Cyfrowy test reakcji łańcuchowej polimerazy pod kątem zmienności genetycznej u pacjenta ze sporadyczną rodzinną polipowatością gruczolakowatą przy użyciu formatu chip-in-a-tube
20 sierpnia 2018
Cyfrowa reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) jest użytecznym narzędziem do bardzo czułego wykrywania wariantów pojedynczych nukleotydów i wariantów liczby kopii DNA. W tym miejscu przedstawiamy kluczowe zagadnienia dotyczące pomiaru rzadkich wariantów w ludzkim genomie za pomocą cyfrowego PCR w formacie chip-in-a-tube.
Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie badań genetycznych, takie jak wykrywanie mozaicyzmu i testy genetyczne oparte na płynnej biopsji. Główną zaletą tej techniki jest wysokoprzepustowa detekcja niskowariantowej frakcji allelowej. Implikacje tej techniki rozciągają się na diagnostykę nowotworów, ponieważ wykrywanie mutacji onkogennych z wysoką czułością może przyczynić się do rozwoju medycyny precyzyjnej.
Rozpocznij ten eksperyment od dodania 10 l buforu próbki DNA do probówek z 8-probówkowym paskiem. Następnie dodaj 1 mikrolitr drabinki DNA do pierwszej probówki z 8-probówkowym paskiem i jeden mikrolitr próbki genomowego DNA do każdej z pozostałych probówek. Za pomocą nasadki do mikropłytek wymieszać zawartość paska z 8 probówkami, wirując przez jedną minutę.
Umieść pasek, końcówki pipet i urządzenie żelowe w przyrządzie do elektroforezy. Naciśnij przycisk start, aby rozpocząć bieg. Po zakończeniu cyklu sprawdź elektroferogram na wyświetlaczu, aby upewnić się, że dolny marker zawarty w buforze próbki DNA jest prawidłowo przypisany do elektroferogramu.
Jeśli nie, ręcznie przypisz marker w trybie elektroferogramu w oprogramowaniu. Następnie, w trybie regionu oprogramowania, określ region wielkości genomowego DNA, aby automatycznie obliczyć stężenie DNA. Dodaj wcześniej zaprojektowane startery, sondy i genomowe DNA do nowego paska z 8 probówkami, aby uzyskać całkowitą objętość 15 litrów. Pipeta w górę iw dół do mieszania.
Dodaj platformę załadowczą na wióry wbudowane w świeżą taśmę z 8 tubami, a następnie umieść taśmę sitową w automatycznej ładowarce. Upewnij się, że wióry stykają się z platformą załadowczą. Następnie umieść suwak załadowczy na platformie i użyj ogranicznika, aby przytrzymać suwak z ładowarki.
Odpipetować 15 l mieszaniny PCR w pobliżu końcówki suwaka, a następnie nacisnąć przycisk ładowarki, aby uruchomić ładowarkę na jedną minutę. Po zakończeniu pracy wyjmij pasek rurki z ładowarki i umieść go w wzmacniaczu uszczelniającym. Ostrożnie popchnij przesuwaną pokrywę i krawędź górnej pokrywy.
Uruchom wzmacniacz uszczelniający na około dwie minuty. Jeśli uszczelnienie jest niekompletne, na co wskazuje kałuża płynu, powtórz bieg przez dodatkową minutę. Do probówek dodać 230 l płynu uszczelniającego.
Umieść pasek probówki w termocyklerze i uruchom PCR zgodnie z opisem w protokole. Jeśli występuje nierównomierny rozkład przegród dodatnich, dostosuj temperaturę lub czas trwania PCR. Aby wykryć i przeanalizować intensywność fluorescencji produktów PCR, umieść pasek probówki na przyrządzie detekcyjnym i dodaj 6 ml wody destylowanej.
Usuń wszelkie widoczne pęcherzyki powietrza za pomocą końcówki pipety. Załaduj przyrząd do detektora. W oprogramowaniu detekcyjnym wybierz karty Fluorescencja, Eksperyment, a następnie Próbka NTC i kliknij przycisk URUCHOM, aby rozpocząć uruchamianie.
Po zakończeniu przebiegu potwierdź wykres pozycji, histogram i wykres punktowy 2-W. Aby zebrać produkt PCR, usuń płyn uszczelniający z probówki. Dodaj 100 l buforu TE i energicznie wiruj przez 30 sekund.
Krótko odwirować probówki w wirówce stołowej i postępować zgodnie z opisem w protokole tekstowym, aby zakończyć zbieranie produktu PCR. Wykresy pozycji utworzone przez cyfrowy PCR wykazują żółtą fluorescencję HEX zarówno u pacjentów, jak i w próbkach ojczystych, co wskazuje na obecność wariantu T allelu APC, ale nie w żadnej kontroli matrycy. Tylko genomowe DNA pacjentów zawiera wariant C, na co wskazuje zielona fluorescencja FAM.
Jak potwierdzono dalej na wykresach rozrzutu, zarówno pacjent, jak i ojciec są dodatni dla HEX lub wariantu T, podczas gdy tylko pacjent wykazuje obecność wariantu C. Wariant frakcji allelowej pacjenta lub VAF, obliczony za pomocą DPCR, wynosił 13,2%, podobnie jak 12,7%, osiągnięty przez sekwencjonowanie nowej generacji. Z drugiej strony, VAF rodziców pacjentów i zdrowych dawców wynosiły mniej niż 0,1%Elektrofereza pobranych i skoncentrowanych produktów DPCR potwierdza, że wielkość przewidywanego fragmentu wynosi 123 pary zasad w DNA pacjentów i rodziców. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o utrzymaniu ławki w czystości, na przykład poprzez użycie wentylatora filtrującego.
Przegląd
Niniejszy artykuł omawia zastosowanie cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) do czułej detekcji wariantów pojedynczych nukleotydów oraz wariantów liczby kopii DNA. Przedstawiono w nim metodologię oraz znaczenie wykorzystania cyfrowej PCR w badaniach genetycznych, w szczególności w diagnostyce nowotworów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Genetyka
- Onkologia
- Techniki diagnostyczne
Wstęp
- Cyfrowy PCR (dPCR) umożliwia wysokoprzepustową detekcję niskich frakcji alleli wariantowych.
- Technika ta jest przydatna w wykrywaniu mozaicyzmu oraz w badaniach genetycznych opartych na płynnej biopsji.
- Przyczynia się ona do rozwoju medycyny precyzyjnej, umożliwiając detekcję mutacji onkogennych z wysoką czułością.
Cel badania
- Wykazanie skuteczności cyfrowego PCR w pomiarze rzadkich wariantów genetycznych.
- Przedstawienie szczegółowego protokołu wdrożenia tej techniki.
- Zbadanie znaczenia cyfrowego PCR w diagnostyce klinicznej.
Zastosowane metody
- Przygotowanie próbek DNA i mieszanie ich z primerami oraz sondami.
- Elektroforeza w celu wstępnej analizy DNA.
- Wykorzystanie termocyklera do amplifikacji PCR.
- Detekcja produktów PCR za pomocą analizy intensywności fluorescencji.
Główne wyniki
- Skuteczna detekcja wariantów alleli APC w próbkach pacjentów.
- Frakcja allelu wariantowego (VAF) obliczona za pomocą cyfrowego PCR była porównywalna z wynikami sekwencjonowania nowej generacji.
- Elektroforeza potwierdziła wielkość produktów PCR.
- Wykazano znaczenie utrzymania czystości miejsca pracy podczas procedury.
Wnioski
- Cyfrowy PCR jest potężnym narzędziem do wykrywania rzadkich wariantów genetycznych.
- Metoda ta ma istotne znaczenie dla diagnostyki nowotworów i medycyny precyzyjnej.
- Prawidłowe wykonanie protokołu jest kluczowe dla uzyskania dokładnych wyników.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Cyfrowy PCR umożliwia precyzyjną kwantyfikację niskich frakcji alleli wariantowych, co wspiera wczesne wykrywanie mozaicyzmu somatycznego w genach predysponujących do nowotworów. Możliwość ta usprawnia walidację celu poprzez zapewnienie ortogonalnego potwierdzenia rzadkich wariantów zidentyfikowanych za pomocą sekwencjonowania. Format chip-in-a-tube zwiększa wydajność w zastosowaniach przesiewowych w badaniach przedklinicznych wymagających wysokiej czułości.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez wykrywanie niskoczęstotliwościowych wariantów APC w sporadycznej rodzinnej polipozie gruczołowej jelita grubego.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez ortogonalną walidację mozaicyzmu wykrytego w próbkach pacjentów.
- Wartość prognostyczna: Ilościowe oznaczenie frakcji allelu wariantowego wspomaga selekcję projektów w portfolio poprzez potwierdzenie obecności wariantu w systemach istotnych dla choroby.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Format chip-in-a-tube umożliwia przeprowadzenie ośmiu jednoczesnych reakcji dPCR, co poprawia standaryzację w procesach przesiewowych wykrywania mutacji.
- Wynik ilościowy: Precyzyjny pomiar VAF (13,2% u pacjenta) umożliwia wiarygodną ocenę efektu skumulowanego w modelach przedklinicznych.
- Skalowalność: Procedury uszczelniania i zbierania próbek wspierają powtarzalną analizę partycji dla późniejszej weryfikacji.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Wykrywanie mozaicyzmu somatycznego APC jest zgodne ze szlakami tumorigennymi w modelach raka jelita grubego.
- Ciągłość translacyjna: Zgodność VAF z wynikami NGS (12,7%) wspiera decyzje o przejściu do kolejnych etapów w walidacji przedklinicznej w zależności od poziomu ryzyka.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Wykresy rozproszenia oparte na fluorescencji potwierdzają specyficzność wariantu, redukując ryzyko wyników fałszywie dodatnich podczas wyboru celu.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od walidacji celu po identyfikację związku wiodącego, zapewniając ilościową analitykę genetyczną w celu ograniczania ryzyka mechanistycznego.
- Biologia odkrywcza: Wsparcie w testowaniu hipotez poprzez ilościowe określanie frakcji alleli wariantowych APC w próbkach z nowotworów rodzinnych.
- Przesiewowanie: Format chip-in-a-tube umożliwia powtarzalność testu i uzyskanie ilościowych wyników w kampaniach przesiewowych pod kątem mutacji.
- Analityka: Analiza intensywności fluorescencji i wykresy rozrzutu dostarczają wyników statystycznych do porównywania warunków wariantów w różnych próbkach.
- Badania translacyjne: Pomiary VAF łączą wyniki odkrywcze z ciągłością przedkliniczną w modelach polipowatości adenoma.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustandaryzowane procedury uszczelniania i zbierania próbek umożliwiają ponowne wykorzystanie platformy dla wielu celów genetycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna w walidacji celu dzięki czułemu wykrywaniu niskich frakcji alleli wariantowych.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja za pomocą formatu chip-in-a-tube i protokołów uszczelniania zapewnia powtarzalność między seriami pomiarowymi.
- Wartość strategiczna: Zmniejszenie ryzyka biologicznego na późnym etapie dzięki wczesnemu potwierdzeniu mozaicyzmu w fazie odkryć.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja skorygowana o ryzyko, umożliwiona przez ortogonalne pomiary VAF odpowiadające benchmarkom NGS.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie konfiguracji dPCR, detekcji fluorescencji oraz oprogramowania do analizy partycji.
- Wymagany jest termocykler, uchwyt detekcyjny oraz instrumentarium do uszczelniania reakcji na płytkach (chipach).
- Niezbędna jest standaryzacja czasu uszczelniania i rozmieszczenia pokrywki płytki w ramach zespołu, aby zapobiec nierównomiernemu rozmieszczeniu partycji.
- Kwestie adaptacyjne obejmują optymalizację czasu trwania PCR w celu uzyskania równomiernego rozkładu partycji w różnych typach próbek.
- Ograniczenie praktyczne: wymagane jest staranne napełnianie i uszczelnianie płytki, aby uniknąć nad- lub niedoszacowania liczby partycji pozytywnych.
