Name: Metody oceny roli c-fos i dusp1 w zależności onkogenu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Poznaj metody walidacji c-Fos i Dusp1 jako celów terapeutycznych w białaczce przy użyciu mysich modeli in vivo i in vitro. Technika ta znajduje zastosowanie w różnych typach nowotworów napędzanych kinazami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy są wdzięczni G. Q. Daleyowi za dostarczenie komórek BaF3 i WEHI oraz T. Reya za konstrukcje MSCV-BCR-ABL-Ires-YFP. Autorzy są wdzięczni M. Carrollowi za dostarczenie pacjentom próbek z kryzysu związanego z CML. Badanie to było wspierane przez granty dla M.A. z NCI (1RO1CA155091), Białaczki i V Fundacji oraz z NHLBI (R21HL114074-01).

<ol><li>Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+chronic+myelogenous+leukemia+in+mice+by+the+P210bcr%2Fabl+gene+of+the+Philadelphia+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome.</a> Science. 247, 824-830 (1990).</li>
<li>Druker, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+selective+inhibitor+of+the+Abl+tyrosine+kinase+on+the+growth+of+Bcr-Abl+positive+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells.</a> Nature Medicine. 2, 561-566 (1996).</li>
<li>Mahon, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discontinuation+of+imatinib+in+patients+with+chronic+myeloid+leukaemia+who+have+maintained+complete+molecular+remission+for+at+least+2+years%3A+the+prospective%2C+multicentre+Stop+Imatinib+%28STIM%29+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Oncology%22%5BJournal%5D)">Discontinuation of imatinib in patients with chronic myeloid leukaemia who have maintained complete molecular remission for at least 2 years: the prospective, multicentre Stop Imatinib (STIM) trial.</a> Lancet Oncology. 11, 1029-1035 (2010).</li>
<li>O'Hare, T., Zabriskie, M. S., Eiring, A. M., Deininger, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pushing+the+limits+of+targeted+therapy+in+chronic+myeloid+leukaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Pushing the limits of targeted therapy in chronic myeloid leukaemia.</a> Nature Reviews Cancer. 12, 513-526 (2012).</li>
<li>Rousselot, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imatinib+mesylate+discontinuation+in+patients+with+chronic+myelogenous+leukemia+in+complete+molecular+remission+for+more+than+2+years%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Imatinib mesylate discontinuation in patients with chronic myelogenous leukemia in complete molecular remission for more than 2 years.</a> Blood. 109, 58-60 (2007).</li>
<li>Krause, D. S., Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine+kinases+as+targets+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tyrosine kinases as targets for cancer therapy.</a> The New England Journal of Medicine. 353, 172-187 (2005).</li>
<li>Sharma, S. V., Settleman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+the+balance+between+life+and+death%3A+targeted+cancer+therapy+and+%22oncogenic+shock%22%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Exploiting the balance between life and death: targeted cancer therapy and "oncogenic shock".</a> Biochemical Pharmacology. 80, 666-673 (2010).</li>
<li>Sharma, S. V., Settleman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogene+addiction%3A+setting+the+stage+for+molecularly+targeted+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Oncogene addiction: setting the stage for molecularly targeted cancer therapy.</a> Genes & Development. 21, 3214-3231 (2007).</li>
<li>Weinstein, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer.+Addiction+to+oncogenes--the+Achilles+heal+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cancer. Addiction to oncogenes--the Achilles heal of cancer.</a> Science. 297, 63-64 (2002).</li>
<li>Corbin, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+chronic+myeloid+leukemia+stem+cells+are+insensitive+to+imatinib+despite+inhibition+of+BCR-ABL+activity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Human chronic myeloid leukemia stem cells are insensitive to imatinib despite inhibition of BCR-ABL activity.</a> The Journal of Clinical Investigation. 121, 396-409 (2011).</li>
<li>Straussman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+micro-environment+elicits+innate+resistance+to+RAF+inhibitors+through+HGF+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumour micro-environment elicits innate resistance to RAF inhibitors through HGF secretion.</a> Nature. 487, 500-504 (2012).</li>
<li>Wilson, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+potential+for+growth-factor-driven+resistance+to+anticancer+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Widespread potential for growth-factor-driven resistance to anticancer kinase inhibitors.</a> Nature. 487, 505-509 (2012).</li>
<li>Kesarwani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+c-FOS+and+DUSP1+abrogates+intrinsic+resistance+to+tyrosine-kinase+inhibitor+therapy+in+BCR-ABL-induced+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Targeting c-FOS and DUSP1 abrogates intrinsic resistance to tyrosine-kinase inhibitor therapy in BCR-ABL-induced leukemia.</a> Nature Medicine. 23, 472-482 (2017).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((c-fos+regulates+neuronal+excitability+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">c-fos regulates neuronal excitability and survival.</a> Nature Genetics. 30, 416-420 (2002).</li>
<li>Dorfman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+erp%2Fmkp-1+gene+does+not+affect+mouse+development%3A+normal+MAP+kinase+activity+in+ERP%2FMKP-1-deficient+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Disruption of the erp/mkp-1 gene does not affect mouse development: normal MAP kinase activity in ERP/MKP-1-deficient fibroblasts.</a> Oncogene. 13, 925-931 (1996).</li>
<li>Padhye, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorocurcumins+as+cyclooxygenase-2+inhibitor%3A+molecular+docking%2C+pharmacokinetics+and+tissue+distribution+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Fluorocurcumins as cyclooxygenase-2 inhibitor: molecular docking, pharmacokinetics and tissue distribution in mice.</a> Pharmaceutical Research. 26, 2438-2445 (2009).</li>
<li>Molina, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+chemical+screening+reveals+an+inhibitor+of+Dusp6+that+expands+cardiac+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages.</a> Nature Chemical Biology. 5, 680-687 (2009).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+targeting+of+quiescent+chronic+myelogenous+leukemia+stem+cells+by+histone+deacetylase+inhibitors+in+combination+with+imatinib+mesylate%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Effective targeting of quiescent chronic myelogenous leukemia stem cells by histone deacetylase inhibitors in combination with imatinib mesylate.</a> Cancer Cell. 17, 427-442 (2010).</li>
<li>Koschmieder, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+chronic+phase+of+myeloid+leukemia+with+expansion+of+hematopoietic+stem+cells+in+a+transgenic+model+of+BCR-ABL+leukemogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Inducible chronic phase of myeloid leukemia with expansion of hematopoietic stem cells in a transgenic model of BCR-ABL leukemogenesis.</a> Blood. 105, 324-334 (2005).</li>
<li>Abraham, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+targeting+of+p53+and+c-MYC+selectively+eliminates+leukaemic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dual targeting of p53 and c-MYC selectively eliminates leukaemic stem cells.</a> Nature. 534, 341-346 (2016).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+p53+by+SIRT1+inhibition+enhances+elimination+of+CML+leukemia+stem+cells+in+combination+with+imatinib%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Activation of p53 by SIRT1 inhibition enhances elimination of CML leukemia stem cells in combination with imatinib.</a> Cancer Cell. 21, 266-281 (2012).</li>
<li>Qiagen-miRNAeasy kit. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/rna/mirna/mirneasy-mini-kit/#resources">https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/rna/mirna/mirneasy-mini-kit/#resources</a> (2018).</li>
<li>DNA-free DNA removal kit. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM1906?gclid=EAIaIQobChMIg4D-_ZvC2wIVx5-zCh00Cg8fEAAYASAAEgIv6vD_BwE&s_kwcid=AL!3652!3!264318446624!b!!g!!&ef_id=V7SO5AAAAck3ba89:20180607185004:s">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM1906?gclid=EAIaIQobChMIg4D-_ZvC2wIVx5-zCh00Cg8fEAAYASAAEgIv6vD_BwE&s_kwcid=AL!3652!3!264318446624!b!!g!!&ef_id=V7SO5AAAAck3ba89:20180607185004:s</a> (2018).</li>
<li>SuperScript™ III First-Strand Synthesis System. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18080051">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18080051</a> (2018).</li>
<li>Human Long Term Culture Initiating Cell Itc-ic Assay. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.stemcell.com/human-long-term-culture-initiating-cell-ltc-ic-assay.html">https://www.stemcell.com/human-long-term-culture-initiating-cell-ltc-ic-assay.html</a> (2018).</li>
<li>Abarrategi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+human+bone+marrow+niche+in+mice%3A+From+host+bone+marrow+engraftment+to+bioengineering+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Modeling the human bone marrow niche in mice: From host bone marrow engraftment to bioengineering approaches.</a> Journal of Experimental Medicine. 215, 729-743 (2018).</li>
<li>Kesarwani, M., Huber, E., Kincaid, Z., Azam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+screening+and+validation+of+resistant+mutations+against+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A method for screening and validation of resistant mutations against kinase inhibitors.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W przypadku większości komórek nowotworowych odpowiedź terapeutyczna na TKI jest pośredniczona przez blokadę sygnałów kinazy-onkoproteiny tyrozyny, od których guz jest uzależniony. Jednak stosunkowo niewiele wiadomo na temat tego, w jaki sposób mniejszość komórek nowotworowych przyczyniających się do MRD unika uzależnienia od onkogenu i terapii4. Ostatnie badania wykazały, że sygnalizacja czynnika wzrostu pośredniczy w oporności na leki zarówno w białaczce, jak i guzach narządów litych. Sugeruje t...

Konstytutywna aktywność kinazy tyrozynowej onkogenu fuzji BCR-ABL1 powoduje CML, co stanowi uzasadnienie dla celowania w aktywność kinazy przez inhibitory małych cząsteczek. Sukces TKI w leczeniu pacjentów z CML zrewolucjonizował koncepcję terapii celowanej1,2. Następnie terapia antykinazowa jako medycyna precyzyjna została opracowana dla kilku innych nowotworów złośliwych, w tym guzów litych. Do tej pory ponad trzydzieści inhibitorów kinaz zostało zatwierdzonych przez amerykańską FDA do leczenia różnych nowotworów złośliwych. Chociaż leczenie TKI jest bardzo skuteczne w tłumieniu choroby, nie jest wyleczalne. Poza tym podczas leczenia utrzymuje się niewielka populacja komórek nowotworowych: MRD3,4,5. Nawet pacjenci, którzy wykazali całkowitą remisję, pozostają z MRD, które ostatecznie prowadzi do nawrotu, jeśli nie jest stale tłumione. Dlatego eliminacja komórek MRD jest konieczna, aby osiągnąć trwałą lub leczniczą odpowiedź. CML stanowi cenny paradygmat do definiowania koncepcji medycyny precyzyjnej, mechanizmów onkogenezy, racjonalnych terapii ukierunkowanych na cel, progresji choroby i oporności na leki. Jednak nawet dzisiaj mechanizm napędzający śmierć komórek indukowaną przez TKI w komórkach nowotworowych nie jest w pełni zrozumiały, ani dlaczego komórki MRD (składające się z białaczkowych komórek macierzystych [LSC]) są wewnętrznie odporne na TKIs4,6. Niemniej jednak zjawisko "uzależnienia onkogenu" od zmutowanej onkoproteiny kinazy jest związane ze skutecznością TTKI, gdzie ostre hamowanie docelowego onkogenu przez TKI powoduje wstrząs onkogenny, który prowadzi do masywnej odpowiedzi proapoptotycznej lub spoczynku w sposób zależny od kontekstu komórki6,7,8,9. Brakuje jednak mechanistycznych podstaw zależności onkogenowej. Ostatnie badania sugerują, że sygnalizacja czynnika wzrostu znosi zależność od onkogenu, a w konsekwencji nadaje oporność na terapię TKI 10,11,12. Dlatego, aby uzyskać wgląd w mechanizm uzależnienia od onkogenów, przeprowadziliśmy profilowanie ekspresji całego genomu z komórek uzależnionych i nieuzależnionych BCR-ABL1 (hodowanych z czynnikami wzrostu), które ujawniły, że c-Fos i Dusp1 są krytycznymi mediatorami uzależnienia od onkogenu13. Genetyczna delecja c-Fos i Dusp1 jest syntetycznie śmiertelna dla komórek wykazujących ekspresję BCR-ABL1, a myszy użyte w eksperymencie nie rozwinęły białaczki. Co więcej, hamowanie c-Fos i DUSP1 przez inhibitory małocząsteczkowe wyleczyło CML indukowaną przez BCR-ABL1 u myszy. Wyniki pokazują, że poziomy ekspresji c-Fos i Dusp1 definiują próg apoptozy w komórkach nowotworowych, tak że niższe poziomy nadają wrażliwość na lek, podczas gdy wyższe poziomy powodują oporność na terapię13.
Aby zidentyfikować geny napędzające uzależnienie od onkogenu, przeprowadziliśmy kilka eksperymentów profilowania ekspresji całego genomu w obecności czynnika wzrostu i TKI (imatynibu) przy użyciu zarówno myszy, jak i komórek pochodzących od pacjentów z CML (K562). Dane te analizowano równolegle z zestawami danych pacjentów z CML uzyskanymi z hematopoetycznych komórek macierzystych CD34+ przed i po leczeniu imatynibem. Analiza ta ujawniła trzy geny (czynnik transkrypcyjny [c-Fos], fosfatazę o podwójnej swoistości 1 [Dusp1] i białko wiążące RNA [Zfp36]), które są zwykle regulowane w górę w komórkach opornych na TKI. Aby potwierdzić znaczenie tych genów w nadawaniu oporności na leki, przeprowadziliśmy krok po kroku analizę in vitro i in vivo. Poziomy ekspresji tych genów zostały potwierdzone za pomocą qPCR w czasie rzeczywistym (RT-qPCR) i western blotting w komórkach opornych na leki. Co więcej, nadekspresja cDNA i knockdown przez spinki do włosów shRNA c-Fos, Dusp1 i Zfp36 ujawniły, że podwyższone ekspresje c-Fos i Dusp1 są wystarczające i konieczne do nadania oporności na TTKI. W związku z tym przeprowadziliśmy walidację in vivo przy użyciu modeli mysich tylko z c-Fos i Dusp1. W celu walidacji genetycznej c-Fos i Dusp1 stworzyliśmy myszy c-Fosfl/fl indukowane przez ROSACreERT (warunkowy nokaut)14 i skrzyżowaliśmy je z Dusp1-/- (prosty nokaut)15, aby stworzyć myszy podwójnie transgeniczne ROSACreERT2-c-Fosfl/flDusp1-/-. Komórki c-Kit + pochodzące ze szpiku kostnego (z c-Fosfl / fl-, Dusp1-/-- i c-Fosfl / flDusp1-/-) wykazujące ekspresję BCR-ABL1 analizowano in vitro w teście jednostki tworzącej kolonię (CFU) oraz in vivo przez przeszczep szpiku kostnego u śmiertelnie napromieniowanych myszy, w celu zbadania zapotrzebowania na c-Fos i Dusp1 samodzielnie lub razem w rozwoju białaczki. Podobnie, chemiczne hamowanie c-Fos przez DFC (difluorowana kurkumina) 16 i Dusp1 przez BCI (benzylideno-3-(cykloheksyloamino)-2,3-dihydro-1H-inden-1-on)17 testowano in vitro i in vivo przy użyciu ekspresji BCR-ABL1, pochodzących ze szpiku kostnego komórek c-Kit+ myszy typu dzikiego (WT). Aby potwierdzić wymóg c-Fos i Dusp1 w białaczkowych komórkach macierzystych, wykorzystaliśmy mysi model CML, w którym BCR-ABL1 był specyficznie indukowany w komórkach macierzystych przez doksycyklinę (transaktywator Tet ulega ekspresji w regulacji wzmacniacza genu 3' mysiej białaczki macierzystej (SCL))18,19. Użyliśmy komórek Lin-Sca + c-Kit + (LSK) szpiku kostnego od tych myszy w teście przeszczepu in vivo. Ponadto ustaliliśmy poziomy phopsho-p38 i ekspresję IL-6 jako biomarkery farmakodynamiczne dla hamowania Dusp1 i c-Fos, odpowiednio, in vivo. Wreszcie, aby rozszerzyć badanie pod kątem znaczenia dla ludzi, komórki CD34 + pochodzące od pacjentów (odpowiednik komórek c-Kit + od myszy) poddano długoterminowym testom komórkowym inicjującym hodowlę in vitro (LTCIC) oraz humanizowanemu mysiemu modelowi in vivo CML20,21. Myszom z niedoborem odporności przeszczepiono komórki CML CD34 +, a następnie leczono farmakologicznie i analizowano przeżywalność ludzkich komórek białaczkowych.
W tym projekcie rozwijamy metody identyfikacji i walidacji celów przy użyciu narzędzi genetycznych i chemicznych, korzystając z różnych modeli przedklinicznych. Metody te mogą być z powodzeniem stosowane do walidacji innych celów, w których opracowywane są modalności chemiczne do rozwoju terapeutycznego.

<table><tbody><tr><td>Biological Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Cellgro (corning)</td><td>15-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro (corning)</td><td>15-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Cellgro (corning)</td><td>15-016-CVR</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki fragment fibronektyny retronektyny</td><td>Takara</td><td>T100B</td><td></td></tr><tr><td>MethoCult GF M3434 (metyloceluloza dla mysiego CFU)</td> <td>Komórka macierzysta</td><td>3434</td><td></td></tr><tr><td>MethoCult H4434 Classic (metyloceluloza dla ludzkiego CFU)</td> <td>Komórka macierzysta</td><td>4434</td><td></td></tr><tr><td>4-hydroksytamoksyfen</td><td>Sigma</td><td>H6278</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana mysia SCF</td><td>Prospec</td><td>CYT-275</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany mysi Flt3-ligand</td><td>Prospec</td><td>CYT-340</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany Mysz IL-6</td><td>Prospec</td><td>CYT-350</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana mysz IL-7</td><td>Peprotech</td><td>217-17</td><td></td></tr><tr><td>DFC</td><td>LKT Laboratories Inc.</td><td>D3420</td><td></td></tr><tr><td>BCI</td><td>Chemzon Scientific</td><td>NZ-06-195</td><td></td></tr><tr><td>Laboratorium Imatinib</td><td>LC</td><td>I-5508</td><td></td></tr><tr><td>Kurkumina</td><td>Sigma</td><td>458-37-7</td><td></td></tr><tr><td>NDGA</td><td>Sigma</td><td>500-38-9</td><td></td></tr><tr><td>Penn/Strep</td><td>Cellgro (corning)</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta biologiczny</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna EDTA 1x</td><td>Cellgro (corning)</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Cellgro (corning)</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Cellgro (corning)</td><td>25-005-CL</td><td>5 mg/ml zapas w wodzie</td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Gibco (life technologies)</td><td>A11138-03</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H7006</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4.7H2O</td><td>Sigma</td><td>S9390</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan protaminy</td><td>Sigma</td><td>P3369</td> 5 <td>mg/ml w wodzie</td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego (0,4%)</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Cellgro (corning)</td><td>25-950-CQC</td><td></td></tr><tr><td>WST-1</td><td>Roche</td><td>11644807001</td><td></td></tr><tr><td>0,45 &mu; M acro filtr tarczowy</td><td>PALL</td><td>2016-10</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m Nylon cell stariner</td><td>Becton Dickinson</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>FICOL (Histopaque 1083) (polisacharoza)</td> <td>Simga</td><td>1083</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21040CV</td><td></td></tr><tr><td>LS Kolumny</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Roche</td><td>CO-RO</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów fosfatazy 2</td><td>Sigma</td><td>P5762</td><td></td></tr><tr><td>Membrana nitrokululozowa</td><td>Bio-Rad</td><td>1620115</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate (substrat chemiluminescencyjny)</td><td>Thermo Scientific</td><td>34075</td><td></td></tr><tr><td>CD5</td><td>eBioscience</td><td>13-0051-82</td><td></td></tr><tr><td>CD11b</td><td>eBioscience</td><td>13-0112-75</td><td></td></tr><tr><td>CD45R (B220)</td><td>BD nauki biologiczne</td><td>553092</td><td></td></tr><tr><td>CD45.1-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0453-85</td><td></td></tr><tr><td>CD45.2-PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0454-83</td><td></td></tr><tr><td>hCD45-FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>555482</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Biotin-FITC</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-857&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-7-4</td><td>eBioscience</td><td>MA5-16539</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Gr-1 (Ly-6G/c)</td><td>eBioscience</td><td>13-5931-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ter-119</td><td>eBioscience</td><td>13-5921-75</td><td></td></tr><tr><td>Ly-6 A/E (Sca1) PE Cy7</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>558612</tr><tr><td>CD117 APC&nbsp;</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>553356</tr><tr><td>BD Pharm Lyse</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>555899</tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm (Roztwór utrwalający i przepuszczalny)</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>554714</tr><tr><td>BD trwała ondulacja/pranie&nbsp; (roztwór do przepuszczania i przemywania dla przepływu fosfonu)</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>554723</tr><tr><td>phospho p38</td><td>Technologie sygnalizacji komórkowej</td><td>4511S</td><td></td></tr><tr>całkowite technologie <td>sygnalizacji komórkowej</td><td>p38</td><td>9212</td><td></td></tr><tr><td>Mysia kontrola IgG</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>554121</tr><tr><td>Mąka Alexa 488 sprzężona&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-11034</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Invitrogen</td><td>K278001</td><td></td></tr><tr><td>2x HBS</td><td>Invitrogen</td><td>K278002</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Ambion</td><td>AM9261</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Rurki naczyń włosowatych</td><td>Fisher</td><td>22-260-950</td><td></td></tr><tr><td>Probówka do pobierania krwi</td><td>Giene Bio-One</td><td>450480</td><td></td></tr><tr><td>Surowica cielęca nowonarodzonego Atlanta</td><td>biologiczna</td><td>S11295</td><td></td></tr><tr><td>Erytropoeteina</td><td>Amgen</td><td>5513-267-10</td><td></td></tr><tr><td>ludzki SCF</td><td>Prospec</td><td>CYT-255</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki IL-3</td><td>Prospec</td><td>CYT-210</td><td></td></tr><tr><td>G-SCF</td><td>Prospec</td><td>CYT-220</td><td></td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>Prospec</td><td>CYT-221</td><td></td></tr><tr><td>MyeloCult (pożywka do testu LTCIC)</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5100</td><td></td></tr><tr><td>Hydrokortyzon Hemibursztynian sodu</td><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>7904</td><td></td></tr><tr><td>MEM alpha</td><td>Gibco</td><td>12561-056</td><td></td></tr><tr><td>1/2 cc Strzykawka insulinowa Lo-Dose u-100 28 G1/2</td><td>Becton Dickinson</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>Tłuczek Mortor</td><td>Coor tek&nbsp;</td><td>60316 i 60317</td><td></td></tr><tr><td>Izofloran (Isothesia TM)</td><td>Butler Schien</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>SOC</td><td>New England Biolabs</td><td>B90920s</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma</td><td>A0166</td><td>100 mg / ml zapas w wodzie</td></tr><tr><td>Agar baktonowy (agar)</td><td>Difco</td><td>214050</td><td></td></tr><tr><td>Wspaniały bulion</td><td>Becton Dickinson</td><td>243820</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Genemate</td><td>E-3119-500</td><td></td></tr><tr><td>Doksycyklina</td><td>chow TestDiet.com</td><td>52662</td><td>zmodyfikowany RMH1500, autoklawowalny 5LK8&nbsp; z 0,0625% Doksycykliną&nbsp;</td></tr><tr><td>Tamoxifen</td><td>Sigma</td><td>T5648</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek jodonitrotetrazolu&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>I10406</td><td></td></tr><tr><td>Kits</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dneasy Zestaw do krwi i tkanek</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Green (polimeraza taq z zielonym barwnikiem loadign)</td><td>Promega</td><td>M1722</td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy Mini Kit&nbsp; (zestaw do izolacji RNA)</td><td>Qiagen</td><td>217084</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Dnazy Wolnej od DNA (leczenie DNAzy dla RT PCR)</td><td>Ambion, Life Technologies</td><td>AM1906</td><td></td></tr><tr><td>Indeks górny III Synteza pierwszej nici (odwrotna transkryptaza do syntezy cDNA)</td> <td>Invitrogen</td><td>18080051</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green (mieszanka polimerazy taq z zielonym barwnikiem interchalacyjnym do qPCR)</td> <td>Zestaw</td><td></td> mikrokulek Bio-Rad 1725270 <td></td></tr><tr><td>CD117</td><td>Miltenyi</td><td>130-091-224</td><td></td></tr><tr><td>Długotrwały test komórkowy inicjujący hodowlę ludzką</td> Technologie <td></td><td></td><td>komórek tymczasowych</td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NAPCO series 8000 WJ Inkubator CO2</td><td>Thermo scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirnik kubełkowy wahadłowy cetrifuge 5810R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TC-10 automatyczny licznik komórek</td><td>Bio-RAD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C-1000 Termocykler</td><td>Bio-RAD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler Real Plex 2</td> System obrazowania <td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc (system obrazowania żeli i plam zachodnich)</td><td>Bio-RAD</td><td>17001401</td><td></td></tr><tr><td>Hemavet (licznik boląców)</td><td>Drew-Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSR II (analizator FACS)</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fortessa I (analizator FACS)</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSAriaII (Sorter FACS)</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stojak magnetyczny</td><td>Miltenyi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Naradiator</td><td>&nbsp;J.L. Shepherd and Associates, San Fernando CA</td><td>Mark I Model 68A</td><td>źródło Cs 137</td></tr><tr><td>Mice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ROSACreERT2</td><td>Jackson Laboratory</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scl-tTA&nbsp;</td><td>Dr Claudia Huettner' s lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BoyJ&nbsp;</td><td>rdzeń myszy w CCHMC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57Bl/6&nbsp;</td>Główny ośrodek myszy <td>Jackson Laboratory</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NSGS</td><td>w CCHMC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ROSACreERT2/c-Fosfl/fl Dusp1-/-&nbsp;</td><td>Wyprodukowano w domu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ROSACreERT2/c-Fosfl/fl</td><td>Wyprodukowano w domu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cells</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BaF3</td><td>Prezent od George'a Daleya, Harvard Medical School, Boston</td><td></td><td></td></tr><tr><td>WEHI</td><td>Prezent od George'a Daleya, Harvard Medical School, Boston</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CML-CD34+ i normalne komórki</td> <td>CD34+Szpital Uniwersytecki, Uniwersytet w Cincinnati</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

metody oceny roli c-fos i dusp1 w zależności onkogenu

Methods for Evaluating the Role of c-Fos and Dusp1 in Oncogene Dependence

Demonstracja inhibitorów kinazy tyrozynowej (TKI) w leczeniu przewlekłej białaczki szpikowej (CML) zwiastuje nową erę w leczeniu raka. Jednak niewielka populacja komórek nie reaguje na leczenie Tki, co skutkuje minimalną chorobą resztkową (MRD); nawet najsilniejsze TKI nie są w stanie wyeliminować tych komórek. Te komórki MRD służą jako rezerwuar do rozwoju oporności na terapię. Nie wiadomo, dlaczego leczenie TKI jest nieskuteczne w przypadku komórek MRD. Sygnalizacja czynnika wzrostu jest zaangażowana we wspieranie przeżycia komórek MRD podczas leczenia Tki, ale brakuje zrozumienia mechanistycznego. Ostatnie badania wykazały, że podwyższona ekspresja c-Fos i Dusp1 w wyniku zbieżnej sygnalizacji onkogennej i czynnika wzrostu w komórkach MRD pośredniczy w oporności na TTKI. Genetyczne i chemiczne hamowanie c-Fos i Dusp1 sprawia, że CML jest wyjątkowo wrażliwy na TKI i leczy CML zarówno w genetycznych, jak i humanizowanych modelach mysich. Zidentyfikowaliśmy te docelowe geny za pomocą wielu mikromacierzy z komórek wrażliwych i opornych na TKI. W tym miejscu przedstawiamy metody walidacji celu przy użyciu mysich modeli in vitro i in vivo. Metody te można łatwo zastosować do dowolnego celu w celu walidacji genetycznej i rozwoju terapeutycznego.

Uzależnienie od onkogenu zostało powiązane z skutecznością terapeutyczną inhibitorów kinaz tyrozynowych (TKI). Mechanizmy napędzające tę zależność od onkogenów nie są jednak w pełni zrozumiałe. Przeprowadziliśmy szereg bezstronnych analiz ekspresji genów, aby zidentyfikować komponent genetyczny biorący udział w organizowaniu tego zjawiska uzależnienia. Analizy te wykazały nadekspresję trzech genów: c-Fos, Dusp1 i Zfp36 w komórkach nowotworowych, które nie są zależne od sygnalizacji onkoge...

Tutaj opisujemy protokoły genetycznej i chemicznej walidacji c-Fos i Dusp1 jako celu terapeutycznego w białaczce, używając genetycznych i humanizowanych modeli mysich in vitro i in vivo. Metodę tę można zastosować do dowolnego celu walidacji genetycznej i rozwoju terapeutycznego.

Metody oceny roli c-fos i dusp1 w zależności onkogenu

The demonstration of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in treating chronic myeloid leukemia (CML) has heralded a new era in cancer therapeutics. However, ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie terapii nowotworów, takich jak identyfikacja kluczowych genów zaangażowanych w zależność od onkogenów. Główną zaletą tej techniki jest to, że wykorzystuje zależność onkogenu, która jest wspólna dla wielu nowotworów napędzanych przez kinazy, dlatego ma zastosowanie do wielu typów nowotworów. Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w białaczkę, może być również stosowana do innych systemów, takich jak guzy lite, takie jak rak płuc, guzy mózgu i guzy trzustki.Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą miały trudności z powodu braku doświadczenia w biologii molekularnej i fizjologii komórki. Na początek zbierz kości nóg od myszy poddanej eutanazji. Oczyść tkanki z kości skalpelem.Następnie umieść kości w zimnym PBS na lodzie i zmiażdż kości tłuczkiem. Następnie przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko o średnicy 70 mikrometrów do 50-mililitrowej rurki z nakrętką z 10-mililitrową pipetą. Umyj moździerz i tłuczek kilkakrotnie zimnym PBS i dodaj zawiesinę komórkową do 50-mililitrowej probówki.Następnie odwirować szpik kostny i usunąć supernatant za pomocą pipety próżniowej i szklanej. Ponownie zawiesić osad komórk

methods-for-evaluating-role-c-fos-dusp1-oncogene

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ten film opisuje protokół walidacji genetycznej poprzez transfer docelowych genów za pomocą retrowirusów w liniach komórkowych przewlekłej białaczki szpikowej. Retrowirusy działają jako mediator w przenoszeniu materiału genetycznego do komórki białaczkowej w procesie zwanym transdukcją, który umożliwia długotrwałą ekspresję genu docelowego. Metodę tę można zastosować do dowolnych komórek docelowych w celu walidacji genetycznej i opracowania terapeutycznego.

Transdukcja za pośrednictwem retrowirusa: metoda wprowadzania genu docelowego do komórek rakowych

Ten protokół pokazuje, jak generować fluorescencyjnie oznaczone, genetycznie zdefiniowane guzy klonalne w oku/czułkach Drosophila imaginal discs (EAD). Opisuje, jak rozdzielić EAD i mózg od larw trzeciego stadium rozwojowego i jak je przetworzyć w celu wizualizacji i ilościowego określenia zmian ekspresji genów i inwazyjności guza.

Model guza dysku imaginalnego Drosophila: wizualizacja i kwantyfikacja ekspresji genów i inwazyjności guza za pomocą mozaik genetycznych

Identyfikacja nowych celów leków, które przechodzą od testów przedklinicznych do badań na ludziach, jest priorytetem naukowym. W tym celu opisujemy tutaj podejście genomiki funkcjonalnej do badania wpływu wyczerpania genów na sferoidy linii komórek nowotworowych, które bardziej odpowiednio modelują nowotwory u ludzi in vivo.

Wykorzystanie badań przesiewowych genomiki funkcjonalnej do identyfikacji potencjalnie nowych celów leków w hodowlach sferoidalnych komórek nowotworowych

Biblioteka CRISPR/sgRNA została zastosowana do badania genów kodujących białka. Jednak wykonalność biblioteki sgRNA w celu odkrycia funkcji granicy CTCF w regulacji genów pozostaje niezbadana. W tym miejscu opisujemy bibliotekę sgRNA specyficzną dla loci HOX, aby wyjaśnić funkcję granic CTCF w loci HOX.

PRZEKĄTNA TERENU Badania przesiewowe biblioteki CRISPR/sgRNA skoncentrowane na loci identyfikujące krytyczne granice CTCF

Domeny wewnętrznie nieuporządkowane są ważne dla funkcji czynnika transkrypcyjnego fuzji onkogennej. Aby terapeutycznie ukierunkować te białka, konieczne jest bardziej szczegółowe zrozumienie mechanizmów regulacyjnych stosowanych przez te domeny. Tutaj używamy transkryptomiki do mapowania ważnych cech strukturalnych wewnętrznie nieuporządkowanej domeny EWS w mięsaku Ewinga.

Mapowanie zależności struktura-funkcja zaburzonych onkogennych czynników transkrypcyjnych za pomocą analizy transkryptomicznej

To badanie opisuje protokół badania wpływu zmienionego pH na ekspresję onkogenu za pomocą analizy sekwencyjnej RNA linii komórkowej przewodu trzustkowego.

Analiza ekspresji onkogenów ze zmianami pH w linii komórek przewodowych trzustki

Test komet jest skuteczną metodą wykrywania uszkodzeń DNA, w tym jedno- i dwuniciowych pęknięć DNA. Opisujemy alkaliczne i neutralne testy komet w celu zmierzenia uszkodzeń DNA w komórkach nowotworowych w celu oceny efektu terapeutycznego chemioterapii.

Ocena uszkodzeń DNA in vitro za pomocą testu komety

Tutaj prezentujemy dwuwymiarową elektroforezę żelową (2DE) w połączeniu ze spektrometrią mas (MS) w celu oddzielenia i identyfikacji proteomu tkankowego ludzkiego gruczolaka przysadki, który przedstawia dobry i powtarzalny wzór 2DE. Wiele białek obserwuje się w każdym miejscu 2DE podczas analizy złożonego proteomu nowotworu przy użyciu MS o wysokiej czułości.

Dwuwymiarowa elektroforeza żelowa w połączeniu z metodami spektrometrii mas do analizy proteomu tkanki gruczolaka przysadki mózgowej

Naszym celem było opracowanie praktycznego protokołu do oceny dysfunkcji mitochondriów związanych ze zmęczeniem u pacjentów z rakiem. Ten innowacyjny protokół jest zoptymalizowany do użytku klinicznego, obejmującego tylko standardową flebotomię i podstawowe procedury laboratoryjne.

Ocena roli funkcji mitochondriów w zmęczeniu związanym z rakiem

Procesy rządzące inwazją raka pęcherza moczowego stanowią okazję do rozwoju biomarkerów i terapii. Poniżej przedstawiamy model inwazji raka pęcherza moczowego, który obejmuje hodowlę 3D sferoid guza, obrazowanie poklatkowe i mikroskopię konfokalną. Technika ta jest przydatna do definiowania cech procesu inwazyjnego oraz do badań przesiewowych środków terapeutycznych.

System hodowli komórkowych 3D do badania inwazji i oceny terapii w raku pęcherza moczowego

Poznaj metody walidacji c-Fos i Dusp1 jako celów terapeutycznych w białaczce przy użyciu mysich modeli in vivo i in vitro. Technika ta znajduje zastosowanie w różnych typach nowotworów napędzanych kinazami.

Metody oceny roli c-fos i dusp1 w zależności onkogenu

Przeglądaj więcej filmów