Testy obrazowania żywych komórek w celu zbadania migracji i inwazji komórek macierzystych glejaka wielopostaciowego guza mózgu

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie glejaka, guza mózgu, komórek macierzystych lub biologii BTSC, ułatwiając identyfikację nowych podejść do hamowania migracji i inwazji. Główną zaletą tych technik jest to, że pozwalają one na ilościowe określenie migracji i inwazji BTSC w czasie w wielu warunkach. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię glejaka, ponieważ migracja i inwazja komórek rakowych do normalnej tkanki mózgowej przyczynia się do nawrotu choroby.

Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w to, w jaki sposób BTSC migrują i atakują, można ją również zastosować do rakowych komórek macierzystych pochodzących z innych typów nowotworów. Zacznij od rozmrożenia fiolki z kriogenicznie zakonserwowanymi BTSC w zlewce z 70% etanolem umieszczonej w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż do rozmrożenia ostatniej części lodu. Rozcieńczyć rozmrożone komórki i 10 mililitrów pożywki w 15-mililitrowej stożkowej probówce do ich odwirowania i ponownie zawiesić granulki BTSC w ośmiu mililitrach kompletnej pożywki.

Przenieść komórki do kolby hodowlanej T25 na 10 do 14 dni hodowli w warunkach nieprzylegających, codziennie monitorując kolbę i w razie potrzeby uzupełnić komórki jednym do dwóch mililitrów świeżej, kompletnej pożywki. Gdy neurosfery osiągną średnicę około 250 mikrometrów, użyj pipety, aby przepłukać pożywkę na dnie kolby, aby odłączyć wszelkie przylegające komórki i przenieść supernatant do 15-mililitrowej stożkowej probówki w celu odwirowania. Aby rozdzielić neurosfery BTSC na pojedyncze komórki, ponownie zawieś osad w jednym mililitrze wstępnie podgrzanego roztworu do odrywania komórek i inkubuj przez siedem minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie wykonaj 40 prób za pomocą mikropipety P1000 ustawionej na 800 mikrolitrów.

Gdy komórki są całkowicie zdysocjowane, dodaj pięć mililitrów PBS uzupełnionego antybiotykami do probówki w celu ponownego odwirowania i ponownie zawieś osad w jednym do czterech mililitrów kompletnej pożywki, w zależności od wielkości osadu. Następnie wysiewaj dwie do trzech razy od 10 do piątej komórki w ośmiu mililitrach kompletnej pożywki na kolbę T25 i przenieś kolby do inkubatora do hodowli komórkowych na jeden do dwóch tygodni hodowli. Aby ocenić wpływ leczenia farmakologicznego będącego przedmiotem zainteresowania na migrację, należy najpierw wstępnie potraktować komórki odpowiednim stężeniem leku przez odpowiedni okres eksperymentalny.

Aby przygotować płytkę chemotaksji, pokryj trzy studzienki z wkładką membranową i trzy studzienki zbiornika dennego na warunek 96-dołkowej płytki chemotaksji odpowiednio 75 i 225 mikrolitrów 0,2 miligrama na mililitr kolagenu typu I przez jedną godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji odessać roztwór kolagenu z każdej studzienki bez rysowania powłoki kolagenowej i przemyć studzienki dwa razy sterylnym PBS. Po ostatnim myciu wyjmij wkładkę z płytki i dodaj 225 mikrolitrów pożywki bez czynnika wzrostu uzupełnionej 10% FBS do każdej studzienki dolnego zbiornika płytki chemotaksji.

Następnie delikatnie włóż górną wkładkę do dolnego zbiornika pod kątem, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków i dodaj 2,5 razy 10 do trzecich zdysocjowanych BTSC w 50 mikrolitrach pożywki wolnej od czynnika wzrostu do każdej studzienki. Ważne jest, aby całkowicie rozdzielić BTSC na pojedyncze komórki i dokładnie je policzyć przed posiewem, aby uniknąć grudek komórek lub zbyt wielu komórek w górnej wkładce. Aby zobrazować migrację BTSC wzdłuż gradientu FBS, umieść płytkę w systemie obrazowania żywych komórek i ustaw oprogramowanie do automatycznego obrazowania tak, aby uzyskiwało mikroskopowe obrazy płytki co jedną do dwóch godzin przez okres do 72 godzin.

Po zakończeniu akwizycji obrazu wybierz nową definicję przetwarzania, aby odróżnić BTSC od ich porów wstawienia na dolnej stronie membrany, modyfikując analizę, jeśli nie odróżnia ona dokładnie komórek od błony tła, jak to konieczne. Aby określić ilościowo komórki, które migrowały przez pory, zbierz dane jako powierzchnię komórki na dolnej stronie błony dla każdej z trzech studzienek replikowanych na warunek, a następnie narysuj wykres migracji komórek jako obszar komórek migrujących w mikrometrach do kwadratu w czasie. Aby ocenić inwazję neurosfery BTSC, najpierw dodaj interesujący związek do kolby o pożądanym stężeniu przez z góry określony przebieg czasu przed posiewem inwazji neurosfery.

Gdy średni rozmiar neurosfery osiągnie około 150 do 200 mikrometrów, przechyl i delikatnie wymieszaj kolbę pipetą i przenieś 500 mikrolitrów zawieszonych neurosfer BTSC do jednej 1,5-mililitrowej probówki na warunki eksperymentalne na lodzie. Odessać jak najwięcej pożywki z dna każdej 1,5-mililitrowej probówki bez utraty osadu neurosfery i delikatnie ponownie zawiesić neurosfery w 500 mikrolitrach świeżo przygotowanego roztworu kolagenu typu I o stężeniu 0,4 miligrama na mililitr. Przenieś 100 mikrolitrów neurosfer zawieszonych w kolagenie do trzech dołków na warunek na nową 96-dołkową płytkę na lodzie i pozwól neurosferom osiąść na pięć minut.

Bardzo ważne jest, aby pozwolić neurosferom osiąść na lodzie na pięć minut. W przeciwnym razie sfery nie będą znajdować się na tej samej płaszczyźnie ostrości dla obrazowania. Po pięciu minutach polimeryzacji kolagenu w inkubatorze hodowli komórkowych przenieś płytkę do tacki systemu obrazowania żywych komórek, aby uzyskać referencyjny obraz wielkości neurosfery w momencie posiewu przed rozpoczęciem inwazji.

Następnie ustaw oprogramowanie tak, aby pobierało obrazy co jedną do dwóch godzin, aż tempo inwazji ustabilizuje się, zwykle o 24 godziny. Aby zobrazować rosnącą powierzchnię BTSC w miarę ich inwazji na matrycę w czasie, użyj obiektywu 10X, aby uzyskać cztery obrazy na studnię dla każdego zestawu trzech powtórzonych studzienek. Aby określić względną powierzchnię komórki reprezentowaną jako procentowa zbieżność studni, ustaw definicję przetwarzania, która konkretnie podkreśla komórki na tle studni, a następnie zbierz dane jako całkowitą powierzchnię komórki dla każdej studzienki w każdym punkcie czasowym, określ średnią z trzech studzienek replikacji, i narysuj na wykresie inwazję BTSC, wykreślając rosnącą powierzchnię komórek w czasie.

BTSC powleczone jako pojedyncze komórki mogą być hodowane jako swobodnie unoszące się neurosfery. Neurosfery mogą być następnie leczone lekiem będącym przedmiotem zainteresowania i posiane w celu analizy chemotaksji wpływu interwencji terapeutycznych na migrację BTSC. Jeśli BTSC nie są w pełni zdysocjowane, komórki nie migrują przez pory i pozostają małymi neurosferami.

Jeśli na dołek zostanie posianych więcej niż 2,5 razy od 10 do trzech BTSC, komórki raczej zlepiają się niż migrują na dolne strony błon. Ponadto ważne jest, aby unikać tworzenia pęcherzyków w studzienkach wkładki membranowej podczas powlekania komórek lub podczas umieszczania wkładki membranowej w dolnym zbiorniku, ponieważ pęcherzyki uniemożliwiają dokładne obrazowanie komórek i kwantyfikację. Inwazja BTSC z neurosfer do otaczającej macierzy może być obrazowana i mierzona w czasie w formacie 96-dołkowej płytki.

Wpływ interwencji terapeutycznych na inwazję BTSC można ocenić, określając ilościowo powierzchnię komórek w miarę ich inwazji na matrycę w czasie. Osadzenie neurosfer BTSC o średnicy większej niż 200 mikrometrów prowadzi do płaszczyzny ostrości, która jest zbyt duża, aby dokładnie określić ilościowo wszystkie sfery w polu widzenia. Podobnie, niepowodzenie w utrzymaniu macierzy w temperaturze czterech stopni Celsjusza podczas osadzania neurosfer w kolagenie w celu przeprowadzenia testu inwazji może również prowadzić do powstania sfer, które nie znajdują się na tej samej płaszczyźnie ostrości z macierzą zewnątrzkomórkową, która nie krzepnie równomiernie, uniemożliwiając dokładne pozyskiwanie danych.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o optymalizacji warunków leczenia farmakologicznego i czasu pozyskiwania obrazu dla każdej badanej hodowli BTSC. Procedura ta może być również zmodyfikowana, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące tego, w jaki sposób rakowe komórki macierzyste z innych typów nowotworów migrują i atakują in vitro. Technika ta może pomóc utorować drogę naukowcom w dziedzinie biologii nowotworów do zbadania migracji i inwazji in vitro w BTSC glejaka.