Name: Ocena interfejsu synaptycznego pierwotnych ludzkich limfocytów T z krwi obwodowej i tkanki limfatycznej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: Poznaj metodę oceny interfejsu synaptycznego pierwotnych ludzkich limfocytów T z krwi obwodowej i tkanki limfatycznej przy użyciu płaskich dwuwarstw lipidowych. Technika ta pozwala na analizę małych populacji komórek z mniejszą ilością odczynników niż tradycyjne metody.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant R01AI118694 NIH dla Michaela R. Bettsa, który obejmuje podnagrodę 566950 dla Jurija Sykuleva. Dziękujemy Sidney Kimmel Cancer Center Bioimaging Shared Resource za ich doskonałe wsparcie.

Badanie to zostało przeprowadzone zgodnie z Deklaracją Helsińską. Od wszystkich uczestników uzyskano pisemną świadomą zgodę, a próbki krwi i węzłów chłonnych pobrano za zgodą Institutional Review Board na University of Pennsylvania (IRB#809316, IRB# 815056). Wszyscy badani byli osobami dorosłymi. Próbki krwi pępowinowej zostały udostępnione przez oddział położnictwa i ginekologii (Labor and Delivery of the Department of Obstetrics &amp; Gynecology) w Thomas Jefferson University. Wszystkie próbki zostały zanonimizowane.
1. Izolacja limfocytów T CD4+ do analizy obrazowej
<ol>
	<li>Rozmrozić 1 mL alikwot zawierający 107 zamrożonych monocyto-limfocytów krwi obwodowej (PBMC) lub monocyto-limfocytów węzłów chłonnych (LNMC) z zebranych próbek. W sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza dodać rozmrożone komórki do 9 mL medium RPMI uzupełnionego o penicylinę/streptomycynę i glutaminę.
	<ol>
		<li>Odwirować komórki przez 10 min przy 300 x g w temperaturze 4 °C, odprowadzić supernatant i resuspender komórki w 5 mL uzupełnionego medium RPMI zawierającego 10% FBS (medium kompletne). Inkubować komórki przez noc w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Następnego dnia oczyścić limfocyty T CD4+ poprzez negatywną selekcję immunomagnetyczną, korzystając z dostępnego komercyjnie zestawu zgodnie z instrukcją producenta.</li>
	<li>Aby zmierzyć liczbę świeżo oczyszczonych limfocytów T CD4+, zmieszać 5 µL zawiesiny komórkowej z równą objętością roztworu błękitu trypanu. Nanieść mieszaninę komórek z błękitem trypanu na komorę countingową (hemocytometr) i policzyć żywe komórki w 5 polach komory.</li>
	<li>Obliczyć średnią liczbę komórek i wyznaczyć liczbę komórek w oryginalnej zawiesinie: liczba komórek/1 mL = średnia liczba x 2 x 104. Jeśli całkowita liczba wyizolowanych komórek jest zbyt mała, użyć komórek bez ich przeliczania.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 300 x g przez 10 min i resuspender je w buforze do testów (20 mM HEPES, pH 7.4, 137 mM NaCl, 2 mM Na2HPO4, 5 mM D-glukozy, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2 oraz 1% albuminy surowicy ludzkiej) w zagęszczeniu 105 komórek/50 µL lub mniejszym i przechowywać komórki w temperaturze 4 °C (przez 1–2 h) do momentu rozpoczęcia eksperymentów.</li>
	<li>Utylizować wszystkie odpady biologiczne zgodnie z obowiązującymi wytycznymi instytucjonalnymi.</li>
	<li>Jeśli wymagana jest populacja kontrolna, przygotować aktywowane limfocyty T CD8 z PBMC krwi pępowinowej: umieścić 107 komórek w 5 mL medium kompletnego w kolbie hodowlanej T25, a następnie dodać mieszaninę przeciwciał anty-CD3 i anty-CD28 w stężeniach odpowiednio 10 µg/mL i 1 µg/mL.</li>
	<li>Następnego dnia usunąć aktywowane komórki krwi pępowinowej z kolby, przemyć je raz świeżym medium kompletnym i namnażać komórki w obecności rekombinowanej IL-2 (100 U/mL) przez 2 tygodnie.</li>
	<li>Oczyścić limfocyty T CD8+ krwi pępowinowej poprzez negatywną selekcję immunomagnetyczną przy użyciu dostępnego komercyjnie zestawu zgodnie z instrukcją producenta. Policzyć komórki i wymienić medium na bufor do testów, postępując zgodnie z opisem w krokach 1.3–1.6 dla limfocytów T CD8+ z LN i PB.</li>
</ol>
2. Komponenty do przygotowania płaskich dwuwarstw lipidowych
<ol>
	<li>Przygotować 3 rodzaje liposomów zgodnie z opisem zamieszczonym w innej publikacji5(a) 0,4 mM DOPC (1,2-dioleoylo-sn(b) liposomy 0,4 mM DOPC zawierające 33 mol% DOGS-NTA (1,2-dioleojo-snlipidy (sól amonowa kwasu 1,2-dioleojlo-sn-glicero-3-[(N-(5-amino-1-karboksypentyl)iminodiooctowej)sukcynylo]), (c) liposomy DOPC 0,4 mM zawierające 4 mol% Biotinyl-Cap-PE (1,2-dioleojlo-sn-glycero-3-fosfoetanolamina-N-(cap biotynil) (sól sodowa)).</li>
	<li>Przygotować 5% roztwór kazeiny zgodnie z wcześniejszym opisem5.
	<ol>
		<li>Rozpuścić 5 g kazeiny w proszku w 100 ml wody ultraczystej i dodać 350 µL 10 M wodorotlenku sodu. Całość mieszać na standardowym mieszadle magnetycznym z małą prędkością (zgodnie z dostępną skalą) w temperaturze pokojowej przez 2 h, a następnie przez noc w 4 °CDostosuj pH do wartości 7,3 i poddaj roztwór ultrawirowaniu przez 2 h przy 100 000 x g przy 4 °CPrzefiltruj nadsącz za pomocą 0.22 µm przefiltrować sterylnie i przechowywać roztwór w aliquotach w temperaturze -80 °C. 
		OSTRZEŻENIE: Roztwór wodorotlenku sodu może powodować oparzenia chemiczne i może doprowadzić do trwałej ślepoty w przypadku kontaktu z oczami. Podczas pracy z tą substkcją chemiczną lub jej roztworami należy stosować rękawice gumowe, odzież ochronną oraz ochronę oczu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oznakuj przeciwciało anty-CD3 biotyną w celu otrzymania monobiotynowanych cząsteczek przeciwciał, stosując wcześniej opisany sposób.8.
	<ol>
		<li>Przygotuj roztwór Biotin-PEO4-NHS w dimetylosulforksie (DMSO) o stężeniu 0,1 mg/ml. Dodaj 3.7 µL roztworu Biotin-PEO4-NHS do 1 mg przeciwciała w 0,5 mL soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) zawierającej 100 mM wodorowęglanu sodu.</li>
		<li>Inkubować mieszaninę przez 2 h w temperaturze pokojowej. Przygotować roztwór estru NHS Alexa Fluor 488 w stężeniu 10 mg/mL w DMSO. Dodać roztwór estru NHS Alexa Fluor 488 do przeciwciała znakowanego Biotin-PEO4-NHS w 10-krotnym nadmiarze molowym.</li>
		<li>Inkubować mieszaninę przez 1 h w temperaturze pokojowej, powoli mieszając na standardowym mieszadle magnetycznym. Nie związany barwnik oddzielić za pomocą chromatografii żelowej.</li>
		<li>Wyznacz stężenie przeciwciał poprzez pomiar gęstości optycznej roztworu przeciwciał przy 280 nm (A280). Pomiar gęstości optycznej znakowanych przeciwciał przy 577 nm (A577).</li>
		<li>Wyznacz stosunek barwnika do przeciwciała, korzystając z następującego równania: 
		<img alt="Równanie obliczania liczby moli barwnika na mol białka przy użyciu absorbancji przy 577 nm; przedstawienie wzoru." src="/files/ftp_upload/58143/58143eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie"> 
		UWAGA: Dodatkowe szczegóły znajdują się w protokole producenta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekspresja rekombinowanego rozpuszczalnego białka ICAM-1 w Muszka owocówka system ekspresyjny opisany wcześniej3,4,9,10.
	<ol>
		<li>Klonować do, z cDNA kodującym domenę ektodomenową ICAM-1, do Muszka owocówka wektor ekspresyjny pMT/V5-His z indukowalnym promotorem metalotioneiny do produkcji białka rekombinowanego z dołączoną sekwencją His6 znacznik na końcu C-terminalnym.</li>
		<li>Przeprowadź kotransfekcję komórek S2 z otrzymanym plazmidem zawierającym ICAM-1 oraz wektorem ekspresyjnym G418. Wyselekcjonuj stabilne transfektanty, stosując pożywkę Schneidera. Muszka owocowa Pożywka uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą (FCS) oraz G418 w stężeniu 0,5 mg/ml przez 3 tygodnie. Namnażanie komórek w bezsurowiczej pożywce dla owadów i indukcja ekspresji białka za pomocą 0,5 mM CuSO4.4 przez 3 dni.</li>
		<li>Skoncentrować nadsącz z hodowli 10-krotnie i poddać dializie przeciwko PBS poprzez koncentrator do filtracji stycznej, zgodnie z wcześniejszym opisem11.</li>
		<li>Nałóż skoncentrowany nadsącz hodowli na kolumnę zawierającą Sepharose z kowalencyjnie unieruchomionym przeciwciałem monoklonalnym anty-ICAM-1, a następnie eluj związane białko ICAM-1 za pomocą buforu glicynowego 50 mM o pH 3,0. Natychmiast zneutralizuj eluowane białko ICAM-1 buforem Tris 2 M o pH 8,0.</li>
		<li>Przeprowadzić dializę eluatu przeciwko buforowi PBS o pH 8,0, a następnie przenieść zdializowany materiał na kolumnę z agarozą Ni-NTA. Rozpuszczalne ICAM-1 eluować za pomocą 200 mM imidazolu o pH 8,0. Przeprowadzić dializę eluatu przeciwko buforowi PBS o pH 8,0.</li>
		<li>Oznakuj oczyszczone ICAM-1 estrem NHS Cy5 zgodnie z instrukcją producenta. 
		UWAGA: Najlepszy końcowy stosunek barwnika do białka wynosi 1:1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wytworzenie fragmentów Fab z przeciwciała anty-CD107a poprzez trawienie papainą oraz oczyszczanie fragmentów Fab metodą chromatografii wymiany jonowej zgodnie z wcześniej opisaną procedurą3Oznakuj fragmenty Fab za pomocą estru NHS Alexa Fluor 568 zgodnie z instrukcją producenta.</li>
</ol>
3. Tworzenie płaskich dwuwarstw lipidowych wspieranych szklaną podstawką
<ol>
	<li>Przygotuj świeży kwasowy roztwór piranha, mieszając 140 mL stężonego kwasu siarkowego i 60 mL 30% nadtlenku wodoru. Umyj szklane szkiełka zakryjące do płytek przepływowych, mocząc je w kwasowym roztworze piranha przez 30 min. Trzymaj szklane szkiełko zakryjące za pomocą polipropylenowych pęset nożycowych. 
	OSTRZEŻENIE: Roztwór piranha jest niezwykle silnym utleniaczem. Podczas pracy z roztworem należy zawsze nosić okulary ochronne, gogle lub pełną przyłbicę oraz grube gumowe rękawice. Pracuj z roztworem piranha wyłącznie w dygestorium. Unikaj podgrzewania, transportowania lub wstrząsania roztworem w trakcie użytkowania, ponieważ może on eksplodować. Odpady z roztworu piranha zbieraj do szklanej butelki z otworem zawierającym ołów. Skontaktuj się z Instytucjonalnym Komitetem Bezpieczeństwa w sprawie właściwej utylizacji odpadów.</li>
	<li>Wypłucz umyte szkiełka zakryjące 7x wodą ultrapure, przenosząc je sekwencyjnie do zlewków zawierających świeżą wodę. Odstaw mokre szkiełka zakryjące, aby pozostała woda spłynęła z czystego szkła, pozostawiając je suche.
	<ol>
		<li>Alternatywnie można użyć końcówki pipety podłączonej do pompy próżniowej, aby ostrożnie usunąć pozostałe krople wody ze szkiełek zakryjących.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W komorze sterylnej wykonaj rozcieńczenia różnych lipidów, aby przygotować mieszaninę liposomów do tworzenia dwuwarstw. Po pierwsze, połącz 37 µL liposomów DOPC i 3 µL liposomów Biotinyl-Cap-PE. Po drugie, zmieszaj 14 µL liposomów DOPC i 15 µL liposomów DOGS-NTA. Po trzecie, dodaj 1 µL pierwszej mieszaniny do 29 µL drugiej mieszaniny, aby otrzymać końcową mieszaninę liposomów.</li>
	<li>W komorze sterylnej przygotuj stanowisko pracy z suchymi szkiełkami zakrywającymi w zasięgu ręki. Nanieś dokładnie 2 µL końcowej mieszaniny liposomów (patrz krok 3.3) precyzyjnie na środek samoprzylepnego kanału płytki. Natychmiast i bardzo precyzyjnie wyrównaj czyste i suche szkiełko zakryjące z płytką i delikatnie opuść je na lepką stronę płytki.
	<ol>
		<li>W przypadku przygotowywania więcej niż jednej płytki, pracuj nad jedną płytką na raz, ponieważ mieszanina liposomów szybko odparowuje. Odwróć płytkę i użyj zewnętrznego pierścienia polipropylenowej pęsety nożycowej, aby wywrzeć delikatny nacisk na obwodowy styk szkiełka zakrywającego z płytką, upewniając się, że szkiełko jest ściśle przylega do płytki, aby zapobiec wyciekom. 
		UWAGA: Nie naciskaj kanałów płytki, aby uniknąć pęknięcia lub uszkodzenia szkiełka zakrywającego.</li>
		<li>Ponownie odwróć płytkę i zaznacz pozycję utworzonej dwuwarstwy, która wygląda jak kropla między szkiełkiem zakrywającym a płytką kanałową, rysując 4 kropki markerem permanentnym wokół dwuwarstwy na zewnętrznej stronie płytki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przed pierwszym wstrzyknięciem cieczy do kanału wyznacz jeden port kanału jako port wlotowy, a drugi jako port wylotowy i zachowaj to oznaczenie przez cały eksperyment.</li>
	<li>Aby uniknąć powstawania pęcherzyków powietrza, wprowadź końcówkę pipety bezpośrednio do portu wlotowego kanału. Powoli wypełnij kanały płytki 50 µL ciepłego (co najmniej w temperaturze pokojowej) buforu do analizy (skład buforu opisano w kroku 1.5).</li>
	<li>Przygotuj 0,5 M roztwór chlorku niklu(II). Rozmroź 2 mL alikwot roztworu kazeiny w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 30 min i uzupełnij go roztworem chlorku niklu do końcowego stężenia 200 µM.</li>
	<li>Przepłucz dwuwarstwy, wstrzykując najpierw 100 µL roztworu kazeiny do portu wlotowego kanału, a następnie natychmiast usuwając 100 µL z portu wylotowego na płytce za pomocą pipety. Zablokuj dwuwarstwy tym samym roztworem, wstrzykując 100 µL roztworu kazeiny do portu wlotowego każdego kanału i inkubując płytkę przez 45 min w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Rozmroź alikwoty białek Cy5-ICAM-1-His6 i streptawidyny. Połącz białka w buforze do analizy do końcowego stężenia 2 µg/mL każdego z nich. Wirować roztwór przez 30 min przy 20 000 x g i 4 °C, aby usunąć wszelkie agregaty.</li>
	<li>Usuń pozostałą część roztworu blokującego z portu wylotowego kanału płytki za pomocą pipety. Wstrzyknij 100 µL roztworu zawierającego ICAM-1 i streptawidynę do portu wlotowego.</li>
	<li>Inkubuj płytkę przez 45 min w temperaturze pokojowej. Usuń nadmiar roztworu białka z portu wylotowego. Przepłucz dwuwarstwę 2x, wstrzykując najpierw 100 µL buforu do analizy do portu wlotowego kanału, a następnie natychmiast usuwając 100 µL z portu wylotowego.</li>
	<li>Rozcieńcz przeciwciało anty-CD3 znakowane Alexa-Fluor-488 w buforze do analizy do końcowego stężenia 2 µg/mL. Wstrzyknij 100 µL roztworu przeciwciał do portu wlotowego płytki i inkubuj przez 45 min w temperaturze pokojowej. Usuń nadmiar roztworu białka z portu wylotowego. Przepłucz dwuwarstwę 2x 100 µL buforu do analizy, analogicznie do kroku 3.11.</li>
</ol>
4. Obrazowanie interakcji limfocytów T z płaską dwuwarstwą
<ol>
	<li>Podgrzać stolik oraz obiektyw mikroskopu konfokalnego lub mikroskopu fluorescencyjnego z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRF) do momentu ustabilizowania temperatury na poziomie 37 °C. Umieścić preparat z dwuwarstwami na podgrzewanym stoliku. Przesunąć stolik w odpowiednią pozycję zgodnie z oznaczeniami i ustawić ostrość na dwuwarstwie, wykorzystując fluorescencję cząsteczek ICAM-1 znakowanych Cy.
	<ol>
		<li>W mikroskopie konfokalnym użyć obiektywu 61X, a w mikroskopie TIRF obiektywu 100X, przy odpowiednich ustawieniach filtrów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku obrazowania uwalniania ziarnistości za pomocą mikroskopii TIRF, do zawiesiny komórkowej przed wstrzyknięciem komórek do portów wlotowych dodać fragmenty Fab przeciwciał anty-CD107a znakowane Alexa-Fluor-568 do końcowego stężenia 4 µg/mL.
	<ol>
		<li>Resuspendować przygotowane limfocyty T CD4+ wyizolowane z węzłów chłonnych (LN), krwi obwodowej (PB) lub krwi pępowinowej i wstrzyknąć 50 µL zawiesiny komórkowej do portu wlotowego kanału preparatu zawierającego dwuwarstwę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wybrać żądaną liczbę pól i rejestrować obrazy każdego z nich raz co 2 min przez 30 min po wstrzyknięciu.</li>
	<li>Do pozyskania obrazów wykorzystać kanały pola jasnego, światła odbitego oraz fluorescencyjne (Alexa 488 i Cy5) mikroskopu konfokalnego. W mikroskopie TIRF użyć trybu TIRF dla fluorescencji Alexa-Fluor-488 i Alexa-Fluor-568 oraz trybu szerokopolowego (widefield) dla fluorescencji Cy5, a także do obrazowania w polu jasnym.</li>
</ol>
5. Analiza obrazu
<ol>
	<li>Przeanalizuj uzyskane obrazy przy użyciu odpowiedniego oprogramowania. Zaobserwuj morfologię komórek na obrazach w świetle przechodzącym i wyklucz z analizy komórki skupione oraz widocznie uszkodzone lub apoptotyczne. Uwzględnij w analizie wyłącznie te komórki, które wchodzą w produktywną interakcję z powierzchnią dwuwarstwy (t. j., komórki kumulujące fluorescencję Alexa-Fluor-488 (przeciwciała anty-CD3) na styku).</li>
	<li>Wyznaczyć wielkość obszaru adhezji komórkowej w 20. minucie po rozpoczęciu interakcji komórki z dwuwarstwą lipidową. 
	UWAGA: Obszar adhezji to ciemny obszar powstający na styku komórki i dwuwarstwy na obrazach z mikroskopii odbiciowej interferencyjnej (IRM).</li>
	<li>Należy obserwować wszelkie gromadzenie się fluorescencji Cy5-ICAM-1 oraz formowanie się połączenia pierścieniowego przez segregowane cząsteczki Cy-ICAM-1 na styku komórka-dwuwarstwa. Jeśli zgromadzone cząsteczki ICAM-1 utworzyły pierścieniowe połączenie adhezyjne na co najmniej dwóch kolejnych obrazach, takie komórki należy oznaczyć jako komórki tworzące obwodowy supramolekularny klaster aktywacyjny (pSMAC).12.</li>
	<li>Oceń uwalnianie ziarnistości, mierząc intensywność fluorescencji Alexa-Fluor-568 na styku limfocyty T i dwuwarstwy w stosunku do fluorescencji tła poza obszarem kontaktu w bezpośrednim sąsiedztwie komórki. Komórki o stosunku sygnału Alexa-Fluor-568 do tła wynoszącym co najmniej 1,3 określ jako komórki ulegające degranulacji.</li>
</ol>

<ol><li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunological+synapse%3A+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285, 221-227 (1999).</li>
<li>Somersalo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+T+lymphocytes+form+an+antigen-independent+ring+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic T lymphocytes form an antigen-independent ring junction.</a> Journal of Clinical Investigation. 113, 49-57 (2004).</li>
<li>Beal, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+C+theta+regulates+stability+of+the+peripheral+adhesion+ring+junction+and+contributes+to+the+sensitivity+of+target+cell+lysis+by+CTL%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Protein kinase C theta regulates stability of the peripheral adhesion ring junction and contributes to the sensitivity of target cell lysis by CTL.</a> The Journal of Immunology. 181, 4815-4824 (2008).</li>
<li>Beal, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+early+T+cell+receptor+signaling+regulate+the+pathway+of+lytic+granule+delivery+to+the+secretory+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Kinetics of early T cell receptor signaling regulate the pathway of lytic granule delivery to the secretory domain.</a> Immunity. 31, 632-642 (2009).</li>
<li>Dustin, M. L., Starr, T., Varma, R., Thomas, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+planar+bilayers+for+study+of+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Supported planar bilayers for study of the immunological synapse.</a> Current Protocols in Immunology. , Chapter 18, Unit 18 13 (2007).</li>
<li>Reuter, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-Specific+CD8%28%2B%29+T+Cells+Exhibit+Reduced+and+Differentially+Regulated+Cytolytic+Activity+in+Lymphoid+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">HIV-Specific CD8(+) T Cells Exhibit Reduced and Differentially Regulated Cytolytic Activity in Lymphoid Tissue.</a> Cell Reports. 21, 3458-3470 (2017).</li>
<li>Buggert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limited+immune+surveillance+in+lymphoid+tissue+by+cytolytic+CD4%2B+T+cells+during+health+and+HIV+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Limited immune surveillance in lymphoid tissue by cytolytic CD4+ T cells during health and HIV disease.</a> PLoS Pathogens. 14, e1006973(2018).</li>
<li>Carrasco, Y. R., Fleire, S. J., Cameron, T., Dustin, M. L., Batista, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LFA-1%2FICAM-1+interaction+lowers+the+threshold+of+B+cell+activation+by+facilitating+B+cell+adhesion+and+synapse+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">LFA-1/ICAM-1 interaction lowers the threshold of B cell activation by facilitating B cell adhesion and synapse formation.</a> Immunity. 20, 589-599 (2004).</li>
<li>Anikeeva, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+role+of+lymphocyte+function-associated+antigen-1+in+mediating+effective+cytolytic+activity+by+cytotoxic+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Distinct role of lymphocyte function-associated antigen-1 in mediating effective cytolytic activity by cytotoxic T lymphocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 6437-6442 (2005).</li>
<li>Steblyanko, M., Anikeeva, N., Campbell, K. S., Keen, J. H., Sykulev, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+Influence+the+Size+and+Dynamics+of+Signaling+Microclusters+in+a+Pyk2-dependent+Manner%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Integrins Influence the Size and Dynamics of Signaling Microclusters in a Pyk2-dependent Manner.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290, 11833-11842 (2015).</li>
<li>Anikeeva, N., Lebedeva, T., Sumaroka, M., Kalams, S. A., Sykulev, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+HIV-specific+T-cell+receptor%3A+expression%2C+purification+and+analysis+of+the+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Soluble HIV-specific T-cell receptor: expression, purification and analysis of the specificity.</a> Journal of Immunological Methods. 277, 75-86 (2003).</li>
<li>Monks, C., Freiberg, B., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+segregation+of+supramolecular+activation+clusters+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells.</a> Nature. 395, 82-86 (1998).</li>
<li>Riddell, S. R., Greenberg, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+anti-CD3+and+anti-CD28+monoclonal+antibodies+to+clone+and+expand+human+antigen-specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">The use of anti-CD3 and anti-CD28 monoclonal antibodies to clone and expand human antigen-specific T cells.</a> Journal of Immunological Methods. 128, 189-201 (1990).</li>
<li>Lin, S. J., Yu, J. C., Cheng, P. J., Hsiao, S. S., Kuo, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+interleukin-15+on+anti-CD3%2Fanti-CD28+induced+apoptosis+of+umbilical+cord+blood+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">Effect of interleukin-15 on anti-CD3/anti-CD28 induced apoptosis of umbilical cord blood CD4+ T cells.</a> European Journal of Haematology. 71, 425-432 (2003).</li>
<li>Anikeeva, N., Sykulev, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+controlling+granule-mediated+cytolytic+activity+of+cytotoxic+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunologic+Research%22%5BJournal%5D)">Mechanisms controlling granule-mediated cytolytic activity of cytotoxic T lymphocytes.</a> Immunologic Research. 51, 183-194 (2011).</li>
<li>Huppa, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TCR-peptide-MHC+interactions+in+situ+show+accelerated+kinetics+and+increased+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TCR-peptide-MHC interactions in situ show accelerated kinetics and increased affinity.</a> Nature. 463, 963-967 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisana tutaj nowatorska technika wykorzystuje podobne odczynniki wymagane do budowy płaskich dwuwarstw w konwencjonalnej komórce przepływowej5 i może być z powodzeniem stosowana do obrazowania pierwotnych granic faz ludzkich limfocytów T 3,4,15. Technika ta oferuje znaczne zmniejszenie zużycia cząsteczek fluorescencyjnych i wymaga 10–20 razy mniej limfocytów T w porównaniu z systemem komórek przepływowyc...

Wiedza naukowa na temat cech strukturalnych synaps immunologicznych komórek T i ich związku z funkcjonalną aktywnością limfocytów T została uzyskana głównie dzięki badaniom linii komórkowych i klonów pochodzących z PB. W jakim stopniu odkrycia te odnoszą się do pierwotnych limfocytów T uzyskanych z krwi lub ludzkich tkanek limfoidalnych, pozostaje niejasne, ponieważ interfejsy synaptyczne limfocytów T znajdujących się w tkankach limfatycznych i innych tkankach nie zostały do tej pory przeanalizowane. Co ważne, pojawiające się dane sugerują, że limfocyty T rezydujące w tkankach i pochodzące z narządów limfatycznych mogą mieć znaczące różnice w swoim fenotypie i aktywności funkcjonalnej w porównaniu z tymi w PB6,7. To jeszcze bardziej ugruntowało potrzebę lepszego zrozumienia cech interfejsu synaptycznego komórek T w pierwotnych ludzkich limfocytach T.
W tym celu opracowaliśmy nowatorskie podejście na mini-skalę, wykorzystujące dwuwarstwy lipidowe wbudowane w wielokanałowe szkiełka przepływowe, co pozwala nam na obrazowanie interfejsów limfocytów T/dwuwarstw z mniej niż 105 pierwotnymi limfocytami T wyizolowanymi z ludzkich PB i LN. Ta nowatorska technika umożliwia badanie właściwości biofizycznych pierwotnych interfejsów synaptycznych ludzkich komórek T w celu lepszego modelowania i zrozumienia interakcji komórka-komórka in vivo.

<table><tbody><tr><td>Zestaw do izolacji limfocytów T CD4, ludzki</td><td>Miltenyl Biotec</td><td>130-096-533</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji limfocytów T CD8, ludzki</td><td>Miltenyl Biotec</td><td>130-096-495</td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375C</td><td></td></tr><tr><td>PSY NTA</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>790528C</td><td></td></tr><tr><td>Czapeczka biotynylowa PE</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>870273C</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy ludzkiej</td><td>Octapharma USA</td><td>NDC 68982-643-01</td><td></td></tr><tr><td>sticky-Slide VI 0.4</td><td>ibidi</td><td>80608</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe do szkiełek samoprzylepnych</td><td>ibidi</td><td>10812</td><td></td></tr><tr><td>Bioptech FCS2 Chamber</td><td>Bioptech</td><td>060319-2-03</td><td></td></tr> przeciwciało <tr><td>anty-CD3</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16-0037-81</td><td>Klon OKT3, komórki hybrydoma są dostępne w ATCC</td></tr><tr><td>przeciwciało anty-CD28</td><td>Genetex</td><td>GTX14664</td><td>9.3 klon</td></tr><tr><td>kazeiny</td><td>Sigma</td><td>C5890</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-PEO4-NHS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21329</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650-5</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 zestaw do znakowania białek z kolumną do oczyszczania znakowanych białek</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10235</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do znakowania białek Alexa Fluor 568 z kolumną do znakowanego oczyszczania białek</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10238</td><td></td></tr><tr><td>Amersham Cy5 NHS Ester</td><td>GE Life Science</td><td>PA15101</td><td></td></tr><tr><td>pMT/V5-His Wektory ekspresyjne Drosophila A, B, C Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>V412020</td><td></td></tr><tr><td>pcopneo, G418 Wektor ekspresji Drosophila do selekcji pozytywnej</td><td>ATCC</td><td>37409</td><td></td></tr><tr><td>Surowica wolna od pożywki drozofialnej Owad-XPRESS</td><td>Lonza</td><td>12-730Q</td><td></td></tr><tr><td>Hybridoma YN1/1.7.4</td><td>ATCC</td><td>CRL1878</td><td>Hybrydoma wydziela przeciwciało przeciwko ICAM-1.</td></tr><tr><td>Sepharose aktywowana bromkiem cyjanu 4B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9142</td><td>Stosowany do przygotowania sefarozy z kowentnie związanym przeciwciałem anty-ICAM.</td></tr><tr><td>Koncentrator przepływu stycznego MasterFlex</td><td>Cole-Parmer</td><td>77601-60 7592-40</td><td>Stosowany do zagęszczania supernatantu zawierającego ICAM-1 i dializy ICAM-1 zawierającego supernant</td></tr><tr><td>Centramate Lab Systemy przepływu stycznego</td><td>Pall Laboratory</td><td>FS002K10 OS010T12 FS005K10</td><td>Stosowany do zatężania supernatantu ICAM-1 i dializy ICAM-1 zawierającego supernant</td></tr><tr><td>Ni-NTA Agaroza</td><td>QIAGEN</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>Rurki do dializy</td><td>Spectra/Por</td><td>131384</td><td></td></tr><tr><td>Papaina z lateksu papai</td><td>Mysie przeciwciało</td> anty-ludzkie Sigma <td>P3125</td><td></td></tr><tr><td>przeciwko CD107a</td><td>BD Bioscences</td><td>555798</td><td>Klon H4A3</td></tr><tr><td>Naturalne niebieskie rękawiczki Ansell</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-014-539</td><td></td></tr><tr><td>Kleszczyki nożycowe z polipropylenu Nalgene</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>6320-0010</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>ProZyme</td><td>SA10</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td> Mikroskop odwrócony <td>Nikon</td><td></td><td>Nikon TiE wyposażony w PFS do długoterminowej kontroli stabilności obrazu, obiektywy olejowe 60X, 4 lasery z liniami wzbudzenia przy 405, 458, 488, 514, 561 i 640 nm, 2 detektory GaAsP i 2 PMT o wysokiej czułości, światło przechodzące DIC, programowalny stolik X,Y,Z do wielu pozycji i łączenia dużych obszarów, funkcje poklatkowe, komora Tokai-Hit z kontrolą temperatury i CO2 do obrazowania na żywo oraz stół z izolacją antywibracyjną</td></tr><tr><td>Mikroskop TIRF</td><td>System Andor</td><td></td><td>Andor Revolution XD wyposażony w oświetlacz Nikon TIRF-E, Lasery z liniami 405,488,561 i 640, światło przechodzące DIC, głowica dysku obrotowego Yokogawa CSU-X1 do obrazowania konfokalnego, obiektyw 100/1,49 NA, kamera EM-CCD Andor iXon X3, grzałka obiektywu i piezoelektryczny stolik z napędem silnikowym z systemem Perfect Focus System (PFS)</td></tr> <tr><td>Oprogramowanie do analizy obrazu MetaMorph Premier</td><td>Urządzenia molekularne</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ocena interfejsu synaptycznego pierwotnych ludzkich limfocytów t z krwi obwodowej i tkanki limfatycznej

Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

Obecne zrozumienie dynamiki i cech strukturalnych interfejsów synaptycznych komórek T zostało w dużej mierze określone dzięki zastosowaniu dwuwarstwowych płaskich warstw opartych na szkle oraz klonów lub linii komórek T pochodzących in vitro1,2,3, 4. Nie wiadomo, w jaki sposób te odkrycia odnoszą się do pierwotnych ludzkich limfocytów T wyizolowanych z krwi lub tkanek limfoidalnych, częściowo z powodu znacznych trudności w uzyskaniu wystarczającej liczby komórek do analizy5. W tym przypadku zajmujemy się tym poprzez opracowanie techniki wykorzystującej wielokanałowe szkiełka przepływowe do budowy płaskich dwuwarstw lipidowych zawierających cząsteczki aktywujące i adhezyjne. Niska wysokość szkiełek przepływowych sprzyja szybkiej sedymentacji komórek w celu synchronizacji łączenia komórka-dwuwarstwa, umożliwiając w ten sposób naukowcom badanie dynamiki powstawania interfejsu synaptycznego i kinetyki uwalniania granulek. Stosujemy to podejście do analizy interfejsu synaptycznego zaledwie 10,4 do 10,5 pierwotnych kriokonserwowanych limfocytów T wyizolowanych z węzłów chłonnych (LN) i krwi obwodowej (PB). Wyniki pokazują, że nowatorska technika dwuwarstwowego lipidu umożliwia badanie właściwości biofizycznych pierwotnych ludzkich limfocytów T pochodzących z krwi i tkanek w kontekście zdrowia i choroby.

W pierwszej kolejności porównaliśmy strukturę interfejsu synaptycznego tworzonego przez aktywowane limfocyty T CD8+ pochodzące z krwi pępowinowej, wystawione na działanie dwuwarstw lipidowych zbudowanych albo w tradycyjnych wielkoskalowych systemach komór przepływowych (szczegóły w Tabeli Materiałów)1,2,3,4, albo w wielokanałowych szk...

Protokół opisuje technikę badania zdolności pierwotnych poliklonalnych ludzkich limfocytów T do tworzenia interfejsów synaptycznych za pomocą płaskich dwuwarstw lipidowych. Używamy tej techniki, aby pokazać zróżnicowaną zdolność tworzenia synaps ludzkich pierwotnych limfocytów T pochodzących z węzłów chłonnych i krwi obwodowej.

Ocena interfejsu synaptycznego pierwotnych ludzkich limfocytów T z krwi obwodowej i tkanki limfatycznej

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of ...

Podejście, o którym będziemy dzisiaj mówić, zostało opracowane w celu porównania właściwości i aktywności funkcjonalnej limfocytów T krwi tkankowej i obwodowej. O znaczeniu tego tematu świadczy fakt, że limfocyty T krwi obwodowej stanowią tylko 20% wszystkich limfocytów T w organizmie. Możliwość badania niewielkiej liczby limfocytów T pochodzących z tkanek jest bardzo istotna i to jest dokładnie to, co udało nam się osiągnąć.Główną zaletą tej techniki jest to, że wymaga mniejszej liczby komórek i mniejszych objętości odczynników niż tradycyjne techniki. Zacznij od użycia polipropylenowych kleszczyków nożycowych, aby zanurzyć szklane szkiełka nakrywkowe w świeżo przygotowanym kwaśnym roztworze piranii na 25 do 30 minut. Pod koniec prania spłucz szkiełka nakrywkowe siedem razy w świeżej objętości ultraczystej wody na każde pranie.Następnie odłóż mokre szkiełka nakrywkowe na bok, aby pozostała woda spłynęła z czystej szklanki. Gdy szkiełka nakrywkowe wyschną, podwielokrotność dwóch mikrolitrów końcowej mieszaniny liposomów dokładnie w środku samoprzylepnego kanału suwakowego w sterylnym kapturze przepływowym. I natychmiast, ale ostrożnie, wyrównaj jedno czyste i suche szkiełko nakrywkowe ze szkiełkiem, aby umożliwić delikatne opuszczenie szkiełka nakrywkowego na lepką stronę szkiełka.I użyj zewnętrznego pierścienia polipropylenowych kleszczyków nożycowych, aby delikatnie docisnąć obwodowy kontakt szkiełka nakrywkowego ze szkiełkiem, upewniając się, że szkiełko jest mocno przymocowane do szkiełka, aby zapobiec wyciekom. Następnie odwróć slajd i za pomocą markera permanentnego narysuj cztery kropki wokół dwuwarstwy po zewnętrznej stronie zespołu szkiełka. Przed pierwszym wstrzyknięciem należy wyznaczyć jeden port kanału jako port wejściowy, a drugi jako port wyjściowy, zachowując to oznaczenie przez cały czas trwania eksperymentu.Aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza, włóż końcówkę końcówki pipety bezpośrednio do portu wejściowego, aż poczujesz, że gumowa uszczelka kanału suwaka jest penetrowana końcówką. Powoli napełnij kanał 50 mikrolitrami ciepłego buforu testowego. Wstrzyknąć 200 mikrolitrów chlorku niklu(II) w roztworze blokującym kazeinę do portu wejściowego.I usuń 50 mikrolitrów bufora z portu wyjściowego. Po 45-minutowej inkubacji usunąć nadmiar roztworu kazeiny z portu wyjściowego. Wstrzyknąć 100 mikrolitrów ICAM-1 w roztworze streptawidyny do portu wejściowego na 45-minutową inkubację w temperaturze pokojowej.Pod koniec inkubacji usunąć nadmiar roztworu białkowego z portu wyjściowego. I umyj dwuwarstwę dwa razy 100 mikrolitrami buforu testowego na pranie. Następnie oznacz dwuwarstwy 100 mikrolitrami przeciwciała anty-CD3 sprzężonego z fluoro-4 przez 45 minut w temperaturze pokojowej.Następnie dwa płukania w 100 mikrolitrach buforu testowego na przemycie, jak pokazano. Aby zobrazować oddziaływania dwuwarstwowe limfocytów T, umieść szkiełko na podgrzewanym pod kątem 37 stopni Celsjusza mikroskopu z całkowitą wewnętrzną fluorescencją odbiciową lub TIRF. Dostosuj stolik za pomocą znaczników atramentu, aby wyśrodkować dwuwarstwę na obiektywie o mocy 100.W celu obrazowania uwalniania granulek dodaj sprzężone fluorescencyjnie fragmenty przeciwciała anty-CD107A FAB do zawiesiny limfocytów T CD4. I ponownie zawieś znakowane komórki w 50 mikrolitrach buforu testowego do wstrzyknięcia do portu wejściowego kanału szkiełkowego. Następnie należy wybrać odpowiednią liczbę pól doświadczalnych i rejestrować obrazy każdego pola raz na minutę przez 30 minut po wstrzyknięciu.W tym reprezentatywnym eksperymencie nie zaobserwowano różnic między limfocytami T CD8, które tworzyły klasyczne synapsy immunologiczne na dwuwarstwach lipidowych zbudowanych zarówno w komórce przepływowej, jak i w wielokanałowym suwaku przepływowym. Po interakcji dwuwarstwowej lipidów limfocyty T CD4 utworzyły dojrzałe synapsy odpornościowe, ale albo uwalniają, albo nie uwalniają granulek, uwalniają granulki bez tworzenia dojrzałych synaps lub nie tworzą synaps ani nie uwalniają granulek. Warto zauważyć, że limfocyty T CD4 pochodzące z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej są w stanie zacząć uwalniać ziarnistości prawie dwa razy szybciej niż komórki CD4 pochodzące z węzłów chłonnych.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby utrzymywać stałą temperaturę i pipetować powoli, aby nie powstały pęcherzyki. Oprócz naszych możliwości zbadania interfejsu dwuwarstwowego limfocytów T, podejście to pozwoliłoby nam również na przeprowadzenie barwienia międzykomórkowego limfocytów T, które dotknęły dwuwarstwy. To znacznie ułatwiłoby ilość informacji, które można wykorzystać do opisania poszczególnych limfocytów T pochodzących z tkanki limfatycznej lub innych tkanek.Nie zapominaj, że praca z roztworem piranii jest niezwykle niebezpieczna i ważne jest, aby podczas tej procedury nosić odpowiednie środki ochrony osobistej.

assessment-synaptic-interface-primary-human-t-cells-from-peripheral

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Niniejszy artykuł opisuje metodę wizualizacji tworzenia synapsy wirologicznej indukowanej przez otoczkę HIV-1 na płaskich dwuwarstwach wspieranych szkłem za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRF). Metodę tę można również połączyć z barwieniem immunofluorescencyjnym w celu wykrycia aktywacji i redystrybucji cząsteczek sygnałowych, które zachodzą podczas tworzenia synapsy wirologicznej indukowanej przez otoczkę HIV-1.

Obrazowanie synapsy wirologicznej i sygnalizacji indukowanej przez białko otoczki HIV-1 na syntetycznych dwuwarstwach lipidowych

Ten film analizuje tworzenie się synaps immunologicznych między limfocytami T w nieoczyszczonych preparatach pan-leukocytów a enterotoksyną B, komórkami Raji Staphylococcus aureus obciążonymi SEB. Wzbogacenie CD3 i F-aktyny obserwuje się w synapsie immunologicznej za pomocą obrazowej cytometrii przepływowej.

Analiza synaps immunologicznych między ludzkimi limfocytami T a komórkami Raji załadowanymi SEB przy użyciu obrazowej cytometrii przepływowej

Ten film demonstruje technikę in vitro do badania tworzenia synaps immunologicznych między pierwotnymi ludzkimi limfocytami T a wspieranymi dwuwarstwami lipidowymi (SLB). Białka powierzchniowe limfocytów T oddziałują z odpowiednimi ligandami unieruchomionymi na SLB, tworząc synapsę immunologiczną, po której następuje ruch granulek litycznych w kierunku synapsy, co jest wizualizowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Technika in vitro do badania interakcji limfocytów T z obsługiwanymi płaskimi dwuwarstwami lipidowymi

Ten film demonstruje obrazowanie na żywych komórkach topologii synaps immunologicznych, badając interakcje między limfocytami T a komórkami nabłonkowymi przenoszącymi antygeny fluorescencyjne. Mikroskopia fluorescencyjna ujawnia przemieszczenie czerwonej cytoplazmy i żółte pierścienie błonowe w komórkach śródbłonka, co wskazuje na tworzenie się synaps immunologicznych.

Ocena topologii synaps immunologicznych za pomocą obrazowania żywych komórek

W przeciwieństwie do bezkomórkowych cząsteczek HIV-1, zakażone limfocyty T CD4+ są skutecznie wykrywane przez plazmocytoidalne komórki dendrytyczne (pDC). Niniejszy manuskrypt opisuje metodę, w której jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) lub izolowane pDC są hodowane wspólnie z limfocytami T zakażonymi wirusem HIV-1 w celu oceny wrodzonego wykrywania przez pDC, oceniane przez uwalnianie IFN typu I.

Ocena wrodzonego wyczuwania limfocytów T CD4 + zakażonych wirusem HIV-1 przez plazmocytoidalne komórki dendrytyczne przy użyciu systemu kohodowli ex vivo.

Możliwość szczegółowego monitorowania odpowiedzi limfocytów T in vivo jest ważna dla rozwoju naszego zrozumienia odpowiedzi immunologicznej. W tym miejscu opisujemy zastosowanie docelowych macierzy fluorescencyjnych (FTA) w teście in vivo limfocytów T, który ocenia &gt;250 parametrów jednocześnie za pomocą cytometrii przepływowej.

Zastosowanie fluorescencyjnych macierzy docelowych do oceny odpowiedzi limfocytów T in vivo

Ten manuskrypt opisuje, jak przeprowadzić (pojedyncze cząsteczki) testy oparte na transferze energii rezonansu Förstera (FRET) w celu zmierzenia dynamiki wiązania między receptorem antygenu limfocytów T (TCR) a cząsteczkami MHC naładowanymi peptydami antygenowymi, które występują w synapsie immunologicznej limfocytu T w kontakcie z funkcjonalizowaną dwuwarstwą lipidową podpartą planarnie.

Pomiar wiązania TCR-pMHC in situ za pomocą testu mikroskopowego opartego na FRET

Ten artykuł opisuje metodę pomiaru alloreaktywności w mieszanej populacji limfocytów T za pomocą obrazowania cytometrii przepływowej.

Pomiar alloreaktywności limfocytów T za pomocą obrazowej cytometrii przepływowej

Tutaj opisujemy kompletny proces analizy jakościowej i ilościowej synaps immunologicznych pomiędzy pierwotnymi ludzkimi limfocytami T a komórkami prezentującymi antygen. Metoda opiera się na obrazowej cytometrii przepływowej, która pozwala na pozyskanie i ocenę kilku tysięcy obrazów komórek w stosunkowo krótkim czasie.

Analiza jakościowa i ilościowa synapsy immunologicznej w organizmie człowieka z wykorzystaniem obrazowej cytometrii przepływowej

Ten protokół obrazuje zarówno powstawanie synaps immunologicznych, jak i późniejszy spolaryzowany ruch wydzielniczy w kierunku synapsy immunologicznej. Koniugaty komórkowe utworzono między komórką Raji impulsową superantygenem (działającą jako komórka prezentująca antygen) a klonem Jurkat (działającym jako limfocyt T wspomagający efektor).

Obrazowanie ludzkiej synapsy immunologicznej

Tutaj prezentujemy protokół stopniowej rekonstytucji syntetycznych komórek prezentujących antygen za pomocą dwuwarstw lipidowych wspieranych przez koraliki i ich użycie do badania wyjścia synaptycznego z aktywowanych limfocytów T.

Przygotowanie dwuwarstw lipidowych wspieranych przez kulki w celu zbadania emisji cząstek stałych przez synapsy odpornościowe limfocytów T

Poznaj metodę oceny interfejsu synaptycznego pierwotnych ludzkich limfocytów T z krwi obwodowej i tkanki limfatycznej przy użyciu płaskich dwuwarstw lipidowych. Technika ta pozwala na analizę małych populacji komórek z mniejszą ilością odczynników niż tradycyjne metody.

Ocena interfejsu synaptycznego pierwotnych ludzkich limfocytów T z krwi obwodowej i tkanki limfatycznej

Przeglądaj więcej filmów