Name: Zastosowanie przeszczepu krwiotwórczych komórek macierzystych do oceny pochodzenia zespołu mielodysplastycznego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: Poznaj przeszczep krwiotwórczych komórek macierzystych do oceny potencjału złośliwego zmienionych genetycznie komórek hematopoetycznych. Metoda ta umożliwia analizę funkcjonalną komórek macierzystych nowotworu i identyfikację komórek inicjujących chorobę w zespole mielodysplastycznym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Intramural Research Program of the National Cancer Institute, National Institutes of Health (numery grantów ZIA SC 010378 i BC 010983).

Procedury dla zwierząt opisane w tym artykule zostały zatwierdzone przez National Cancer Institute przy Bethesda Animal Care and Use Committee i są zgodne z zasadami zawartymi w Polityce Publicznej Służby Zdrowia dotyczącej humanitarnej opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych, Ustawie o dobrostanie zwierząt oraz Przewodniku dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych.
1. Przygotowanie komórek
<ol>
	<li>Pobieranie komórek jądrzastych szpiku kostnego (BMNC)
	<ol>
		<li>Używaj tylko sterylnych materiałów. Sterylizuj narzędzia wielokrotnego użytku za pomocą autoklawu parowego. Kupuj igły, strzykawki i plastikowe wyroby w sterylnych pojemnikach jednorazowego użytku. Wszystkie manipulacje na zwierzętach i komórkach należy wykonywać w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II, typu A2.</li>
		<li>Przygotuj BMNC w 14 ml okrągłej probówce zawierającej 3 ml HF2 (zbilansowany roztwór soli Hanka uzupełniony 2% płodową surowicą bydlęcą).</li>
		<li>Eutanazja myszy dawcy C57Bl6 (dodatnie dla allelu CD45 CD45.2) w wieku zwykle 2-6 miesięcy, przy użyciu komory CO2.</li>
		<li>Wysterylizuj tuszę myszy, rozpylając 70% etanolu na całe ciało za pomocą butelki z rozpylaczem. Zdejmij skórę z nóg, od miednicy w dół do kostki.</li>
		<li>Usuń kość udową i piszczelową z tuszy za pomocą sterylnych nożyczek (prostych, ostrych/ostrych, 11,5 cm) i kleszczyków (Graefe, ząbkowane, szerokość końcówki 0,8 mm). Wyraźnie przytnij przyczepione mięśnie.</li>
		<li>Odetnij bliższy i dalszy koniec kości piszczelowej nożyczkami. Trzymając kość piszczelową kleszczami, włóż strzykawkę o rozmiarze 27 ml i pojemności 3 ml zawierającą 2,5 ml HF2 do jamy szpiku piszczelowego na dystalnym końcu kości piszczelowej (kostki). Wypłucz komórki szpiku kostnego z kości piszczelowej, delikatnie uciskając do probówki o okrągłym dnie o pojemności 14 ml.
		<ol>
			<li>Powtórz dla drugiej kości piszczelowej.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przetnij bliższy i dalszy koniec kości udowej nożyczkami. Przepłukać jamę szpiku kości udowej, wkładając igłę o rozmiarze 20 dołączoną do strzykawki o pojemności 3 ml zawierającej 2,5 ml HF2 do dystalnego końca jamy szpiku kości udowej i delikatnie uciskając strzykawkę.
		<ol>
			<li>Powtórz tę czynność dla drugiej kości udowej, zbierając cały szpik kostny z kości piszczelowej i udowej do tej samej 14 ml probówki z okrągłym dnem.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Rozproszyć masę szpiku, kilkakrotnie zasysając w górę i w dół za pomocą tej samej igły o rozmiarze 20 dołączonej do strzykawki o pojemności 3 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie przeciwciałami BMNC
	<ol>
		<li>Policz BMNC. Dodać 20 μl 3% roztworu kwasu octowego do 20 μl zawiesiny BMNC utworzonej w kroku 1.1.8. Następnie policz za pomocą hemocytometru i odwróconego mikroskopu.</li>
		<li>Osadzać BMNC przez delikatne odwirowywanie przy 450 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ponownie zawiesić osad z HF2, używając 90 μl na 107 komórek i dodać 10 μl biotynylowanego koktajlu przeciwciał antyliniowych do zawiesiny komórkowej.</li>
		<li>Po inkubacji przez 20 minut w temperaturze 4 °C, przepłukać zabarwione komórki 3 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).</li>
		<li>Ponownie zawiesić BMNC ze 100 μl HF2 na 107 komórek. Dodać 2 μl przeciwciała antybiotyny sprzężonego z allofikocyjaniną (APC) do zawiesiny komórkowej, a następnie inkubować w temperaturze 4 °C przez 20 minut.</li>
		<li>Przepłukać wybarwiony BMNC 3 ml PBS i ponownie zawiesić BMNC z HF2 uzupełnionym 0,2 μg/ml jodku propidyny (PI) do sortowania komórek metodą cytometrii przepływowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sortowanie komórek BMNC za pomocą cytometrii przepływowej
	<ol>
		<li>Kalibruj sortownik komórek cytometrii przepływowej. Zoptymalizuj wszystkie fotopowielacze (PMT), parametry rozpraszania i fluorescencji przy użyciu niebarwionych komórek i ustaw w zakresie liniowym każdego detektora.</li>
		<li>Przygotuj niebarwione, wybarwione PI i oznaczone APC komórki koktajlowe pochodzenia równolegle z kroku 1.2. Analizuj pod kątem kompensacji spektralnej.</li>
		<li>Dyskryminuj komórki dubletowe przez sekwencyjne bramkowanie FSC-H i SSC-H, 640-SSC-A i 640-SSC-H i 640-SSC-S przeciwko 640-SSC-W.</li>
		<li>Wyklucz nieżywotne komórki za pomocą PI wzbudzonego przy 561 nm i emisji zebranej za pomocą filtra pasmowo-przepustowego 614/20. Wzbudzić komórki znakowane APC linii produkcyjnej przy długości fali 640 nm i zbierać emisję za pomocą filtra pasmowo-przepustowego 671/30.</li>
		<li>Rejestruj wartości fluorescencji jako wysokość napięcia i zbierz co najmniej 100 000 zdarzeń w plikach danych w trybie listy, aby zwizualizować populacje do posortowania.</li>
		<li>Oblicz kompensację spektralną po pobraniu trzech próbek po 10 000 komórek dla następujących: komórek nieznakowanych, komórek znakowanych PI i koktajlu przeciwciał antyliniowych sprzężonych z komórkami znakowanymi APC.</li>
		<li>Ustaw trzy regiony, aby posortować linię ujemną (LN), linię dodatnią (LP) ze słabą intensywnością fluorescencji (LP1) i populację LP z jasną fluorescencją (LP2) w probówkach o pojemności 5 ml zawierających 0,5 ml 10% pożywki FBS.</li>
		<li>Sortuj komórki za pomocą jednej kropli obwiedni i oczyszczaj tryb przerwania.</li>
		<li>Wykonaj analizę po sortowaniu z łączną liczbą 1 000 komórek w każdej posortowanej próbce, aby potwierdzić czystość i żywotność posortowanych komórek.</li>
		<li>Zebrać posortowane komórki przez odwirowanie w stężeniu 450 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić osad komórek z 0,5 ml HF2.</li>
		<li>Potwierdź posortowany numer komórki za pomocą hemocytometru i błękitu trypana. Dostosuj liczbę komórek za pomocą HF2 do przeszczepu. 
		UWAGA: Szerokie spektrum populacji BMNC można wyizolować do przeszczepu przy użyciu dodatkowych kombinacji przeciwciał sprzężonych z fluorochromem w kroku 1.2.2 powyżej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie myszy biorcy i przeszczepienie krwiotwórczych komórek macierzystych (HSCT)
<ol>
	<li>Przygotowanie biorców przeszczepów
	<ol>
		<li>Utrzymanie opieki weterynaryjnej i hodowlanej nad kongenicznymi myszami biorcami (B6-LY5.1/Cr, CD45.1) w obiekcie dla zwierząt wolnych od określonych patogenów (SPF).</li>
		<li>W celu profilaktycznego odkażania przewodu pokarmowego należy dostarczyć biorcom sterylną wodę zawierającą 100 mg/l cyprofloksacyny przez 7 dni przed napromieniowaniem w dawce śmiertelnej (9 Gy) i utrzymywać przez 14 dni po napromienianiu.</li>
		<li>Zapewnić napromieniowanie w dawce śmiertelnej (9 Gy) ze źródła Cs w następujący sposób. Korzystaj z przeszkolonego, certyfikowanego operatora Cs. Ustaw instrument źródłowy Cs tak, aby dostarczał promieniowanie gamma o prędkości 70 cGy/min całkowitego ciała. Umieść 10 myszy w specjalnie zaprojektowanym uchwycie i włóż uchwyt do komory naświetlacza. Dostarcz napromienianie całego ciała 9 Gy w ciągu 13 minut i wróć myszy do klatek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeszczepienie krwiotwórczych komórek macierzystych
	<ol>
		<li>Zmieszać BMNC typu dzikiego (WT) od kongenicznej myszy biorcy (B6-LY5.1/Cr, CD45.1) w dawce 2 x 105 komórek na mysz z 2 do 5 x 104 komórek oczyszczonego testowego BMNC przygotowanego z sortowaniem metodą cytometrii przepływowej, jak opisano w ppkt 1.3 powyżej. Wymieszaj komórki w tej samej strzykawce. 
		UWAGA: WT BMNC zapewnia efekt oszczędzania promieniowania myszy biorcy i pozwala na przeżycie myszy biorcy, jeśli komórki testowe nie obsługują hematopoezy. WT BMNC używany w tego typu eksperymencie wykazuje ekspresję allelu CD45.1, a zatem można go odróżnić od komórek testowych za pomocą przeciwciał, które rozróżniają CD45.1 i CD45.2. Ogniwa WT BM są określane jako "ogniwa pomocnicze", "ogniwa oszczędzające promieniowanie" lub "ogniwa konkurencyjne</li>".
		<li>Dostosuj objętość mieszaniny komórek do 200 μl na biorcę, używając sterylnego HF2 w celu ułatwienia wstrzyknięcia.</li>
		<li>Przeszczep mieszaniny komórek śmiertelnie napromieniowanym myszom biorcom poprzez dożylne wstrzyknięcie do żyły ogonowej za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml i igły o rozmiarze 28, w ciągu 24 godzin od napromieniowania. Umieść ogon myszy pod lampą grzewczą, ponieważ ciepło prowadzi do rozszerzenia żyły ogonowej. 
		UWAGA: Pod koniec badania należy poddać eutanazji wszystkie myszy biorcy i ocenić postęp choroby za pomocą sekcji zwłok, histologii i cytometrii przepływowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Test wszczepienia za pomocą cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Aby ocenić wszczepienie komórek dawcy, należy pobrać krew obwodową (PB) od myszy biorcy w 6., 12. i 16. tygodniu po przeszczepie.</li>
	<li>Ogrzej biorców w klatce z lampą grzewczą przez około 1 minutę i umieść mysz w respekcie.</li>
	<li>Przeciąć żyłę ogonową skalpelem (ostrze 10, rękojeść skalpela #3) i zebrać 100 μl PB na biorcę za pomocą probówki mikrokapilarnej zawierającej EDTA jako antykoagulant.</li>
	<li>Podzielić zebrany PB na dwie równe porcje, umieszczając 50 μl w sterylnej probówce do mikrowirówki. Należy użyć jednej podwielokrotności do automatycznej pełnej morfologii krwi (CBC) (wykonywanej w NCI Histopathology Core), a drugiej podwielokrotności do barwienia przeciwciał i cytometrii przepływowej.</li>
	<li>Aby wykryć wszczepienie dawcy za pomocą cytometrii przepływowej, należy poddać lizie czerwone krwinki (RBC), dodając 1 ml hipotonicznego buforu do lizy RBC (8,29 g/L NH4Cl, 1 g/L KHCO3, 0,037 g/L Na2EDTA, pH 7,2) do 50 μL pobranego PB. Zmieszać próbkę i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odwirować zlizany PB przy 4 600 x g przez 1,5 minuty. Ostrożnie odessać supernatant i wyrzucić.</li>
	<li>Częściowo rozerwij osad komórkowy, delikatnie stukając lub "trzepając" dnem rurki. Dodać 1,3 ml PBS do osadu znajdującego się w probówce i odwirować przy 4,600 x g przez 1,5 min. Ostrożnie odessać i wyrzucić supernatant.</li>
	<li>Rozbij osad komórkowy przez stukanie lub trzeganie i dodaj 200 μl HF2 uzupełnionego 5% surowicą szczurzą do osadu komórkowego</li>.
	<li>Dodać przeciwciało anty-CD45.2 (1 μl) sprzężone z allofikocyjaniną (APC) do zawiesiny komórek. Inkubować w temperaturze 4 °C przez co najmniej 30 minut i krótko zwirować mieszaninę.</li>
	<li>Po barwieniu przemyć komórki dwukrotnie, jak opisano powyżej, i ponownie zawiesić 400 μl HF2 uzupełnionym 1 μg/ml PI.</li>
	<li>Wykryj wszczepienie za pomocą 4-kolorowego cytometru przepływowego. Uzyskaj dodatkowe informacje na temat typów komórek we krwi obwodowej, dodając dodatkowe przeciwciała w celu wykrycia określonych typów komórek, takich jak limfocyty B lub T.</li>
	<li>Rejestruj dane dotyczące seryjnego wszczepienia za pomocą arkusza kalkulacyjnego, aby umożliwić dalszą analizę danych.</li>
</ol>

<ol><li>Corey, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelodysplastic+syndromes%3A+the+complexity+of+stem-cell+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Myelodysplastic syndromes: the complexity of stem-cell diseases.</a> Nature Reviews Cancer. 7 (2), 118-129 (2007).</li>
<li>Garcia-Manero, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelodysplastic+syndromes%3A+2015+Update+on+diagnosis%2C+risk-stratification+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">Myelodysplastic syndromes: 2015 Update on diagnosis, risk-stratification and management.</a> American Journal of Hematology. 90 (9), 831-841 (2015).</li>
<li>Heaney, M. L., Golde, D. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10341278">Myelodysplasia.</a> The New England Journal of Medicine. 340 (21), 1649-1660 (1999).</li>
<li>Nimer, S. D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18467609">Myelodysplastic syndromes.</a> Blood. 111 (10), 4841-4851 (2008).</li>
<li>Aul, C., Giagounidis, A., Germing, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiological+features+of+myelodysplastic+syndromes%3A+results+from+regional+cancer+surveys+and+hospital-based+statistics%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">Epidemiological features of myelodysplastic syndromes: results from regional cancer surveys and hospital-based statistics.</a> International Journal of Hematology. 73 (4), 405-410 (2001).</li>
<li>Pedersen-Bjergaard, J., Christiansen, D. H., Desta, F., Andersen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+genetic+pathways+and+cooperating+genetic+abnormalities+in+the+pathogenesis+of+therapy-related+myelodysplasia+and+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Alternative genetic pathways and cooperating genetic abnormalities in the pathogenesis of therapy-related myelodysplasia and acute myeloid leukemia.</a> Leukemia. 20 (11), 1943-1949 (2006).</li>
<li>Uy, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+changes+in+the+clonal+structure+of+MDS+and+AML+in+response+to+epigenetic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Dynamic changes in the clonal structure of MDS and AML in response to epigenetic therapy.</a> Leukemia. 31 (4), 872-881 (2017).</li>
<li>Gough, S. M., Slape, C. I., Aplan, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NUP98+gene+fusions+and+hematopoietic+malignancies%3A+common+themes+and+new+biologic+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">NUP98 gene fusions and hematopoietic malignancies: common themes and new biologic insights.</a> Blood. 118 (24), 6247-6257 (2011).</li>
<li>Lin, Y. W., Slape, C., Zhang, Z., Aplan, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NUP98-HOXD13+transgenic+mice+develop+a+highly+penetrant%2C+severe+myelodysplastic+syndrome+that+progresses+to+acute+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">NUP98-HOXD13 transgenic mice develop a highly penetrant, severe myelodysplastic syndrome that progresses to acute leukemia.</a> Blood. 106 (1), 287-295 (2005).</li>
<li>Block, M., Jacobson, L. O., Bethard, W. F. <a target="_blank" href="https://jamanetwork.com/journals/jama/article-abstract/286455">Preleukemic acute human leukemia.</a> Journal of the American Medical Association. 152 (11), 1018-1028 (1953).</li>
<li>Thanopoulou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engraftment+of+NOD%2FSCID-beta2+microglobulin+null+mice+with+multilineage+neoplastic+cells+from+patients+with+myelodysplastic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Engraftment of NOD/SCID-beta2 microglobulin null mice with multilineage neoplastic cells from patients with myelodysplastic syndrome.</a> Blood. 103 (11), 4285-4293 (2004).</li>
<li>Kerbauy, D. M., Lesnikov, V., Torok-Storb, B., Bryant, E., Deeg, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engraftment+of+distinct+clonal+MDS-derived+hematopoietic+precursors+in+NOD%2FSCID-beta2-microglobulin-deficient+mice+after+intramedullary+transplantation+of+hematopoietic+and+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Engraftment of distinct clonal MDS-derived hematopoietic precursors in NOD/SCID-beta2-microglobulin-deficient mice after intramedullary transplantation of hematopoietic and stromal cells.</a> Blood. 104 (7), 2202-2203 (2004).</li>
<li>Benito, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NOD%2FSCID+mice+transplanted+with+marrow+from+patients+with+myelodysplastic+syndrome+%28MDS%29+show+long-term+propagation+of+normal+but+not+clonal+human+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+Research%22%5BJournal%5D)">NOD/SCID mice transplanted with marrow from patients with myelodysplastic syndrome (MDS) show long-term propagation of normal but not clonal human precursors.</a> Leukemia Research. 27 (5), 425-436 (2003).</li>
<li>Medyouf, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelodysplastic+cells+in+patients+reprogram+mesenchymal+stromal+cells+to+establish+a+transplantable+stem+cell+niche+disease+unit%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Myelodysplastic cells in patients reprogram mesenchymal stromal cells to establish a transplantable stem cell niche disease unit.</a> Cell Stem Cell. 14 (6), 824-837 (2014).</li>
<li>Chung, Y. J., Choi, C. W., Slape, C., Fry, T., Aplan, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+a+myelodysplastic+syndrome+by+a+long-term+repopulating+hematopoietic+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transplantation of a myelodysplastic syndrome by a long-term repopulating hematopoietic cell.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 14088-14093 (2008).</li>
<li>Pietras, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+Distinct+Subsets+of+Lineage-Biased+Multipotent+Progenitors+Control+Blood+Production+in+Normal+and+Regenerative+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Functionally Distinct Subsets of Lineage-Biased Multipotent Progenitors Control Blood Production in Normal and Regenerative Conditions.</a> Cell Stem Cell. 17 (1), 35-46 (2015).</li>
<li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retro-orbital+injections+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animal%22%5BJournal%5D)">Retro-orbital injections in mice.</a> Lab Animal. 40 (5), 155-160 (2011).</li>
<li>Chung, Y. J., Fry, T. J., Aplan, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloablative+hematopoietic+stem+cell+transplantation+improves+survival+but+is+not+curative+in+a+pre-clinical+model+of+myelodysplastic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Myeloablative hematopoietic stem cell transplantation improves survival but is not curative in a pre-clinical model of myelodysplastic syndrome.</a> PLoS One. 12 (9), e0185219(2017).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Chociaż MDS są klonalnym zaburzeniem hematopoetycznych komórek macierzystych, "komórki macierzyste" MDS, czyli komórki inicjujące, nie zostały jeszcze scharakteryzowane. Wcześniej wykazaliśmy, że MDS można przeszczepić myszom WT przy użyciu szpiku kostnego od myszy NHD13 za pomocą HSCT, charakteryzującego się niedokrwistością makrocytarną, leukopenią, neutropenią i morfologicznymi dowodami dysplazji15. Ponadto konkurencyjne testy ponownego populowania wykazały przewagę wzrostu komórek ze szpiku ko...

Zespoły mielodysplastyczne (MDS) reprezentują zróżnicowany zestaw klonalnych zaburzeń krwi charakteryzujących się nieefektywną hematopoezą, morfologicznymi dowodami dysplazji i skłonnością do transformacji w ostrą białaczkę szpikową (AML)1,2,3,4. Nieskuteczna hematopoeza jest rozpoznawana jako zatrzymanie dojrzewania szpiku kostnego i powoduje cytopenię krwi obwodowej pomimo hiperkomórkowego szpiku kostnego1,3. Częstość występowania MDS była różnie szacowana na 2-12 przypadków na 100 000 osób rocznie w Stanach Zjednoczonych, a częstość występowania MDS wzrasta wraz z wiekiem, co czyni ten stan ważnym do zrozumienia, biorąc pod uwagę starzejącą się populację USA3,5. Chociaż większość przypadków MDS nie ma jasnej etiologii, uważa się, że niektóre przypadki MDS są spowodowane ekspozycją na znane czynniki genotoksyczne, w tym rozpuszczalniki, takie jak benzen, i chemioterapia raka6.
Pacjenci z MDS zazwyczaj nabywają mutacje w komórkach MDS7. Chociaż stosunkowo rzadko, wielu pacjentów z MDS nabyło zrównoważone translokacje chromosomowe obejmujące geny takie jak NUP98, EVI1, RUNX1 i MLL (http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman). Nasze laboratorium od dawna interesuje się translokacjami chromosomów, które obejmują gen NUP988. Transgeniczne myszy, które wyrażają transgen NUP98-HOXD13 (NHD13) regulowany przez promotor i elementy wzmacniające Vav1, wykazują wszystkie kluczowe cechy MDS, w tym cytopenię krwi obwodowej, morfologiczne dowody dysplazji i transformację do AML9.
Chociaż MDS są uznawane od ponad 60 lat10 i są uważane za chorobę klonalnych komórek macierzystych, próby wszczepienia ludzkiej komórki MDS myszom z niedoborem odporności zakończyły się w dużej mierze niepowodzeniem, ponieważ komórki MDS słabo się wszczepiają11,12,13,14 A u myszy nie rozwija się choroba kliniczna. Starając się zidentyfikować, które komórki krwiotwórcze mogą przenosić MDS, zwróciliśmy się do modelu NHD13 i wykazaliśmy, że możemy wszczepić MDS jako jednostkę chorobową, która wykazuje wszystkie kardynalne cechy ludzkiego MDS, w tym cytopenię krwi obwodowej, dysplazję i transformację do AML15. W niniejszym raporcie przedstawiamy szczegóły techniczne tych eksperymentów, a także podejścia do dalszej frakcjonowania hematopoetycznych komórek macierzystych i prekursorowych (HSPC), w celu identyfikacji komórek inicjujących MDS.

<table><tbody><tr><td>14 ml probówka z okrągłym dnem</td><td>Falcon</td><td>352057</td><td></td></tr><tr><td>Zbilansowany roztwór soli Hanka</td><td>Lonza</td><td>10-527F</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-CD45.2</td><td>Southern Biotech</td><td>1800-15</td><td>LOT# A077-T044O</td></tr><tr><td>3 mL</td><td>Monoject</td><td>8881513934</td><td></td></tr><tr><td>igła 27-G</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>igła 20-G</td><td>BD</td><td></td><td></td>305176</tr><tr><td>Koktajl Lineage</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-858</td><td>LOT# 5170418221</td></tr><tr><td>Przeciwciała anty-biotynowe</td><td>Miltenyi</td><td>130-113-288</td><td>LOT# 5171109046</td></tr><tr><td>1 mL Strzykawka</td><td>Excelint</td><td>26027</td><td>Strzykawka insulinowa</td></tr><tr>Lampa<td>grzewcza</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>E70001901</td><td></td></tr><tr><td>FACS Maszyna</td><td>Cytec</td><td>FACScan</td><td>2 lasery, 5 detektorów kolorów</td></tr><tr><td>Przyrząd sortujący FACS</td><td>Beckman Coulter</td><td>MOFLO ASTRIOS</td><td>5 laserów, 23 parametry, 6 jednoczesne sortowanie populacji</td></tr><tr><td>Jodek propidyny</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P3566</td><td></td></tr><tr><td>Gamma Irradiator</td><td>Best Theratronics</td><td>Gammacell 40</td><td></td></tr><tr><td>Probówka do pobierania krwi</td><td>RAM scientific</td><td>76011</td><td></td></tr><tr><td>Odbiorca myszy</td><td>Charles River</td><td>B6-LY5.1 / Cr, CD45.1</td><td></td></tr><tr><td>NUP98-HOXD13 myszy</td><td>nie dotyczy</td><td>C57Bl / 6, CD45.2</td><td>Kolonia utrzymywana w NIH</td></tr><tr><td>5 ml okrągłej probówki</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr></tbody></table>

zastosowanie przeszczepu krwiotwórczych komórek macierzystych do oceny pochodzenia zespołu mielodysplastycznego

Use of Hematopoietic Stem Cell Transplantation to Assess the Origin of Myelodysplastic Syndrome

Zespoły mielodysplastyczne (MDS) to zróżnicowana grupa zaburzeń hematopoetycznych komórek macierzystych, które charakteryzują się nieefektywną hematopoezą, cytopeniami krwi obwodowej, dysplazją i skłonnością do transformacji w ostrą białaczkę. Transgeniczne myszy NUP98-HOXD13 (NHD13) podsumowują ludzki MDS pod względem cytopenii krwi obwodowej, dysplazji i transformacji w ostrą białaczkę. Wcześniej wykazaliśmy, że MDS można przenieść z genetycznie zmodyfikowanej myszy z MDS do biorców typu dzikiego poprzez przeszczepienie komórek jądrzastych szpiku kostnego MDS (BMNC). Aby lepiej zrozumieć komórkę MDS, z której pochodzą, opracowaliśmy podejścia do specyficznych dla przeszczepu, immunofenotypowo zdefiniowanych podzbiorów krwiotwórczych. W tym artykule opisujemy proces izolacji i przeszczepiania określonych populacji hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych. Po przeszczepieniu opisano podejścia do oceny skuteczności przeszczepu i trwałości komórek MDS dawcy.

Przedstawiamy reprezentatywne rysunki dla wyników kilku eksperymentów. Rysunek 1 przedstawia reprezentatywny eksperyment sortowania metodą cytometrii przepływowej. Podczas prawidłowej różnicowania krwiotwórczego, w miarę jak komórki nabywają predyspozycje do konkretnej linii krwiotwórczej, pojawiają się na ich powierzchni markery definiujące tę linię, a one same tracą zdolność do samoodnowy. W związku z tym u myszy typu dzikiego samoodnowa komórek macierzysty...

Opisujemy zastosowanie przeszczepu krwiotwórczych komórek macierzystych (HSCT) do oceny potencjału nowotworowego genetycznie modyfikowanych komórek krwiotwórczych. HSCT jest przydatny do oceny różnych złośliwych komórek krwiotwórczych in vivo, a także do generowania dużej kohorty myszy z zespołami mielodysplastycznymi (MDS) lub białaczką w celu oceny nowych terapii.

Zastosowanie przeszczepu krwiotwórczych komórek macierzystych do oceny pochodzenia zespołu mielodysplastycznego

Myelodysplastic syndromes (MDS) are a diverse group of hematopoietic stem cell disorders that are defined by ineffective hematopoiesis, peripheral blood ...

Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kilka pytań w dziedzinie metody nowotworu złośliwego dotyczących charakterystyki komórek, które inicjują nowotwór złośliwy. Główną zaletą tej techniki jest to, że stanowi ona podstawę do analizy funkcjonalnej tych nowotworowych komórek macierzystych. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię zespołów mielodysplastycznych lub MDS, ponieważ może ona pomóc w identyfikacji komórek inicjujących chorobę.Aby przygotować biorców do przeniesienia adopcyjnego, na tydzień przed przeszczepem należy dostarczyć sterylną wodę uzupełnioną o 100 miligramów na litr cyprofloksacyny zwierzętom biorcy w stanie genowym przez siedem dni w specyficznym, wolnym od patogenów obiekcie dla zwierząt. Siódmego dnia poproś przeszkolonego, certyfikowanego operatora cezu 17 o ustawienie instrumentu źródłowego cezu tak, aby dostarczał 70 centygrai całkowitego promieniowania gamma ciała na minutę. Umieść 10 myszy w specjalnie zaprojektowanym uchwycie.Włóż uchwyt do komory naczepnika, dostarcz 9 szarych promieni całkowitego ciała w ciągu 13 minut. Następnie wróć zwierzęta do ich klatek. Następnego ranka spryskaj 70 procentami etanolu całą czarną mysz C57 i użyj nożyczek, aby usunąć skórę od miednicy do kostek.Użyj kleszczy z nożyczkami, aby usunąć kość udową i piszczelową. Dokładnie przytnij mięśnie od kości. Odetnij bliższe i dystalne końce kości piszczelowych i podnieś jedną kość piszczelową kleszczami.Włożyć trzymililitrową strzykawkę wyposażoną w igłę o grubości 27 g do jamy szpiku kostnego i przepłukać szpik kostny do 14-mililitrowej probówki z okrągłym dnem zawierającej 2,5 mililitra buforowanego roztworu soli fizjologicznej Hanksa uzupełnionego 2% płodową surowicą bydlęcą lub HF2. Po zebraniu całego szpiku należy kilkakrotnie odessać tkankę przez końcówkę igły o średnicy 20 gów, aby rozproszyć masę szpiku w jednej zawiesinie do zliczenia. Aby oznaczyć komórki jądrzaste szpiku kostnego lub BMNC do sortowania przepływowego, zbierz komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w ilości od jednego do dziesięciu do siódmego BMNC na 90 mikrolitrów stężenia HF2.Następnie dodaj dziesięć mikrolitrów biotynylowanego koktajlu przeciwciał antyliniowych do zawiesiny komórkowej na 20-minutową inkubację w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Następnie płuczkę płuczkę w trzech mililitrach PBS. Ponownie zawiesić osad w 100 mikrolitrach HF2 na jeden razy dziesięć do siódmych komórek.Po drugie, oznacz komórki dwoma mikrolitrami sprzężonego przeciwciała antybiotyny APC. Po 20 minutach w temperaturze czterech stopni Celsjusza, chroniąc przed światłem, umyj komórki w trzech mililitrach świeżego PBS. Ponownie zawiesić osad w HF2 uzupełniony 0,2 mikrograma na mililitr jodku propidyny na lodzie.Teraz skalibruj sortownik komórek cytometrii przepływowej przy użyciu niebarwionych komórek, aby zoptymalizować wszystkie parametry fotopowielaczy, rozproszenia i fluorescencji w zakresie liniowym każdego detektora. Zdobądź trzy próbki po 10 000 komórek dla nieznakowanych, znakowanych PI i antyliniowych komórek znakowanych APC. Pod koniec sortowania przeanalizuj 1 000 komórek z każdej próbki, aby potwierdzić czystość i żywotność posortowanych komórek.Odwirować próbki w wirówce. Następnie ponownie zawiesić granulki w 0,5 mililitra HF2 w celu policzenia. W celu adoptywnego przeniesienia posortowanych komórek, wymieszaj 100 mikrolitrów dwukrotności BMNC z piątym BMNC typu dzikiego od kongenicznego biorcy zwierzęcia w sterylnym HF2.Z 100 mikrolitrami od dwóch do pięciu razy dziesięć do czwartej, posortowany dawca BMNC zainteresowania sterylnym HF2 w mikroprobówce wirówkowej na zwierzę biorcy. Załaduj jedną strzykawkę o pojemności jednego mililitra, wyposażoną w 28 mierników na odbiorcę z 200 mikrolitrami komórek. Następnie umieść myszy biorcy pod lampą grzewczą, aby wywołać rozszerzenie żył ogonowych.Dostarczyć mieszaniny komórek do każdego śmiertelnie napromieniowanego zwierzęcia biorcy przez żyłę ogonową. Ponieważ samoodnawianie się komórek macierzystych jest ograniczone do ujemnego liniowo BMNC typu dzikiego, komórki ujemne pod względem linii, dodatnie o niskiej linii i dodatnie komórki o wysokiej linii są sortowane i przeszczepiane do biorców typu dzikiego w celu określenia zdolności do samoodnawiania się każdej populacji komórek. Adoptywnie przeszczepiony trans genetyczny BMNC dawcy od zwierząt modelowych MDS można odróżnić ex vivo po ekspresji markera powierzchni komórek CD45.2.Do 16 tygodni po przeszczepieniu ujemnego liniowo BNMC lub niesortowanego BMNC od transgenicznych zwierząt dawców MDS, komórki transgeniczne konkurują z komórkami typu dzikiego, o czym świadczy rosnący odsetek komórek dawcy CD45.2-dodatnich, obserwowany we krwi obwodowej śmiertelnie napromieniowanych zwierząt biorców. Pokazano tutaj komórki z transformacji białaczkowej od myszy przeszczepionej transgenicznymi komórkami MDS. Zwróć uwagę na obecność licznych wybuchów i niedojrzałych form.Podczas wykonywania zabiegu należy pamiętać o ograniczeniu czasu manipulacji ex vivo, ponieważ może ona nadmiernie obciążyć komórki, powodując śmierć komórki lub utratę funkcjonalności. Po opracowaniu technika ta toruje drogę naukowcom w programie terenowym do wprowadzenia nowotworu złośliwego w celu zbadania źródła choroby u genetycznie modyfikowanych myszy.

use-hematopoietic-stem-cell-transplantation-to-assess-origin

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Niniejszy protokół szczegółowo opisuje proces otrzymywania transplantowalnych hematopoetycznych komórek macierzystych z mysich embrionalnych komórek macierzystych (ESC) oraz ich późniejszą iniekcję do letalnie napromieniowanych myszy biorców. W skrócie, ESC są różnicowane do postaci ciał embroidalnych, które następnie są infekowane retrowirusem HoxB4 i współhodowane z komórkami zrębowymi OP9 oraz cytokinami hematopoetycznymi.

Wytwarzanie komórek macierzystych krwi z mysich embrionalnych komórek macierzystych

Opisano metodę analizy rozkładu progenitorów krwiotwórczych szpiku kostnego w cytometrii przepływowej, a także efektywnej izolacji wysoko oczyszczonych komórek macierzystych krwiotwórczych (HSCs). Procedura izolacji opiera się przede wszystkim na magnetycznym wzbogaceniu komórek c-Kit+ oraz sortowaniu komórek w celu oczyszczenia HSCs do badań komórkowych i molekularnych.

Analiza fenotypowa i izolacja mysich hematopoetycznych komórek macierzystych oraz progenitorów zadeklarowanych do określonej linii

Ten protokół zawiera instrukcje krok po kroku dotyczące przeprowadzania konkurencyjnych eksperymentów z przeszczepem szpiku kostnego myszy w celu zbadania funkcji krwiotwórczych komórek macierzystych/progenitorowych bez wcześniejszego oczyszczania komórek macierzystych przez sortowanie komórek.

Konkurencyjne przeszczepy w celu oceny sprawności hematopoetycznych komórek macierzystych

Kwantyfikacja komórek pochodzących od dawcy jest wymagana do monitorowania wszczepienia po przeszczepie komórek macierzystych u pacjentów z hemoglobinopatiami. Połączenie sortowania komórek opartego na cytometrii przepływowej, testu tworzenia kolonii i późniejszej analizy krótkich powtórzeń tandemowych można zastosować do oceny proliferacji i różnicowania komórek progenitorowych w przedziale erytroidalnym.

Wykrywanie resztkowych erytroidalnych komórek progenitorowych dawcy po przeszczepieniu krwiotwórczych komórek macierzystych u pacjentów z hemoglobinopatiami

Wykrywanie minimalnej lub mierzalnej choroby resztkowej (MRD) jest ważnym biomarkerem prognostycznym do udoskonalania oceny ryzyka i przewidywania nawrotu ostrej białaczki szpikowej (AML). Te kompleksowe wytyczne i zalecenia wraz z najlepszymi praktykami w zakresie spójnej i dokładnej identyfikacji i wykrywania MRD mogą pomóc w podejmowaniu skutecznych decyzji dotyczących leczenia AML.

Kompleksowy protokół pobierania i przetwarzania szpiku kostnego do pomiaru mierzalnej choroby resztkowej i białaczkowych komórek macierzystych w ostrej białaczce szpikowej

Przedstawiamy protokół wykrywania jednoczesnej ekspresji markerów komórek macierzystych białaczki na pierwotnych komórkach ostrej białaczki szpikowej za pomocą cytometrii przepływowej. Pokazujemy, jak określić ilościowo trzy populacje przodków i przypuszczalną populację LSC o rosnącym stopniu dojrzałości. Potwierdziliśmy obecność tych populacji w odpowiadających im ksenoprzeszczepach pochodzących od pacjentów.

Cytometria przepływowa w celu oceny komórek macierzystych białaczki w pierwotnej ostrej białaczce szpikowej i w ksenoprzeszczepach pobranych od pacjenta, w momencie diagnozy i obserwacji

Diagnoza MDS jest trudna ze względu na brak kryteriów morfologicznych lub cytogenetyki bez informacji. MFC może pomóc udoskonalić proces diagnostyczny MDS. Aby analiza MFC stała się przydatna w praktyce klinicznej, musi opierać się na parametrach o wystarczającej swoistości i czułości, a dane powinny być powtarzalne dla różnych operatorów.

Cytometria przepływowa sterowana bazą danych do oceny dojrzewania komórek szpiku kostnego

Tutaj opisujemy prosty protokół izolacji i barwienia mysich komórek szpiku kostnego do fenotypu hemopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych wraz z wspierającymi je niszowymi komórkami macierzystymi śródbłonka i mezenchymalnymi komórkami macierzystymi. Uwzględniono również metodę wzbogacania komórek zlokalizowanych w obszarach śródkostnych i centralnych szpiku kostnego.

Analiza cytometrii przepływowej mysich komórek macierzystych i progenitorowych szpiku kostnego oraz komórek niszowych zrębu

Tutaj przedstawiono szczegółowy protokół izolowania i charakteryzowania mikrośrodowiskowych populacji szpiku kostnego z mysich modeli zespołów mielodysplastycznych i ostrej białaczki szpikowej. Technika ta identyfikuje zmiany w niekrwiotwórczej niszy szpiku kostnego, w tym w komórkach śródbłonka i mezenchymalnych komórek zrębu, wraz z postępem choroby.

Identyfikacja mikrośrodowiskowych populacji szpiku kostnego w zespole mielodysplastycznym i ostrej białaczce szpikowej

Zastrzyki doudowe pozwalają na wszczepienie niewielkiej liczby hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC), poprzez umieszczenie komórek bezpośrednio w jamie szpiku kostnego. Tutaj opisujemy eksperymentalny protokół wstrzykiwania do kości udowej ludzkich HSPC myszom z niedoborem odporności.

Wstrzyknięcie doudowe ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych myszom z obniżoną odpornością

Poznaj przeszczep krwiotwórczych komórek macierzystych do oceny potencjału złośliwego zmienionych genetycznie komórek hematopoetycznych. Metoda ta umożliwia analizę funkcjonalną komórek macierzystych nowotworu i identyfikację komórek inicjujących chorobę w zespole mielodysplastycznym.

Zastosowanie przeszczepu krwiotwórczych komórek macierzystych do oceny pochodzenia zespołu mielodysplastycznego

Przeglądaj więcej filmów