką monitorowania wiązania lipidów z białkami, jak pokazano tutaj dla MLKL. Zacznij od posiewu pięć razy 10 do czwartego nokautującego mysich fibroblastów embrionalnych MLKL lub MEF wyrażających domenę katową MLKL połączonej z kasetą oligomeryzacyjną i Wenus w jednym mililitrze uzupełnionego DMEM na 24-dołkowych płytkach do ich nocnej inkubacji w inkubatorze do hodowli komórek. Następnego ranka potraktuj komórki doksycykliną przez 12 godzin, aby indukować ekspresję transgenu, a następnie dodaj standardowy DMEM uzupełniony dimeryzatorem białka wiążącego FK506 i nieprzepuszczalnym dla błony zielonym barwnikiem fluorescencyjnym w celu wywołania nekroptozy.Aby monitorować śmierć komórki, należy umieścić płytkę w odpowiednim urządzeniu do obrazowania umieszczonym w inkubatorze do hodowli tkanek ssaków i otworzyć oprogramowanie systemu obrazowania. Wybierz kartę Zaplanuj nadchodzące skanowania, a następnie wybierz tacę, naczynie, typy skanowania i wzór skanowania na karcie Układ fizyczny. Wybierz szybką fluorescencję w zakładce Właściwości i kliknij okno Oś czasu oraz całkowitą liczbę punktów czasowych i częstotliwość akwizycji, aby dodać czas skanowania.Następnie kliknij przycisk Zastosuj, aby rozpocząć pobieranie obrazu. Aby określić ilościowo nekroptozę, wybierz okienko Zadania i umieść kursor myszy na tle kilku obrazów, aby ustawić nową analizę zliczania obiektów ze stałym progiem segmentacji powyżej poziomu tła. Następnie wybierz opcję Podgląd, aby sprawdzić obiekty fluorescencyjne na bieżącym obrazie i w razie potrzeby dostosować poziomy progowe.Staranny dobór progu można przeprowadzić, obserwując wiele dołków na płycie i korzystając z funkcji Podgląd w oprogramowaniu. Pamiętaj tylko, aby użyć tego samego ustawienia progu dla wszystkich dołków w płycie. Aby zintegrować zliczenia zielonej fluorescencji, na karcie Uruchom nową analizę wybierz zakres czasu i studnie do analizy, a następnie wprowadź nazwę zadania analizy.Następnie kliknij przycisk OK i kliknij dwukrotnie nazwę zadania, aby wyeksportować dane do dodatkowej analizy w odpowiednim oprogramowaniu do tworzenia wykresów. W celu wiązania lipidowego MLKL za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego lub NMR, należy użyć hermetycznych strzykawek do porcjowania jednego miligrama na mililitr badanych fosfolipidów do czystych szklanych fiolek do poszczególnych serii miareczkowania NMR i umieścić fiolki pod strumieniem gazowym argonu lub azotu na pięć do 30 minut. Dozowanie lipidów z lotnych rozpuszczalników, takich jak chloroform lub metanol, musi odbywać się szybko z zapasów przechowywanych na suchym lodzie, aby zminimalizować niespójności w stężeniach lipidów między próbkami spowodowane odparowaniem rozpuszczalnika.Pod koniec okresu parowania należy użyć dużej pęsety, aby ułożyć fiolki na dnie kolby Buchnera. Uszczelnić kolbę gumowym korkiem i podłączyć plastikową rurkę podłączoną do przewodu podciśnieniowego w celu opróżnienia zawartości fiolki pod łagodnym podciśnieniem przez noc w celu usunięcia wszelkich pozostałości substancji organicznych. Następnego ranka do każdej szklanej fiolki z filmem lipidowym dodać bufor NMR uzupełniony detergentem o odpowiednim stężeniu eksperymentalnym i sonikować fiolkę w łaźni wodnej przez okres do 30 minut, zatrzymując sonikację co 10 minut, aby sprawdzić rozpuszczalność filmu lipidowego.Pod koniec sonikacji pozostawić fiolki do ostygnięcia przez 15 minut i przeprowadzić seryjne rozcieńczanie miceli lipidowo-detergentowych w buforze NMR z dodatnim detergentem, sonikując mieszaniny 1:1 dla pożądanej serii stężeń. Przygotować kontrolne i referencyjne próbki NMR białka i dodatków odpowiednio w NMR ujemnych i dodatnich pod względem detergentu, dodając białko i dodatki do każdego rozcieńczenia lipidów w buforze dodatnim pod względem detergentu. Następnie przenieś odpowiednią objętość próbek do probówek NMR o odpowiedniej wielkości i załaduj próbki do przyrządu do NMR.Całkowitą nekroptozę MEF z nokautem MLKL można zaobserwować w ciągu jednej godziny od oligomeryzacji wstępnie inkubowanych komórek doksycykliny wykazujących ekspresję skondensowanego transgenu za pośrednictwem dimerów. Ta szybka nekroptoza kinetyczna potwierdza rolę MLKL jako domniemanego wykonawcy pęknięcia błony plazmatycznej, co skutkuje wytwarzaniem Venus puncta związanej z błoną plazmatyczną w ciągu jednej do dwóch minut od leczenia dimerem i kodowaniem Wenus na obrzeżach komórki i stopniowym zaokrąglaniem komórek w ciągu dwóch do trzech minut. W wyniku szybkiej nekroptozy komórki zmieniają morfologię z normalnego wydłużonego kształtu na zaokrąglone i spuchnięte w ciągu pięciu minut od oligomeryzacji, częściowo pęknięte po 10 minutach i w znacznym stopniu rozebrane za pomocą znikającego cytozolu po 20 minutach.Eksperymenty wiązania lipidów in vitro monitorowane za pomocą spektroskopii NMR ujawniają główne zmiany strukturalne w białku domeny egzekutora MLKL po wiązaniu lipidów w celu przemieszczenia regionu klamry hamującej z zamkniętej N-helisy do otwartej i wewnętrznie nieuporządkowanej konformacji, a także informacje o pozostałościach w mieszaninach obu konformerów. Procentowa zawartość zamkniętych i otwartych konformerów w danej próbce może być również monitorowana, co dostarcza dowodów potwierdzających interakcję domeny egzekucyjnej MLKL z fosfolipidami i sugeruje bezpośredni związek między MLKL a błoną plazmatyczną. Tak więc, próbując określić ilościowo śmierć komórki za pomocą tej procedury, ważne jest, aby wiedzieć i pamiętać, że barwnik wiążący DNA ma wyższy próg fluorescencji niż normalnie genetycznie kodowane białko fluorescencyjne.Z tego powodu mogą być używane równolegle. Należy również pamiętać, że lipidy micelarne są wrażliwe na temperaturę i dlatego temperatura próbki NMR może wymagać optymalizacji. Tak więc, zgodnie z tą procedurą, można zastosować inne techniki, takie jak mikroskopia całkowitego wewnętrznego odbicia i elektromikroskopia, aby określić, jak szybko dochodzi do pęknięcia komórek na komórkach poddawanych nekroptozie i gdzie pęknięcie jest zlokalizowane na błonie plazmatycznej.Ponadto można przeprowadzić termoforezę w mikroskali w celu ortogonalnej walidacji wiązania MLKL z lipidami micelarnymi. Techniki opisane w tym filmie utorowały drogę naukowcom zajmującym się nekroptozą do zbadania roli MLKL jako wykonawcy pęknięcia błony plazmatycznej. Nie zapominaj, że praca z chloroformem może być bardzo niebezpieczna i że podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek i praca w dobrze wentylowanym pomieszczeniu.

characterization-mlkl-mediated-plasma-membrane-rupture

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Tutaj prezentujemy protokół do określania wewnątrzkomórkowych zdarzeń sygnalizacyjnych indukowanych w żywotnych komórkach przez fizyczną interakcję z sąsiednimi martwymi lub umierającymi komórkami. Protokół koncentruje się na zdarzeniach sygnalizacyjnych wywołanych przez rozpoznawanie martwych komórek za pośrednictwem receptora, w przeciwieństwie do ich wychwytu fagocytarnego lub uwalniania rozpuszczalnych mediatorów.

Identyfikacja wewnątrzkomórkowych zdarzeń sygnalizacyjnych indukowanych w żywotnych komórkach przez interakcję z sąsiednimi komórkami przechodzącymi apoptotyczną śmierć komórki

Ten protokół opisuje prostą metodę izolowania i hodowli pierwotnych mysich neuronów ziarnistych (CGN) od 6-7 dniowych szczeniąt, efektywną transdukcję CGN dla badań nad utratą i zyskiem funkcji, oraz modelowanie ekscytotoksyczności neuronów indukowanej przez NMDA, śmierci komórek indukowanej niskim poziomem potasu, uszkodzeń DNA i stresu oksydacyjnego przy użyciu tego samego modelu hodowli.

Modelowanie śmierci i zwyrodnienia neuronów w pierwotnych neuronach ziarnistych móżdżku myszy

Opisujemy wykrywanie aktywacji inflamasomu NLRP3 na bazie komórkowej za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i barwienia dla aktywnej kaspazy-1 i adaptera, ASC. Przedstawiono test uwalniania dehydrogenazy mleczanowej w celu wykrycia lizy piroptotycznej w skali populacji. Techniki te można dostosować do badania wielu aspektów biologii inflamasomów.

Wykrywanie aktywacji inflamasomu i śmierci komórek piroptotycznych w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego myszy

Tutaj opisujemy wysokoprzepustowy test oparty na fluorescencji, który mierzy skuteczność uszczelniania błony plazmatycznej za pomocą analiz fluorometrycznych i obrazowych w żywych komórkach. Test ten może być stosowany do badań przesiewowych leków lub genów docelowych, które regulują ponowne uszczelnianie błony plazmatycznej w komórkach ssaków.

Wysokoprzepustowy pomiar skuteczności ponownego uszczelniania błony plazmatycznej w komórkach ssaków

Wzmocnienie sygnału tyramidu podczas barwienia immunofluorescencyjnego umożliwia czułe wykrywanie fosforylowanych RIPK3 i MLKL podczas nekroptozy wywołanej przez ZBP1 po zakażeniu HSV-1.

Wzmocnienie sygnału tyramidu do barwienia immunofluorescencyjnego zależnej od ZBP1 fosforylacji RIPK3 i MLKL po zakażeniu HSV-1 w komórkach ludzkich

Ten protokół opiera się na indukowanej przez LPS i ATP śmierci makrofagów THP-1 zróżnicowanych PMA. Używamy cytometrii przepływowej do analizy podwójnego barwienia aneksyny V i 7-AAD w celu wykrycia śmierci komórki, wykorzystując całą komórkę i stosując skaningową mikroskopię elektronową do obserwacji morfologii błony komórkowej.

Śmierć makrofagów THP-1 różnicowanych przez PMA i ATP indukowana przez LPS i ATP i jej walidacja

Protokół ten opisuje metodę obrazowania żywymi komórkami do monitorowania przepuszczalności błony lizosomalnej podczas nekroptozy, wykorzystującą sondy fluorescencyjne wykrywające zmiany w integralności błony lizosomalnej i zakwaszeniu.

Obrazowanie żywymi komórkami permeabilizacji błony lizosomalnej podczas nekroptozy

Opisujemy sposób pomiaru dynamiki wapnia wewnątrzkomórkowego w pobliżu błony oraz w całej objętości komórki w hodowlach astrocytów, wykorzystując mikroskopię całkowitego wewnętrznego odbicia oraz epifluorescencyjną.

Pomiar dynamiki wapnia w pobliżu błony plazmatycznej oraz w całej przestrzeni wewnątrzkomórkowej astrocytów

Regulowana endocytoza kontroluje poziomy ekspresji na powierzchni komórki dla większości białek błonowych. W niniejszym opracowaniu wykorzystujemy redukowalne, nieprzenikające przez błonę odczynniki do biotinylacji, aby zmierzyć tempo endocytozy transportera dopaminy (DAT), który jest politopeowym białkiem błonowym. Metoda ta umożliwia prostą procedurę pomiaru tempa endocytozy większości białek błony plazmatycznej.

Pomiar szybkości endocytozy białek błony plazmatycznej za pomocą odwracalnego znakowania biotyną

Niniejszy protokół opisuje szybką technikę ilościowego oznaczania translokacji GLUT4 z cytoplazmy do błony plazmatycznej komórek za pomocą cytometrii przepływowej.

Ilościowy pomiar translokacji GLUT4 do błony komórkowej przy użyciu cytometrii przepływowej

Poznaj metody charakteryzacji pęknięcia błony plazmatycznej przez MLKL w nekroptozie. Wykorzystaj mikroskopię komórek żywych, SEM i NMR do badania mechanizmów śmierci komórkowej.

Charakterystyka pęknięcia błony plazmatycznej za pośrednictwem MLKL w nekroptozie

Przeglądaj więcej filmów