Metody oceny roli c-fos i dusp1 w zależności onkogenu

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie terapii nowotworów, takich jak identyfikacja kluczowych genów zaangażowanych w zależność od onkogenów. Główną zaletą tej techniki jest to, że wykorzystuje zależność onkogenu, która jest wspólna dla wielu nowotworów napędzanych przez kinazy, dlatego ma zastosowanie do wielu typów nowotworów. Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w białaczkę, może być również stosowana do innych systemów, takich jak guzy lite, takie jak rak płuc, guzy mózgu i guzy trzustki.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą miały trudności z powodu braku doświadczenia w biologii molekularnej i fizjologii komórki. Na początek zbierz kości nóg od myszy poddanej eutanazji. Oczyść tkanki z kości skalpelem.

Następnie umieść kości w zimnym PBS na lodzie i zmiażdż kości tłuczkiem. Następnie przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko o średnicy 70 mikrometrów do 50-mililitrowej rurki z nakrętką z 10-mililitrową pipetą. Umyj moździerz i tłuczek kilkakrotnie zimnym PBS i dodaj zawiesinę komórkową do 50-mililitrowej probówki.

Następnie odwirować szpik kostny i usunąć supernatant za pomocą pipety próżniowej i szklanej. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 5 mililitrach PBS. Za pomocą pipety powoli dodaj zawieszony szpik kostny do górnej części polisacharozy o temperaturze pokojowej.

Następnie wiruj polisacharozę w temperaturze 400 g przez 20 minut przy wyłączonym hamulcu. Po odwirowaniu zebrać za pomocą pipety mętny całkowity interfejs komórek jednojądrzastych i przenieść go do nowej 15-mililitrowej probówki. Doprowadź objętość do 10 mililitrów za pomocą PBS i usuń 20 mikrolitrów do liczenia.

Po odwirowaniu wyrzucić supernatant i umieścić osad na lodzie. Następnie ponownie zawieś osad komórkowy w PBS za pomocą EDTA i BSA. Dodaj mikrogranulki CD117 do zawiesiny komórkowej i wiruj, aby wymieszać.

Następnie inkubować zawiesinę przez 10 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Następnie zwiększ objętość do 10 mililitrów za pomocą większej ilości PBS z EDTA i BSA i odwiruj w 1200 G w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 5 minut. Użyć próżni, aby usunąć supernatant i zawiesić osad komórkowy w PBS z EDTA i BSA.

Następnie dodaj 3 mililitry PBS z EDTA i BSA do stojaka magnetycznego z kolumną magnetyczną i pozwól mu spłynąć do probówki zbiorczej. Po zakończeniu przepływu buforu przez kolumnę, dodaj zawiesinę komórek i pozwól jej przepłynąć przez kolumnę do probówki zbiorczej. Następnie dodaj 5 dodatkowych mililitrów PBS z EDTA i BSA do kolumny i natychmiast przepłucz ją tłokiem.

Wyjąć tłok i powtórzyć płukanie przed policzeniem komórek. Po odwirowaniu komórek usunąć supernatant i zawiesić osad komórkowy w pełnym IMDM do hodowli. Hoduj komórki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.

Najpierw połącz retrowirusowe plazmidowe DNA z plazmidem opakowaniowym, chlorkiem wapnia i wodą w 1,5-mililitrowej probówce. Następnie dodaj 500 mikrolitrów HBS do kolejnej 1,5 mililitrowej tubki. Dodawać mieszaninę transfekcji kroplami do probówki zawierającej HBS, jednocześnie mieszając z wirownikiem ustawionym na najniższe ustawienie.

Mieszaninę transfekcji inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 do 30 minut. W okresie inkubacji dodać chlorochinę do komórek HEK i trzymać je w inkubatorze. Po dodaniu mieszanki transfekcyjnej inkubuj komórki przez 8 godzin w inkubatorze CO2 o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5%, zmieniając pożywkę komórkową, dodając bardzo powoli 14 mililitrów świeżej pożywki DMEM10.

Powolne dociskanie do ścianki naczynia pomaga zapobiec usuwaniu komórek HEK. Następnie inkubuj komórki przez noc w inkubatorze CO2 o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5%. Użyj 10-mililitrowej strzykawki, aby zebrać supernatant wirusa.

Następnie podłącz filtr strzykawkowy 0,45 mikrometra do strzykawki. Zanurz wirusowy supernatant w nowej probówce do pobrania. Zebrać supernatant wirusa około 16 godzin później.

Następnie dodaj dwa mililitry rekombinowanego fragmentu ludzkiej fibronektyny w PBS do nietraktowanych 6-dołkowych płytek hodowlanych. Następnego dnia użyj pipety, aby usunąć fibronektynę z płytek. Zablokować płytki za pomocą 2% BSA w PBS i inkubować płytki w temperaturze pokojowej przez 30 minut.

Użyj odkurzacza, aby usunąć BSA i umyj płytki PBS przed wyjęciem ich za pomocą odkurzacza. Następnie natychmiast dodaj przefiltrowany supernatant wirusowy i odwiruj płytkę przez dwie godziny. Użyj próżni, aby usunąć supernatant i ponownie obróć płytkę.

Następnie usunąć supernatant za pomocą odkurzacza i przemyć pokryte wirusem studzienki PBS. Usunąć PBS za pomocą próżni, dodać wcześniej hodowane komórki c-Kip plus myszy do studzienek pokrytych wirusem. Po odwirowaniu inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

48 godzin po transdukcji osadzać komórki przez odwirowanie i ponownie zawieś je w buforze FACS 1. Najpierw rozmrozić metylocelulozę za pomocą cytokin dla myszy w temperaturze pokojowej. Następnie podniec 3 mililitry metylocelulozy w probówce FACS.

Dodać 100 mikrolitrów zawiesiny komórkowej z odpowiednimi inhibitorami do 3 mililitrów metylocelulozy. Następnie wiruj zawiesinę na wysokich obrotach przez 10 do 30 sekund. Po ucieczce większości pęcherzyków powietrza użyj strzykawki o pojemności 1 mililitra, aby umieścić 1 mililitr pożywki na trzech powtórzonych płytkach.

Umieść płytki na dużej szalce Petriego wraz z jednym otwartym naczyniem zawierającym sterylną wodę. Następnie przykryj dużą szalkę Petriego i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Przygotować plamę chlorku jodonitrotetrazoliowego, rozpuszczając 10 miligramów chlorku jodonitrotetrazolu w 10 mililitrach wody.

Filtr wysterylizuj roztwór barwiący za pomocą strzykawki Luer lock wyposażonej w filtr 0,2 mikrometra. W kapturze do hodowli tkankowej dodaj kroplami 100 mikrolitrów roztworu barwiącego wokół płytki CFU. Następnie inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze do hodowli komórkowych.

Na koniec, po tym, jak kolonie zmienią kolor na ciemnoczerwono-brązowy, użyj białego tła w sterylnym kapturze do hodowli tkankowych, aby zrobić zdjęcia poplamionej płytki CFU. W tym protokole wykorzystano wiele bezstronnych analiz ekspresji genów w celu zidentyfikowania komponentu genetycznego, który koordynuje uzależnienie od onkogenów. Aby potwierdzić rolę c-Fos i Dusp1 jako celu terapeutycznego w białaczce, potwierdzono ich nadekspresję w komórkach wykazujących ekspresję onkogenu BCR-ABL1.

Analiza za pomocą RT-qPCR i western blotting potwierdziła, że oba były indukowane przez BCR-ABL1 i że ich ekspresja jest zwiększana przez czynnik wzrostu IL-3. Komórki wykazujące ekspresję YFP i ekspresję posortowano za pomocą FACS w celu przeprowadzenia dalszych testów in vitro i in vivo. Wyniki wykazały, że sama delecja c-Fos i Dusp1 hamowała liczbę CFU.

Komórki pozbawione zarówno c-Fos, jak i Dusp1 były znacznie upośledzone w swojej zdolności do tworzenia kolonii, a leczenie imatynibem zniszczyło wszystkie CFU, co wskazuje, że utrata c-Fos i Dusp1 jest syntetycznie śmiertelna dla ekspresji BCR-ABL1. Po tym odkryciu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się nowotworami do zbadania sieci genetycznych i genów napędzających zależność od onkogenów oraz tego, jak te geny wpływają na ich szczególną odpowiedź w modelach mysich i u ludzi. Nie zapominaj, że praca z retrowirusami i próbkami od pacjentów może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy przestrzegać bezpiecznych praktyk laboratoryjnych.