Name: Wysokoprzepustowy test strumienia wapnia do badania receptorów NMDA z wrażliwością na glicynę/D-serynę i glutaminian (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 48 s
Description: Poznaj wysokoprzepustowy test strumienia wapnia do badania receptorów NMDA z wrażliwością na glicynę/D-serynę i glutaminian w komórkach HEK 293. Ta metoda umożliwia analizę aktywności receptorów i poszukiwanie nowych leków na choroby neurologiczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy chcieliby podziękować Biuru Programu Stypendialnego Post Baccalaureate oraz Instytutom Badań Biomedycznych Novartis za sfinansowanie tego badania.

1. Przygotowanie komórek
UWAGA: Ten protokół, łącznie z generowaniem danych, wykorzystuje komórki HEK293 transdukowane bakulowirusem kodującym komórki NR1 i NR2A.
<ol>
	<li>Wysiewać odpowiednią liczbę komórek HEK293 i dodawać wirusa NR1 i/lub NR2A w odpowiednich stężeniach końcowych (1,00 μl każda). W przypadku płytki 384-dołkowej należy użyć 10 000 komórek/basenik w końcowej objętości 30 μl.</li>
	<li>Alternatywnie, wysiewaj komórki HEK293-NR1-NR2A w odpowiedniej liczbie i objętości komórek (w przypadku płytki 384-dołkowej użyj 10 000 komórek/basenik w końcowej objętości 30 μL). Dodać tetracyklinę w stężeniu 2 μg/ml w celu wywołania ekspresji NR2A i dodać związek ochronny (100 μM MDL105,519 lub 5 μM CGP07066724).</li>
	<li>UWAGA: Bakulowirus kodujący NR1 i NR2 powinien mieć przybliżone miano między 5 x 109 - 10 x 109 jednostek zakaźnych na mililitr24.</li>
</ol>
2. Pomiar aktywności receptora NMDA
<ol>
	<li>Przygotować 384-dołkową płytkę z komórkami HEK293 transdukowanymi komórkami NR1/NR2 lub HEK293-NR1-NR2A w obecności jednego ze związków ochronnych. Użyj przezroczystej dolnej płytki pokrytej czarną ramką, poli-D-lizyną. 
	UWAGA: Ochrona za pomocą 100 μM MDL105,519 służy do nadawania wrażliwości na glicynę, podczas gdy 5 μM CGP070667 służy do nadawania wrażliwości na glutaminian.</li>
	<li>Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 16 godzin (przez noc).</li>
	<li>Wyjmij płytkę z inkubatora i delikatnie wyrzuć pożywkę komórkową, powoli obracając płytkę nad kompatybilnym pojemnikiem na bioodpady. Delikatnie postukaj płytką o ręcznik papierowy, aby oczyścić nośnik z krawędzi płyty i spuścić pozostały nośnik.</li>
	<li>Przygotować barwnik wapnia6 przez solubilizację jednej fiolki barwnika calcium6 (1 rozmiar płytki) w 10 ml buforu do inkubacji (HBSS pH 7,5, 20 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 1 mM probenecyd). Inkubować płytkę przez 2 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Wyjąć płytkę z inkubatora i pozwolić komórkom dostosować się do temperatury pokojowej przez 10 minut.</li>
	<li>Delikatnie wylać barwnik wapienno-6 zgodnie z opisem w kroku 2.3 i dodać 30 μl buforu do oznaczania (HBSS pH 7,5, 20 mM HEPES, 1,8 mM CaCl2, 1 mM probenecydu).</li>
	<li>Powtórz krok 2.6 dwa razy, w sumie 3 prania. Pozostawić 30 μl buforu do oznaczania na komórkach po ostatnim przemyciu.</li>
	<li>Pozwól komórkom odpocząć przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotować płytkę liganda, sporządzając 4-krotny zapas 400 μM glicyny i 400 μM glutaminianu (końcowe stężenie 100 μM; optymalne stężenie ligandów należy określić w sposób opisany poniżej). Przenieść co najmniej 25 μl liganda na płytkę 384-dołkową z dnem w kształcie litery V.</li>
	<li>Załaduj płytkę liganda i płytkę komórkową do FDSS (Functional Drug Screening System).</li>
	<li>Mierz wyjściową fluorescencję (Fo) płytki komórkowej przez 30 sekund. Przenieś 10 μl zapasu liganda na płytkę komórkową za pomocą funkcji dozowania FDSS i zmierz strumień wapnia, rejestrując fluorescencję barwnika wapnia 6-barwnikowego przez 5 minut.</li>
	<li>Obliczyć maksymalny współczynnik fluorescencji, dzieląc maksymalną uzyskaną fluorescencję przez fluorescencję podstawową (Fmax/Fo).</li>
</ol>
3. Optymalizacja poziomów ekspresji NMDAR
<ol>
	<li>Aby określić optymalną ilość bakulowirusa do użycia, należy przeprowadzić miareczkowanie zarówno wirusów NR1, jak i NR2A. Przygotuj 384-dołkową płytkę z komórkami HEK293 (zalecenie 10 000 komórek/studzienkę, 30 μl pożywki) i dołącz związki ochronne zgodnie z opisem w kroku 2.1.</li>
	<li>Dodać różne ilości wirusa NR1 w różnych rzędach płytki (na przykład: dodać odpowiednio 0 μl, 2 μl, 1 μl, 0,5 μl, 0,25 μl w rzędach A-E). Dodaj duplikaty, aby zapewnić dokładność danych.</li>
	<li>Dodać różne ilości wirusa NR2A w różnych kolumnach płytki (na przykład: dodać odpowiednio 0 μL, 2 μL, 1 μL, 0,5 μL, 0,25 μL w rzędach A-E). Dodaj duplikaty, aby zapewnić dokładność danych.</li>
	<li>Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 16 godzin (przez noc).</li>
	<li>Określ optymalny stosunek i ilość wirusów NR1 i NR2A, wykonując pomiar strumienia wapnia na FDSS (patrz wyżej).</li>
</ol>
4. Miareczkowanie ligandów
<ol>
	<li>Przygotuj komórki zgodnie z opisem w kroku 2.3.</li>
	<li>Przygotować rozcieńczenia każdego liganda w obecności stężeń nasyconych (100 μM) drugiego liganda w postaci 4-krotnego roztworu podstawowego. Na przykład: dla końcowego stężenia glicyny w teście 10 μM należy przygotować 40 μM roztwór podstawowy glicyny zawierający 400 μM glutaminianu.</li>
	<li>Kontynuuj pomiar FDSS zgodnie z opisem w kroku 2.11.</li>
</ol>
5. Testowanie związków
<ol>
	<li>Przygotuj komórki zgodnie z opisem w kroku 1.</li>
	<li>Przygotować płytkę liganda z 5-krotnym zapasem końcowego stężenia liganda w buforze do oznaczania.</li>
	<li>Przygotować płytkę ze związkami z 4-krotnym zapasem pożądanego stężenia końcowego związków w buforze do oznaczania. Aby uzyskać końcowe stężenie związku 10 μM w buforze do oznaczania, należy przygotować roztwór podstawowy o stężeniu 40 μM.
	<ol>
		<li>Utrzymać stałe stężenie dimetylosulfotlenku (DMSO) we wszystkich próbkach, przygotowując wstępne rozcieńczenie związku w DMSO przed dalszym rozcieńczaniem do buforu do oznaczania.</li>
		<li>Aby uzyskać odpowiedź na dawkę związku w końcowym teście w zakresie od 3 do 30 μM, należy przygotować wstępne rozcieńczenie związku w DMSO w zakresie od 1 do 10 mM. Rozcieńczyć te w buforze testowym do 4-krotnego stężenia zapasu. Końcowe stężenie DMSO nie powinno przekraczać 0,5%. 
		UWAGA: Zaleca się badanie każdej próbki w trzech egzemplarzach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Załaduj ligand, związek i płytkę komórkową do FDSS.</li>
	<li>Mierz fluorescencję podstawową przez 30 sekund.</li>
	<li>Dodać 10 μl bulionu wieloskładnikowego i mierzyć fluorescencję przez 5 minut.</li>
	<li>Dodać 10 μl wywaru ligandowego i mierzyć fluorescencję przez 5 minut.</li>
	<li>Określ całkę współczynnika fluorescencji, obliczając pole pod krzywą współczynników fluorescencji w ciągu ostatnich 5 minut pomiaru. 
	UWAGA: Alternatywnie do analizy można użyć maksymalnego stosunku fluorescencji po dodaniu liganda.</li>
</ol>

<ol><li>Farrall, A. J., Wardlaw, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier%3A+ageing+and+microvascular+disease--systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Aging%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier: ageing and microvascular disease--systematic review and meta-analysis.</a> Neurobiology of Aging. 30 (3), 337-352 (2009).</li>
<li>Walhovd, K. B., Fjell, A. M., Espeseth, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cognitive+decline+and+brain+pathology+in+aging--need+for+a+dimensional%2C+lifespan+and+systems+vulnerability+view%5BTitle%5D)+AND+%22Scandinavian+Journal+of+Psychology%22%5BJournal%5D)">Cognitive decline and brain pathology in aging--need for a dimensional, lifespan and systems vulnerability view.</a> Scandinavian Journal of Psychology. 55 (3), 244-254 (2014).</li>
<li>Wittchen, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+size+and+burden+of+mental+disorders+and+other+disorders+of+the+brain+in+Europe+2010%5BTitle%5D)+AND+%22European+Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">The size and burden of mental disorders and other disorders of the brain in Europe 2010.</a> European Neuropsychopharmacology. 21 (9), 655-679 (2011).</li>
<li>Traynelis, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+receptor+ion+channels%3A+structure%2C+regulation%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Glutamate receptor ion channels: structure, regulation, and function.</a> Pharmacological Reviews. 62 (3), 405-496 (2010).</li>
<li>Mony, L., Kew, J. N., Gunthorpe, M. J., Paoletti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+modulators+of+NR2B-containing+NMDA+receptors%3A+molecular+mechanisms+and+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Allosteric modulators of NR2B-containing NMDA receptors: molecular mechanisms and therapeutic potential.</a> British Journal of Pharmacology. 157 (8), 1301-1317 (2009).</li>
<li>Lau, C. G., Zukin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptor+trafficking+in+synaptic+plasticity+and+neuropsychiatric+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">NMDA receptor trafficking in synaptic plasticity and neuropsychiatric disorders.</a> Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 413-426 (2007).</li>
<li>Zhou, Q., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptors+in+nervous+system+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">NMDA receptors in nervous system diseases.</a> Neuropharmacology. 74, 69-75 (2013).</li>
<li>Paoletti, P., Bellone, C., Zhou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptor+subunit+diversity%3A+impact+on+receptor+properties%2C+synaptic+plasticity+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">NMDA receptor subunit diversity: impact on receptor properties, synaptic plasticity and disease.</a> Nature Reviews Neuroscience. 14, 383(2013).</li>
<li>Sanz-Clemente, A., Nicoll, R. A., Roche, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+in+NMDA+receptor+composition%3A+many+regulators%2C+many+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscientist%22%5BJournal%5D)">Diversity in NMDA receptor composition: many regulators, many consequences.</a> Neuroscientist. 19 (1), 62-75 (2013).</li>
<li>Neyton, J., Paoletti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relating+NMDA+receptor+function+to+receptor+subunit+composition%3A+limitations+of+the+pharmacological+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Relating NMDA receptor function to receptor subunit composition: limitations of the pharmacological approach.</a> Journal of Neuroscience. 26 (5), 1331-1333 (2006).</li>
<li>Hunt, D. L., Castillo, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+plasticity+of+NMDA+receptors%3A+mechanisms+and+functional+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Synaptic plasticity of NMDA receptors: mechanisms and functional implications.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 496-508 (2012).</li>
<li>Huganir, R. L., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPARs+and+synaptic+plasticity%3A+the+last+25+years%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">AMPARs and synaptic plasticity: the last 25 years.</a> Neuron. 80 (3), 704-717 (2013).</li>
<li>Shimomura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycine+plays+a+crucial+role+as+a+co-agonist+of+NMDA+receptors+in+the+neuronal+circuit+generating+body+movements+in+rat+fetuses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Glycine plays a crucial role as a co-agonist of NMDA receptors in the neuronal circuit generating body movements in rat fetuses.</a> Neuroscience Research. 97, 13-19 (2015).</li>
<li>Tajima, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+NMDA+receptors+and+the+mechanism+of+inhibition+by+ifenprodil%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Activation of NMDA receptors and the mechanism of inhibition by ifenprodil.</a> Nature. 534 (7605), 63-68 (2016).</li>
<li>Mayer, M. L., Westbrook, G. L., Guthrie, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-dependent+block+by+Mg2%2B+of+NMDA+responses+in+spinal+cord+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Voltage-dependent block by Mg2+ of NMDA responses in spinal cord neurones.</a> Nature. 309 (5965), 261-263 (1984).</li>
<li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+NMDA+Receptor+Inhibition+and+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanism of NMDA Receptor Inhibition and Activation.</a> Cell. 165 (3), 704-714 (2016).</li>
<li>Yildiz-Unal, A., Korulu, S., Karabay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+strategies+against+calpain-mediated+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychiatric+Disease+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective strategies against calpain-mediated neurodegeneration.</a> Neuropsychiatric Disease and Treatment. 11, 297-310 (2015).</li>
<li>Gascon, S., Sobrado, M., Roda, J. M., Rodriguez-Pena, A., Diaz-Guerra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitotoxicity+and+focal+cerebral+ischemia+induce+truncation+of+the+NR2A+and+NR2B+subunits+of+the+NMDA+receptor+and+cleavage+of+the+scaffolding+protein+PSD-95%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Excitotoxicity and focal cerebral ischemia induce truncation of the NR2A and NR2B subunits of the NMDA receptor and cleavage of the scaffolding protein PSD-95.</a> Molecular Psychiatry. 13 (1), 99-114 (2008).</li>
<li>Uttara, B., Singh, A. V., Zamboni, P., Mahajan, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+and+neurodegenerative+diseases%3A+a+review+of+upstream+and+downstream+antioxidant+therapeutic+options%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress and neurodegenerative diseases: a review of upstream and downstream antioxidant therapeutic options.</a> Current Neuropharmacology. 7 (1), 65-74 (2009).</li>
<li>Hansen, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementation+of+a+fluorescence-based+screening+assay+identifies+histamine+H3+receptor+antagonists+clobenpropit+and+iodophenpropit+as+subunit-selective+N-methyl-D-aspartate+receptor+antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Implementation of a fluorescence-based screening assay identifies histamine H3 receptor antagonists clobenpropit and iodophenpropit as subunit-selective N-methyl-D-aspartate receptor antagonists.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 333 (3), 650-662 (2010).</li>
<li>Bettini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+novel+NMDA+receptor+antagonists+selective+for+NR2A-+over+NR2B-containing+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of novel NMDA receptor antagonists selective for NR2A- over NR2B-containing receptors.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 335 (3), 636-644 (2010).</li>
<li>Feuerbach, D., Loetscher, E., Neurdin, S., Koller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+pharmacology+of+the+human+NMDA-receptor+subtypes+R1-2A%2C+R1-2B%2C+R1-2C+and+R1-2D+using+an+inducible+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Comparative pharmacology of the human NMDA-receptor subtypes R1-2A, R1-2B, R1-2C and R1-2D using an inducible expression system.</a> European Journal of Pharmacology. 637 (1-3), 46-54 (2010).</li>
<li>Hansen, K. B., Brauner-Osborne, H., Egebjerg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+characterization+of+ligands+at+recombinant+NMDA+receptor+subtypes+by+electrophysiological+recordings+and+intracellular+calcium+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Combinatorial+Chemistry+and+High+Throughput+Screening%22%5BJournal%5D)">Pharmacological characterization of ligands at recombinant NMDA receptor subtypes by electrophysiological recordings and intracellular calcium measurements.</a> Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening. 11 (4), 304-315 (2008).</li>
<li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+NMDA-receptor+calcium+influx+assay+sensitive+to+stimulation+by+glutamate+and+glycine%2FD-serine%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A NMDA-receptor calcium influx assay sensitive to stimulation by glutamate and glycine/D-serine.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11608(2017).</li>
<li>Hackos, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+Allosteric+Modulators+of+GluN2A-Containing+NMDARs+with+Distinct+Modes+of+Action+and+Impacts+on+Circuit+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Positive Allosteric Modulators of GluN2A-Containing NMDARs with Distinct Modes of Action and Impacts on Circuit Function.</a> Neuron. 89 (5), 983-999 (2016).</li>
<li>Romero-Hernandez, A., Furukawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Mode+of+Antagonist+Binding+in+NMDA+Receptors+Revealed+by+the+Crystal+Structure+of+the+GluN1-GluN2A+Ligand-Binding+Domain+Complexed+to+NVP-AAM077%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Novel Mode of Antagonist Binding in NMDA Receptors Revealed by the Crystal Structure of the GluN1-GluN2A Ligand-Binding Domain Complexed to NVP-AAM077.</a> Molecular Pharmacology. 92 (1), 22-29 (2017).</li>
<li>Auberson, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Phosphonomethylquinoxalinediones+as+competitive+NMDA+receptor+antagonists+with+a+preference+for+the+human+1A%2F2A%2C+rather+than+1A%2F2B+receptor+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+and+Medicinal+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">5-Phosphonomethylquinoxalinediones as competitive NMDA receptor antagonists with a preference for the human 1A/2A, rather than 1A/2B receptor composition.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 12 (7), 1099-1102 (2002).</li>
<li>Danysz, W., Parsons, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycine+and+N-methyl-D-aspartate+receptors%3A+physiological+significance+and+possible+therapeutic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Glycine and N-methyl-D-aspartate receptors: physiological significance and possible therapeutic applications.</a> Pharmacological Reviews. 50 (4), 597-664 (1998).</li>
<li>Liu, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topoisomerase+II+Inhibitors+Can+Enhance+Baculovirus-Mediated+Gene+Expression+in+Mammalian+Cells+through+the+DNA+Damage+Response%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Science%22%5BJournal%5D)">Topoisomerase II Inhibitors Can Enhance Baculovirus-Mediated Gene Expression in Mammalian Cells through the DNA Damage Response.</a> International Journal of Molecular Science. 17 (6), (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konfliktu interesów i nie mają nic do ujawnienia.

Powodzenie tego testu zależy w dużej mierze od stanu zdrowia użytych komórek HEK. Należy stosować komórki ulegające wzrostowi wykładniczemu i o niskiej liczbie pasażów. Test ten obejmuje wiele transferów i dodawania roztworów, więc zachowanie ostrożności zapewni większą dokładność jego wyników. Stężenia związków i wszystkich innych odczynników powinny być również sprawdzane krzyżowo w celu zminimalizowania błędów. Podczas zastępowania pożywki komórkowej buforem testowym do badania strumienia wapnia, płytkę należy delikat...

Dzięki obecnym postępom w medycynie, oczekiwana długość życia znacznie wzrosła; jednak rozpowszechnienie chorób związanych z wiekiem również wzrosło. Choroby ośrodkowego układu nerwowego (OUN), takie jak schizofrenia, stwardnienie zanikowe boczne (ALS), choroba Alzheimera i choroba Parkinsona, między innymi, nie są wyjątkiem i przewiduje się, że ich liczba wzrośnie w ciągu następnej dekady1,2,3. Nieprawidłowe działanie jonotropowych receptorów glutaminianu znanych jako receptory N-metylo-D-asparaginianu (NMDAR) zostało powiązane między innymi z chorobą Alzheimera, schizofrenią, urazowym uszkodzeniem mózgu, udarem, cukrzycą i jaskrą, co uzasadnia potrzebę zbadania ich biologii w celu opracowania skutecznych, modyfikujących chorobę terapii4,5,6,7.
NMDARs składają się z czterech monomerów lub podjednostek4,8,9. Skład strukturalny NMDAR pokazuje zmienność rozwojową i regionalną w obrębie mózgu7,10. NMDAR są zaangażowane w plastyczność synaptyczną, funkcje poznawcze i generowanie rytmów oddychania i lokomocji11,12,13. Jako kanał bramkowany napięciem jest w dużej mierze nieprzewodzący przy spoczynkowym potencjale błonowym (-70 mV) i jest blokowany przez magnez, aby zapobiec dalszemu przenikaniu jonów. Kanał jest aktywowany przez wiązanie dwóch ligandów, glutaminianu i glicyny/D-seryny, oraz jednoczesną depolaryzację błony synaptycznej za pośrednictwem receptorów AMPA, innej podklasy jonotropowych receptorów glutaminianu. Depolaryzacja usuwa blokadę magnezu NMDAR, umożliwiając napływ kationów, w szczególności wapnia14,15,16. Mimo że aktywacja NMDAR jest niezbędna do przeżycia komórki, nadmierna aktywacja może prowadzić do śmierci komórki17,18,19 poprzez ekscytotoksyczność. To, w połączeniu ze złożonym charakterem receptora, sprawia, że trudno jest przeprowadzić badania niezbędne do opracowania skutecznych terapii.
Do badania NMDAR opracowano różne metody. Jednak każdy z nich ma towarzyszące zastrzeżenia. Na przykład jedną z szeroko stosowanych technik jest test oparty na fluorescencji, który mierzy zmiany wewnątrzkomórkowe wapnia za pośrednictwem NMDAR w stabilnej linii komórkowej pod kontrolą promotora indukowanego tetracykliną (Tet-On)20. Jednak w tym systemie supramaksymalne stężenia ligandów, które są potrzebne, oraz wymóg, aby inhibitory NMDAR były obecne podczas pomiaru, sprawiają, że prawie niemożliwe jest wykrycie aktywności konkurencyjnego antagonisty. W innych podobnych systemach ekspresja funkcjonalnego receptora powoduje toksyczność, wymagającą blokerów kanałów, takich jak ketamina21,22 w celu zachowania kultur komórkowych. Te blokery kanałów znajdują się w rdzeniu receptora i są trudne do wypłukania, zwłaszcza w formacie na płytce, więc zakłócają badania funkcjonalne receptora. Wreszcie, w pomiarach elektrofizjologicznych, takich jak zaciskanie łat, przepustowość jest ograniczona, a badania na dużą skalę są bardzo drogie23. Niezależnie od tego, powyższe systemy są niewrażliwe na stymulację glicyną; w związku z tym badanie zależnej od glicyny aktywności NMDAR staje się wyzwaniem.
Tutaj opisujemy nowatorskie podejście do badania NMDAR, które przezwycięża omawiane ograniczenia. Nasza technika wykorzystuje system ekspresji bakulowirusa do ekspresji receptora na poziomie funkcjonalnym z optymalnym stosunkiem podjednostek w ciągu zaledwie 16 godzin. Co więcej, zastosowanie bakulowirusa pozwala na proste i kombinatoryczne podejście, które zapewnia szeroką charakterystykę odrębnych rekombinowanych podtypów NMDAR. W przeciwieństwie do innych testów, ten protokół nie wymaga blokerów kanałów ze względu na zastosowanie słabych antagonistów. Największą zaletą metody jest to, że po wypłukaniu słabego antagonisty receptor jest wrażliwy na modulację poszczególnych miejsc wiązania glicyny i glutaminianu, a także na podwójną modulację miejsc wiązania ligandów glicyna/D-seryna i glutaminianu. Test podsumowuje znaną farmakologię receptora NMDAR oraz działanie jego znanych pozytywnych i negatywnych modulatorów. Wreszcie, opracowanie tego testu komórkowego in vitro przezwycięża toksyczność komórkową spowodowaną nadmiernym napływem wapnia i pozwala na badania funkcjonalne receptora w sposób wysokoprzepustowy, co może przyspieszyć odkrycia modulatorów NMDAR w stanach chorobowych.

<table><tbody><tr><td>HEK-293</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>Ludzka linia komórkowa receptora NMDA (NR1 / NR2A)</td><td>ChanTest Corporation</td><td>CT6120</td><td></td></tr><tr><td>pFastBac Wektor podwójnej ekspresji</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10712-024</td><td></td></tr><tr><td>Corning 384-well Przezroczysta mikropłytka z płaskim dnem</td><td>Corning Life Sciences</td><td>3844</td><td></td></tr><tr><td>FLIPR Zestaw do oznaczania wapnia 6-QF</td><td>molekularny Urządzenia</td><td>R8192</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>Glutaminian</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49621</td><td></td></tr><tr><td>D-seryna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4250</td><td></td></tr><tr><td>L701,324</td><td>Tocris</td><td>907</td><td></td></tr><tr><td>Bufor HEPES</td><td>Boston Bio Produkt</td><td>BB-103</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór chlorku magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63069</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>VWR</td><td>E506</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>Probenecyd</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P36400</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, GlutaMAX media</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10565018</td><td></td></tr><tr><td>MDL105,519</td><td>NIBR</td><td>Syntetyzowany we własnym zakresie</td><td></td></tr><tr><td>NVP-AAM077</td><td>NIBR</td><td>Syntetyzowany we własnym zakresie</td><td></td></tr><tr><td>CGP070667</td><td>NIBR</td><td>Syntetyzowany w domu</td><td></td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowy test strumienia wapnia do badania receptorów nmda z wrażliwością na glicynę/d-serynę i glutaminian

A High-throughput Calcium-flux Assay to Study NMDA-receptors with Sensitivity to Glycine/D-serine and Glutamate

Receptory N-metylo-D-asparaginianu (NMDA) (NMDAR) są klasyfikowane jako jonotropowe receptory glutaminianu i odgrywają kluczową rolę w uczeniu się i zapamiętywaniu. Nieprawidłowe działanie NMDAR, wyrażone jako nadmierna lub niedostateczna aktywność spowodowana mutacjami, zmienioną ekspresją, transportem lub lokalizacją, może przyczyniać się do wielu chorób, zwłaszcza w ośrodkowym układzie nerwowym. Dlatego zrozumienie biologii receptora, a także ułatwienie odkrywania związków i małych cząsteczek ma kluczowe znaczenie w trwających wysiłkach na rzecz zwalczania chorób neurologicznych. Obecne podejścia do badania receptora mają ograniczenia, w tym niską przepustowość, wysokie koszty i niemożność zbadania jego zdolności funkcjonalnych ze względu na konieczną obecność blokerów kanałów, aby zapobiec ekscytotoksyczności za pośrednictwem NMDAR. Ponadto istniejące systemy testowe są wrażliwe na stymulację tylko glutaminianem i nie mają wrażliwości na stymulację przez glicynę, drugi koligand NMDAR. Tutaj przedstawiamy pierwszy test na płytce o wysokiej przepustowości do badania receptora NMDA z wrażliwością na oba koligandy, glutaminian i D-serynę/glicynę. Takie podejście pozwala na badanie różnych składów podjednostek NMDAR i umożliwia badania funkcjonalne receptora w trybach wrażliwych na glicynę i/lub glutaminian. Dodatkowo metoda nie wymaga obecności inhibitorów podczas pomiarów. Za pomocą tego testu można wykryć działanie dodatnich i ujemnych modulatorów allosterycznych, a znana farmakologia NMDAR została odtworzona w naszym systemie. Technika ta pokonuje ograniczenia istniejących metod i jest opłacalna. Wierzymy, że ta nowatorska technika przyspieszy odkrycie terapii patologii zależnych od NMDAR.

Przed badaniem efektów działania małych cząsteczek należy określić optymalne poziomy ekspresji NMDAR oraz optymalne stężenia ligandów. Zgodnie z opisem, komórki HEK293 wysiano w gęstości 10 0 komórek na dołek na płytce 384-dołkowej w obecności 5 µM CGP06067, a następnie poddano transdukcji za pomocą zmiennych ilości wirusów NR1 i NR2A. Po inkubacji przez noc zmierzono indukowany ligandem przepływ jonów wapnia (Rysunek 1). Wyniki tych eksperymentów wskazują na...

Celem tego protokołu jest ułatwienie badania receptorów NMDA (NMDAR) na większą skalę i umożliwienie badania modulacyjnych efektów małych cząsteczek i ich zastosowań terapeutycznych.

Wysokoprzepustowy test strumienia wapnia do badania receptorów NMDA z wrażliwością na glicynę/D-serynę i glutaminian

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR ...

Metoda ta może pomóc w odkryciu modulatorów NMDA w leczeniu chorób neurologicznych. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona badanie aktywności receptora NMDA w przetoce, w odpowiedzi na stężenia obronne lub kombinacje ligandów w związkach. Tak więc ta metoda może zapewnić wgląd w ogólne możliwości receptora NMDA.Może być również stosowany do badania podtypów specyficznych w biologii i wrażliwości receptora NMDA, w odpowiedzi na ligandy lub związki. Aby zmierzyć aktywność receptora NMDA, przygotuj płytkę 384-dołkową z komórkami HEK 293, transdukowanymi komórkami NR1, NR2 lub HEK 293, NR1, NR2A w obecności związku ochronnego. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięciu procent dwutlenku węgla przez 16 godzin.Następnego dnia wyjmij płytkę z inkubatora i delikatnie wyrzuć pożywkę komórkową, powoli obracając płytkę nad kompatybilnym pojemnikiem na bioodpady. Delikatnie postukaj talerzem o ręcznik papierowy, aby oczyścić go z krawędzi talerza, a następnie odcedź pozostałe media. Następnie należy przygotować barwnik wapnia 6, rozpuszczając jedną fiolkę barwnika wapnia 6 w 10 mililitrach buforu do inkubacji.Dodaj 30 mikrolitrów barwnika do komórek w pł

a-high-throughput-calcium-flux-assay-to-study-nmda-receptors-with

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Niniejszy materiał wideo przedstawia szczegółowy protokół badania profilu farmakologicznego ludzkich kanałów TRPA1 przy użyciu systemu FlexStation 3. Protokół obejmuje szczegóły dotyczące przygotowania komórek, ładowania barwnika oraz obsługi czytnika mikropłytek FlexStation 3.

Komórkowy test wapniowy do przesiewowej analizy funkcji kanałów TRP o średniej i wysokiej przepustowości z wykorzystaniem systemu FlexStation 3

Tutaj opisujemy adaptację protokołów używanych do indukowania plastyczności homeostatycznej w neuronach do badania plastyczności receptorów sprzężonych z białkiem G astrocytów. Metoda ta, ostatnio wykorzystana do badania zmian w mGluR grupy astrocytarnej I u młodych myszy, może być stosowana do pomiaru skalowania różnych astrocytarnych GPCR w tkance dorosłych myszy in situ i in vivo oraz do lepszego zrozumienia wrażliwości receptorów astrocytarnych na zmiany aktywności neuronalnej.

Indukowanie plastyczności receptorów astrocytarnych poprzez manipulację szybkością odpalania neuronów

Tutaj opisano procedurę uzyskiwania długich odcinków zapisu prądu z jednego kanału jonowego za pomocą techniki patch-clamp dołączonej do komórki. Metoda ta pozwala na obserwację w czasie rzeczywistym wzorca konformacji kanałów otwórz-zamknij, które leżą u podstaw sygnału biologicznego. Dane te informują o właściwościach kanałów w niezakłóconych błonach biologicznych.

Jednokanałowe nagrywanie z zaciskiem krosowym dołączonym do komórki

Opisujemy połączenie ogniskowej fotoaktywacji związków neuroaktywnych wywołanej promieniowaniem UV z całokomórkowym patch-clampem i wielofotonowym obrazowaniem wewnątrzkomórkowych tranustów sodu w dendrytach i kolcach neuronów hipokampa w ostrych wycinkach tkanki mózgu myszy.

Wielofotonowe wewnątrzkomórkowe obrazowanie sodu w połączeniu z ogniskowym rozpakowywaniem glutaminianu za pośrednictwem promieniowania UV w neuronach piramidowych CA1

Tutaj opisujemy konfigurację, nawigację po oprogramowaniu i analizę danych dla przestrzennie i czasowo precyzyjnej metody pomiaru tonicznych i fazowych zmian zewnątrzkomórkowego glutaminianu in vivo za pomocą układów mikroelektrod połączonych enzymami (MEA).

Wykorzystanie bioczujników opartych na enzymach do pomiaru toniku i glutaminianu fazowego w mysich modelach choroby Alzheimera

Pobudliwość neuronów może być modulowana poprzez dynamiczny proces endo- i egzocytozy pobudzających jonotropowych receptorów glutaminianu. Opisany tutaj jest dostępny test o wysokiej zawartości do ilościowego określania puli populacji receptorów powierzchniowych i wewnętrznych.

Test o wysokiej zawartości do monitorowania transportu receptora AMPA

Przedstawiamy protokół do oceny równowagi między uwalnianiem glutaminianu a klirensem w pojedynczych synapsach glutaminergicznym korowo-prążkowych w ostrych wycinkach od dorosłych myszy. Protokół ten wykorzystuje czujnik fluorescencyjny iGluu do wykrywania glutaminianu, kamerę sCMOS do akwizycji sygnału oraz urządzenie do ogniskowego oświetlenia laserowego.

Wskaźniki uwalniania i wychwytu glutaminianu w pojedynczych synapsach w ostrych wycinkach mózgu od myszy normalnych i myszy z chorobą Huntingtona

Tutaj prezentujemy protokół pomiaru in vitro strumieni Ca2+ w neuronach śródmózgowia i ich dalszego wpływu na kaspazę-3 za pomocą pierwotnych hodowli śródmózgowia myszy. Model ten można wykorzystać do badania zmian patofizjologicznych związanych z nieprawidłową aktywnością Ca2 + w neuronach śródmózgowia oraz do badań przesiewowych nowych terapii pod kątem właściwości antyapoptotycznych.

Kwantyfikacja spontanicznych strumieni Ca2+ i ich dalszych skutków w pierwotnych neuronach śródmózgowia myszy

Opisano dwie powiązane metody wizualizacji zdarzeń subkomórkowych wymaganych do transmisji synaptycznej. Protokoły te umożliwiają monitorowanie w czasie rzeczywistym dynamiki napływu presynaptycznego wapnia i fuzji błony pęcherzyków synaptycznych przy użyciu obrazowania żywych komórek neuronów hodowanych in vitro.

Fluorescencyjny pomiar funkcji synaptycznych w czasie rzeczywistym w modelach stwardnienia zanikowego bocznego

W tej pracy opisano wysokoprzepustowy, wewnątrzkomórkowy test fluorescencji wapnia dla 384-dołkowych płytek do badania bibliotek małych cząsteczek na rekombinowanych receptorach sprzężonych z białkiem G (GPCR). Cel, receptor kininowy kleszcza pomoru bydła, Rhipicephalus microplus, ulega ekspresji w komórkach CHO-K1. Ten test identyfikuje agonistów i antagonistów przy użyciu tych samych komórek w jednym teście "podwójnej addycji".

Test fluorescencji wapnia z "podwójnym dodaniem" do wysokoprzepustowych badań przesiewowych rekombinowanych receptorów sprzężonych z białkiem G

Obecne metody opisują nieratiometryczne podejście do wysokorozdzielczego, subkompartmentowego obrazowania wapnia in vivo u Caenorhabditis elegans przy użyciu łatwo dostępnych genetycznie kodowanych wskaźników wapnia.

Subkomórkowe obrazowanie neuronalnej obsługi wapnia in vivo

Poznaj wysokoprzepustowy test strumienia wapnia do badania receptorów NMDA z wrażliwością na glicynę/D-serynę i glutaminian w komórkach HEK 293. Ta metoda umożliwia analizę aktywności receptorów i poszukiwanie nowych leków na choroby neurologiczne.

Wysokoprzepustowy test strumienia wapnia do badania receptorów NMDA z wrażliwością na glicynę/D-serynę i glutaminian

Przeglądaj więcej filmów