Cyfrowy test reakcji łańcuchowej polimerazy pod kątem zmienności genetycznej u pacjenta ze sporadyczną rodzinną polipowatością gruczolakowatą przy użyciu formatu chip-in-a-tube

Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie badań genetycznych, takie jak wykrywanie mozaicyzmu i testy genetyczne oparte na płynnej biopsji. Główną zaletą tej techniki jest wysokoprzepustowa detekcja niskowariantowej frakcji allelowej. Implikacje tej techniki rozciągają się na diagnostykę nowotworów, ponieważ wykrywanie mutacji onkogennych z wysoką czułością może przyczynić się do rozwoju medycyny precyzyjnej.

Rozpocznij ten eksperyment od dodania 10 l buforu próbki DNA do probówek z 8-probówkowym paskiem. Następnie dodaj 1 mikrolitr drabinki DNA do pierwszej probówki z 8-probówkowym paskiem i jeden mikrolitr próbki genomowego DNA do każdej z pozostałych probówek. Za pomocą nasadki do mikropłytek wymieszać zawartość paska z 8 probówkami, wirując przez jedną minutę.

Umieść pasek, końcówki pipet i urządzenie żelowe w przyrządzie do elektroforezy. Naciśnij przycisk start, aby rozpocząć bieg. Po zakończeniu cyklu sprawdź elektroferogram na wyświetlaczu, aby upewnić się, że dolny marker zawarty w buforze próbki DNA jest prawidłowo przypisany do elektroferogramu.

Jeśli nie, ręcznie przypisz marker w trybie elektroferogramu w oprogramowaniu. Następnie, w trybie regionu oprogramowania, określ region wielkości genomowego DNA, aby automatycznie obliczyć stężenie DNA. Dodaj wcześniej zaprojektowane startery, sondy i genomowe DNA do nowego paska z 8 probówkami, aby uzyskać całkowitą objętość 15 litrów. Pipeta w górę iw dół do mieszania.

Dodaj platformę załadowczą na wióry wbudowane w świeżą taśmę z 8 tubami, a następnie umieść taśmę sitową w automatycznej ładowarce. Upewnij się, że wióry stykają się z platformą załadowczą. Następnie umieść suwak załadowczy na platformie i użyj ogranicznika, aby przytrzymać suwak z ładowarki.

Odpipetować 15 l mieszaniny PCR w pobliżu końcówki suwaka, a następnie nacisnąć przycisk ładowarki, aby uruchomić ładowarkę na jedną minutę. Po zakończeniu pracy wyjmij pasek rurki z ładowarki i umieść go w wzmacniaczu uszczelniającym. Ostrożnie popchnij przesuwaną pokrywę i krawędź górnej pokrywy.

Uruchom wzmacniacz uszczelniający na około dwie minuty. Jeśli uszczelnienie jest niekompletne, na co wskazuje kałuża płynu, powtórz bieg przez dodatkową minutę. Do probówek dodać 230 l płynu uszczelniającego.

Umieść pasek probówki w termocyklerze i uruchom PCR zgodnie z opisem w protokole. Jeśli występuje nierównomierny rozkład przegród dodatnich, dostosuj temperaturę lub czas trwania PCR. Aby wykryć i przeanalizować intensywność fluorescencji produktów PCR, umieść pasek probówki na przyrządzie detekcyjnym i dodaj 6 ml wody destylowanej.

Usuń wszelkie widoczne pęcherzyki powietrza za pomocą końcówki pipety. Załaduj przyrząd do detektora. W oprogramowaniu detekcyjnym wybierz karty Fluorescencja, Eksperyment, a następnie Próbka NTC i kliknij przycisk URUCHOM, aby rozpocząć uruchamianie.

Po zakończeniu przebiegu potwierdź wykres pozycji, histogram i wykres punktowy 2-W. Aby zebrać produkt PCR, usuń płyn uszczelniający z probówki. Dodaj 100 l buforu TE i energicznie wiruj przez 30 sekund.

Krótko odwirować probówki w wirówce stołowej i postępować zgodnie z opisem w protokole tekstowym, aby zakończyć zbieranie produktu PCR. Wykresy pozycji utworzone przez cyfrowy PCR wykazują żółtą fluorescencję HEX zarówno u pacjentów, jak i w próbkach ojczystych, co wskazuje na obecność wariantu T allelu APC, ale nie w żadnej kontroli matrycy. Tylko genomowe DNA pacjentów zawiera wariant C, na co wskazuje zielona fluorescencja FAM.

Jak potwierdzono dalej na wykresach rozrzutu, zarówno pacjent, jak i ojciec są dodatni dla HEX lub wariantu T, podczas gdy tylko pacjent wykazuje obecność wariantu C. Wariant frakcji allelowej pacjenta lub VAF, obliczony za pomocą DPCR, wynosił 13,2%, podobnie jak 12,7%, osiągnięty przez sekwencjonowanie nowej generacji. Z drugiej strony, VAF rodziców pacjentów i zdrowych dawców wynosiły mniej niż 0,1%Elektrofereza pobranych i skoncentrowanych produktów DPCR potwierdza, że wielkość przewidywanego fragmentu wynosi 123 pary zasad w DNA pacjentów i rodziców. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o utrzymaniu ławki w czystości, na przykład poprzez użycie wentylatora filtrującego.