Name: Hodowla Caenorhabditis elegans na dużych obszarach na płytkach: przygotowanie próbki do badania zmian metabolicznych w cukrzycy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 8 s
Description: Naucz się hodowli Caenorhabditis elegans na dużą skalę na płytkach z agarem. Ta metoda umożliwia uzyskanie zsynchronizowanych populacji nicieni i dużych próbek do badań metabolicznych w cukrzycy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) w ramach IRTG 1874 "Cukrzycowe powikłania mikronaczyniowe" i CRC 1118 "Reaktywne metabolity jako przyczyna późnych powikłań cukrzycowych". Szczepy C. elegans N2 i CL2166 zostały dostarczone przez CGC, który jest finansowany przez Biuro Programów Infrastruktury Badawczej NIH (P40 OD010440).

UWAGA: Ten protokół jest podzielony na pięć sekcji. W sekcjach 1–3 przedstawiono główny protokół hodowli C. elegans na dużą skalę. Sekcje 4 i 5 zawierają dodatkowe protokoły oceny przykładowych metabolitów występujących w metabolitach cukrzycy. Szczegółowo w sekcji 1 opisano ogólną hodowlę na dużą skalę na talerzach. W sekcji 2 skoncentrowano się na przenoszeniu dużych ilości C. elegans, natomiast w sekcji 3 wyjaśniono zbieranie próbki na dużą skalę. W sekcji 4 wyjaśniono izolację białka z próbki, a w sekcji 5 opisano przygotowanie próbki do kolejnych analiz metodą chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas w tandemie (LC-MS/MS).
1. Hodowla na dużą skalę na talerzach
<ol>
	<li>Ogólnie rzecz biorąc, pracuj pod sterylnym kapturem lub obok otwartego ognia, aby uniknąć zanieczyszczeń.</li>
	<li>Aby hodować robaki do momentu osiągnięcia stadium młodego dorosłego osobnika, postępuj zgodnie z tym wcześniej opublikowanym protokołem7 z następującymi adaptacjami.
	<ol>
		<li>Użyj żywych bakterii Escherichia coli OP50 do karmienia nicieni i przygotuj 400 μM agar fluorodeoksyurydynowy (nie ampicylinę/FUdR) do eksperymentów.</li>
		<li>Do przygotowania populacji synchronicznej należy użyć nieskoncentrowanego OP50, a do kolejnych eksperymentów z dorosłymi należy użyć 3,3-krotnie stężonego OP50, usuwając 70% supernatantu.</li>
		<li>Zalecane są codzienne odstępy między karmieniem. Podczas oceny stresu oksydacyjnego różne odstępy czasu i objętości karmienia mogą mieć wpływ na wyniki.</li>
		<li>Do zaszczepienia weź płytkę z kilkoma nicieniami i pokrój ją skalpelem na kawałki o wymiarach około 0,5 x 1cm2. Przenieść dwie do trzech części na płytki pożywki hodowlanej nicieni (NGM) o średnicy 60 mm, zawierające nieskoncentrowany OP50.</li>
		<li>Inkubować płytki w temperaturze odpowiedniej dla danego szczepu (dziki typ N2 powinien być hodowany w temperaturze 20 °C) tak długo, aż jaja będą widoczne na płytce.</li>
		<li>Zmyć większość jaj i dorosłych zwierząt 2 ml buforu M9 i zebrać je do probówki o pojemności 15 ml. Odwirować zawiesinę o stężeniu 800 x g przez 2 min. W międzyczasie zacznij przygotowywać roztwór wybielający.</li>
		<li>Wyjąć probówkę wirówkową i usunąć bufor M9 za pomocą pipety o pojemności 10 ml. Dodać 10 ml roztworu wybielającego i mieszać z wirem, aż dorosłe nicienie zostaną zmielone. Trwa to zwykle ok. 5–7 minut, ale nie powinno trwać dłużej niż 15 minut, w przeciwnym razie jaja nie rozwiną się w pełni w dalszej części eksperymentu.</li>
		<li>Odwirować zawiesinę o stężeniu 800 x g przez 2 minuty. Przemyć 3 razy 10 ml buforu M9 w celu usunięcia jaj z roztworu wybielającego.</li>
		<li>Teraz dodaj 150 μl zawiesiny jaj na płytki OP50. Na każdym talerzu powinna znajdować się gęstość 200–300 jaj. Poczekaj, aż nicienie osiągną stadium dorosłe. 
		UWAGA: Bufor M9 (pH 7,0) używany do przedstawionych eksperymentów składa się z następujących substancji: 22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4 i 86 mM NaCl. Po autoklawowaniu mieszaniny dodać 1 mM MgSO4. Roztwór wybielający zawiera 0,5 M NaOH, 2,3 mM NaOCl rozpuszczony w wodzie destylowanej.</li>
		<li>Przygotuj sterylny bufor M9, sterylne końcówki pipet z odciętą końcówką do zmycia robaków oraz probówki o pojemności 15 ml do ich zebrania.</li>
		<li>Nanieść około 1 ml buforu M9 na płytki, delikatnie rozprowadzić bufor kołysząc i delikatnie odpipetować nicienie z płytki.</li>
		<li>Teraz zbierz nicienie w tubce. Za pomocą wyciętych końcówek pipet nanieść 150 μl zawiesiny bezpośrednio na płytki (wysiane OP50) i ocenić mikroskopowo gęstość nicieni (zalecane: 50–100 nicieni na płytkę 60 mm).</li>
		<li>Jeśli są zbyt gęste, rozcieńczyć zawiesinę buforem M9 i ocenić ją pod mikroskopem, aż do osiągnięcia pożądanej gęstości. Jeśli wydajność jest zbyt mała, pozwól robakom się uspokoić lub odwiruj zawiesinę 10 s przy 800 x g, aby usunąć płyn. 
		UWAGA: Przykład wystarczającej gęstości jest podany w <silna klasa="xfig">Rysunek 1A (makroskopowy) i 1B (mikroskopowy) przy 20-krotnym powiększeniu. Postępuj empirycznie zgodnie z opisem.</li>
		<li>Pamiętaj, że robaki szybko się osiadają. Aby zapewnić równomierne rozprowadzenie między płytkami, odwróć rurkę po każdym ułożeniu płytek (4–5 płytek). 
		UWAGA: Wycięta końcówka pipety, a także delikatne kołysanie i mycie płytek zmniejszają naprężenia ścinające.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przenoszenie dużych ilości Caenorhabditis elegans
<ol>
	<li>Nicienie zmyć około 500 μl buforu M9, w zależności od wieku i suchości płytek. Używając tego samego buforu, powtarzać odrywanie nicieni, aż większość zwierząt zostanie zebrana w zawiesinie.</li>
	<li>Powoli nabierz nicienie odciętą końcówką pipety i przenieś je na płytkę przygotowaną z OP50. Pozostaw talerz do wyschnięcia. 
	UWAGA: Uważaj, aby nie nałożyć znacznie więcej niż zalecana objętość. Zwłaszcza w długotrwałych eksperymentach płytki mogą tego nie tolerować, a agar może pęknąć, umożliwiając nicieniom wpełzanie do pęknięć.</li>
</ol>
3. Zbiór dużej próbki Caenorhabditis elegans
<ol>
	<li>W zależności od wybranej metody rozpocznij eksperymenty z wystarczającą ilością C. elegans. Do analiz LC-MS/MS należy przygotować 20 płytek (60 mm x 15 mm) na grupę z około 100 nicieniami na płytkę, aby zapewnić wydajność co najmniej 200 μg białka na próbkę. 
	UWAGA: Ta część protokołu nie wymaga już pracy w sterylnych warunkach, ponieważ nicienie zostaną zebrane i zamrożone. </li>
	<li>W dniu pobrania próbki należy przygotować ciekły azot w celu szybkiego zamrożenia pobranych próbek. Trzymaj niesterylny bufor M9 na lodzie, aby spowolnić metabolizm nicieni.</li>
	<li>Zmyj C. elegans z płytek, nakładając 1 ml buforu M9 i delikatnie obracając płytki. Pozwala to uniknąć zbierania martwych nicieni i większości jaj, jeśli takie są, ponieważ przyklejają się one do bakterii i agaru.</li>
	<li>Pobrać objętość i przenieść ją do probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Po pobraniu pełnej próbki należy poczekać, aż nicienie opadną lub krótko odwirować probówkę przy 800 x g i usunąć większość buforu M9. Przemyj próbkę 3 razy około 10 ml M9 (10x objętość próbki), aby usunąć wszelkie bakterie. 
	UWAGA: Aby upewnić się, że wszystkie martwe nicienie zostaną usunięte, inną opcją jest unoszenie się sacharozy. Nie było to jednak odpowiednie dla wyświetlanych eksperymentów15. Sacharoza jest hydrolizowana do glukozy i fruktozy. W przedstawionych eksperymentach oceniano rolę glukozy w promowaniu zmian biochemicznych występujących w przewlekłej cukrzycy. W związku z tym unoszenie się sacharozy może potencjalnie zakłócić wyniki.</li>
	<li>Przygotować jedną probówkę o pojemności 1,5 ml z 1 ml buforu M9 i jedną pustą probówkę o pojemności 1,5 ml dla każdej próbki. Przenieść osad za pomocą szklanej pipety z probówki o pojemności 15 ml do pustej probówki o pojemności 1,5 ml. Ten krok ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia transferu ilościowego. 
	UWAGA: W przeciwieństwie do poprzednich kroków, tutaj nicienie są bardziej skoncentrowane. Ze względu na możliwe przyleganie do plastikowych końcówek pipet spodziewana jest utrata dużej części próbki. Dlatego zamiast tego należy używać pipet szklanych.</li>
	<li>Po przeniesieniu należy użyć szklanej pipety, aby pobrać 1 ml buforu M9 z drugiej probówki o pojemności 1,5 ml w celu wypłukania nicieni ze ścianki pipety. Umyj również pozostałe nicienie z probówki o pojemności 15 ml i przenieś je do probówki z próbką.</li>
	<li>Odwirować probówkę z próbką o sile 19 000 x g przez 1 minutę, a następnie usunąć jak najwięcej supernatantu.</li>
	<li>Uszczelnij probówkę Parafilmem i natychmiast zamroź ją w ciekłym azocie. Przechowywać probówkę w temperaturze -80 °C do czasu przygotowania lizatu.</li>
</ol>
4. Izolacja białek dla spektrometrii mas
UWAGA: Opisana tutaj izolacja białka może być również użyta do innych testów (np. western blot).
<ol>
	<li>Do zamrożonej próbki dodać taką samą objętość kulek tlenku cyrkonu o średnicy 0,5 mm i co najmniej 2 razy większą objętość buforu lizatu zawierającego koktajl inhibitorów proteinazy. 
	UWAGA: Przedstawione analizy korelacji nicieni z białkami przeprowadzono przy użyciu 100 μL buforu. Próbki LC-MS/MS poddano lizie z użyciem 200 μl buforu.</li>
	<li>Uruchomić homogenizator na 1 minutę na prędkości 9. Upewnij się, że próbki są całkowicie zmielone. Powtórz ten krok, jeśli nie są w pełni zlizowane.</li>
	<li>Odwirować próbki przez 30 minut w temperaturze 4 °C przy 19 000 x g. Przenieść supernatant do nowej probówki na lodzie i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu wykonania dalszych pomiarów. 
	UWAGA: Bufor niedenaturujący użyty w przedstawionych eksperymentach składa się z następujących substancji: 20 mM Tris HCl (pH 8), 137 mM NaCl, 1% Triton-X i 2 mM EDTA. 
	UWAGA: Postępując zgodnie z krokami tego protokołu i stosując sugerowaną skalę, wydajność osadu białkowego z około 1000 nicieni powinna wynosić około 500 μg. Aby uzyskać więcej porównań, zapoznaj się z Rysunek 2 i reprezentatywne wyniki.</li>
</ol>
5. Przygotowanie próbki do pomiarów metodą chromatografii cieczowej i tandemowej spektrometrii mas
UWAGA: W zależności od interesującego parametru, przygotowanie próbki będzie się różnić. Protokół ten koncentruje się na oznaczaniu methylglyoxal i AGE.
<ol>
	<li>Zmierz wewnątrzkomórkowy methylglyoxal przez derywatyzację 1,2-diaminobenzenem (DB), jak opisano wcześniej9.
	<ol>
		<li>Homogenizować próbki z 20 μl lodowatego 20% (wag./obj.) kwasu trichlorooctowego w 0,9% (wag./obj.) chlorku sodu i 80 μl wody w probówce o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Próbki o objętości 5 μl należy napełnić wzorcem wewnętrznym (13C3 MG; 400 nM), wymieszać je przez wirowanie, a następnie odwirować przy 21 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przenieść 35 μl supernatantu do fiolki z próbką HPLC zawierającej szklaną wkładkę o pojemności 200 μl.</li>
		<li>Dodać 5 μl 3% azydku sodu (wag./obj.) do każdej próbki, a następnie 10 μl 0,5 mM DB w 200 mM HCl zawierającym 0,5 mM kwasu dietylenotriaminopentaoctowego (DETAPAC) w wodzie.</li>
		<li>Próbki inkubować przez 4 godziny w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.</li>
		<li>Analizuj próbki za pomocą LC-MS/MS, zgodnie z wcześniejszym opisem9. 
		UWAGA: W celu pomiaru AGE należy wyizolować białka zgodnie z opisem w sekcji 4 protokołu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmierz stężenie białka w (rozmrożonych) lizatach za pomocą testu Bradforda10.
	<ol>
		<li>Przygotować podwielokrotności 30 μl dla krzywej wzorcowej wzbogaconej albuminą surowicy bydlęcej (BSA) rozpuszczoną w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) o następującym stężeniu: 0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,6; 0,8; i 1,0 mg/dl. 
		UWAGA: Jeśli próbka została przygotowana w sugerowanej wielkości (patrz krok 4.1 w celu przygotowania lizatu z 200 μl buforu), szacowane stężenie powinno mieścić się w zakresie około 2–7 mg/ml. W takim przypadku przed pomiarem należy rozcieńczyć próbki w stosunku 1:10 za pomocą PBS. 
		UWAGA: W przypadku pierwszych eksperymentów z użyciem tej metody zaleca się pomiar próbek w różnych rozcieńczeniach (1, 1:10 i 1:100). Ponieważ nie ma dokładnego określenia liczby nicieni, plon może się różnić w zależności od poszczególnych badaczy.</li>
		<li>Użyć przezroczystej 96-dołkowej płytki (polistyrenu) i odpipetować 10 μl każdego wzorcowego stężenia oraz próbek w wybranych rozcieńczeniach w dwóch egzemplarzach w studzienkach.</li>
		<li>Rozcieńczyć koncentrat odczynnika do oznaczania białek w stosunku 1:5 wodą destylowaną (równanie). dest.) i dodać 200 μl rozcieńczenia do każdej próbki na płytce. Inkubować płytkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Zmierzyć absorbancję w ciągu 30 minut przy długości fali 595 nm za pomocą czytnika płytek. Próbki mogą być interpolowane z obliczonej krzywej wzorcowej. Więcej szczegółów na temat tej metody zostało obszernie opisanych w literaturze10.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmierz wewnątrzkomórkowe AGE zgodnie z wcześniejszym opisem11,12.
	<ol>
		<li>Całkowite ekstrakty białkowe (około 200 μg) przepłukać 3x wodą przez ultrawirowanie w odśrodkowych jednostkach filtrujących o mocy 10 kDa.</li>
		<li>Dodać 10 μl 100 mM HCl, 10 μl pepsyny (2 mg/ml w 20 mM HCl) i 10 μl tymolu (2 mg/ml w 20 mM HCl) do odzyskanego białka (około 100 μL) i inkubować próbki w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.</li>
		<li>Zneutralizować i buforować próbki o pH 7,4, dodając 12,5 μl 0,5 M buforu fosforanu potasu (pH 7,4) i 5 μl 260 mM KOH.</li>
		<li>Dodać 10 μl pronazy E [2 mg/ml w 10 mM buforze fosforanu potasu (pH 7,4)] i 10 μl roztworu penicyliny i streptomycyny i inkubować próbki w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.</li>
		<li>Dodać 10 μl aminopeptydazy [2 mg/ml w 10 mM buforze fosforanu potasu (pH 7,4)] i 10 μl prolidazy [2 mg/ml w 10 mM buforze fosforanu potasu (pH 7,4)] i inkubować próbki w temperaturze 37 °C przez 48 godzin.</li>
		<li>Przeanalizuj otrzymany hydrolizat za pomocą LC-MS/MS, zgodnie z wcześniejszym opisem12.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Fronius, M., Clauss, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechano-sensitivity+of+ENaC%3A+may+the+%28shear%29+force+be+with+you%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archiv%22%5BJournal%5D)">Mechano-sensitivity of ENaC: may the (shear) force be with you.</a> Pflügers Archiv. 455 (5), 775-785 (2008).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html">http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html</a> (2006).</li>
<li>Altun, Z. F., Hall, D. H. Nervous system, general description. WormAtlas. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.wormatlas.org/hermaphrodite/nervous/Neuroframeset.html">http://www.wormatlas.org/hermaphrodite/nervous/Neuroframeset.html</a> (2011).</li>
<li>Sohn, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+neurodegeneration+may+precede+microvascular+changes+characteristic+of+diabetic+retinopathy+in+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Retinal neurodegeneration may precede microvascular changes characteristic of diabetic retinopathy in diabetes mellitus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (19), E2655-E2664 (2016).</li>
<li>Chilelli, N. C., Burlina, S., Lapolla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AGEs%2C+rather+than+hyperglycemia%2C+are+responsible+for+microvascular+complications+in+diabetes%3A+a+%26%2334%3Bglycoxidation-centric%26%2334%3B+point+of+view%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrition%2C+Metabolism+%26+Cardiovascular+Diseases%22%5BJournal%5D)">AGEs, rather than hyperglycemia, are responsible for microvascular complications in diabetes: a &#34;glycoxidation-centric&#34; point of view.</a> Nutrition, Metabolism & Cardiovascular Diseases. 23 (10), 913-919 (2013).</li>
<li>Schlotterer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+as+model+for+the+study+of+high+glucose-+mediated+life+span+reduction%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">C. elegans as model for the study of high glucose- mediated life span reduction.</a> Diabetes. 58 (11), 2450-2456 (2009).</li>
<li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1152(2009).</li>
<li>Leiers, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stress-responsive+glutathione+S-transferase+confers+resistance+to+oxidative+stress+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">A stress-responsive glutathione S-transferase confers resistance to oxidative stress in Caenorhabditis elegans.</a> Free Radical Biology and Medicine. 34 (11), 1405-1415 (2003).</li>
<li>Rabbani, N., Thornalley, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+methylglyoxal+by+stable+isotopic+dilution+analysis+LC-MS%2FMS+with+corroborative+prediction+in+physiological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Measurement of methylglyoxal by stable isotopic dilution analysis LC-MS/MS with corroborative prediction in physiological samples.</a> Nature Protocols. 9 (8), 1969-1979 (2014).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 7 (72), 248-254 (1976).</li>
<li>Ahmed, N., Argirov, O. K., Minhas, H. S., Cordeiro, C. A., Thornalley, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+of+advanced+glycation+endproducts+%28AGEs%29%3A+surveying+AGEs+by+chromatographic+assay+with+derivatization+by+6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl-carbamate+and+application+to+Nepsilon-carboxymethyl-lysine-+and+Nepsilon-%281-carboxyethyl%29lysine-modified+albumin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Assay of advanced glycation endproducts (AGEs): surveying AGEs by chromatographic assay with derivatization by 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl-carbamate and application to Nepsilon-carboxymethyl-lysine- and Nepsilon-(1-carboxyethyl)lysine-modified albumin.</a> Biochemical Journal. 364 (Pt 1), 1-14 (2002).</li>
<li>Thornalley, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+screening+of+advanced+glycation+endproducts+in+cellular+and+extracellular+proteins+by+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Quantitative screening of advanced glycation endproducts in cellular and extracellular proteins by tandem mass spectrometry.</a> Biochemical Journal. 375 (Pt 3), 581-592 (2003).</li>
<li>Karachalias, N., Babaei-Jadidi, R., Ahmed, N., Thornalley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+fructosyllysine+and+advanced+glycation+end+products+in+the+kidney%2C+retina+and+peripheral+nerve+of+streptozotocin-induced+diabetic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Accumulation of fructosyllysine and advanced glycation end products in the kidney, retina and peripheral nerve of streptozotocin-induced diabetic rats.</a> Biochemical Society Transactions. 31, 1423-1425 (2003).</li>
<li>Morcos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glyoxalase-1+prevents+mitochondrial+protein+modification+and+enhances+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Glyoxalase-1 prevents mitochondrial protein modification and enhances lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> Aging Cell. 7 (2), 260-269 (2008).</li>
<li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Caenorhabditis+elegans+methods%3A+synchronization+and+observation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019(2012).</li>
<li>Lagido, C., McLaggan, D., Glover, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Screenable+In+Vivo+Assay+for+Mitochondrial+Modulators+Using+Transgenic+Bioluminescent+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), e53083(2015).</li>
<li>Takamiya, S., Mita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+purification+of+active+liquid-cultured+Caenorhabditis+elegans+using+a+modified+Baermann+apparatus%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology+International%22%5BJournal%5D)">Large-scale purification of active liquid-cultured Caenorhabditis elegans using a modified Baermann apparatus.</a> Parasitology International. 65 (5 Pt B), 580-583 (2016).</li>
<li>Cornaglia, M., Lehnert, T., Gijs, M. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+systems+for+high-throughput+and+high-content+screening+using+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic systems for high-throughput and high-content screening using the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Lab Chip. 17 (22), 3736-3759 (2017).</li>
<li>Zhu, G., Yin, F., Wang, L., Wei, W., Jiang, L., Qin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+type+2+diabetes-like+hyperglycemia+in+C.+elegans+on+a+microdevice%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Modeling type 2 diabetes-like hyperglycemia in C. elegans on a microdevice.</a> Integrative Biology. 8 (1), 30-38 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten przedstawia wiarygodne podejście do hodowli C. elegans na dużą skalę w celu uzyskania wyników ilościowych. Wyniki uzyskane w literaturze można powtórzyć, jak pokazano w reprezentatywnych wynikach. Mimo że ten protokół zbierania próbek C. elegans na dużą skalę wydaje się prostą metodą, istnieją pewne pułapki, które należy wziąć pod uwagę. Jeśli chodzi o synchronizację populacji nicieni, protokół ten opisuje podejście polegające na bieleniu populacji podchlorynem sodu i wodor...

Analizy białek, takie jak western blot czy spektrometria mas, wymagają miligramów białka. Plon ten wymaga hodowli na dużą skalę setek C. elegans, którą można osiągnąć albo przez hodowlę płynną, albo na pożywkach stałych, przenosząc nicienie przez mycie. Naprężenie płynu i ścinanie indukuje ekspresję nabłonkowych kanałów sodowych (ENaC), które mogą zwiększać stres osmotyczny poprzez zwiększony wychwyt sodu, potencjalnie zmieniając długość życia C. elegans i wpływając na analizy metaboliczne1. W związku z tym niektóre kluczowe kroki w tym protokole dla podejścia opartego na płytkach uwzględniają redukcję naprężeń wpływających na zmienność eksperymentalną. Z drugiej strony, kultura płynna wpływa na fenotyp nicieni i komplikuje hodowlę i zbieranie dokładnej liczby nicieni2. Co więcej, substancje reaktywne mogą być zmieniane przez składniki pożywki i mogą rozprowadzać się nierównomiernie, zanim dotrą do nicieni. Jeśli chodzi o ograniczenia hodowli płynnej, protokół ten zapewnia alternatywne podejście do hodowli próbek C. elegans na dużą skalę.
C. elegans to organizm modelowy z odrębną siecią 302 komórek neuronalnych, stanowiących jedną trzecią wszystkich jego komórek3. Od czasu wprowadzenia go do nauki opisano wiele genów homologicznych i ortologicznych, co zwiększa jego wartość jako modelu dla badań medycznych. Ostatnio przedstawiono dowody na upośledzenie neurologiczne w retinopatii cukrzycowej, poprzedzające uszkodzenie naczyń krwionośnych4. C. elegans nie ma naczyń krwionośnych, ale zawiera odrębną sieć neuronalną, co czyni go odpowiednim modelem do badania zmian neuronalnych oprócz naczyniowych. W związku z tym C. elegans jest szczególnie interesujący dla badania ogólnych mechanizmów powikłań cukrzycowych. Zmiany biochemiczne w powikłaniach cukrzycowych wiążą się z powstawaniem AGEs, które dodatkowo wpływają na powstawanie ROS w odpowiedzi na hiperglikemię5. AGE występują u C. elegans i przyczyniają się do uszkodzenia neuronów6. Choroby przewlekłe są często spowodowane złożonymi, wielogenowymi procesami wymagającymi wieloparametrycznego podejścia do oceny ich mechanizmów, czego przykładem jest ocena powikłań cukrzycowych. Protokół ten może być przydatny do uzyskiwania wielu parametrów jednocześnie, a także później. Zwiększoną porównywalność i odtwarzalność podejścia wieloparametrycznego można osiągnąć poprzez pominięcie różnic morfologicznych i metabolicznych między hodowlą pożywek płynnych i stałych.

<table><tbody><tr><td>E. coli OP50</td><td>CGC</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans N2</td><td>CGC</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans CL2166</td><td>CGC</td><td>nie dotyczy szalki</td><td></td></tr><tr><td>Petriego, 60 mm x 15 mm</td><td>Greiner One</td><td>628161</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta wolumetryczna, szkło, 10 ml</td><td>Neolab</td><td>E-0413</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza inhibitor tabletki koktajlowe</td><td>Roche</td><td>04693124001</td><td></td></tr><tr><td>Niedenaturujący bufor lizatu: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl, pH 8</td><td>Sigma</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X-100</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>Sigma</td><td>E5391</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 96-dołkowe, przezroczyste dno</td><td>Marka</td><td>781611</td><td></td></tr><tr><td>Infinite M200, czytnik płytek</td><td>Tecan</td><td>30017581</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki z tlenku cyrkonu, 0,5 mm</td><td>Następny postęp</td><td>ZROB05-RNA</td><td></td></tr><tr><td>Bullet Blender, homogenizator</td><td>Następny postęp</td><td>BBX24</td><td></td></tr><tr><td>Pepsyna z błony śluzowej żołądka świń</td><td>Sigma</td><td>P6887</td><td></td></tr><tr><td>Thymol</td><td>Sigma</td><td>T0501</td><td></td></tr><tr><td>Pronaza E/ Proteaza z Streptomyces griseus </td><td>Sigma</td><td>P6911</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór penicyliny-streptomycyny</td><td>Sigma</td><td>P43339</td><td></td></tr><tr><td>Prolidaza z nerki świni</td><td>Sigma</td><td>P6675</td><td></td></tr><tr><td>Aminopeptydaza z Aeromonas proteolytica</td><td>Sigma</td><td>A8200</td><td></td></tr><tr><td>Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-0.5</td><td>Merckmillipore</td><td>UFC501096</td><td></td></tr><tr><td>Podstawowe materiały do hodowli płytek są opisane w Referencji 6.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

hodowla caenorhabditis elegans na dużych obszarach na płytkach: przygotowanie próbki do badania zmian metabolicznych w cukrzycy

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Hodowla Caenorhabditis elegans (C. elegans) na dużą skalę na płytkach agarowych może być czasochłonna i trudna. Protokół ten opisuje prostą i niedrogą metodę pozyskiwania dużej liczby zwierząt w celu izolacji białek w celu przeprowadzenia western blot, spektrometrii mas lub dalszych analiz proteomicznych. Ponadto można łatwo osiągnąć zwiększenie liczby nicieni w barwieniu immunologicznym i integrację wielu analiz w tych samych warunkach hodowli. Dodatkowo ułatwiony jest transfer między płytkami o różnych warunkach eksperymentalnych. Powszechne techniki w hodowli płytkowej polegają na przenoszeniu pojedynczego C. elegans za pomocą drutu platynowego i przenoszeniu wypełnionych kawałków agaru za pomocą skalpela. Jednak wraz ze wzrostem liczby nicieni techniki te stają się zbyt czasochłonne. Protokół ten opisuje hodowlę C. elegans na dużą skalę, w tym liczne kroki mające na celu zminimalizowanie wpływu przygotowania próbki na fizjologię robaka. Naprężenia płynów i ścinające mogą zmieniać długość życia i procesy metaboliczne C. elegans, co wymaga szczegółowego opisu krytycznych etapów w celu uzyskania wiarygodnych i powtarzalnych wyników. C. elegans jest organizmem modelowym, składającym się z komórek nerwowych do jednej trzeciej, ale pozbawionym naczyń krwionośnych, co daje możliwość badania wyłącznie zmian neuronalnych niezależnych od kontroli naczyniowej. Ostatnio stwierdzono wczesną neurodegenerację w retinopatii cukrzycowej przed zmianami naczyniowymi. W związku z tym C. elegans jest szczególnie interesujący dla badania ogólnych mechanizmów powikłań cukrzycowych. Na przykład obserwuje się zwiększone tworzenie końcowych produktów zaawansowanej glikacji (AGE) i reaktywnych form tlenu (ROS), które w sposób powtarzalny występują u C. elegans. Przedstawiono tutaj protokoły postępowania z próbkami o odpowiedniej wielkości dla szerszego spektrum badań, czego przykładem jest badanie zmian biochemicznych wywołanych cukrzycą. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten może być przydatny w badaniach wymagających dużej liczby C. elegans i w których hodowla płynna nie jest odpowiednia.

Przedstawiono tutaj przykłady tworzenia wielkoskalowej hodowli C. elegans do zastosowań w badaniach nad cukrzycą. Może być interesujące odniesienie parametrów do pojedynczego zwierzęcia, zamiast normalizowania ich do całkowitego stężenia białka. W analizach wymagających niewielkiej liczby nicieni można to łatwo osiągnąć poprzez przeliczenie osobników. W przypadku wielkoskalowej hodowli C. elegans, obejmującej setki nicieni na grupę eksperymentalną, podejście to jest niep...

Ten protokół opisuje metodę uprawy Caenorhabditis elegans na dużą skalę na stałych podłożach. Jako alternatywa dla hodowli płynnej, protokół ten pozwala na uzyskanie parametrów o różnych skalach pod uprawą płytkową. Zwiększa to porównywalność wyników poprzez pominięcie różnic morfologicznych i metabolicznych między hodowlą pożywek płynnych i stałych.

Hodowla Caenorhabditis elegans na dużych obszarach na płytkach: przygotowanie próbki do badania zmian metabolicznych w cukrzycy

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple ...

W dziedzinie C. elegans metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania, które wymagają produkcji dużych populacji i próbek nicieni przy użyciu hodowli płytkowej. Głównymi zaletami tego protokołu są jego łatwe ustanowienie i łatwość opisania, w tym pułapek i zastosowań. Po uzyskaniu zsynchronizowanej populacji nicieni dodaj około jednego mililitra buforu M nine do płytek i ostrożnie rozprowadź bufor, kołysząc płytki.Następnie zbierz nicienie w 15-mililitrowej tubce. Teraz odwróć rurkę i użyj mikroskopu, aby ocenić gęstość nicieni. W razie potrzeby dostosuj gęstość zawiesiny i kontynuuj jej ocenę pod mikroskopem.Nanieść 150 mikrolitrów zawiesiny bezpośrednio na płytki ze zmodyfikowanymi końcówkami do pipet. Aby zapewnić równomierne rozprowadzenie nicieni między płytkami, należy odwracać rurkę zawiesiny w regularnych odstępach czasu. Najpierw umyj nicienie za pomocą zmodyfikowanej końcówki pipety z około 500 mikrolitrami buforu M 9.Korzystając z tego samego buforu, kontynuuj odłączanie nicieni do momentu, gdy większość zwierząt zostanie zebrana w zawiesinie. Następnie zbierz nicienie za pomocą zmodyfikowanej końcówki pipety i przenieś je na płytkę z OP50. Zmodyfikowane końcówki pipet zmniejszają naprężenia ścinające i uszkodzenia nicieni ze względu na większą średnicę.Następnie pozostaw płytkę do wyschnięcia. Przed pobraniem próbek należy przygotować ciekły azot, aby zatrzasnąć zebrane nicienie. Następnie umieść bufor M nine na lodzie.Nałóż jeden mililitr buforu M nine na każdą płytkę i delikatnie obracaj, aby umyć każdą płytkę. Następnie należy pobrać objętość buforu M nine i przenieść go do nowych 15-mililitrowych probówek. Odwirować probówkę na krótko w temperaturze 800 razy g, przed usunięciem większości buforu M 9.Następnie umyj próbki trzykrotnie 10 mililitrami buforu M nine, aby usunąć wszelkie bakterie. Za pomocą szklanej pipety przenieś każdą granulkę do pustej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Za pomocą szklanej pipety pobrać jeden mililitr buforu M nine z drugiej probówki o pojemności 1,5 mililitra, aby wypłukać nicienie ze ścianki pipety.Następnie umyj pozostałe nicienie z 15-mililitrowych probówek i przenieś je do probówek z próbkami. Następnie odwirować probówki z próbkami o masie 19 000 g przez jedną minutę i usunąć jak najwięcej supernatantu. Następnie uszczelnij każdą probówkę folią parafinową i natychmiast zamroź je w ciekłym azocie.Przechowuj probówki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu przygotowania lizatu. Do każdej zamrożonej próbki dodać te same objętości kulek tlenku cyrkonu o grubości 0,5 milimetra i dwukrotność objętości buforu lizatu z koktajlem inhibitorów proteinazy. Następnie umieść probówki w homogenizatorze na jedną minutę z prędkością dziewięć.Odwirować próbki przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 19 000 razy g. Na koniec przenieś supernatant do nowej probówki na lodzie i przechowuj go w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do przyszłych eksperymentów. W tym protokole wyhodowano duże ilości C. elegans do zastosowań w badaniach nad cukrzycą.Liczba pobranych nicieni korelowała z wydajnością białka w lizacie, co pokazuje, że przy użyciu tego protokołu można osiągnąć odtwarzalną ilościową izolację białka. Przedstawiono tutaj analizy spektrometryczne reaktywnego metabolitu methylglyoxalu oraz zaawansowane produkty końcowe glikacji powstałe w wyniku ekspozycji na methylglyoxal. Porównano nicienie poddane działaniu glukozy i grupy kontrolne.Przenoszenie nicieni za pomocą pipety może powodować naprężenia ścinające, potencjalnie uszkadzając nicienie. Poziomy stresu oksydacyjnego u nicieni pipetowanych i nicieni przenoszonych za pomocą metalowego drutu nie różniły się przy użyciu tego protokołu. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak western blot, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania z zakresu proteomiki.Protokół ten ułatwia również eksperymenty, które odnoszą wiele parametrów do tej samej populacji.

plate-based-large-scale-cultivation-caenorhabditis-elegans-sample

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opisujemy metody badania aspektów amylopatii u robaka C. elegans. Pokazujemy, jak konstruować robaki wyrażające ludzkie Aβ42 w neuronach i jak testować ich funkcję w testach behawioralnych. Dalej pokazujemy, jak uzyskać pierwotne hodowle neuronów, które można wykorzystać do badań farmakologicznych.

System modelowy Caenorhabditis elegans do badania amylopatii

Opisujemy tutaj poprawiony protokół dla hodowli na dużą skalę embrionalnych komórek C. elegans. Embrionalne komórki C. elegans hodowane in vitro przy użyciu tej metody wydają się różnicować i rekapitulować ekspresję genów w sposób specyficzny dla komórki. Techniki, które wymagają bezpośredniego dostępu do komórek lub izolacji określonych typów komórek z innych tkanek, mogą być stosowane na komórkach hodowanych przez C. elegans.

Metoda hodowli embrionalnych komórek C. elegans

Tutaj prezentujemy nicienia Caenorhabditis elegans jako wszechstronny model gospodarza do badania interakcji mikrobiologicznych.

Nicienie Caenorhabditis elegans - wszechstronny model in vivo do badania interakcji gospodarz-mikroorganizm

Opisujemy protokoły korzystania z platformy śledzenia nicieni o szerokim polu widzenia (WF-NTP), która umożliwia wysokoprzepustową charakterystykę fenotypową dużych populacji Caenorhabditis elegans. Protokoły te mogą być wykorzystywane do charakteryzowania subtelnych zmian behawioralnych w zmutowanych szczepach lub w odpowiedzi na leczenie farmakologiczne w wysoce skalowalny sposób.

Zautomatyzowana analiza behawioralna dużych populacji C. elegans przy użyciu platformy śledzenia o szerokim polu widzenia

Aby wykorzystać Caenorhabditis elegans (C. elegans) w badaniach omiki, potrzebna jest metoda generowania dużych populacji robaków, gdzie pojedyncza próbka może być mierzona na różnych platformach do analiz porównawczych. Przedstawiono tutaj metodę hodowli populacji C. elegans na płytkach hodowlowych na dużą skalę (LSCP) oraz dokumentowania wzrostu populacji.

Kultura i analiza populacji dużoskalowych o mieszanym stadium Caenorhabditis elegans

Poniższy protokół opisuje rozwój i optymalizację wysokoprzepustowego przepływu pracy dla hodowli robaków, obrazowania fluorescencyjnego i automatycznego przetwarzania obrazów w celu ilościowego określenia agregatów poliglutaminy jako oceny zmian w proteostazie.

Automatyzacja zagregowanej kwantyfikacji u Caenorhabditis elegans

Tutaj prezentujemy protokół oceny neuroprotekcyjnych aktywności testowych związków u Caenorhabditis elegans, w tym agregacji poliglutaminy, śmierci neuronów i zachowania chemounikania, a także przykładowej integracji wielu fenotypów.

Caenorhabditis elegans jako modelowy system do odkrywania związków bioaktywnych przeciwko neurotoksyczności za pośrednictwem poliglutaminy

Mikroby jelitowe mogą pozytywnie lub negatywnie wpływać na zdrowie swojego gospodarza poprzez specyficzne lub konserwatywne mechanizmy. Caenorhabditis elegans to wygodna platforma do badań przesiewowych pod kątem takich drobnoustrojów. Niniejszy protokół opisuje wysokoprzepustowe badania przesiewowe 48 izolatów bakteryjnych pod kątem wpływu na odporność nicieni na stres, wykorzystywane jako wskaźnik zdrowia robaków.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe izolatów drobnoustrojów mające wpływ na zdrowie Caenorhabditis elegans

Obecny protokół opisuje procedurę ręcznego izolowania jelit od dorosłych nicieni Caenorhabditis elegans w celu wprowadzenia ich do genomiki, proteomiki, mikrobiomu lub innych testów.

Ręczna sekcja jelit Caenorhabditis elegans

Prezentowany tutaj jest zoptymalizowany protokół hodowli izolowanych pojedynczych nicieni na stałych podłożach w mikrofabrykowanych urządzeniach wielodołkowych. Takie podejście pozwala na monitorowanie poszczególnych zwierząt przez całe życie pod kątem różnych fenotypów związanych ze starzeniem się i zdrowiem, w tym aktywności, wielkości i kształtu ciała, geometrii ruchu i przeżycia.

Długotrwała hodowla i monitorowanie izolowanych Caenorhabditis elegans na pożywkach stałych w urządzeniach wielodołkowych

Nauczanie nauk biologicznych może być bardziej stymulujące dla studentów dzięki zastosowaniu eksperymentów. Ten manuskrypt przedstawia dwa różne, ale uzupełniające się protokoły, które można wykorzystać w klasie, aby zachęcić uczniów do formułowania i testowania hipotez związanych z dietami wysokokalorycznymi, głodówką i starzeniem się.

Stosowanie tanich barwników do wizualizacji akumulacji glikogenu i integralności jelit u Caenorhabditis elegans

Naucz się hodowli Caenorhabditis elegans na dużą skalę na płytkach z agarem. Ta metoda umożliwia uzyskanie zsynchronizowanych populacji nicieni i dużych próbek do badań metabolicznych w cukrzycy.

Hodowla Caenorhabditis elegans na dużych obszarach na płytkach: przygotowanie próbki do badania zmian metabolicznych w cukrzycy

Przeglądaj więcej filmów