Ocena interfejsu synaptycznego pierwotnych ludzkich limfocytów T z krwi obwodowej i tkanki limfatycznej
July 30th, 2018
Protokół opisuje technikę badania zdolności pierwotnych poliklonalnych ludzkich limfocytów T do tworzenia interfejsów synaptycznych za pomocą płaskich dwuwarstw lipidowych. Używamy tej techniki, aby pokazać zróżnicowaną zdolność tworzenia synaps ludzkich pierwotnych limfocytów T pochodzących z węzłów chłonnych i krwi obwodowej.
Podejście, o którym będziemy dzisiaj mówić, zostało opracowane w celu porównania właściwości i aktywności funkcjonalnej limfocytów T krwi tkankowej i obwodowej. O znaczeniu tego tematu świadczy fakt, że limfocyty T krwi obwodowej stanowią tylko 20% wszystkich limfocytów T w organizmie. Możliwość badania niewielkiej liczby limfocytów T pochodzących z tkanek jest bardzo istotna i to jest dokładnie to, co udało nam się osiągnąć.
Główną zaletą tej techniki jest to, że wymaga mniejszej liczby komórek i mniejszych objętości odczynników niż tradycyjne techniki. Zacznij od użycia polipropylenowych kleszczyków nożycowych, aby zanurzyć szklane szkiełka nakrywkowe w świeżo przygotowanym kwaśnym roztworze piranii na 25 do 30 minut. Pod koniec prania spłucz szkiełka nakrywkowe siedem razy w świeżej objętości ultraczystej wody na każde pranie.
Następnie odłóż mokre szkiełka nakrywkowe na bok, aby pozostała woda spłynęła z czystej szklanki. Gdy szkiełka nakrywkowe wyschną, podwielokrotność dwóch mikrolitrów końcowej mieszaniny liposomów dokładnie w środku samoprzylepnego kanału suwakowego w sterylnym kapturze przepływowym. I natychmiast, ale ostrożnie, wyrównaj jedno czyste i suche szkiełko nakrywkowe ze szkiełkiem, aby umożliwić delikatne opuszczenie szkiełka nakrywkowego na lepką stronę szkiełka.
I użyj zewnętrznego pierścienia polipropylenowych kleszczyków nożycowych, aby delikatnie docisnąć obwodowy kontakt szkiełka nakrywkowego ze szkiełkiem, upewniając się, że szkiełko jest mocno przymocowane do szkiełka, aby zapobiec wyciekom. Następnie odwróć slajd i za pomocą markera permanentnego narysuj cztery kropki wokół dwuwarstwy po zewnętrznej stronie zespołu szkiełka. Przed pierwszym wstrzyknięciem należy wyznaczyć jeden port kanału jako port wejściowy, a drugi jako port wyjściowy, zachowując to oznaczenie przez cały czas trwania eksperymentu.
Aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza, włóż końcówkę końcówki pipety bezpośrednio do portu wejściowego, aż poczujesz, że gumowa uszczelka kanału suwaka jest penetrowana końcówką. Powoli napełnij kanał 50 mikrolitrami ciepłego buforu testowego. Wstrzyknąć 200 mikrolitrów chlorku niklu(II) w roztworze blokującym kazeinę do portu wejściowego.
I usuń 50 mikrolitrów bufora z portu wyjściowego. Po 45-minutowej inkubacji usunąć nadmiar roztworu kazeiny z portu wyjściowego. Wstrzyknąć 100 mikrolitrów ICAM-1 w roztworze streptawidyny do portu wejściowego na 45-minutową inkubację w temperaturze pokojowej.
Pod koniec inkubacji usunąć nadmiar roztworu białkowego z portu wyjściowego. I umyj dwuwarstwę dwa razy 100 mikrolitrami buforu testowego na pranie. Następnie oznacz dwuwarstwy 100 mikrolitrami przeciwciała anty-CD3 sprzężonego z fluoro-4 przez 45 minut w temperaturze pokojowej.
Następnie dwa płukania w 100 mikrolitrach buforu testowego na przemycie, jak pokazano. Aby zobrazować oddziaływania dwuwarstwowe limfocytów T, umieść szkiełko na podgrzewanym pod kątem 37 stopni Celsjusza mikroskopu z całkowitą wewnętrzną fluorescencją odbiciową lub TIRF. Dostosuj stolik za pomocą znaczników atramentu, aby wyśrodkować dwuwarstwę na obiektywie o mocy 100.
W celu obrazowania uwalniania granulek dodaj sprzężone fluorescencyjnie fragmenty przeciwciała anty-CD107A FAB do zawiesiny limfocytów T CD4. I ponownie zawieś znakowane komórki w 50 mikrolitrach buforu testowego do wstrzyknięcia do portu wejściowego kanału szkiełkowego. Następnie należy wybrać odpowiednią liczbę pól doświadczalnych i rejestrować obrazy każdego pola raz na minutę przez 30 minut po wstrzyknięciu.
W tym reprezentatywnym eksperymencie nie zaobserwowano różnic między limfocytami T CD8, które tworzyły klasyczne synapsy immunologiczne na dwuwarstwach lipidowych zbudowanych zarówno w komórce przepływowej, jak i w wielokanałowym suwaku przepływowym. Po interakcji dwuwarstwowej lipidów limfocyty T CD4 utworzyły dojrzałe synapsy odpornościowe, ale albo uwalniają, albo nie uwalniają granulek, uwalniają granulki bez tworzenia dojrzałych synaps lub nie tworzą synaps ani nie uwalniają granulek. Warto zauważyć, że limfocyty T CD4 pochodzące z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej są w stanie zacząć uwalniać ziarnistości prawie dwa razy szybciej niż komórki CD4 pochodzące z węzłów chłonnych.
Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby utrzymywać stałą temperaturę i pipetować powoli, aby nie powstały pęcherzyki. Oprócz naszych możliwości zbadania interfejsu dwuwarstwowego limfocytów T, podejście to pozwoliłoby nam również na przeprowadzenie barwienia międzykomórkowego limfocytów T, które dotknęły dwuwarstwy. To znacznie ułatwiłoby ilość informacji, które można wykorzystać do opisania poszczególnych limfocytów T pochodzących z tkanki limfatycznej lub innych tkanek.
Nie zapominaj, że praca z roztworem piranii jest niezwykle niebezpieczna i ważne jest, aby podczas tej procedury nosić odpowiednie środki ochrony osobistej.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół opisuje technikę badania zdolności do tworzenia interfejsu synaptycznego pierwotnych poliklonalnych ludzkich komórek T przy użyciu płaskich dwuwarstew lipidowych. Badanie podkreśla różnice w tworzeniu synaps pomiędzy komórkami T pochodzącymi z węzłów chłonnych i tych z krwi obwodowej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Immunologia
- Biologia komórki
Tło
- Komórki T krwi obwodowej stanowią tylko 20% wszystkich komórek T w organizmie.
- Badanie komórek T pochodzących z tkanek jest kluczowe dla zrozumienia odpowiedzi immunologicznych.
- Technika pozwala na analizę z mniejszą liczbą komórek i reagentów w porównaniu z tradycyjnymi metodami.
- Płaskie dwuwarstwy lipidowe zapewniają model do badania interakcji komórkowych.
Cel badania
- Porównać zdolności do tworzenia synaps komórek T pochodzących z tkanek i krwi obwodowej.
- Opracować metodę wymagającą mniej komórek do analizy.
- Zwiększyć zrozumienie funkcjonalności komórek T w różnych środowiskach.
Zastosowanie metod
- Przygotowanie szklanych pokryw slajdowych za pomocą kwaśnego roztworu pirani.
- Płukanie pokryw wodą ultraczystą.
- Wykorzystanie płaskich dwuwarstew lipidowych do badania interakcji komórek T.
- Ocenianie tworzenia interfejsu synaptycznego między komórkami T a dwuwarstewami lipidowymi.
Główne wyniki
- Wykazane różnice w zdolności do tworzenia synaps komórek T z różnych źródeł.
- Potwierdzenie skuteczności techniki w badaniu małych populacji komórek.
- Dostarczenie wglądu w aktywności funkcjonalne komórek T w różnych tkankach.
- Podkreślenie zalet stosowania mniejszego nakładu reagentów w eksperymentach.
Wnioski
- Protokół pozwala na badanie tworzenia synaps w komórkach T.
- Oferuje cennym narzędzie dla badaczy zajmujących się funkcjonalnością komórek T.
- Wyniki mogą mieć wpływ na zrozumienie odpowiedzi immunologicznych w zdrowiu i chorobie.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Direct assessment of synaptic interfaces in primary human T cells from both peripheral blood and lymphoid tissue addresses a critical gap in translational immunology and cell therapy R&D. This technique enables mechanistic de-risking and predictive confidence by allowing functional interrogation of rare tissue-derived T cell populations using minimal sample input. The approach supports portfolio decisions by providing quantitative, reproducible data on T cell activation and granule release kinetics relevant to immune modulation strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct functional comparison of tissue- and blood-derived T cells for target validation.
- Supports mechanistic de-risking by revealing differences in synapse formation and granule release kinetics.
- Facilitates hypothesis testing on immune cell activation pathways using primary human samples.
- Provides quantitative outputs for portfolio triage and early-stage decision making.
Screening & Assay Development
- Establishes a reproducible, low-input assay platform for evaluating T cell activation and effector function.
- Supports assay standardization and scalability by minimizing cell and reagent requirements.
- Enables screening of functional responses in rare or limited primary cell populations.
- Delivers quantitative, time-resolved readouts suitable for compound or biologic evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro findings with disease-relevant tissue T cell phenotypes for translational continuity.
- Enables risk-adjusted advancement by comparing functional outputs across health and disease contexts.
- Supports biomarker discovery by correlating synaptic interface dynamics with functional granule release.
- Provides mechanistic insights to inform preclinical model selection and validation.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery and translational research by enabling direct, quantitative analysis of primary T cell function from both blood and tissue sources.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of T cell activation and synapse formation mechanisms.
- Screening: Provides a standardized, scalable assay for functional screening of T cell responses.
- Analytics: Delivers quantitative, time-resolved measurements of granule release and synaptic interface formation.
- Translational Research: Facilitates alignment of in vitro findings with disease-relevant tissue phenotypes.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for diverse immune cell functional studies across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in T cell functional studies.
- Operational Value: Minimizes sample and reagent requirements, enabling studies with rare or limited primary cells.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust, quantitative data early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of immune modulation programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell isolation and advanced fluorescence microscopy.
- Demands access to TIRF microscopy and precise fluid handling instrumentation.
- Standardization of assay conditions is critical for reproducibility across teams.
- Adaptation may be needed for different tissue sources or T cell subsets.
- Careful handling of hazardous reagents and strict adherence to safety protocols are essential.
