Ocena interfejsu synaptycznego pierwotnych ludzkich limfocytów T z krwi obwodowej i tkanki limfatycznej
30 lipca 2018
Protokół opisuje technikę badania zdolności pierwotnych poliklonalnych ludzkich limfocytów T do tworzenia interfejsów synaptycznych za pomocą płaskich dwuwarstw lipidowych. Używamy tej techniki, aby pokazać zróżnicowaną zdolność tworzenia synaps ludzkich pierwotnych limfocytów T pochodzących z węzłów chłonnych i krwi obwodowej.
Podejście, o którym będziemy dzisiaj mówić, zostało opracowane w celu porównania właściwości i aktywności funkcjonalnej limfocytów T krwi tkankowej i obwodowej. O znaczeniu tego tematu świadczy fakt, że limfocyty T krwi obwodowej stanowią tylko 20% wszystkich limfocytów T w organizmie. Możliwość badania niewielkiej liczby limfocytów T pochodzących z tkanek jest bardzo istotna i to jest dokładnie to, co udało nam się osiągnąć.
Główną zaletą tej techniki jest to, że wymaga mniejszej liczby komórek i mniejszych objętości odczynników niż tradycyjne techniki. Zacznij od użycia polipropylenowych kleszczyków nożycowych, aby zanurzyć szklane szkiełka nakrywkowe w świeżo przygotowanym kwaśnym roztworze piranii na 25 do 30 minut. Pod koniec prania spłucz szkiełka nakrywkowe siedem razy w świeżej objętości ultraczystej wody na każde pranie.
Następnie odłóż mokre szkiełka nakrywkowe na bok, aby pozostała woda spłynęła z czystej szklanki. Gdy szkiełka nakrywkowe wyschną, podwielokrotność dwóch mikrolitrów końcowej mieszaniny liposomów dokładnie w środku samoprzylepnego kanału suwakowego w sterylnym kapturze przepływowym. I natychmiast, ale ostrożnie, wyrównaj jedno czyste i suche szkiełko nakrywkowe ze szkiełkiem, aby umożliwić delikatne opuszczenie szkiełka nakrywkowego na lepką stronę szkiełka.
I użyj zewnętrznego pierścienia polipropylenowych kleszczyków nożycowych, aby delikatnie docisnąć obwodowy kontakt szkiełka nakrywkowego ze szkiełkiem, upewniając się, że szkiełko jest mocno przymocowane do szkiełka, aby zapobiec wyciekom. Następnie odwróć slajd i za pomocą markera permanentnego narysuj cztery kropki wokół dwuwarstwy po zewnętrznej stronie zespołu szkiełka. Przed pierwszym wstrzyknięciem należy wyznaczyć jeden port kanału jako port wejściowy, a drugi jako port wyjściowy, zachowując to oznaczenie przez cały czas trwania eksperymentu.
Aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza, włóż końcówkę końcówki pipety bezpośrednio do portu wejściowego, aż poczujesz, że gumowa uszczelka kanału suwaka jest penetrowana końcówką. Powoli napełnij kanał 50 mikrolitrami ciepłego buforu testowego. Wstrzyknąć 200 mikrolitrów chlorku niklu(II) w roztworze blokującym kazeinę do portu wejściowego.
I usuń 50 mikrolitrów bufora z portu wyjściowego. Po 45-minutowej inkubacji usunąć nadmiar roztworu kazeiny z portu wyjściowego. Wstrzyknąć 100 mikrolitrów ICAM-1 w roztworze streptawidyny do portu wejściowego na 45-minutową inkubację w temperaturze pokojowej.
Pod koniec inkubacji usunąć nadmiar roztworu białkowego z portu wyjściowego. I umyj dwuwarstwę dwa razy 100 mikrolitrami buforu testowego na pranie. Następnie oznacz dwuwarstwy 100 mikrolitrami przeciwciała anty-CD3 sprzężonego z fluoro-4 przez 45 minut w temperaturze pokojowej.
Następnie dwa płukania w 100 mikrolitrach buforu testowego na przemycie, jak pokazano. Aby zobrazować oddziaływania dwuwarstwowe limfocytów T, umieść szkiełko na podgrzewanym pod kątem 37 stopni Celsjusza mikroskopu z całkowitą wewnętrzną fluorescencją odbiciową lub TIRF. Dostosuj stolik za pomocą znaczników atramentu, aby wyśrodkować dwuwarstwę na obiektywie o mocy 100.
W celu obrazowania uwalniania granulek dodaj sprzężone fluorescencyjnie fragmenty przeciwciała anty-CD107A FAB do zawiesiny limfocytów T CD4. I ponownie zawieś znakowane komórki w 50 mikrolitrach buforu testowego do wstrzyknięcia do portu wejściowego kanału szkiełkowego. Następnie należy wybrać odpowiednią liczbę pól doświadczalnych i rejestrować obrazy każdego pola raz na minutę przez 30 minut po wstrzyknięciu.
W tym reprezentatywnym eksperymencie nie zaobserwowano różnic między limfocytami T CD8, które tworzyły klasyczne synapsy immunologiczne na dwuwarstwach lipidowych zbudowanych zarówno w komórce przepływowej, jak i w wielokanałowym suwaku przepływowym. Po interakcji dwuwarstwowej lipidów limfocyty T CD4 utworzyły dojrzałe synapsy odpornościowe, ale albo uwalniają, albo nie uwalniają granulek, uwalniają granulki bez tworzenia dojrzałych synaps lub nie tworzą synaps ani nie uwalniają granulek. Warto zauważyć, że limfocyty T CD4 pochodzące z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej są w stanie zacząć uwalniać ziarnistości prawie dwa razy szybciej niż komórki CD4 pochodzące z węzłów chłonnych.
Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby utrzymywać stałą temperaturę i pipetować powoli, aby nie powstały pęcherzyki. Oprócz naszych możliwości zbadania interfejsu dwuwarstwowego limfocytów T, podejście to pozwoliłoby nam również na przeprowadzenie barwienia międzykomórkowego limfocytów T, które dotknęły dwuwarstwy. To znacznie ułatwiłoby ilość informacji, które można wykorzystać do opisania poszczególnych limfocytów T pochodzących z tkanki limfatycznej lub innych tkanek.
Nie zapominaj, że praca z roztworem piranii jest niezwykle niebezpieczna i ważne jest, aby podczas tej procedury nosić odpowiednie środki ochrony osobistej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje technikę badania zdolności do tworzenia interfejsu synaptycznego przez pierwotne poliklonalne ludzkie limfocyty T z wykorzystaniem planarnych dwuwarstw lipidowych. Badanie podkreśla różnice w tworzeniu synaps pomiędzy limfocytami T pochodzącymi z węzłów chłonnych a tymi z krwi obwodowej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Immunologia
- Biologia komórki
Wstęp
- Limfocyty T krwi obwodowej stanowią jedynie 20% wszystkich limfocytów T w organizmie.
- Badanie limfocytów T pochodzących z tkanek jest kluczowe dla zrozumienia odpowiedzi immunologicznych.
- Opisana technika umożliwia analizę przy użyciu mniejszej liczby komórek i odczynników w porównaniu z metodami tradycyjnymi.
- Planarne dwuwarstwy lipidowe stanowią model do badania oddziaływań międzykomórkowych.
Cel badania
- Porównanie zdolności do tworzenia synaps przez limfocyty T pochodzące z tkanek oraz z krwi obwodowej.
- Opracowanie metody wymagającej mniejszej liczby komórek do analizy.
- Pogłębienie wiedzy na temat funkcjonalności limfocytów T w różnych środowiskach.
Zastosowane metody
- Przygotowanie szkiełek nakrywkowych przy użyciu kwaśnego roztworu piranha.
- Płukanie szkiełek nakrywkowych w wodzie ultra-czystej.
- Wykorzystanie płaskich lipidowych dwuwarstw do badań nad oddziałaniami limfocytów T.
- Ocena tworzenia się interfejsu synaptycznego pomiędzy limfocytami T a dwuwarstwami lipidowymi.
Główne wyniki
- Wykazano zróżnicowane zdolności tworzenia synaps immunologicznych przez limfocyty T pochodzące z różnych źródeł.
- Potwierdzono skuteczność techniki w badaniu małych populacji komórek.
- Przedstawiono informacje na temat aktywności funkcjonalnej limfocytów T w różnych tkankach.
- Wskazano na zalety wykorzystania mniejszej ilości odczynników w układach eksperymentalnych.
Wnioski
- Protokół ten umożliwia skuteczne badanie tworzenia się synaps limfocytów T.
- Stanowi on cenne narzędzie dla badaczy analizujących funkcjonalność limfocytów T.
- Wyniki mogą mieć znaczenie dla zrozumienia odpowiedzi immunologicznych w stanie zdrowia i choroby.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Bezpośrednia ocena interfejsów synaptycznych w pierwotnych ludzkich limfocytach T pochodzących zarówno z krwi obwodowej, jak i z tkanki limfatycznej, wypełnia krytyczną lukę w immunologii translacyjnej oraz badaniach i rozwoju (R&D) terapii komórkowych. Technika ta umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka i zwiększenie pewności prognostycznej poprzez funkcjonalną analizę rzadkich populacji limfocytów T pochodzących z tkanek przy minimalnej ilości materiału wyjściowego. Podejście to wspiera decyzje portfelowe, dostarczając ilościowych i powtarzalnych danych na temat aktywacji limfocytów T oraz kinetyki uwalniania ziarnistości, istotnych dla strategii modulacji odporności.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednie porównanie funkcjonalne limfocytów T pochodzących z tkanek i krwi w celu walidacji celu terapeutycznego.
- Wspiera mechanistyczną ocenę ryzyka poprzez ujawnianie różnic w tworzeniu synaps i kinetyce uwalniania ziarnistości.
- Ułatwia testowanie hipotez dotyczących szlaków aktywacji komórek odpornościowych z wykorzystaniem pierwotnych próbek ludzkich.
- Dostarcza ilościowych wyników niezbędnych do selekcji projektów w portfolio i podejmowania decyzji na wczesnym etapie.
Przesiewy i opracowanie analizy
- Tworzy powtarzalną platformę analityczną z niskim nakładem materiału do oceny aktywacji i funkcji efektorowych limfocytów T.
- Wspiera standaryzację i skalowalność analizy poprzez minimalizację zapotrzebowania na komórki i odczynniki.
- Umożliwia badanie odpowiedzi funkcjonalnych w rzadkich lub ograniczonych populacjach pierwotnych komórek.
- Zapewnia ilościowe, rozdzielone w czasie odczyty, odpowiednie do oceny związków chemicznych lub biologicznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje wyniki in vitro z fenotypami limfocytów T w tkankach istotnych dla przebiegu choroby w celu zapewnienia ciągłości translacyjnej.
- Umożliwia dostosowanie postępów do poziomu ryzyka poprzez porównywanie wyników funkcjonalnych w kontekście stanu zdrowia i choroby.
- Wspiera odkrywanie biomarkerów poprzez korelację dynamiki interfejsu synaptycznego z funkcjonalnym uwalnianiem ziarnistości.
- Zapewnia wgląd w mechanizmy, co pozwala na właściwy dobór i walidację modeli przedklinicznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta łączy wczesną fazę odkryć z badaniami translacyjnymi, umożliwiając bezpośrednią, ilościową analizę funkcji pierwotnych limfocytów T pochodzących zarówno z krwi, jak i z tkanek.
- Biologia odkrywcza: Wspiera badanie mechanizmów aktywacji limfocytów T oraz tworzenia synaps w oparciu o postawione hipotezy.
- Screening: Zapewnia zstandaryzowany, skalowalny test do funkcjonalnego screeningu odpowiedzi limfocytów T.
- Analityka: Umożliwia ilościowe, rozdzielone w czasie pomiary uwalniania ziarnistości oraz tworzenia interfejsu synaptycznego.
- Badania translacyjne: Ułatwia dopasowanie wyników uzyskanych in vitro do fenotypów tkanek istotnych w kontekście chorób.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje platformę wielokrotnego użytku do różnorodnych badań funkcjonalnych komórek odpornościowych w ramach wielu programów.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad funkcjami limfocytów T.
- Wartość operacyjna: Minimalizuje zapotrzebowanie na próbki i odczynniki, umożliwiając badania z wykorzystaniem rzadkich lub ograniczonych ilości pierwotnych komórek.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez dostarczenie wiarygodnych danych ilościowych na wczesnym etapie procesu badawczego.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój programów modulacji immunologicznej.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie izolacji komórek pierwotnych i zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej.
- Niezbędny jest dostęp do mikroskopii TIRF oraz precyzyjnych instrumentów do manipulacji płynami.
- Standaryzacja warunków analizy jest kluczowa dla zapewnienia powtarzalności wyników między zespołami.
- Możliwa może być konieczność adaptacji metody dla różnych źródeł tkanek lub subpopulacji limfocytów T.
- Niezbędne jest ostrożne obchodzenie się z niebezpiecznymi odczynnikami oraz ścisłe przestrzeganie protokołów bezpieczeństwa.
