Name: Przejściowa ekspresja w liściach Nicotiana benthamiana do produkcji triterpenów w skali preparatywnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-16T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Poznaj metodę przejściowej ekspresji w liściach Nicotiana benthamiana do produkcji triterpenów w skali preparatywnej. Protokół umożliwia szybkie uzyskiwanie związków o wysokiej wartości farmaceutycznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez stypendium Norwich Research Park (JR), wspólny grant OpenPlant Synthetic Biology Research Centre (BBSRC) finansowany przez Radę Badań Inżynieryjnych i Fizycznych oraz Radę ds. Badań Biotechnologicznych i Biotechnologicznych i Biologicznych (BBSRC) (BB/L014130/1) (M.J.S., A.O.); grant na wymianę wiedzy i komercjalizację w Centrum Johna Innesa (BB/KEC1740/1) (B.B.); oraz grant Instytutu BBSRC na program strategiczny "Molekuły z natury" (BB/P012523/1) oraz Fundacja Johna Innesa (A.O.). Chcielibyśmy podziękować George'owi Lomonossoffowi za dostarczenie wektorów pEAQ oraz Andrew Davisowi za zdjęcia.

<ol><li>Thimmappa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triterpene+biosynthesis+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Triterpene biosynthesis in plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 65, 225-257 (2014).</li>
<li>Seki, H., Tamura, K., Muranaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P450s+and+UGTs%3A+Key+players+in+the+structural+diversity+of+triterpenoid+saponins%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">P450s and UGTs: Key players in the structural diversity of triterpenoid saponins.</a> Plant Cell Physiology. 56 (8), 1463-1471 (2015).</li>
<li>Roy, A., Saraf, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limonoids%3A+overview+of+significant+bioactive+triterpenes+distributed+in+plants+kingdom%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+and+Pharmaceutical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Limonoids: overview of significant bioactive triterpenes distributed in plants kingdom.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 29 (2), 191-201 (2006).</li>
<li>Kamble, S. M., Goyal, S. N., Patil, C. R. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2014/ra/c4ra02784a">Multifunctional pentacyclic triterpenoids as adjuvants in cancer chemotherapy: a review.</a> RSC Advances. 4 (63), 33370-33382 (2014).</li>
<li>Liby, K. T., Sporn, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+oleanane+triterpenoids%3A+multifunctional+drugs+with+a+broad+range+of+applications+for+prevention+and+treatment+of+chronic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Synthetic oleanane triterpenoids: multifunctional drugs with a broad range of applications for prevention and treatment of chronic disease.</a> Pharmacological Reviews. 64 (4), 972-1003 (2012).</li>
<li>Yadav, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+inflammatory+pathways+by+triterpenoids+for+prevention+and+treatment+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins%22%5BJournal%5D)">Targeting inflammatory pathways by triterpenoids for prevention and treatment of cancer.</a> Toxins. 2 (10), 2428-2466 (2010).</li>
<li>Christensen, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ginsenosides+chemistry%2C+biosynthesis%2C+analysis%2C+and+potential+health+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Food+and+Nutrition+Research%22%5BJournal%5D)">Ginsenosides chemistry, biosynthesis, analysis, and potential health effects.</a> Advances in Food and Nutrition Research. 55, 1-99 (2009).</li>
<li>Reed, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+translational+synthetic+biology+platform+for+rapid+access+to+gram-scale+quantities+of+novel+drug-like+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Engineering%22%5BJournal%5D)">A translational synthetic biology platform for rapid access to gram-scale quantities of novel drug-like molecules.</a> Metabolic Engineering. 42, 185-193 (2017).</li>
<li>Andersen-Ranberg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+landscape+of+diterpene+structural+diversity+through+stereochemically+controlled+combinatorial+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Expanding the landscape of diterpene structural diversity through stereochemically controlled combinatorial biosynthesis.</a> Angewandte Chemie International Edition. 55 (6), 2142-2146 (2016).</li>
<li>Peyret, H., Lomonossoff, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pEAQ+vector+series%3A+the+easy+and+quick+way+to+produce+recombinant+proteins+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The pEAQ vector series: the easy and quick way to produce recombinant proteins in plants.</a> Plant Molecular Biology. 83, 51-58 (2013).</li>
<li>Sainsbury, F., Thuenemann, E. C., Lomonossoff, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pEAQ%3A+versatile+expression+vectors+for+easy+and+quick+transient+expression+of+heterologous+proteins+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">pEAQ: versatile expression vectors for easy and quick transient expression of heterologous proteins in plants.</a> Plant Biotechnology Journal. 7 (7), 682-693 (2009).</li>
<li>Sainsbury, F., Lomonossoff, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extremely+high-level+and+rapid+transient+protein+production+in+plants+without+the+use+of+viral+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Extremely high-level and rapid transient protein production in plants without the use of viral replication.</a> Plant Physiology. 148 (3), 1212-1218 (2008).</li>
<li>Voinnet, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enhanced+transient+expression+system+in+plants+based+on+suppression+of+gene+silencing+by+the+p19+protein+of+tomato+bushy+stunt+virus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus.</a> The Plant Journal. 33 (5), 949-956 (2003).</li>
<li>Holtz, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commercial-scale+biotherapeutics+manufacturing+facility+for+plant-made+pharmaceuticals%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Commercial-scale biotherapeutics manufacturing facility for plant-made pharmaceuticals.</a> Plant Biotechnology Journal. 13 (8), 1180-1190 (2015).</li>
<li>Bucar, F., Wubea, A., Schmidb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+product+isolation+-+how+to+get+from+biological+material+to+pure+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Natural+Product+Reports%22%5BJournal%5D)">Natural product isolation - how to get from biological material to pure compounds.</a> Natural Product Reports. 30, 525-545 (2003).</li>
<li>Kaufmann, B., Christen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+extraction+techniques+for+natural+products%3A+microwave-assisted+extraction+and+pressurised+solvent+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemical+Analysis%22%5BJournal%5D)">Recent extraction techniques for natural products: microwave-assisted extraction and pressurised solvent extraction.</a> Phytochemical Analysis. 13 (2), 105-113 (2002).</li>
<li>Larsen, E., Christensen, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+saponification+method+for+the+quantitative+determination+of+carotenoids+in+green+vegetables%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Archaeological+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Simple saponification method for the quantitative determination of carotenoids in green vegetables.</a> Journal of Archaeological and Food Chemistry. 53 (17), 6598-6602 (2005).</li>
<li>Sainsbury, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+a+virus-derived+system+to+manipulate+plant+natural+product+biosynthetic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Using a virus-derived system to manipulate plant natural product biosynthetic pathways.</a> Methods Enzymology. , 185-202 (2012).</li>
<li>Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Cloning+using+in+vitro+site-specific+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">DNA Cloning using in vitro site-specific recombination.</a> Genome Research. 10, 1788-1795 (2000).</li>
<li>Ting, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNARE-RNAi+results+in+higher+terpene+emission+from+ectopically+expressed+caryophyllene+synthase+in+Nicotiana+benthamiana%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">SNARE-RNAi results in higher terpene emission from ectopically expressed caryophyllene synthase in Nicotiana benthamiana.</a> Molecular Plant. 8, 454-466 (2015).</li>
<li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+production+of+artemisininin+in+Nicotiana+benthamiana+is+boosted+by+a+specific+lipid+transfer+protein+from+A.+annua%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Engineering%22%5BJournal%5D)">Transient production of artemisininin in Nicotiana benthamiana is boosted by a specific lipid transfer protein from A. annua.</a> Metabolic Engineering. 38, 159-169 (2016).</li>
<li>Nielsen, A. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redirecting+photosynthetic+reducing+power+toward+bioactive+natural+product+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Redirecting photosynthetic reducing power toward bioactive natural product synthesis.</a> ACS Synthetic Biology. 2, 308-315 (2013).</li>
<li>Dong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoterpene+biosynthesis+potential+of+plant+subcellular+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Monoterpene biosynthesis potential of plant subcellular compartments.</a> New Phytologist. 209, 679-690 (2016).</li>
<li>Ferrero, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+and+morphogenesis+of+the+endoplasmic+reticulum+driven+by+the+membrane+domain+of+3-hydroxy-3-methylglutaryl+Coenzyme+A+reductase+in+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Proliferation and morphogenesis of the endoplasmic reticulum driven by the membrane domain of 3-hydroxy-3-methylglutaryl Coenzyme A reductase in plant cells.</a> Plant Physiology. 168, 899-914 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wysokoprzepustowa infiltracja próżniowa pozwala na rutynowe stosowanie tego protokołu w naszym laboratorium do preparatywnej produkcji związków triterpenowych o znaczeniu dla różnych zastosowań końcowych. Opisywany tutaj aparat infiltracji próżniowej jest łatwy do odtworzenia. Dodanie zbiornika próżniowego jest wskazane w celu skrócenia czasu potrzebnego do wytworzenia niezbędnej próżni, jednak możliwe jest po prostu ponowne wykorzystanie niezmodyfikowanego pieca próżniowego jako komory infiltracyjnej. Ochrona pompy próżniowej poprzez dodanie odpowiedniego skraplacza jest teoretycznie sensowna, ale w naszym laboratorium stwierdziliśmy, że nie jest to konieczne.
Pokrycie infiltracji jest zagrożone, jeśli liście nie są całkowicie zanurzone w zawiesinie infiltracyjnej. Problem ten jest minimalizowany poprzez zapewnienie, że poziom zawiesiny sięga górnej powierzchni uchwytu na rośliny i że uchwyt na rośliny jest ściśle dopasowany do kąpieli infiltracyjnej. Należy zauważyć na rysunku 2 , że górna powierzchnia uchwytu na rośliny jest wpuszczona w kąpiel infiltracyjną, gdy jest na miejscu. Osiąga się to za pomocą paneli na środkowych krawędziach uchwytu, które tworzą punkt kotwiczenia z górną częścią wanny rozsączającej. Zawieszenie infiltracji będzie wymagało okresowych uzupełnień w celu utrzymania poziomu zawieszenia. Najlepiej osiągnąć to poprzez dodanie nadmiaru zawiesiny infiltracji, aby zapobiec stopniowej redukcji OD600 w trakcie infiltracji dużej partii. Jednak w naszych rękach zastąpienie wody nie wydaje się mieć zauważalnego wpływu na oczekiwane plony w skali preparatywnej, chociaż nie zostało to zbadane ilościowo. To, ile roślin może zostać zinfiltrowanych z jednej partii zawiesiny infiltracji, jest nadal kwestią otwartą. Rutynowo infiltrujemy od 100 do 200 roślin za pomocą jednej partii zawiesiny infiltracyjnej. Ponadto normalne jest, że część gleby wypłukuje się do zawiesiny infiltracji w trakcie procesu infiltracji. Nie stwierdzono, aby miało to zauważalny wpływ na skuteczność infiltracji.
Podczas zbiorów wskazane jest (ale nie krytyczne) zbieranie tylko liści, które zostały naciekane (niektóre liście wyrosną po infiltracji). Selektywny zbiór zapobiega rozcieńczaniu nieproduktywną tkanką, która w przeciwnym razie zwiększyłaby stosunek endogennych zanieczyszczeń w stosunku do interesującego związku. Ma to nominalny wpływ na łatwość dalszego oczyszczania i zwiększa skalę tych procesów. Podczas stosowania tHMGR w celu zwiększenia podaży prekursorów, często obserwuje się nekrozowany fenotyp, który rozwija się w okresie wzrostu po infiltracji. Jest to normalne i faktycznie wspomaga selektywne zbiory i dalszy proces suszenia. Wysuszony proszek z liści można zwykle przechowywać w szczelnie zamkniętym pojemniku w chłodnym, suchym, ciemnym miejscu, ale najlepiej w eksykatorze pod próżnią. Zależy to od stabilności związku zainteresowanego. Zachowaj ostrożność, jeśli zdecydujesz się na przechowywanie w zamrażarce w temperaturze -80 °C. Upewnij się, że suszone liście znajdują się w wodoodpornym pojemniku, a po wyjęciu z magazynu, przed otwarciem pozwól mu ogrzać się do temperatury pokojowej. Niezastosowanie się do tego spowoduje ponowne zwilżenie liści, co utrudni dalszą obróbkę.
Kroki po zbiorach w tym protokole są przedstawione w celach ilustracyjnych i aby pomóc tym badaczom, którzy mogą mieć ograniczone doświadczenie w chemii praktycznej. Można je zastąpić wieloma innymi technikami ekstrakcji/oczyszczania produktów naturalnych. Jak wskazano we wprowadzeniu, PSE mają wiele zalet, jednak koszt inwestycyjny komercyjnie dostępnej aparatury PSE może być zaporowy i nie jest niezbędny. Podstawowa obróbka żywicą jonowymienną jest bardzo wygodną metodą zastępującą tradycyjne zmydlanie, po którym następuje podział ciecz/ciecz. Nie nadaje się jednak do produktów zawierających grupy kwasów karboksylowych lub grupy funkcyjne, które uległyby hydrolizie w warunkach zasadowych, takich jak estry. Oczekuje się, że produkty te zostaną zatrzymane na zasadowej żywicy jonowymiennej. Istnieje jednak możliwość wykorzystania tego do procedury przechwytywania i uwalniania (nie udokumentowanej tutaj). Tam, gdzie tradycyjne zmydlanie byłoby odpowiednie, podstawową obróbką żywicą jonowymienną stanowi wygodną alternatywę. Stwierdzono, że metoda chromatograficzna opisana w kroku 9 jest uogólniona dla związków opisanych na rysunku 3. Jednak związki o zwiększonej polarności mogą wymagać wydłużonego okresu elucji 100% octanu etylu. W odniesieniu do kroku 9.2, dalsze dokładne oczyszczanie jest całkowicie specyficzne dla związku i zależy również od skali. Powtarzające się rundy chromatografii flash na mniejszą skalę ze zoptymalizowanymi gradientami są zwykle wystarczające do uzyskania czystości odpowiedniej do analizy NMR. Na większą skalę krystalizacja jest często wygodną alternatywą. W trudnych przypadkach można zastosować preparatywną lub półpreparatywną wysokosprawną chromatografię cieczową (HPLC) w zależności od pożądanej ilości wyizolowanego związku. Przykłady dalszych procesów oczyszczania dla szeregu reprezentatywnych związków można znaleźć w innym miejscu8.
Obecny protokół, przedstawiony tutaj, jest rutynowo stosowany w naszym laboratorium i ma udowodnioną użyteczność. Nadal jednak istnieje znaczne pole do dalszej optymalizacji platformy wyrażeń. W naszym laboratorium trwają prace mające na celu zbadanie, w jaki sposób dalsza inżynieria szlaków i różnicowa kontrola poziomów ekspresji białek mogą jeszcze bardziej poprawić produkcję triterpenów, jednocześnie pośrednicząc w toksyczności dla komórek gospodarza. Istnieje również potencjał do zbadania manipulacji wewnątrzkomórkowymi systemami transportowymi20,21 oraz kierowania enzymów do różnych przedziałów komórkowych22,23, co może poprawić wydajność wielu zdarzeń utleniania. Można również zbadać potencjalne korzyści płynące z modyfikacji podstawowej morfologii kluczowych organelli. Na przykład zaobserwowano, że nadekspresja domeny błonowej Arabidopsis thaliana HMGR indukuje przerost retikulum endoplazmatycznego u roślin24; kluczowym miejscem dla aktywności CYP450. Protokół ten idealnie nadaje się do produkcji ilości produktów triterpenowych w skali miligram do grama i może być stosowany w warunkach badawczych w celu uzyskania dostępu do związków do dalszych badań (np. systematyczne badanie zależności struktura-aktywność i wstępne badania właściwości farmakodynamicznych i farmakokinetycznych związków ołowiu o znaczeniu klinicznym). Platforma jest jednak skalowalna liniowo i niezawodnie po prostu poprzez zwiększenie liczby wykorzystywanych roślin, a praktyczność przejściowej ekspresji za pomocą agroinfiltracji została wykazana na skalę przemysłową w produkcji białek farmaceutycznych14, a zatem istnieje potencjał do rozszerzenia tej platformy na komercyjną produkcję wysokowartościowych triterpenów. Alternatywnie, możliwe jest również wyobrażenie sobie produkcji stabilnych transformantów niosących sfinalizowany pożądany wielogenowy szlak biosyntezy, co pozwoli na masową uprawę i dalsze "hodowlanie" transgenicznych szczepów N. benthamiana wytwarzających różne związki o wartości handlowej.

Triterpeny są jedną z największych i najbardziej zróżnicowanych strukturalnie rodzin naturalnych produktów roślinnych. Pomimo ich ogromnej różnorodności, uważa się, że wszystkie naturalne produkty triterpenowe pochodzą z tego samego liniowego prekursora 2,3-oksydoskwalenu, produktu szlaku mewalonianu w roślinach. Cyklizacja 2,3-oksydoskwalenu jest inicjowana i kontrolowana przez rodzinę enzymów zwanych cyklazami oksydoskwalenu (OSC). Ten etap cyklizacji reprezentuje pierwszy poziom dywersyfikacji, z setkami różnych rusztowań triterpenowych zgłoszonych przez nature1. Rusztowania te są dodatkowo zróżnicowane poprzez dostosowanie enzymów, w tym między innymi cytochromu p450 (CYP450s)1,2. Takie szlaki biosyntezy mogą prowadzić do ogromnej złożoności, czasami prowadząc do powstania produktów końcowych, które są ledwo rozpoznawalne z macierzystego triterpenu. Na przykład uważa się, że złożona struktura silnego środka owadobójczego i przeciw paszczemu limonoidowi azadirachtyny wywodzi się z tetracyklicznego triterpenu typu tirucallane3.
Wiele naturalnych produktów pochodzących z triterpenów, nawet tych z stosunkowo niezmodyfikowanymi rusztowaniami macierzystymi, okazało się posiadać medycznie istotną aktywność biologiczną4,5,6,7. Jednak do tej pory potencjał ten nie przełożył się na mnogość leków pochodzących z triterpenów w klinice. Jest to prawdopodobnie (przynajmniej częściowo) konsekwencja ograniczonego praktycznego dostępu do syntezy tej klasy związków, problemu, który może zdławić eksplorację zależności struktura-aktywność i rozwój głównych kandydatów przez tradycyjne przepływy pracy chemii medycznej.
Przejściowa ekspresja enzymów biosyntezy triterpenów z innych gatunków roślin w liściach N. benthamiana może przekierować endogenne dostawy 2,3-oksydosqualenu w kierunku produkcji nowych produktów triterpenowych o wysokiej wartości (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Proces ten można wykorzystać do funkcjonalnego scharakteryzowania enzymów kandydujących i zrekonstruowania szlaków biosyntezy ważnych naturalnie występujących metabolitów. Równocześnie można go również wykorzystać w kombinatorycznych podejściach biosyntezy do wytwarzania nowych produktów triterpenowych, strategii, która może zaowocować bibliotekami strukturalnie powiązanych analogów, umożliwiając systematyczne badanie zależności struktura-aktywność biologicznie aktywnych związków ołowiu8,9.
Agroinfiltracja jest skutecznym i prostym sposobem na osiągnięcie przejściowej ekspresji w liściach N. benthamiana. Proces ten polega na infiltracji liści zawiesiną A. tumefaciens przenoszącą interesujący nas konstrukt (konstrukty) wyrażeń binarnych. Osiąga się to poprzez zastosowanie ciśnienia, które przetłacza ciecz przez aparaty szparkowe, wypierając powietrze w przestrzeni międzykomórkowej i zastępując je zawiesiną A. tumefaciens. Bakterie przenoszą odpowiednie T-DNA do wnętrza komórek roślinnych, co powoduje zlokalizowaną i przejściową ekspresję białka w infiltrowanej tkance liścia.
Podczas gdy dowolny wektor binarny odpowiedni do generowania roślin transgenicznych może być wykorzystany do ekspresji przejściowej, używamy systemu ekspresji białka hipertranslacyjnego (HT) pochodzącego z wirusa mozaiki cowpea (CPMV)10,11. W tym systemie interesujący gen jest otoczony przez regiony nieulegające translacji (UTR) z RNA-2 CPMV. 5' UTR zawiera modyfikacje skutkujące bardzo wysokimi poziomami translacji białek bez polegania na replikacji wirusa12. Technika ta została opracowana w serii wektorów binarnych Easy-And-Quick (pEAQ), która zawiera konstrukcje kompatybilne z protokołem klonowania rekombinacji specyficznej dla miejsca (pEAQ-HT-DEST)10,11. Większość wektorów pEAQ zawiera również krzaczasty gen tłumiący P19 pochodzący z wirusa karłowatości pomidorów13 w części T-DNA kasety ekspresji, co omija potrzebę jednoczesnej filtracji oddzielnego szczepu przenoszącego P19 i zapewnia bardzo wysoką ekspresję białka w komórce rośliny gospodarza10,11.
Użycie N. benthamiana jako gospodarza wyrażenia ma szczególne zalety podczas pracy z roślinnymi szlakami biosyntezy. Architektura komórki wewnętrznie wspiera odpowiednie przetwarzanie mRNA i białek oraz prawidłową kompartmentalizację, a także posiada niezbędne koenzymy, reduktazy (dla CYP450) i prekursory metaboliczne. Źródłem węgla jest fotosynteza; w ten sposób rośliny można po prostu uprawiać w dobrej jakości kompoście, wymagając jedynie wody, CO2 (z powietrza) i światła słonecznego jako wkładu. Platforma jest również niezwykle wygodna do jednoczesnej ekspresji różnych kombinacji białek, ponieważ można to łatwo osiągnąć poprzez jednoczesną infiltrację różnych szczepów A. tumefaciens, negując potrzebę budowania dużych kaset ekspresji wielogenowej. Co więcej, proces ten można skalować liniowo i niezawodnie po prostu poprzez zwiększenie liczby roślin użytych w eksperymencie.
Poprzednie prace w naszym laboratorium wykazały użyteczność tej platformy do eksperymentów na skalę preparatywną. Obejmowało to przygotowanie nowych triterpenów do stosowania w testach bioaktywności i zwiększenie skali w celu uzyskania ilości gramowych wyizolowanego produktu. Co więcej, akumulacja heterogenicznych produktów triterpenowych może być kilkakrotnie zwiększona przez koekspresję N-końcowej, niewrażliwej na sprzężenie zwrotne formy reduktazy 3-hydroksy, 3-metyglutary-koenzymu A (tHMGR), enzymu ograniczającego szybkość w szlaku mewalonianu<klasa sup = "xref">8.
Kluczem do takich eksperymentów na skalę preparatywną jest możliwość wygodnego zwiększenia skali procesu infiltracji. W typowym eksperymencie do osiągnięcia docelowej ilości wyizolowanego produktu mogą być potrzebne dziesiątki do setek roślin. Ręczna infiltracja pojedynczych liści (przy użyciu niepotrzebnej strzykawki) jest wymagająca operacyjnie i często zbyt czasochłonna, co sprawia, że ta metoda jest niepraktyczna w przypadku rutynowego zwiększania skali. Infiltracja próżniowa ma przewagę nad infiltracją ręczną, ponieważ nie jest zależna od poziomu umiejętności operatora i pozwala na infiltrację większego obszaru powierzchni skrzydła. Procedura ta jest stosowana komercyjnie do produkcji białek farmaceutycznych na dużą skalę14. Protokół ten wykorzystuje łatwe do odtworzenia urządzenie do infiltracji próżniowej, które można skonstruować z dostępnych na rynku części. Pozwala to na jednoczesną infiltrację do 4 roślin, zapewniając szybką i praktyczną infiltrację partii setek roślin w krótkim czasie (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2a - 2b). Aparat do infiltracji próżniowej składa się z pieca próżniowego, który tworzy komorę infiltracyjną (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2f). Piekarnik jest podłączony do pompy za pomocą zbiornika próżniowego. To znacznie skraca czas potrzebny do osiągnięcia pożądanej próżni w komorze infiltracyjnej. Rośliny są zabezpieczane w specjalnie do tego celu uchwycie i odwracane do 10-litrowej kąpieli wodnej ze stali nierdzewnej wypełnionej zawiesiną A. tumefaciens (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2a - 2c). Całkowite zanurzenie nadziemnych części roślin jest ważne dla skutecznej infiltracji. Kąpiel wodna jest następnie umieszczana w komorze infiltracyjnej (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 2d - 2e), a podciśnienie jest stosowane w celu wyciągnięcia powietrza z przestrzeni śródmiąższowych liści. Po obniżeniu ciśnienia o 880 mbar (proces ten trwa około 1 minuty) komora infiltracyjna jest szybko przywracana do ciśnienia atmosferycznego w ciągu 20 - 30 s poprzez otwarcie zaworu wlotowego pieca, po czym infiltracja jest zakończona.
Pięć dni po infiltracji materiał roślinny jest gotowy do zbioru, a następnie ekstrakcji i izolacji pożądanego produktu(ów). Od tego momentu proces ten polega po prostu na ekstrakcji i oczyszczaniu produktu naturalnego z materiału liściowego, co jest procesem znanym każdemu chemikowi zajmującemu się produktami naturalnymi. Istnieje wiele różnych metod wstępnej ekstrakcji i późniejszego oczyszczania15. Najbardziej odpowiedni wybór metod i dokładnych zastosowanych warunków zależy w dużym stopniu od szczególnych właściwości chemicznych związku będącego przedmiotem zainteresowania, a także od dostępności umiejętności i/lub sprzętu. Nie jest możliwe włączenie do niniejszego protokołu w pełni uogólnionej, krok po kroku metody dalszego przetwarzania zebranego materiału z liści roślin na wyizolowany produkt, która mogłaby być ślepo stosowana w odniesieniu do jakiegokolwiek produktu triterpenowego będącego przedmiotem zainteresowania, ani też nie byłoby właściwe podejmowanie takich prób. Jednak protokół ten zapewni przegląd podstawowego przepływu pracy stosowanego w naszym laboratorium oraz niektórych metod na wczesnych etapach procesu, które z naszego doświadczenia okazały się możliwe do uogólnienia dla większości utlenionych produktów triterpenowych z aglikonu. Obejmuje to dwie stosunkowo rzadkie techniki, a mianowicie ekstrakcję rozpuszczalnikiem pod ciśnieniem (PSE) oraz wygodną metodę usuwania chlorofilu w fazie heterogenicznej przy użyciu silnie zasadowej żywicy jonowymiennej.
PSE to wysoce efektywna technika ekstrakcji małych cząsteczek organicznych z matryc stałych. Ekstrakcje odbywają się pod ciśnieniem (ok. 100 - 200 bar), a główną zaletą jest możliwość stosowania temperatur złagodzonych, które przekraczają temperaturę wrzenia rozpuszczalnika ekstrakcyjnego. Może to znacznie skrócić czas i ilość rozpuszczalnika wymaganego do osiągnięcia wyczerpującej ekstrakcji, w porównaniu z innymi technikami gorących rozpuszczalników, takimi jak prosty refluks lub ekstrakcja Soxhleta16. Dostępne są komercyjne stacjonarne urządzenia PSE, które wykorzystują wymienne cele ekstrakcyjne oraz zautomatyzowaną obsługę, podgrzewanie i monitorowanie rozpuszczalników. To sprawia, że ta technika jest niezwykle wygodna. Jest również prawdopodobnie mniej niebezpieczny, szczególnie dla operatorów z ograniczonym doświadczeniem w dziedzinie chemii praktycznej.
Zmydlenie surowych ekstraktów z liści pod refluksem, a następnie podział ciecz/ciecz jest powszechną techniką masowego usuwania chlorofilów przed późniejszym oczyszczaniem lub analizą. Jednak w przypadku większych skal może to być często wymagające pod względem operacyjnym. Ponadto wykrycie granicy faz lub strat produktu spowodowanych tworzeniem się emulsji może być problematyczne. Zastosowanie silnie zasadowych żywic jonowymiennych do przeprowadzenia hydrolizy fazy heterogenicznej może służyć jako wygodna alternatywa. Pigmentowana część hydrolizowanego chlorofilu pozostaje przyklejona do żywicy i może być łatwo usunięta przez filtrację. Protokół ten wykorzystuje adaptację skali preparatywnej wcześniej opisanej procedury analitycznej17, która wykorzystuje dostępną na rynku podstawową żywicę jonowymienną.
Poniżej opisujemy szczegółowy i szybki protokół do produkcji triterpenów na skalę preparatywną z wykorzystaniem tej platformy opartej na roślinach. Protokół ten jest rutynowo stosowany w naszym laboratorium do przygotowania dziesiątek do setek miligramów wyizolowanego produktu triterpenowego do zastosowań takich jak charakterystyka strukturalna za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) i/lub dalszych badań w testach funkcjonalnych.

<table><tbody><tr><td>Przyrząd GC-MS</td><td>dowolny</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Termocykler odpowiedni do przeprowadzania reakcji PCR</td><td>dowolny</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Aparatura do elektroforezy żelowej</td><td>dowolna</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Regulowane mikropipety o wydatku powietrza (Rozmiary: 1000 i mikro; L, 200 i mikro; L, 100 i mikro; L, 20 i mikro; L, 10 i mikro; L oraz 2 i mikro; L )</td><td>dowolna</td><td>nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Szeroki górny nośnik ciekłego azotu (rozmiar: 2 L)</td><td>dowolny</td> nie <td>dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka stołowa (Pojemność: 24 x 1,5/2 mL, Max. prędkość: =/> 15000 obr./min)</td><td>dowolna</td><td>nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka stołowa (Pojemność: 20 x 50 mL, Max. prędkość: =/> 4000 obr./min)</td><td>dowolna</td><td>nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Duża wirówka podłogowa (Pojemność: 4 x 1L, Max. prędkość: =/> 4000 obr./min)</td><td>dowolna</td><td>nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator stojący</td><td>dowolny</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator z wytrząsaniem (Kolba Rozmiary zacisków: 10 mL, 50 mL, 2 L)</td><td>dowolna</td><td>nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Butelki wirówkowe (1 L)</td><td>dowolna</td><td>nie dotyczy</td> Aparatura do infiltracji <td></td></tr><tr><td>próżniowej</td><td>na zamówienie</td><td>n/d</td><td></td>doniczki</tr><tr><td>9 x 9 cm</td><td>dowolna</td><td>nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Aparat do liofilizacji (=/> Pojemność skraplacza 8 litrów)</td><td>dowolna</td><td>nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Buchi SpeedExtractor 914 z komórkami ekstrakcyjnymi 120 ml (przyrząd PSE)</td><td>Buchi</td><td>SpeedExtractor E-914</td><td></td></tr><tr><td>Wyparka obrotowa</td><td>dowolna</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Kolby parownika (rozmiary: 100 mL, 500 mL, 1 L, 2 L)</td><td>dowolna</td><td>nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>butelek Duran (Rozmiary: 1 L, 10 L)</td><td>dowolna</td><td>n/ a</td><td></td></tr><tr><td>Kolby stożkowe (rozmiary 100 mL, 2 L)</td><td>dowolne</td>, <td>nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Szpatułki (różne rozmiary)</td><td>dowolne</td>, <td>nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Waga analityczna (5 cyfr)</td><td>dowolna</td><td>nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Waga (2 cyfry)</td><td>dowolna</td><td>nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Cylindry miarowe (10 mL, 100 mL, 1 L)</td><td>dowolna</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>A -80 zamrażarka</td><td>dowolna</td><td>nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Przyrząd Biotage Isolera ze stojakiem na próbki 250 ml i butelkami (automatyczny przyrząd do chromatografii błyskowej</td>, <td>Biotage</td><td>ISO-1EW</td><td></td></tr><tr><td>, Okulary ochronne,</td><td>dowolne</td>, <td>nie dotyczy</td><td></td></tr>, <tr><td>Fartuch laboratoryjny</td>, <td>dowolny</td>, <td>nie dotyczy</td><td></td></tr>, <tr><td>Autoklaw,</td><td>dowolny</td><td></td><td></td></tr> nie <tr><td>dotyczy<mocny>Materiały eksploatacyjne</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do mikropipet (rozmiary: 1000 i mikro; L, 200 i mikro; L, 100 i mikro; L, 20 i mikro; L, 10 i mikro; L oraz 2 i mikro; L )</td><td>dowolna</td><td>nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek (Rozmiar: 2 ml)</td><td>dowolna</td><td>nie</td><td></td></tr> dotyczy <tr><td>Probówki wirówkowe (Rozmiary: 15 mL, 50 ml)</td><td>dowolna</td><td>bez</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe pipety transferowe (rozmiar 2 mL)</td><td>dowolna</td><td>bez</td><td></td></tr><tr><td>Szalki Petriego (Rozmiar: 100 ml)</td><td>dowolna</td><td>nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Biotage&reg; Wkłady flash SNAP KP-SIL 100 g</td><td>Biotage</td><td>FSK0-1107-0100</td><td></td></tr><tr><td>Fiolki HPLC (1 ml), wkładki do fiolek i nakrętki</td><td>dowolne</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe fioletowe rękawiczki nitrylowe</td><td>dowolne</td><td>nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Filtr górny do E-914, celuloza</td><td>Buchi</td><td>51249</td><td></td></tr><tr><td>Filtr dolny do E-916 / 914, włókno szklane</td><td>Buchi</td><td>11055932</td><td></td></tr><tr><td><mocny> Odczynniki</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piasek kwarcowy, 0,3 - 0,9 mm</td><td>Buchi</td><td>37689</td><td></td></tr><tr><td>Celite 545 (ziemia okrzemkowa)</td><td>Simga-Alrich</td><td>22140-1KG-F</td><td></td></tr><tr><td>Żel krzemionkowy 60 (0,040 -0,0063 mm)</td><td>Merck</td><td>1,09385,5000</td><td></td></tr><tr><td>Kwas 2-(N-morfolino)-etanosulfonowy</td><td>Melford</td><td>B2002</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 </td><td>Simga-Alrich</td><td>208337-100G</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Simga-Alrich</td><td>60377-1KG</td><td></td></tr><tr><td>3' 5'-dimetoksy-4'-acetofenon (acetosyringon)</td><td>Simga-Alrich</td><td>D134406-1G</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>Alfa Aesar</td><td>J60836</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan kanamycyny</td><td>Gibco</td><td>11815-032</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycyna</td><td>Simga-Alrich</td><td>S6501-100G</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycyna</td><td>MP biomedyczne</td><td>190057</td><td></td></tr><tr><td>Żel</td> <td>Agaroza LEMelford</td><td>MB1203</td><td></td></tr><tr><td>LB bulion Millar</td><td>Simga-Alrich</td><td>L3522-250G</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Simga-Alrich</td><td>A5306-250G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Simga-Alrich</td><td>S5886-500G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Simga-Alrich</td><td>P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O</td><td>Sigma-Alrich</td><td>M2773-500G</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma-Alrich</td><td>G7021-100G</td><td></td></tr><tr><td>Ambersep&reg; &nbsp; 900 wodorotlenek (zasadowa żywica jonowymienna)</td><td>Sigma-Alrich</td><td>06476-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Hexane</td><td>Fisher</td><td>H/0406/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Octan etylu</td><td>Fisher</td><td>E/0900/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorometan</td><td>Fisher</td><td>D/1852/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher</td><td>M/4056/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Bromek etydyny</td><td>Sigma-Alrich</td><td>E7637-1G</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR</td><td>20821-330</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q</td><td>woda bez</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Levington F1 Compost</td><td>bez</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Levington F2 Compost</td><td>bez</td><td>zestawu</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Miniprep (zestaw do oczyszczania plazmidu).</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>NEB 5-alpha Kompetentny dostawca E. coli</td><td>New England Biolabs Ltd</td><td>C2987I</td><td></td></tr><tr><td>pEAQ-HT-DEST1 wektor</td><td>Laboratorium Lomonossoff John Innes Center</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>pDONR207</td><td>Thermo-Fisher</td><td>pDONR207</td><td></td></tr><tr><td>A. tumefaciens LBA4404</td><td>Thermo-Fisher</td><td>18313015</td><td></td></tr><tr><td>GATEWAY LR CLONASE(tm) II ENZYME MIX (protokół klonowania rekombinacji specyficznej dla miejsca)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>11791020</td><td></td></tr><tr><td>GATEWAY BP CLONASE (tm) II ENZYME MIX (protokół klonowania rekombinacji specyficznej dla miejsca)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>11789020</td><td></td></tr><tr><td>GO TAQ G2 GREEN MASTER MIX</td><td>Promega UK Ltd</td><td>M7822</td><td></td></tr><tr><td>PHUSION POLIMERAZA DNA O WYSOKIEJ WIERNOŚCI</td><td>New England Biolabs Ltd</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>ZESTAW dNTP 100mm</td><td>Thermo-Fisher</td><td>10297018</td><td></td></tr><tr><td>RNEASY PLANT MINI KIT</td><td>Qiagen Ltd</td><td>74904</td><td></td></tr><tr><td>RQ1 RNASE-FREE DNASE</td><td>Promega UK Ltd</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen SuperScript III System syntezy pierwszej nici</td><td>Fisher</td><td>10308632</td><td></td></tr><tr><td>Trytone</td><td>Sigma-Alrich</td><td>T7293-250G</td><td></td></tr><tr><td>Nicotiana Nasiona Benthamiany</td><td>Każdy renomowany dostawca</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr></tbody></table>

przejściowa ekspresja w liściach nicotiana benthamiana do produkcji triterpenów w skali preparatywnej

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

Triterpeny są jedną z największych i najbardziej zróżnicowanych strukturalnie rodzin naturalnych produktów roślinnych. Wykazano, że wiele pochodnych triterpenów posiada medycznie istotną aktywność biologiczną. Jednak do tej pory potencjał ten nie przełożył się na mnogość leków pochodzących z triterpenów w klinice. Jest to prawdopodobnie (przynajmniej częściowo) konsekwencja ograniczonego praktycznego dostępu do syntezy tej klasy związków, problemu, który może zdławić eksplorację zależności struktura-aktywność i rozwój głównych kandydatów przez tradycyjne przepływy pracy chemii medycznej. Pomimo swojej ogromnej różnorodności, wszystkie triterpeny pochodzą z jednego liniowego prekursora, 2,3-oksydoskwalenu. Przejściowa heterologiczna ekspresja enzymów biosyntetycznych w N. benthamiana może przekierować endogenne zapasy 2,3-oksydoskwalenu w kierunku produkcji nowych, wysokowartościowych produktów triterpenowych, które nie są naturalnie wytwarzane przez tego gospodarza. Agroinfiltracja jest skutecznym i prostym sposobem na osiągnięcie przejściowej ekspresji u N. benthamiana. Proces ten polega na infiltracji liści roślin zawiesiną Agrobacterium tumefaciens niosącą interesujący nas konstrukt ekspresyjny. Jednoczesna infiltracja dodatkowego szczepu A. tumefaciens przenoszącego konstrukt ekspresyjny kodujący enzym, który zwiększa podaż prekursorów, znacznie zwiększa plony. Po upływie pięciu dni naciekany materiał liściowy można zebrać i przetworzyć w celu ekstrakcji i wyizolowania powstałego produktu (produktów) triterpenowego. Jest to proces, który jest liniowo i niezawodnie skalowalny, po prostu poprzez zwiększenie liczby roślin użytych w eksperymencie. W niniejszym artykule opisano protokół szybkiej produkcji triterpenów na skalę preparatywną z wykorzystaniem tej roślinnej platformy. Protokół wykorzystuje łatwe do odtworzenia urządzenie do infiltracji próżniowej, które pozwala na jednoczesną infiltrację do czterech roślin, umożliwiając infiltrację partii setek roślin w krótkim czasie.

Typowe wydajności izolacji zależą od badanej kombinacji enzymów, stabilności chemicznej związku docelowego oraz stopnia trudności procesu oczyszczania. Wcześniej raportowaliśmy wydajności izolacji pochodnych β-amyryny z naszych eksperymentów biosyntezy kombinatorycznej w zakresie od 0,12 do 3,87 mg na gram suchego proszku z liści N. benthamiana. Związki te wykazywały zróżnicowany stopień utlenienia i obejmowały nienaturalne kombinacje enzymów (Rycina 3)8. Protokół ten jest rutynowo stosowany w naszym laboratorium w celu otrzymania dziesiątek lub setek miligramów oczyszczonego produktu do charakterystyki strukturalnej za pomocą spektroskopii NMR oraz w dalszych testach funkcjonalnych. Wykazaliśmy również użyteczność preparatywną tej platformy, otrzymując 0,8 g szkieletu triterpenowego β-amyryny o czystości powyżej 98%. W tym eksperymencie wykorzystano 459 roślin, co odpowiada wydajności izolacji na poziomie 3,3 mg na gram suchego proszku z liści N. benthamiana8.
<img alt="Schemat syntezy β-amyryny za pośrednictwem Agrobacterium; zawiesina do infiltracji; szlak mewalonianowy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58169/58169fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Podsumowanie schematyczne. Schematyczny przedstawienie procesu wykorzystującego przejściową ekspresję enzymów biosyntetycznych w liściach N. benthamiana w celu przekierowania endogennych zapasów 2,3-oksydoskwalenu na preparatywną produkcję nowych, wysokowartościowych produktów triterpenowych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58169/58169fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Proces kriokonserwacji roślin, schemat przedstawiający etapy w układzie chłodzenia kriogenicznego z komorą próżniową." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58169/58169fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Budowa i proces działania infiltratora próżniowego. a) Specjalistyczny uchwyt do roślin z jednym odłączonym skrzydłem. b) Specjalistyczny uchwyt do roślin z przymocowanymi skrzydłami. c) Odwrócenie i zanurzenie roślin. d) Wprowadzenie kąpieli infiltracyjnej. e) Kąpiel infiltracyjna umieszczona w komorze infiltracyjnej. f) Kompletny infiltrator próżniowy: (1) Pompa próżniowa (2) Połączenie pompy próżniowej z rezerwuarem próżniowym (3) Zawór odcinający rezerwuar próżniowy (4) Połączenie między rezerwuarem próżniowym a komorą infiltracyjną (5) Manometr (6) Zawór wlotowy powietrza (7) Komora infiltracyjna (8) Rezerwuar próżniowy. g) Reprezentatywne liście jednej rośliny infiltrowane konstruktem ekspresyjnym dla zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) po pięciu dniach wzrostu po infiltracji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58169/58169fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Tabela wydajności enzymów roślinnych; struktury, wydajności i wyniki oczyszczania; analiza z kodowaniem kolorystycznym." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58169/58169fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Wcześniej raportowane reprezentatywne wyniki preparatywnej produkcji pochodnych β-amyriny z zastosowaniem niniejszego protokołu8. Tabela została uporządkowana według wydajności izolacji. Kolumny posiadają formatowanie warunkowe z kolorowym oznaczeniem wartości względnych. Czerwony = wysoka, zielony = niska (z żółtym jako wartością pośrednią). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58169/58169fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Przejściowa heterologiczna ekspresja enzymów biosyntetycznych w liściach Nicotiana benthamiana może przekierować endogenne dostawy 2,3-oksydoskwalenu na produkcję nowych produktów triterpenowych o wysokiej wartości. W niniejszym dokumencie opisano szczegółowy protokół szybkiej (5 dni) produkcji triterpenów i analogów na skalę preparatywną z wykorzystaniem tej potężnej platformy roślinnej.

Przejściowa ekspresja w liściach Nicotiana benthamiana do produkcji triterpenów w skali preparatywnej

The triterpenes are one of the largest and most structurally diverse families of plant natural products. Many triterpene derivatives have been shown to ...

Protokół ten zapewnia wygodny dostęp do związków triterpenowych w skali preparatywnej do wykorzystania w dalszych badaniach, takich jak charakterystyka strukturalna lub wygaśnięcie aktywności biologicznej istotnej z medycznego punktu widzenia. Protokół jest szybki, skalowalny i pozwala na wykorzystanie kombinacji enzymów po prostu poprzez jednoczesną infiltrację różnych szczepów Agrobacterium, negując potrzebę konstruowania dużych wektorów wielogenowych. Na początek zaszczepij selektywną płytkę agarową LB smugami pożądanych szczepów Agrobacterium tumefaciens z kultur podstawowych glicerolu.Inkubować płytkę przez noc w temperaturze 28 stopni Celsjusza w stojącym inkubatorze. Następnego dnia należy indywidualnie zaszczepić 50 mililitrów selektywnej pożywki LB próbką każdego szczepu Agrobacterium tumefaciens. Inkubuj kulturę przez noc w temperaturze 28 stopni Celsjusza w inkubatorze z wytrząsaniem z prędkością 200 obr./min.Indywidualnie przenieś 50-mililitrowe kultury do 1 000 mililitrów selektywnej pożywki LB i inkubuj przez noc w temperaturze 28 stopni Celsjusza w inkubatorze wytrząsającym przy 200 obr./min. Następnego dnia należy pojedynczo otopić Agrobacterium tumefaciens z płynnych kultur przez odwirowanie w ilości 4 000 g. Po odrzuceniu supernatantu, pojedynczo ponownie zawiesić granulki w 50 mililitrach świeżo przygotowanego buforu MMA.Inkubować zawieszone granulki w temperaturze pokojowej w ciemności przez jedną godzinę. Teraz określ odpowiednią objętość każdej zawiesiny MMA Agrobacterium tumefaciens, aby wytworzyć końcowy OD 600 wynoszący co najmniej 0,2 w całkowitej objętości końcowej 10 litrów. Połączyć ustalone objętości każdej zawiesiny.Teraz dodaj dodatkowy bufor MMA do połączonych zawiesin do końcowej objętości jednego litra, aby można go było natychmiast użyć do infiltracji próżniowej. Przenieś jeden litr zawiesiny infiltracyjnej i jeden litr buforu MMA o sile 10x do kąpieli infiltracyjnej, a następnie dodatkowe osiem litrów wody. Zdejmij zdejmowane skrzydła z wykonanego na zamówienie uchwytu na rośliny.Włóż cztery pięciotygodniowe rośliny, które zostały wyhodowane zgodnie z opisem w protokole tekstowym, i ponownie przymocuj skrzydła. Pokrycie infiltracji jest zagrożone, jeśli liście nie są całkowicie zanurzone w zawiesinie infiltracyjnej. Problem ten jest minimalizowany poprzez zapewnienie, że poziom zawiesiny dociera do górnej powierzchni uchwytu rośliny przed obróbką próżniową.Odwróć uchwyt i umieść go na kąpieli infiltracyjnej, tak aby zanurzyć liście w zawiesinie infiltracyjnej. Przenieś kąpiel infiltracyjną z zanurzonymi roślinami do komory rozsączającej i zamknij drzwiczki. Upewnij się, że zawór wlotu powietrza na infiltratorze jest zamknięty.Po włączeniu pompy próżniowej należy otworzyć zawór wlotu podciśnienia w komorze infiltracyjnej. Gdy ciśnienie w komorze infiltracyjnej zmniejszy się o 880 milibarów, zamknij zawór wlotu podciśnienia i otwórz zawór wlotu powietrza. Po powrocie do ciśnienia atmosferycznego otwórz drzwiczki i wyjmij wannę rozsączającą.Teraz podnieś uchwyt na rośliny, aż rośliny nie będą już zanurzone w zawiesinie infiltracji. Następnie delikatnie potrząśnij uchwytem, aby nadmiar zawiesiny spłynął z liści i wrócił do kąpieli infiltracyjnej. Na koniec ustaw uchwyt w pozycji pionowej, zdejmij odłączane skrzydła i usuń rośliny.Uprawiaj infiltrowane rośliny przez pięć dni w temperaturze 25 stopni Celsjusza w 16 godzinach dziennie światła z codziennym podlewaniem. Po pięciu dniach wzrostu zbierz liście, a następnie wysusz je zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Zmiel suszone liście na gruboziarnisty proszek za pomocą wygodnej metody, takiej jak użycie domowego robota kuchennego lub ręczne zmiażdżenie liści, gdy znajdują się w torbie.Wymieszaj proszek z liści z piaskiem kwarcowym w odpowiednim pojemniku. Działa to jako dyspergator i poprawia wydajność procesu ekstrakcji. Teraz przygotuj cztery komórki ekstrakcyjne do wypełnienia, najpierw je odwracając.Następnie włóż filtr z włókna szklanego, a następnie metalową frytkę i zatyczkę mocującą. Przywróć komórki ekstrakcyjne do pozycji pionowej i dodaj warstwę piasku kwarcowego o głębokości jednego centymetra. Wypełnij komórki ekstrakcyjne przygotowanym proszkiem liściowym aż do linii napełniania.W razie potrzeby delikatnie ściśnij proszek podczas tego procesu, aby ułatwić dodanie większej ilości w każdej komórce ekstrakcyjnej. Teraz dodaj niewielką warstwę piasku kwarcowego na wierzch zapakowanego proszku i włóż górny filtr celulozowy. Włóż wypełnione komórki ekstrakcyjne do przyrządu do ekstrakcji rozpuszczalnikiem pod ciśnieniem i uruchom żądaną metodę.Po zakończeniu metody należy skoncentrować połączony płyn ekstrakcyjny do sucha poprzez odparowanie rotacyjne w próżni, jak wyszczególniono w protokole tekstowym. Sprawdź, jaka jest oczekiwana wydajność ciemnozielonej gnojowicy. Aby usunąć chlorofile, używając zasadowej żywicy jonowymiennej, najpierw rozpuść surowy ekstrakt w minimalnej objętości etanolu.Do otrzymanego roztworu dodać 50 mililitrów zasadowych kulek żywicy jonowymiennej. Następnie mieszaj w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Dodawaj dodatkowe 50 mililitrów kulek podstawowej żywicy jonowymiennej co 30 minut, aż reakcja przejdzie do zakończenia.Początkowo podstawowe kulki żywicy jonowymiennej są koloru różowego, a faza ciekła jest zielona. W miarę postępu reakcji kulki żywicy zmieniają kolor na zielony, a faza ciekła na pomarańczowy lub mętny brązowy kolor w zależności od skali. Przefiltrować mieszaninę reakcyjną przez krótką kolumnę ziemi okrzemkowej przez szklaną kolumnę do chromatografii błyskawicznej, używając mieszków ręcznych do wywierania nacisku.Zebrane kulki żywicy przepłukać etanolem, następnie etanolem jeden do jednego do heksanu, a na końcu heksanem. Użyj objętości płukania wystarczającej do ponownego zawieszenia koralików na górze kolumny ziemi okrzemkowej. Na koniec połączyć filtrat, płukanki i koncentrat do sucha przez odparowanie obrotowe w próżni.Pokazano tutaj obraz liści jednej rośliny naciekanej konstruktem ekspresji białka fluorescencyjnego GFP po pięciu dniach po wzroście naciekowym. Ilustruje to zakres ochrony przed infiltracją, którego można się spodziewać. Liście są ułożone od lewego górnego rogu do prawego dolnego rogu obrazu w porządku malejącym, w odniesieniu do ich pierwotnej wysokości na roślinie.Ten obraz przedstawia 0,8 grama beta-amyryny wyprodukowanej przy użyciu tego protokołu, która jest większa niż 98% czystości. Eksperyment został przeprowadzony w skali 459 roślin i reprezentuje izolowany plon 3,3 miligrama na gram suchego materiału liściowego. Próbując tego protokołu, ważne jest, aby pamiętać, że tylko infiltrowane liście będą wytwarzać interesujący Cię związek.Dlatego korzystne jest selektywne zbieranie tych liści, jeśli to możliwe, aby zapobiec rozcieńczeniu próbki nieproduktywną tkanką. Etapy po zbiorach w niniejszym protokole mają charakter poglądowy. Mogą one zastąpić inne techniki oczyszczania ekstrakcji produktów naturalnych, w zależności od dostępności wiedzy specjalistycznej i/lub obiektów w Twojej instytucji.Stwierdziliśmy, że podstawowa obróbka żywicą jonowymienną przedstawiona w tym protokole jest wygodną alternatywą dla bardziej tradycyjnego zmydlania, po którym następuje podział ciecz/ciecz w celu usunięcia chlorofilów na większą skalę. Przed zastosowaniem tego protokołu należy zapoznać się z danymi dotyczącymi bezpieczeństwa materiałów dla wszystkich stosowanych substancji i podjąć odpowiednie środki ostrożności. Lokalne przepisy dotyczące pracy z materiałem transgenicznym powinny być sprawdzane i przestrzegane, w tym przestrzeganie odpowiednich procedur przechowawczych.

transient-expression-nicotiana-benthamiana-leaves-for-triterpene

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Rośliny oferują nowatorski system do produkcji białek farmaceutycznych na skalę komercyjną, który jest bardziej skalowalny, opłacalny i bezpieczny niż obecne paradygmaty ekspresji. W tym badaniu przedstawiamy proste i wygodne, a jednocześnie skalowalne podejście do wprowadzenia genu docelowego zawierającego Agrobacterium tumefaciens do roślin w celu przejściowej ekspresji białka.

Efektywna agroinfiltracja roślin w celu uzyskania przejściowej ekspresji białek rekombinowanych na wysokim poziomie

Produkcja białka przejściowego w roślinach Nicotiana oparta na infiltracji próżniowej za pomocą agrobakterii przenoszących wektory startowe (oparte na wirusie mozaiki tytoniu) jest szybkim i ekonomicznym podejściem do produkcji antygenów szczepionkowych i białek terapeutycznych. Uprościliśmy procedurę i poprawiliśmy akumulację celu, optymalizując warunki hodowli bakterii, dobierając gatunki gospodarzy i współwprowadzając supresory wyciszające RNA.

Optymalizacja i wykorzystanie produkcji białek przejściowych za pośrednictwem Agrobacterium w Nicotiana

Opisujemy podejście do projektowania eksperymentów, które może być użyte do określenia i modelowania wpływu elementów regulatorowych transgenu, parametrów wzrostu i rozwoju roślin oraz warunków inkubacji na przejściową ekspresję przeciwciał monoklonalnych i białek reporterowych w roślinach.

Charakterystyka układów złożonych z wykorzystaniem podejścia Design of Experiments: przejściowa ekspresja białek w tytoniu jako studium przypadku

Ta praca opisuje nowatorską metodę selektywnego celowania w organelle subkomórkowe u roślin, testowaną za pomocą BioRad Gene Gun.

Przejściowa ekspresja genów w tytoniu przy użyciu zespołu Gibsona i pistoletu genowego

Rośliny tytoniu zostały użyte do produkcji celulazy grzybowej, TrCel5A, za pomocą systemu ekspresji przejściowej. Ekspresję można było monitorować za pomocą fluorescencyjnego białka fuzyjnego, a aktywność białka scharakteryzowano po ekspresji.

Ekspresja rekombinowanej celulazy Cel5A z Trichoderma reesei w roślinach tytoniu

W tym badaniu porównano ekspresję docelowego ludzkiego białka rekombinowanego na różnych platformach produkcyjnych. Skupiliśmy się na tradycyjnych kulturach fermentorowych i roślinach, opisując konfigurację każdego systemu i podkreślając, na podstawie zgłoszonych wyników, nieodłączne ograniczenia i zalety każdej platformy.

Analiza porównawcza ekspresji białek rekombinowanych w różnych biofabrykach: bakteriach, komórkach owadów i systemach roślinnych

Na poziomie subkomórkowym, zdarzenia sygnalizacyjne są dynamicznie modulowane przez sygnały rozwojowe i środowiskowe. W tym miejscu opisujemy protokół, który wykorzystuje system przejściowej ekspresji tytoniu do monitorowania dynamicznej interakcji białko-białko i ujawniania przestrzennej organizacji transdukcji sygnału w komórkach roślinnych.

Obrazowanie przestrzennej reorganizacji szlaku sygnałowego MAPK przy użyciu systemu przejściowej ekspresji tytoniu

Ten manuskrypt opisuje łatwą i szybką procedurę eksperymentalną do określania interakcji białko-białko na podstawie pomiaru aktywności lucyferazy.

Test obrazowania komplementacji lucyferazy w liściach Nicotiana benthamiana do przejściowego określania dynamiki interakcji białko-białko

Tutaj prezentujemy protokół produkcji doustnej szczepionki przeciwko cukrzycy typu 1 w jadalnej roślinie.

Przejściowa ekspresja w buraka ćwikłowym biofarmaceutycznej szczepionki kandydackiej przeciwko cukrzycy typu 1

Tutaj prezentujemy łatwe w użyciu protokoły produkcji i oczyszczania metabolitów diterpenoidowych poprzez kombinatoryczną ekspresję enzymów biosyntetycznych w Escherichia coli lub Nicotiana benthamiana, a następnie chromatograficzne oczyszczanie produktu. Otrzymane metabolity nadają się do różnych badań, w tym charakterystyki struktury molekularnej, badań funkcjonalnych enzymów i testów bioaktywności.

Indywidualne podejście do enzymatycznej produkcji i oczyszczania naturalnych produktów diterpenoidowych

Opisujemy tutaj prostą metodę ekspresji, ekstrakcji i oczyszczania rekombinowanej ludzkiej IgG połączonej z GFP u Nicotiana benthamiana. Protokół ten można rozszerzyć o oczyszczanie i wizualizację wielu białek, które wykorzystują chromatografię kolumnową. Co więcej, protokół można dostosować do osobistego i wirtualnego laboratorium dydaktycznego w college'u, zapewniając eksplorację opartą na projektach.

Wytwarzanie białek fuzyjnych IgG ulegających przejściowej ekspresji w Nicotiana benthamiana

Poznaj metodę przejściowej ekspresji w liściach Nicotiana benthamiana do produkcji triterpenów w skali preparatywnej. Protokół umożliwia szybkie uzyskiwanie związków o wysokiej wartości farmaceutycznej.

Przejściowa ekspresja w liściach Nicotiana benthamiana do produkcji triterpenów w skali preparatywnej

Przeglądaj więcej filmów